Orientadores: Eneida de Paula, Marcelo Bispo de Jesus / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T18:01:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Radaic_Allan_M.pdf: 4265854 bytes, checksum: c076b4c5a6bc95bdcef69dea768f492f (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O câncer é a doença genética responsável pelo maior número de mortes em países desenvolvidos e a segunda maior causa mortis em países em desenvolvimento. Uma das principais formas de tratamento do câncer é a quimioterapia, que se utiliza de fármacos para induzir a morte em células cancerígenas, impedindo, assim, seu crescimento anormal. Para ultrapassar desvantagens das tratamentos atuais, novas terapias vêm sendo desenvolvidas. Dentre elas, a terapia gênica e o uso de sistemas de liberação de fármacos foram as abordagens escolhidas em nossa pesquisa. Carreadores Lipídicos Nanoestruturados (CLN) e Nanopartículas Lipídicas Sólidas (NLS) são alternativas interessantes para viabilizar tais terapias, por conseguirem entregar material genético de forma efetiva e segura de genes, fármacos e proteínas em células alvo. Portanto, esta dissertação teve por objetivos i) desenvolver e aperfeiçoar um novo método de produção de CLN e NLS: a extrusão de microemulsão e ii) produzir nanopartículas capazes de carrear genes (gene codificante para PTEN) e fármacos (mitoxantrona) concomitantemente em células de câncer. Os resultados demonstram que a extrusão de microemulsão é um método factível para a produção de tais partículas, sendo que 15 passagens pela membrana de 100 nm, 5 ºC acima da temperatura de fusão dos lipídios sólidos são os melhores parâmetros para otimização deste processo. As nanopartículas lipídicas produzidas apresentaram diâmetro médio em torno de 140 nm e foram estáveis por, pelo menos, 180 dias estocadas a 4 ºC. Além disso, CLN e NLS mostraram-se semelhantes quanto ao tamanho, potencial Zeta e polidispersão (PDI). Apesar de não apresentarem diferenças quanto a transição de fase, as nanopartículas lipídicas apresentaram uma ultraestrutura monolítica bastante distinta dos lipossomas, o que garantiu uma alta eficiência de encapsulamento para o fármaco mitoxantrona: de 81% em CLN e 64 % em NLS. Finalmente, o carreamento concomitante do fármaco mitoxantrona e do gene da PTEN diminuiu a viabilidade celular em linhagens de câncer de mama (MCF-7) e de próstata (PC3), de maneira mais eficiente que formulações lipossomais / Abstract: Cancer is the genetic disease responsible for major death causes in developed countries and it is the second leading cause of death in developing countries. One of the main forms of cancer treatment is chemotherapy, which uses drugs to induce death in neoplastic cells, thereby preventing their overgrowth. To overcome disadvantages of current treatments, new therapies have been developed. Among them, gene therapy and the use of drug delivery systems were the approaches used in our research. Nanostructured Lipid Carriers (NLC) and Solid Lipid Nanoparticles (SLN) are suitable carriers for such therapies since they can effectively and safely deliver genetic material, drugs and proteins in target cells. Therefore, this work was aimed i) to develop and optimize a new method of production of NLC and SLN: the microemulsion extrusion and ii) to produce nanoparticles capable of co-delivery genes (the coding gene for PTEN) and drugs (mitoxantrone) into cancer cells. The results demonstrate that microemulsion extrusion is a reliable method for the production of such particles, being 15 passages through 100 nm membrane, at 5 °C above the solid lipid melting temperature, are the best parameters for process optimization. The lipid nanoparticles showed average diameter of 140 nm and they were stable up to 180 days of storage at 4 °C. Moreover, NLC and SLN showed similar size, Zeta potential and polydispersity (PDI). While calorimetry did not reveal great differences among the formulations tested, transmission electron microscopy revealed a monolithic structure for lipid nanoparticles distinct from lipossomes, which allowed NLC and SLN to encapsulate 81 and 64 %, respectively, of mitoxantrone. Finally, concomitant entrapment of mitoxantrone and PTEN gene in lipid nanoparticles led to a decrease in the cell viability of breast (MCF-7) and prostate (PC3) cancer cells, more efficiently than liposomal formulations / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

The product of the snail1 gene (SNAIL1) is a transcriptional repressor required for triggering the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT). SNAIL1 transcription is induced when epithelial cells are forced to acquire a mesenchymal phenotype. Furthermore, ectopic expression of snail1 in epithelial cells promotes resistance to apoptosis. In this study, we demonstrate that this resistance to ã radiation-induced apoptosis caused by Snail1 is associated with the transcriptional inhibition of PTEN phosphatase. The binding of Snail1 to PTEN promoter increases after ã radiation, correlating with the stabilization of snail1 protein that prevents the association of p53 to PTEN promoter. These results stress the critical role of Snail1 in the control of apoptosis and demonstrate the regulation of PTEN phosphatase by this transcriptional repressor.In this work we also demonstrate that snail1 protein modulates its own expression in tumor cells in a bimodal fashion. Snail1 binds to an E-box present in its promoter and represses its activity. However, in tumor cell lines with low levels of E-cadherin, snail1 stimulates its own promoter. This positive effect prevails on the inhibitory effect, does not require the E-box, and is independent on the SNAG box in snail1 protein. Transcriptional stimulation of SNAIL1 promoter by snail1 is dependent on the activation of NFêB and is negatively modulated by E-cadherin transfection. These results indicate that the expression of snail1 gene can be regulated by its product and by the levels of E-cadherin, and evidence the existence of a fine-tuning feed-back mechanism of regulation for snail1 transcription. / El producte del gen snail1 (SNAIL1) és un repressor transcripcional requerit per a la transició epiteli-mesénquima (TEM). La seva transcripció s'indueix quan les cèl·lules epitelials són forçades a adquirir un fenotip mesenquimal. A més, l'expressió ectòpica d'snail1 en cèl·lules epitelials promou resistència a apoptosi. En aquest estudi varem demostrar que la resistència a apoptosi, induïda per radiació gamma, en aquestes cèl·lules és causada per snail1 i està associada a la inhibició transcripcional de la fosfatasa PTEN. La unió de snail1 al promotor de PTEN augmenta després de la radiació gamma, es correlaciona amb l'estabilització de la proteïna snail1 i impedeix l'associació de p53 al promotor de PTEN. Aquests resultats expliquen el paper crític de snail1 en el control de la apoptosi i demostren la regulació de la fosfatasa PTEN per aquest repressor transcripcional. En aquest treball també varem demostrar que la proteïna snail1 modula la seva pròpia expressió en cèl·lules tumorals d'una manera bimodal. Snail1 s'uneix a una caixa E present en el seu promotor i reprimeix la seva activitat. No obstant això, en cèl·lules tumorals amb nivells baixos d'E-cadherina, snail1 estimula el seu propi promotor. Aquest efecte activador preval sobre l'efecte inhibitori, no requereix de la caixa E i és independent del domini SNAG en la proteïna snail1. L'estimulació transcripcional del promotor SNAIL1 per snail1 és depenent de l'activació de NFκB i és modulada negativament per la transfecció d'E-cadherina. Aquests resultats indiquen que l'expressió del gen snail1 es pot regular pel seu propi producte i pels nivells d'E-cadherina, i evidencien l'existència d'un fi mecanisme de control en la regulació transcripcional de snail1. / El producto del gen snail1 (SNAIL1) es un represor transcripcional requerido para la transición epitelio-mesénquima (TEM). Su transcripción se induce cuando las células epiteliales son forzadas a adquirir un fenotipo mesenquimal. Además, la expresión ectópica de snail1 en células epiteliales promueve resistencia a apoptosis. En este estudio demostramos que la resistencia a apoptosis, inducida por radiación gamma, en estas células es causada por snail1 y está asociada a la inhibición transcripcional de la fosfatasa PTEN. La unión de snail1 al promotor de PTEN aumenta después de la radiación gamma, se correlaciona con la estabilización de la proteína snail1 y previene la asociación de p53 al promotor de PTEN. Estos resultados explican el papel crítico de snail1 en el control de la apoptosis y demuestran la regulación de la fosfatasa PTEN por este represor transcripcional. En este trabajo también demostramos que la proteína snail1 modula su propia expresión en células tumorales de una manera bimodal. Snail1 se une a una caja E presente en su promotor y reprime su actividad. Sin embargo, en células tumorales con niveles bajos de E-cadherina, snail1 estimula su propio promotor. Este efecto activador prevalece sobre el efecto inhibitorio, no requiere de la caja E y es independiente del dominio SNAG en la proteína snail1. La estimulación transcripcional del promotor SNAIL1 por snail1 es dependiente de la activación de NFκB y es modulada negativamente por la transfección de E-cadherina. Estos resultados indican que la expresión del gen snail1 se puede regular por su propio producto y por los niveles de E-cadherina, y evidencian la existencia de un fino mecanismo de control en la regulación transcripcional de snail1.

PTEN ist als Phosphatase an zahlreichen Signalwegen, z.B. von Wachstumsfaktoren beteiligt. Mutationen im PTEN-Gen führen zur Entstehung vieler sporadischer Tumore sowie dem kongenitalen PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom (PHTS). Eine kausale Therapie für PHTS steht derzeit nicht zur Verfügung. Diese Arbeit beschreibt einen experimentellen Sirolimustherapieversuch bei einem Kind mit PHTS, welches sich unter anderem mit Thymushyperlasie, abdomineller Lipomatose und Kachexie präsentierte. Unter Behandlung zeigten sich eine Verbesserung des Allgemeinzustandes und des Größenwachstums des Patienten, sowie eine transiente Verkleinerung des Thymusvolumens. Die massive Lipomatose wurde im Wachstum gehemmt, nahm aber nicht an Volumen ab. Ein erneutes Thymuswachstum nach 19-monatiger Therapie ließ eine Resistenzentwicklung gegen Sirolimus vermuten. Bei Untersuchungen des PI3K/AKT/mTOR-Signalweges zeigten sich Hinweise für einen möglichen Resistenzmechanismus. Insulin-like growth factor binding protein 2, wird als Biomarker für den Therapieerfolg der Sirolimusbehandlung diskutiert. Dies erwies sich bei unserem Patienten allerdings nicht als geeignet zur Nutzenbewertung der Therapie. In vitro Studien an primären Zellkulturen aus Lipom-Gewebe des Patienten zeigten eine Hemmung von Proliferation und Differenzierung durch Sirolimus, jedoch keine Induktion der Apoptose. Inhibitoren von PI3K und AKT zeigten im Bezug auf Proliferationshemmung und Apotoseinduktion stärkere Effekte. Vor allem der AKT-Inhibitor Perifosin könnte für Patienten mit schwerem PHTS als Therapieoption in Betracht gezogen werden.

PTEN ist als Phosphatase an zahlreichen Signalwegen, z.B. von Wachstumsfaktoren beteiligt. Mutationen im PTEN-Gen führen zur Entstehung vieler sporadischer Tumore sowie dem kongenitalen PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom (PHTS). Eine kausale Therapie für PHTS steht derzeit nicht zur Verfügung. Diese Arbeit beschreibt einen experimentellen Sirolimustherapieversuch bei einem Kind mit PHTS, welches sich unter anderem mit Thymushyperlasie, abdomineller Lipomatose und Kachexie präsentierte. Unter Behandlung zeigten sich eine Verbesserung des Allgemeinzustandes und des Größenwachstums des Patienten, sowie eine transiente Verkleinerung des Thymusvolumens. Die massive Lipomatose wurde im Wachstum gehemmt, nahm aber nicht an Volumen ab. Ein erneutes Thymuswachstum nach 19-monatiger Therapie ließ eine Resistenzentwicklung gegen Sirolimus vermuten. Bei Untersuchungen des PI3K/AKT/mTOR-Signalweges zeigten sich Hinweise für einen möglichen Resistenzmechanismus. Insulin-like growth factor binding protein 2, wird als Biomarker für den Therapieerfolg der Sirolimusbehandlung diskutiert. Dies erwies sich bei unserem Patienten allerdings nicht als geeignet zur Nutzenbewertung der Therapie. In vitro Studien an primären Zellkulturen aus Lipom-Gewebe des Patienten zeigten eine Hemmung von Proliferation und Differenzierung durch Sirolimus, jedoch keine Induktion der Apoptose. Inhibitoren von PI3K und AKT zeigten im Bezug auf Proliferationshemmung und Apotoseinduktion stärkere Effekte. Vor allem der AKT-Inhibitor Perifosin könnte für Patienten mit schwerem PHTS als Therapieoption in Betracht gezogen werden.:INHALTSVERZEICHNIS: 1 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2 BIBLIOGRAPHISCHE BESCHREIBUNG 3 VORBEMERKUNGEN 4 EINFÜHRUNG IN DIE THEMATIK 5 1. PTEN im biochemischen Kontext 5 2. Klinische Bedeutung von PTEN 6 3. Gezielte Therapie für PHTS – Beeinflussung der Signalwege 7 4. Der Patient M.W. als Ausgangspunkt der Arbeit 8 5. Gewinnung von Zellkulturen 10 6. IGFBP-2 als Marker für erfolgreiche Sirolimustherapie 10 7. Fragestellung 11 8. Ergebnisse und Ausblick 11 PUBLIKATIONSMANUSKRIPT 13 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 21 LITERATURVERZEICHNIS 25 ANLAGEN 28 I. Ergänzungsunterlagen zur wissenschaftlichen Publikation 28 Supplement 1 - Additional methodological descriptions 28 Supplement 2 - Video clip of 3D-MRI reconstruction 28 II. Charakterisierung der Lipom-Zellkulturen 29 II.a Lipom-Zellen in Langzeitkultur 29 II.b Veränderung im PI3K-Signalweg 30 III. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 32 IV. Danksagungen 33

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass die Serumkonzentration des insulinähnlichen Wachstumsfaktorbindungsproteins-2 (IGFBP-2) bei Krebserkrankungen, die mit dem Verlust des Tumorsuppressorgens PTEN einhergehen, erhöht ist und daher möglicherweise einen Marker für den PTEN-Status und die Aktivität des PI3K/AKT/mTOR-Signalweges darstellt. Schmid et al. haben 2014 einen Patienten mit PTEN-Hamartom-Tumor-Syndrom (PHTS) mit einer heterozygoten PTEN-Keimbahndeletion und massiver Lipomatose beschrieben, bei dem erhöhte IGFBP-2 Serumspiegel gemessen wurden. Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob PTEN-defiziente Lipomzellen des Patienten im Vergleich zu Kontrollfettzellen mehr IGFBP-2 produzieren, sowie den Einfluss verschiedener pharmakologischer Inhibitoren des AKT/PI3K/mTOR - und des MAPK- Signalwegs auf die IGFBP-2 Produktion zu untersuchen. In der PTEN-defizienten Lipomzellkultur, gewonnen aus reseziertem Lipomgewebe des Patienten, wurden vergleichbare Mengen an IGFBP-2 wie in den nicht PTEN-defizienten Kontrollzellen gefunden. Die pharmakologische Hemmung der PI3K und AKT bewirkten eine signifikante Senkung der IGFBP-2 Expression und Sekretion, wohingegen sich bei Hemmung der MEK und des mTORC1 keine Effekte zeigten. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass eine heterozygote PTEN-Deletion in Lipomzellen nicht zu einer erhöhten IGFBP-2 Produktion führt und daher die erhöhten Serumspiegel des Patienten nicht darauf zurückzuführen sind. Des Weiteren bestätigen die in vitro Ergebnisse die klinische Beobachtung, dass unter der Therapie mit dem mTORC1-Inhibitor Rapamycin die IGFBP-2 Serumspiegel des Patienten nicht zurückgingen. Möglicherweise stellt IGFBP-2 jedoch einen geeigneten Verlaufsmarker für eine Therapie mit PI3K- oder AKT-Inhibitoren dar.

O Glioblastoma Multiforme (GBM) é o tipo de tumor cerebral maligno com maior incidência na população. A perda do gene PTEN (fosfatase e tensina homóloga) é uma alteração comum associada ao GBM (até 60%) e esse gene codifica uma enzima que antagoniza a ação de PI3K, inibindo a fosforilação de AKT e, desse modo, regulando vias de sinalização relativas à sobrevivência celular e proliferação. Mutações em PTEN têm sido associadas à instabilidade genômica e ao aumento no número de quebras de fita dupla, além de serem relacionadas também à redução da expressão de RAD51, a qual é uma proteína-chave da via de reparo por recombinação homóloga (HR). Diante disso, o objetivo deste estudo foi avaliar se o status de PTEN interfere na expressão de RAD51 e proteínas parálogas (RAD51C e RAD51B) e, consequentemente, se PTEN é capaz de influenciar a eficiência de HR. Com o objetivo de induzir a formação de quebras de fita duplas (DSBs) no DNA, as células foram tratadas com a droga antitumoral etoposídeo, que produz quebras no DNA, principalmente duplas (DSBs). Duas linhagens de GBM com status diferentes de PTEN foram utilizadas: T98G (PTEN mutado) e LN18 (PTEN tipo selvagem). As células de GBM foram tratadas com etoposídeo em diferentes experimentos ou ensaios: proliferação celular, quantificação da necrose e apoptose, cinética do ciclo celular, imunofluorescência da proteína ?- H2AX, quantificação dos níveis de expressão de RAD51 e parálogas e o silenciamento de PTEN na linhagem LN18. Os resultados mostraram que a linhagem LN18 foi mais sensível à droga nos tempos iniciais (24 e 72 h) (até 61,2% de redução), em comparação com a T98G (até 12,3% de redução); no tempo mais tardio de análise (120 h), ambas as linhagens sofreram redução acentuadana proliferação. Adicionalmente, a LN18 exibiu maior porcentagem de células apoptóticas e necróticas, em comparação com a linhagem T98G, nos tempos de24, 72 e 120 horas após o tratamento. O ensaio de imunofluorescência revelou maior indução de células positivas para ?-H2AX na linhagem LN18 em relação à T98G (p =<0,001), após tratamento com etoposídeo (50 e 75 ?M). Nessas concentrações, a análise da cinética do ciclo celular mostrou um bloqueio na fase G2 em ambas as linhagens (p<0,01) nos tempos analisados (24, 48 e 72h), mas apenas a linhagem LN18 revelou bloqueio na fase S. A expressão de RAD51, RAD51B e C foi mais elevada em LN18 em comparação com a T98G e U87MG, nas células tratados (75?M) e controles. PTEN foi silenciado (siRNA-PTEN) na linhagem LN18 para verificar se a redução da expressão desse gene reduziria também a expressão de RAD51 e parálogas. Após 72 horas de silenciamento, com 69,9% de inibição de PTEN, a expressão de RAD51 e RAD51C também se mostrou reduzida em relação ao grupo controle. Em conjunto, os resultados obtidos no presente estudo indicam que o status de PTEN é crucial para as vias de sobrevivência, controle do ciclo celular e indução de apoptose nas células de GBM, indicando a relação entre PTEN e RAD51 e parálogas nas células de GBM tratadas com um indutor de quebras no DNA. Adicionalmente, outras ferramentas de estudo são requeridas para investigar as vias moleculares e possíveis interações e complexos proteicos envolvendo a participação de PTEN e RAD51 e suas proteínas parálogas / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant brain tumor. Loss of PTEN (Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10) gene is the most frequent alteration associated with GBM and encodes a phosphatase enzyme that antagonizes the PI3K, by inhibiting AKT phosphorylation thereby regulating signaling pathways related to cell survival and proliferation. PTEN deficiency has been associated with genomic instability and increased endogenous DSBs, as well as reduced expression of RAD51, which is a key gene with crucial role in HR. In this study, we aimed to evaluate whether the PTEN status in GBM cell lines can affect RAD51 expression and HR efficiency under conditions of treatment with the antineoplastic drug etoposide, which targets the DNA topoisomerase II enzyme, thus leading to the production of DNA breaks. T98G (PTEN mutated) and LN18 (PTEN wild-type) cells were treated with etoposide, and several assays were carried out: cell proliferation, detection and quantification of necrosis and apoptosis, cell cycle kinetics, immunofluorescence staining, RAD51 (and paralogs) protein expression, and PTEN silencing in LN18 cell line, by using the siRNA method. LN18 cells showed a greater reduction in cell proliferation, compared to T98G after treatments (25, 50, 75 e 100 µM) at 24, 72 and 120h. Both cell lines showed a significant increase (p=<0.001) in cell death induction, but LN18 presented a greater percentage of apoptotic and necrotic cells than T98G (24, 72 and 120h). The induction of DSB was analyzed by immunostaining (with ?-H2AX antibody), and for the concentrations (50 and 75 µM) tested, LN18 showed higher levels of ?-H2AX positive cells than that observed for T98G (p=<0.001). The analysis of cell cycle kinetics performed for cells treated with etoposide (50 and 75 µM) and collected at 24, 48 and 72h, LN18 presented a greater G2-blockage, as compared to T98G; only LN18 showed a blockage at the S-phase. The expression of RAD51, RAD51B and C was higher in LN18 compared to T98G and U87MG cells treated with etoposide (75 µM) and controls. When we silenced PTEN in LN18 linage, to check if PTEN silencing may reduce the expression of RAD51 and its paralogs, we found a 69.9% reduction in PTEN protein expressions, and the expression of RAD51 and RAD51C was also found reduced, compared to the control group. Taken together, the results obtained in this study indicate that the status of PTEN is critical for survival pathways, cell cycle control and induction of apoptosis in GBM cells, confirming the relationship between PTEN and RAD51 and its paralogs in GBM cells treated with an inducer of DNA breaks. These results contribute with relevant information for further studies on molecular pathways underlying the interaction between PTEN and RAD51 and its paralogs

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

PTEN é um gene supressor de tumor, que resulta na proteína citoplasmática de mesmo nome, e possui a capacidade de modular a apoptose e o ciclo celular, assim como de inibir a migração celular. Por outro lado, o oncogene Akt promove a sobrevida celular e impede a apoptose. A ativação de Akt é inversamente relacionada com a ausência de PTEN em uma variedade de neoplasias malignas. Neste estudo, linhagens celulares derivadas de carcinoma epidermóide bucal (HN6, HN30, HN31 e uma linhagem de células controle, HaCat) foram submetidas ao método de invasão in vitro e clones celulares altamente invasivos foram isolados. Através das técnicas de imunofluorescência e Western blot foi verificada a expressão de ambas as proteínas nos novos clones (denominados HN6.1, HN30.1, HN31.1 e HaCat.1) e comparada às linhagens controle. A técnica da zimografia também foi realizada, desde que várias metaloproteinases (MMPs) têm demonstrado possuir papel importante no processo de invasão e metástase dos CEB. Nossos resultados revelaram que todas as linhagens celulares e seus respectivos clones invasivos mostraram marcação citoplasmática e nuclear para PTEN e pAkt, respectivamente. A exceção foi a HaCat.1 que apresentou marcação predominantemente citoplasmática para pAkt. A análise do Western blot revelou que os clones invasivos expressam menor quantidade de PTEN, não significantes estatisticamente. Essa diminuição foi expressiva somente na linhagem HaCat.1 (p<0.05). Em relação ao pAkt, foi observado uma discreta superexpressão dessa proteína nas linhagens invasivas de CEB. Contrariamente, a linhagem HaCat.1 sofreu uma significante diminuição de pAkt (p<0,05). Finalmente, a zimografia mostrou um discreto aumento de MMP-2 latente e/ou um significante aumento de MMP-9 ativa em todos os clo nes invasivos. Nossos resultados sugerem que não há uma relação inversa consistente e significativa entre as proteínas PTEN e Akt no processo de invasão in vitro com células derivadas de CEB. Não há somente um padrão de sinalização PTEN-PI3K-Akt no processo de carcinogênese desta neoplasia. A linhagem celular HaCat.1 se comportou diferente das linhagens derivadas de CEB e provavelmente sofreu diferenciação. Um aumento estatisticamente significante de secreção de MMP-9 ativa foi observado em 2 das 3 linhagens de CEB estudadas / PTEN is a tumor suppressor gene that encodes a dual phosphates protein capable to modulate apoptosis and cell cycle and prevent cellular migration. On the other hand, Akt oncogene promotes both cell cycle progression and inhibits apoptosis. Akt activation is inversely correlated with PTEN lost in a variety of cancers. In this study, highly invasive clones of OSCC cell lines (HN6, HN30, HN31 and a control cell line, HaCat) were isolated using an in vitro assay method. The expression of both proteins in these cells was compared by immunofluorescence and western blot technique. The metalloproteinase activation was analyzed by gelatin zimography, since several MMPs have been shown to play an important role in the invasion and metastasis of OSCC. All OSCC cell lines and its new clones showed cytoplasmatic and nuclear staining for PTEN and pAkt, respectively. The western blot analysis revealed no significant decrease of PTEN expression in the most invasive clones (named HN6.1, HN30.1 and HN31.1). Only HaCat.1 had a significant decrease (p<0,05). However, there was no significant increase of Akt in the invasiveness clones and oppositely the expression of Akt was strongly reduced (p<0,05) in the HaCat.1. Finally, the zimography showed a discrete increase of inactive MMP-2 and/or a significant increase of active MMP-9 in all the most invasive cell lines. In conclusion, no correlation was seen between PTEN and pAkt in the process of invasion in vitro. There is not only a linear PTEN-PI3K-Akt pathway in OSCC. The HaCat.1 had a different behavior in relation to OSCC cell lines and probably allowed cellular differentiation. In addition, a significant increase of active MMP-9 was seen in 2 of 3 lines of cells derived from OSCC