Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: João Bosco Guerreiro da Silva / Banca: Márcia Maria Costa Nunes Soares / Banca: Rejane Maira Góes / Banca: Ricardo Barros Mariutti / Resumo: O vírus da hepatite C (HCV) causa a doença da Hepatite C e estima-se que cerca de 3% da população mundial esteja infectada com o vírus. A infecção por HCV promove a alteração na expressão de várias proteínas celulares. Estudos têm demonstrado que muitas proteínas de choque térmico (HSPs) possuem um perfil de expressão alterado na presença do vírus e algumas HSPs interagem diretamente com proteínas do HCV. Assim, o presente estudo teve como objetivo avaliar in vitro os níveis de expressão de proteínas de choque térmico na presença e ausência de HCV. Com este propósito, células de hepatoma humano Huh7.5 e células Huh7.5 infectadas com o vírus (HCV JFH-1) foram submetidas à extração de RNA e síntese de cDNA. A expressão diferencial de 84 HSPs e chaperonas foi avaliada por qPCR Array. Os resultados demonstram que cinco genes apresentaram expressão aumentada (em Log2 2), enquanto outros cinco apresentaram expressão reduzida. Para validar estes resultados os 10 genes diferencialmente expressos foram testados por qPCR em três modelos celulares para o HCV: células contendo replicon subgenômico do HCV (SGR-JFH-1), células infectadas com JFH-1 (ambos do genótipo 2a) e células contendo o replicon subgenômico S52 (genótipo 3). O gene HSPB8 mostrou expressão aumentada nos três modelos testados, condizente com os resultados obtidos por qPCR Array. Em seguida, promovemos o silenciamento de HSPB8 e foi observado um aumento na replicação viral. Em contraste, quando aumentamos a expressão de... / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) causes Hepatitis C disease and it is estimated that about 3% of world population are infected with the virus. HCV infection promotes alteration in the expression of several cellular proteins. Studies have shown that many heat shock proteins (HSPs) have an altered expression profile in the presence of the virus and some HSPs interact directly with HCV proteins. Thus, the present study aimed to evaluate in vitro the expression levels of heat shock proteins in the presence and absence of HCV. With this purpose, human hepatoma Huh7.5 cells and Huh7.5 cells infected with the virus (HCV JFH-1) were subjected to RNA extraction and cDNA synthesis. The differential expression of 84 HSPs and chaperones was assessed by qPCR Array. The results demonstrate that five genes showed increased expression (over Log2 2), while five other presented reduced expression. To validate these results, the 10 differentially expressed genes were tested by real-time PCR in three different HCV cell culture models: subgenomic HCV replicon cells (SGR-JFH-1), JFH-1 infected cells (both genotype 2a) and subgenomic S52 cells (genotype 3). The HSPB8 gene showed increased expression in all of three tested models, consistent with qPCR Array results. Then we promoted the silencing of HSPB8 and observed an increase in viral replication. In contrast, when we increased an expression of HSPB8, HCV had a decrease in replication rate. The same procedure was adopted for the DNAJC5B, validated in the ... / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Julio Cesar Borges / Resumo: Neste trabalho foi realizado um estudo de caracterização das proteínas RUV - 1 e RUV - 2 de Neurospora crassa, as quais são proteínas ubiqua mente encontradas e descritas estar envolvidas em diferentes processos celulares. Resultados anteriores obtidos pelo nosso grupo identificaram, através de espectrometria de massas, a proteína RUV - 1 como uma proteína capaz de se ligar ao promotor do gene da glicogênio sintase ( gsn ) durante a resposta ao choque térmico. Mais tarde, foi demonstrado que a proteína foi capaz de se ligar in vitro, e de maneira especifica, a o motivo de DNA STRE, também presente no promotor gsn . Considerando que a proteína RUV - 1 in terage com a proteína parceira RUV - 2 e, juntas, participam de grandes complexos proteicos que atuam na regulação de diferentes processos celulares, e ste trabalho teve como objetivo realizar estudos de caracterização das proteínas RUV - 1 e RUV - 2. Os resultad os de expressão gênica mostraram que o gene ruv - 1 foi s uperexpresso na condição de choque térmico e que o gene ruv - 2 n ão mostrou alteração na expressão na mesma condi ção. Além disso, foi demonstrado que o transcrito do gene ruv - 2 é parcialmente processado n a situação de choque térmico, e não em outra condição indutora de estresse, através do processo conhecido como intron retention levando à síntese de uma proteína truncada . No entanto, os resultados mostraram que a proteína RUV - 2 foi detectada em extratos celulares do fungo obtidos até 4 h de choque térmico. Os cDNAs ( ruv - 1 e ruv - 2 ) foram inserido s no vetor pET28a e as proteínas expressas em E. coli . Entretanto, ainda não foi finalizada a expressão de ambas utilizando o plasmídeo bicistrônico pETDUET - 1, par a a análise de interação de ambas proteínas. Neste trabalho também foi construída uma linhagem do fungo modificada geneticamente, a qual produz a proteína RUV -... / Abstract: In this work, we performed characterization studies of Neurospora crassa RUV - 1 and RUV - 2, which are ubiquitous protein and have been described to be involved in different cellular processes. Previous results obtained by our group identified, by mass sp ectrometry, RUV - 1 as a protein able of binding to the glycogen synthase gene promoter ( gsn ) during heat shock response. Later, it was demonstrated that the protein was able to bind in vitro, and in a specific manner, to the STRE DNA motif, also present in gsn promoter. Since RUV - 1 interacts with RUV - 2 protein, and together participate in large protein complexes that act in the regulation of different cellular processes, this study aimed to conduct characterization studies of RUV - 1 and RUV - 2 proteins . G ene expression results showed that ruv - 1 gene, but not ruv - 2 gene was overexpressed under heat shock. Furthermore, it was shown that ruv - 2 transcript was incompletely processed under heat shock through a process known as intron retention that leads to the prod uction of a truncated protein. No other stress inducing condition s led to the same phenomenon . However, RUV - 2 protein was detected in cell extracts of the fungus exposed to heat shock up to 4 h . The c DNA c ( ruv - 1 and ruv - 2 ) w ere inserted into the pET28a vec tor and the proteins were expressed in E. coli . However, it has not yet been completed the molecular cloning in the bicistronic plasmid pETDUET - 1, which allows the production of both proteins in the same cell, what is required for protein - protein interacti on analysis. In t his work, was also constructed a genetically modified strain, which produces the V5 - tagged RUV - 1 protein (V5 - RUV - 1 ), which that will be later used in immunoprecipitation assay for the identification of partner proteins. Chromatin immunopre cipitation (ChIP) assay using this strain w as performed in order to investigate... / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-06-25Bitstream added on 2014-06-13T20:09:18Z : No. of bitstreams: 1 000750081.pdf: 1365827 bytes, checksum: 5cd5a899c0c01dfdbd749d97a230cbae (MD5) / Quando as células de um organismo são expostas a um estressor, elas respondem sintetizando um grupo de proteínas denominadas proteínas de choque térmico (heat shock proteins - hsp), agrupadas em quatro famílias: hsp-90, hsp-70, hsp-60 e pequenas hsp's, sendo a família das hsp-70 a mais conservada e filogeneticamente ubíqua, e que tem sido considerada indicador molecular da resposta de estresse. O objetivo deste estudo foi caracterizar as respostas fisiológicas e moleculares de pacus (Piaractus mesopotamicus) submetidos à elevação exógena do cortisol, utilizando a expressão do gene da hsp-70 como ferramenta de determinação da resposta molecular. Um total de 104 peixes (67,5±11,7 g) recebeu implantes intraperitoniais de manteiga de cacau contendo 0, 50 e 100 μg cortisol /g de peso vivo, e foi amostrado 1, 3, 6 e 24 horas após o implante, para determinação das concentrações séricas de cortisol, sódio e potássio e plasmáticas de glicose e cloreto. Um grupo foi amostrado antes do implante (grupo basal). Para a expressão gênica foram analisados o grupo basal e o injetado com 50 μg cortisol/g. O cortisol circulante aumentou a partir de 1 hora após o implante dos péletes contendo cortisol e se manteve alto até 24 horas depois. A resposta da glicose circulante acompanhou as elevações do cortisol no sangue, confirmando sua ação gliconeogênica, porém houve ausência de respostas nos indicadores iônicos. A expressão do gene hsp70 do pacu mostrou leve aumento 3 e 6 horas após o implante, mas foi mais expressiva 24 horas depois, indicando a possibilidade do uso da expressão gênica da hsp70 como marcador de elevação dos níveis de cortisol e da resposta de estresse / When the cells of an organism are exposed to a stressor, they respond by synthesizing a group of proteins called heat shock proteins (hsp), which are grouped into four families: Hsp-90, Hsp-70, Hsp-60 and small hsp's, where the family of Hsp-70 is the most conserved and phylogenetically ubiquitous, and has been considered an indicator of molecular stress response. The aim of this study was to characterize the molecular and physiological responses of pacu (Piaractus mesopotamicus) to elevation exogenous cortisol, using gene expression of hsp-70 as a tool for determining the molecular response. A total of 104 fish (67.5 ± 11.7 g) received intraperitoneal implants of cocoa butter containing 0, 50 and 100 mg cortisol / g of live weight and were sampled 1, 3, 6 and 24 hours after implantation for determination of serum cortisol, sodium and potassium and plasma glucose and chloride. One group was sampled before implantation (baseline group). For gene expression were analyzed the baseline group and the injected with 50 mg cortisol / g. The cortisol increased from 1 hour after implantation of pellets containing cortisol and remained high until 24 hours later. The response of circulating glucose followed elevations of cortisol in the blood, confirming gluconeogenic action, but there were no responses in ion indicators. The expression of the hsp70 gene showed slight increase 3 and 6 hours after implantation, but was more pronounced after 24 hours, indicating the possibility of using gene expression of hsp70 as a marker of increased levels of cortisol and stress response

Orientador: Steve Sol Witkin / Coorientador: Débora Cristina Damasceno / Coorientador: Iara Moreno Linhares / Banca: Marilza Vieira Cunha Rudge / Banca: Gustavo Tadeu Volpato / Resumo: Não disponível / Abstract: Embryo implantation and formation of a functional placenta are essential steps for the establishment of pregnancy, survival and development of the embryo and the fetus in the intrauterine environment. Among the various factors involved in embryo-fetal development, heat shock proteins (hsp) play a central role. These proteins function as molecular chaperones and have a highly conserved amino acid sequence, being essential for survival of all organisms from bacteria to plants and mammals. The hsp are essential for cellular survival, thus it is understandable that hsp have gained considerable interest in almost every medical field including reproduction, immunology and infectious diseases. Recent studies have reported the involvement of hsp in various stages of embryonic and fetal development, from formation of the male and female gametes until parturition. Further studies are needed to elucidate the mechanisms by which hsp influence reproductive processes. The purpose of this review is to present and discuss the involvement of hsp on embryonic and fetal development / Mestre

Made available in DSpace on 2016-05-17T16:51:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-08-26. Added 1 bitstream(s) on 2016-05-17T16:55:03Z : No. of bitstreams: 1 000858362.pdf: 1021113 bytes, checksum: 02b2cfecd7a9e23dece803944857347c (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os equinos e asininos pertencem à família Equidae e género Equus, por este motivo são considerados similares e tratados de forma equivalente em relação à fisiologia reprodutiva. A membrana plasmática do espermatozoide funciona como uma barreira física ao ambiente externo e a sua integridade estrutural está diretamente relacionada ao tipo e quantidade de lipídios que a compõem. Desta forma, este estudo teve como objetivos comparar perfil lipídico dos espermatozoides de jumentos e cavalos e comparar o perfil lipídico da membrana dos espermatozoides de jumentos antes e após os processos de criopreservação. No Experimento 1 comparamos o perfil lipídico da membrana espermática de jumentos e cavalos e foram identificados 101 íons lipídicos em cavalos e 105 em jumentos. Os asininos apresentaram maior abundância relativa em 18 íons. No Experimento 2 foram avaliadas as alterações do perfil lipídico da membrana espermática de jumentos durante o processo de criopreservação e observou-se perda de 14 íons lipídicos e 16 novos íons surgiram após os processos de criopreservação. De acordo com os resultados obtidos podemos concluir que a composição lipídica da membrana do espermatozoide de jumentos é diferente de cavalos e os processos de criopreservação levam a alterações na composição de fosfolipídeos da membrana plasmática de espermatozoides de jumentos / The horses and donkeys belong to the Equidae family and genus Equus, for this reason are considered similar and treated equivalently with respect to reproductive physiology. The plasma membrane of the sperm works as a physical barrier to the external environment and its structural integrity is directly related to the type and quantity of lipids that comprise it. Thus, this study aimed to compare the lipid profile of sperm donkeys and horses and compare the lipid membrane of the donkey sperm before and after cryopreservation processes. In Experiment 1 compared the lipid profile of the donkeys and horses sperm membrane and 101 lipid ions were identified in horses and 105 donkeys in. The donkeys had higher relative abundance in 18 ions. In Experiment 2 were evaluated changes in the lipid profile of the donkeys sperm membrane during the cryopreservation process and there was loss of 14 lipid ions and 16 new lipid ions arose after the cryopreservation processes. According to the obtained results we can conclude that the lipid composition of donkey sperm membrane is different from horses and cryopreservation processes lead to changes in the phospholipid composition of the plasma membrane of sperm donkeys / FAPESP: 2013/12838-9

Orientador: Marilza Vieira Cunha Rudge / Coorientador: Steven Sol Witkin / Banca: Debora Cristina Damasceno / Banca: Carlos Antonio Negrato / Resumo: O diabete gestacional (DMG) e a hiperglicemia gestacional leve têm consequências importantes para a mãe e o recém-nascido. Gestantes portadoras de hiperglicemia gestacional leve (HGL) não atingem os critérios diagnósticos para DMG, porém, os recém-nascidos apresentam macrossomia mediada pela glicemia, mesma mortalidade perinatal e resultados perinatais adversos semelhantes ao das DMG. Estudos relatam que as atividades das proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins- hsp) são relevantes para relacionar com as doenças maternas. A família das hsp consiste de diversas proteínas, altamente conservadas durante a evolução. O objetivo do presente estudo foi estudar os níveis de hsp 60, hsp70 e seus respectivos anticorpos no soro materno entre 24-28 semanas e 34-38 semanas de gestação e 6 semanas pós parto em 208 mulheres normoglicêmicas (ND), 121 mulheres com hiperglicemia gestacional leve, 55 mulheres com diabete gestacional e 178 mulheres com overt diabetes. Níveis de hsp60, hsp70, anti-HSP60 e anti-HSP70 foram quantificados através da técnica de ELISA. hsp60 e hsp70 estão diminuídos nos três grupos hiperglicêmicos em cada momento estudado quando comparados com as concentrações do grupo controle. No grupo ND, mas não nos grupos hiperglicêmicos, níveis de hsp60 aumentaram, e níveis de hsp70 diminuíram. Níveis de anti-HSP60 foram similares entre os grupos enquanto níveis de anti-HSP70 foram menores nos três grupos hiperglicêmicos em comparação ao grupo ND durante a gestação, mas não no pós parto. Como conclusão, concentrações circulantes de hsp60 e hsp70 estão diminuídas em mulheres hiperglicêmicas durante a gestação, independente do grau de hiperglicemia, quando comparado com mulheres normoglicêmicas. Outros estudos serão necessários para entender os mecanismos responsáveis por estas alterações nos níveis de hsp60 e hsp70 na hiperglicemia e as consequências na gestação / Abstract: Objective The aim of the present study was to compare serum levels of heat shock proteins (hsp) 60, hsp70 and their respective antibodies in maternal serum. Research design and methods In maternal serum at 24-28 and 34-38 weeks gestation and at 6 weeks postpartum from 208 normoglycemic (ND) women and 121 women with mild gestational hyperglycemia (MGH), 55 with gestational diabetes (GDM) and 178 with overt diabetes. hsp60, hsp70, anti-HSP60 and anti-HSP70 levels were quantitated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Hsp60 and hsp70 levels were decreased in all three hyperglycemic groups at each time period compared to concentrations in the ND controls. In the ND group, but not in the hyperglycemic mothers, hsp60 levels increased, and hsp70 levels decreased with each successive sample. Anti-HSP60 levels were similar between groups while anti-HSP70 levels were lower in the three hyperglycemic groups than in the ND controls during pregnancy, but not postpartum. Conclusions Circulating hsp60 and hsp70 concentrations are decreased in hyperglycemic women during pregnancy, regardless of the degree of hyperglycemia, compared to ND women. Further studies are warranted to explore the mechanism(s) responsible for these alterations in hsp60 and hsp70 levels in hyperglycemia and consequences for pregnancy outcome / Mestre

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:49Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-07-31Bitstream added on 2014-08-13T18:00:22Z : No. of bitstreams: 1 000760138.pdf: 1342792 bytes, checksum: 04e3113cab00466cb2ff5442738feb1d (MD5) / Estudos prévios têm demonstrado que baixas concentrações de agentes antineoplásicos como ciclofosfamida e paclitaxel (PAC) modulam positivamente a resposta imune, estimulando linfócitos T e células dendríticas (DCs). Além disso, são capazes de aumentar a imunogenicidade de células de câncer colorretal humano HCT-116, e de induzir a transcrição de genes de proteínas de choque térmico (HSPs). No presente trabalho, tivemos como objetivo avaliar a expressão das HSPs 40, 70 e 90 e comparar o efeito da concentração efetiva mínima (CEM) com a concentração não-tóxica (CNT) de PAC sobre a imunogenicidade das células HCT-116. Células HCT-116 foram tratadas com a CEM ou com a CNT de PAC. Lisados tumorais foram analisados quanto à expressão das HSPs e utilizados para sensibilizar DCs derivadas de monócitos de sangue periférico de indivíduos normais. As DCs foram avaliadas quanto ao seu fenótipo e foram co-cultivadas com linfócitos T alogênicos para a avaliação da capacidade de estimulação desses linfócitos. O tratamento das células tumorais com ambas as concentrações da droga induziu o aumento da expressão de HSP40, enquanto a produção de HSP70 e HSP90 foram aumentadas apenas pela CEM e pela CNT, respectivamente. Observou-se ligeiro, mas não significante aumento da capacidade de indução da resposta alogênica. Houve também uma tendência ao aumento da expressão de CD40 nos grupos HCT, CEM e CNT. É possível que a expressão das HSPs contribua para o aumento de imunogenicidade induzido pelo PAC. A CEM é menos eficiente que a CNT em aumentar a imunogenicidade das células tumorais, mas não prejudica a capacidade das DCs de induzir a resposta alogênica nem seus marcadores fenotípicos de ativação / Colorectal cancer (CRC) is one of the main causes of death worldwide and its conventional treatment is based on surgery, cytotoxic chemotherapy and radiotherapy, or a combination of these therapeutic modalities. The main chemotherapeutic agents for fighting CRC are metrotexate, 5-aza-2-deoxycitidine, taxans and 5-fluorouracil. Usually, their administration is based on maximum tolerable doses, but it has been shown that low concentrations of most of these drugs upregulate the immune system, both enhancing the immune responsiveness and increasing the immunogenicity of tumor cells. These features are associated with translational changes of a couple of genes, among them, there is an increased expression of heat-shock proteins (HSPs). Although the expression of HSPs may represent an adaptive response of tumor cells to the drug-induced damages, there is evidence that some of these proteins are fundamental for antigen processing and presentation by antigen-presenting cells. Then, in the present review we aimed to show that increased expression of HSPs by drug-treated tumor cells may be favorable for the development of an effective immune response, and that this phenomenon should enhance the combinatory schedules of chemotherapy and immunotherapy

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-08-27T15:57:19Z : No. of bitstreams: 1 000723028_20150823.pdf: 1028906 bytes, checksum: 197bceaec267086e9658eb5a35574fe1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-24T10:46:34Z: 000723028_20150823.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-24T10:47:09Z : No. of bitstreams: 1 000723028.pdf: 1485800 bytes, checksum: aaac9adf54c11e7df2321502f879e475 (MD5) / A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-21Bitstream added on 2014-12-02T11:21:19Z : No. of bitstreams: 1 000784186.pdf: 1415976 bytes, checksum: 3d35d4c96df24ba810e2837e3b0e5c61 (MD5) / O diabete gestacional (DMG) e a hiperglicemia gestacional leve têm consequências importantes para a mãe e o recém-nascido. Gestantes portadoras de hiperglicemia gestacional leve (HGL) não atingem os critérios diagnósticos para DMG, porém, os recém-nascidos apresentam macrossomia mediada pela glicemia, mesma mortalidade perinatal e resultados perinatais adversos semelhantes ao das DMG. Estudos relatam que as atividades das proteínas de choque térmico (Heat Shock Proteins– hsp) são relevantes para relacionar com as doenças maternas. A família das hsp consiste de diversas proteínas, altamente conservadas durante a evolução. O objetivo do presente estudo foi estudar os níveis de hsp 60, hsp70 e seus respectivos anticorpos no soro materno entre 24-28 semanas e 34-38 semanas de gestação e 6 semanas pós parto em 208 mulheres normoglicêmicas (ND) , 121 mulheres com hiperglicemia gestacional leve , 55 mulheres com diabete gestacional e 178 mulheres com overt diabetes. Níveis de hsp60, hsp70, anti-HSP60 e anti-HSP70 foram quantificados através da técnica de ELISA. hsp60 e hsp70 estão diminuídos nos três grupos hiperglicêmicos em cada momento estudado quando comparados com as concentrações do grupo controle. No grupo ND, mas não nos grupos hiperglicêmicos, níveis de hsp60 aumentaram, e níveis de hsp70 diminuíram. Níveis de anti-HSP60 foram similares entre os grupos enquanto níveis de anti-HSP70 foram menores nos três grupos hiperglicêmicos em comparação ao grupo ND durante a gestação, mas não no pós parto. Como conclusão, concentrações circulantes de hsp60 e hsp70 estão diminuídas em mulheres hiperglicêmicas durante a gestação, independente do grau de hiperglicemia, quando comparado com mulheres normoglicêmicas. Outros estudos serão necessários para entender os mecanismos responsáveis por estas alterações nos níveis de hsp60 e hsp70 na hiperglicemia e as consequências na gestação / Objective The aim of the present study was to compare serum levels of heat shock proteins (hsp) 60, hsp70 and their respective antibodies in maternal serum. Research design and methods In maternal serum at 24-28 and 34-38 weeks gestation and at 6 weeks postpartum from 208 normoglycemic (ND) women and 121 women with mild gestational hyperglycemia (MGH), 55 with gestational diabetes (GDM) and 178 with overt diabetes. hsp60, hsp70, anti-HSP60 and anti-HSP70 levels were quantitated by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Hsp60 and hsp70 levels were decreased in all three hyperglycemic groups at each time period compared to concentrations in the ND controls. In the ND group, but not in the hyperglycemic mothers, hsp60 levels increased, and hsp70 levels decreased with each successive sample. Anti-HSP60 levels were similar between groups while anti-HSP70 levels were lower in the three hyperglycemic groups than in the ND controls during pregnancy, but not postpartum. Conclusions Circulating hsp60 and hsp70 concentrations are decreased in hyperglycemic women during pregnancy, regardless of the degree of hyperglycemia, compared to ND women. Further studies are warranted to explore the mechanism(s) responsible for these alterations in hsp60 and hsp70 levels in hyperglycemia and consequences for pregnancy outcome

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello / Resumo: A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Abstract: Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication / Mestre