Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La depresión es un trastorno del estado anímico, que se manifiesta con pérdida de interés o del placer por vivir, sentimientos de culpa o baja autoestima, alteraciones del sueño, del apetito y baja capacidad de concentración atribuidas fundamentalmente a una disminución en la neurotransmisión monoaminérgica. La presente tesis informa los ensayos obtenidos por un estudio teórico de docking, síntesis y evaluación farmacológica de dos nuevas familias las 1-Benzo[b]tiofen-2-il-3-[4- (benzo[b]tiofen-2-carbonil)-piperazin-1-il]-1-propanonas 1(a, b) y la familia 2 (a-c) correspondiente a una serie de tres (4-{3-[4-(Benzo [b] tiofén-2-carbonil)-piperazin-1-il]- propil}-piperazin-1-il)-benzo [b] tiofén-2-il-metanonas diseñadas como potenciales agentes serotoninérgicos. Las estrategias sintéticas utilizadas para la formación de la familia 1(a, b) involucran la reacción de adición de Michael de la Benzo[b]tiofén-carbonil-piperazina 20 sobre las Benzo[b]tiofén-2-il-propenonas 10 y 15 realizada con microondas obteniéndose con rendimientos de 64-75 % respectivamente. La obtención de la familia 2 (a-c) se llevó a cabo por reacción de las Benzo[b]tiofén-carbonil-piperazinas 20 y 25 con 1-Bromo-3-cloropropano generándose los correspondientes dímeros 2 (a-c), con rendimientos de 77%, 78% y 90% respectivamente. Los estudios teóricos de docking fueron realizados con los programas de modelamiento molecular Spartan 2 y para simulación de afinidad receptorial 5-HT1A se utilizó el programa Autodock 4, entregando una buena afinidad al receptor mencionado. Los ensayos farmacológicos comprendieron estudios de competencia de los compuestos sintetizados frente al ligando tritiado 8-Hidroxi-dipropilamino tetralina (8-OHDPAT), ligando de reconocida afinidad por el receptor estudiado Los compuestos sintetizados exhibieron un incremento de la unión del ligando marcado 8-OH-DPAT lo cual puede ser producido por una probable interacción cooperativa de tipo positiva / Depression is a common mental disorder consisting in depressed mood, with lack of interest and pleasure for living, with guiltiness feelings, sleeping, appetite disorders, and low capacity to keep concentrated in an activity, mainly attributed to a diminished monoaminergic neurotransmission. In this thesis, a theoretical, synthetic and pharmacological study of new series of 1- Benzo[b]thiophen-2-yl-3-[4-(benzo[b]thiophen-2-carbonyl)- piperazin-1-yl]-1-propanones (Family 1), and (4-{3-[4-(Benzo [b] thiophen-2-carbonyl)-piperazin-1-yl]-propyl}-piperazin- 1-yl)-benzo [b] thiophen-2-yl-methanones (Family 2) as potencial serotonergic agents is described. The synthetic strategy for the preparation of family 1(a, b) involved Michael addition reactions between Benzo[b]thiophen-carbonyl-piperazines 20 and Benzo[b]thiophen-2-yl-propenones 10, 15, supported by microwave irradiation under free solvent conditions, yielding 64%-75% respectively. The preparation of family 2(a-c) was carried out by reaction between the Benzo[b]thiophen-carbonyl-piperazines 20 and 25 with 1-Bromo-3-cloropropane to afford the corresponding dimers 2 (a-c) in 77%, 78% y 90% yield respectively. Molecular modelling and docking studies of the proposed molecules and the 5- HT1A receptor were carried out by using Spartan 2 and AUTODOCK 4.0. Pharmacologic assays encompassed binding affinities of the ligands with 5-HT1A receptor using 8-OH-DPAT as standard radioligand. The ligands showed an increased affinity of the 8-OH-DPAT for the receptor, these results may be considered as a positive cooperation phenomena, which may arise by an allosteric modulation. Further studies will be carried out in advance

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En los últimos años se ha descrito y dado énfasis al rol determinante que tiene el fibroblasto cardiaco (FC) en el proceso inflamatorio, dónde cumple un rol clave a fin de mantener la homeostasis del órgano. En los procesos inflamatorios y en cualquier episodio de daño, los neutrófilos son la primera línea de defensa del organismo, los cuales son atraídos al sitio de daño por la quimioquina, interleuquina 8 (IL-8), quien además, provoca su activación. Posteriormente, el reclutamiento de neutrófilos en los sitios de daño es dependiente de las proteínas de adhesión E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1. Por lo tanto, controlar la expresión de estas proteínas constituye un nuevo enfoque terapéutico en el tratamiento de los procesos inflamatorios. En ese sentido, el interferón beta (IFN-β), ha demostrado moderar la respuesta inflamatoria; pero hasta la fecha no se ha demostrado su utilidad como agente antiinflamatorio en el corazón y específicamente en el FC. Debido a estos antecedentes, el objetivo general fue estudiar el efecto preventivo del IFN-β sobre la expresión de IL-8, ICAM-1 y VCAM-1 bajo un contexto inflamatorio, inducido por estímulo con LPS. Consecuente con este hallazgo, se observó que el IFN-β disminuye la adhesión de neutrófilos sobre FC inducida por LPS. De esta manera, se demostró que el tratamiento con IFN-β puede modular la cascada inflamatoria, y así, transformarse en una potencial y valiosa herramienta terapéutica capaz de controlar la expresión de estas proteínas de vital importancia partícipes del proceso inflamatorio luego de algún evento de injuria cardiaca como lo puede ser una miocarditis, o bien, un infarto al miocardio / In recent years it is described the determining role that cardiac fibroblast (CF) has in the inflammatory process, where plays a major role to maintain homeostasis. In inflammatory process and any event of damage, neutrophils are the first line of defense, which are attracted to the site of damage through interleukin 8 (IL-8), who initially causes activation. Subsequently, neutrophil recruitment at sites of damage depends on Eselectin, ICAM-1 and VCAM-1 adhesion proteins. Therefore, controlling the expression of these proteins is a new therapeutic approach in the treatment of inflammatory process. In this sense, interferon beta (IFN-β) has shown be a inflammatory moderator; but to date it has not been proved useful as an anti-inflammatory agent in the heart, specifically on CF. On the basis of this background, the overall objective was to study the preventive effect of IFN-β on the expression of IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 on CF under an inflammatory stimuli with LPS and evaluate neutrophil adhesion to CF. The results showed that IFN-β prevents the increased expression on IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 induced by LPS. Consistent with this finding, we observed that IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 decreases the neutrophil adhesion induced also by LPS on CF. Thus, it was shown that IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 can modulate the inflammatory cascade, and thus become a potentially valuable therapeutic tool able to manage these important participants proteins of the inflammatory process after an event of cardiac injury as can be a myocarditis, or myocardial infarction

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El alcoholismo es un problema mundial de salud pública, por lo que es importante comprender sus bases neuro-farmacológicas para identificar nuevos blancos terapéuticos. Uno de los problemas del alcoholismo es la recaída, que corresponde a la pérdida de control sobre el consumo de alcohol cuando el paciente vuelve a beber después de un período de abstinencia. Estudios en modelos animales de alcoholismo han asociado un mayor valor placentero del alcohol al momento de la recaída. Este incremento del valor hedonístico del alcohol podría estar asociado a un mayor nivel del receptor (mu) μ-opioide (OPMR) en el circuito cerebral de recompensa. Para determinar el rol del OPMR en la recaída al consumo de alcohol, en este trabajo se presentan estudios destinados a evaluar la capacidad inhibitoria de distintas secuencias de RNAs de interferencia tipo horquilla (shRNAs) dirigidas a disminuir la expresión de OPMR in vitro, para ser utilizadas posteriormente en futuros estudios en modelos in vivo. Para ello se clonó el gen del receptor μ-opioide de rata (OPMRr) en el plásmido de expresión pHIV-GFP, generando pHIV-OPMRr-GFP. Se transfectaron células HEK-293T, que naturalmente no expresan OPMRr, con pHIV-OPMRr-GFP y se verificó la expresión de OPMRr mediante Western blot. Para lograr el silenciamiento de la expresión OPMRr se co-transfectó pHIV-OPMRr-GFP con cuatro secuencias distintas (A, B, C y D) de shRNAs dirigidos al RNA mensajero del OPMRr. Las secuencias A y D otorgaron el mayor grado de silenciamiento, inhibiendo en un 73% y 75% respectivamente la expresión de OPMRr. Se generaron lentivirus codificantes de los shRNAs más potentes en reducir su expresión para posteriores ensayos in vivo. En conclusión, mediante el uso de técnicas de biología molecular se clonó y expresó el gen del OPMRr en células en cultivo. Además, se identificaron 2 secuencias de shRNAs capaces de silenciar en más de un 70% la expresión del cDNA codificante para OPMRr y se generaron sus correspondientes lentivirus / Alcoholism is a worldwide public health problem. Therefore, it is important to understand its neuropharmacological bases to identify new therapeutic targets. One of the main problems of alcoholism is relapse, which is the loss of control over ethanol consumption when the patients start to drink again after a period of abstinence. Studies carried out on animal models of alcoholism have established an enhanced pleasurable value of ethanol consumption at the time of relapse. This alcohol enhanced hedonistic value could be associated to an increase in the μ-opioid receptor (OPMR) levels on the brain reward circuit. To determine the role of OPMR on ethanol consumption relapse, the ability of different short hairpin RNAs (shRNAs) to decrease OPMR expression in vitro was assessed. The best shRNAs are intended to be used in future in vivo studies. First, the rat μ-opioid receptor (OPMRr) gene was cloned into the expression plasmid pHIV-GFP, generating the pHIV-OPMRr-GFP plasmid. HEK-293T cells, which naturally do not express OPMRr, were transfected with pHIV-OPMRr-GFP and the OPMRr expression was determined by Western blot. To assess the silencing of the OPMRr in vitro, the pHIV-OPMRr-GFP plasmid was co-transfected with 4 shRNAs sequences (A, B, C y D) designed against the OPMRr messenger RNA. shRNAs A and D exhibit the highest silencing ability, inhibiting OPMRr expression by 73% and 75% respectively. For future in vivo assays, lentiviral vectors codifying for these shRNAs were generated. In conclusion, using molecular biology techniques it was possible to clone and express the gene of the OPMRr in HEK-293T cells. Two shRNAs sequences that inhibit the OPMRr cDNA expression over a 70% were identified and lentiviral vectors that codify for these shRNAs were generated / FONDECYT 11130241

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / La curcumina es un compuesto fenólico con una potente actividad biológica. Entre éstas destacan sus propiedades antioxidantes, anticancerígenas y antiinflamatorias. Esta molécula presenta además una muy baja toxicidad y buenas propiedades organolépticas. Sin embargo, todas estas propiedades se ven afectadas por inconvenientes que limitan su uso en medicina, como son su muy baja solubilidad y su baja estabilidad. Estas características de la curcumina hacen que sea muy dificultoso desarrollar una forma farmacéutica apropiada para su uso terapéutico. El objetivo de este trabajo fue incorporar a la curcumina dentro de nanovehículos como nanoemulsiones y nanocápsulas, formuladas con distintos polímeros, para luego estudiar su velocidad de degradación frente a la radiación ultravioleta (UV) y al radical hidroxilo (·OH). Para realizar lo anterior se desarrollaron protocolos de fabricación de distintos nanovehículos conteniendo curcumina. Estos fueron caracterizados en función de su tamaño, potencial zeta, índice de polidispersión, eficiencia de encapsulación y rendimiento. Además, se optimizó una metodología analítica, por espectrofotometría UV-visible, que permitió cuantificar la curcumina presente en los nanovehículos. Finalmente se realizó un estudio de degradación de la curcumina en los distintos nanovehículos, siendo sometidos a radiación UV y agentes oxidantes. Se compararon las pendientes de degradación de la curcumina en los nanosistemas, determinando cual es la formulación que presenta una mayor protección del principio activo. Los resultados mostraron que la curcumina, cuando está incluida en nanovehículos de núcleo oleoso, presenta una menor degradación frente a estímulos lumínicos y oxidativos. Además, se demostró que la incorporación de una cubierta polimérica en los nanosistemas (nanocápsulas) aumenta la protección del principio activo, llegando a tener una degradación por radiación UV siete veces menor que cuando está libre en una solución, y en el caso de la oxidación su degradación es cuatro veces más lenta cuando está encapsulada. Además, se obtuvieron formulaciones con porcentajes de encapsulación de 100% y eficiencias de asociación de la curcumina sobre el 80% / Curcumin is a phenolic compound with potent biological activity, among which its antioxidant, anticancer and anti-inflammatory properties stand out. It also show very low toxicity and good organoleptic properties. However, all these properties are affected by some drawbacks, such as their very low solubility and low stability. These characteristics of curcumin make it very difficult to develop a pharmaceutical dosage form suitable for therapeutic use. The aim of this work was to incorporate curcumin into nanovehicles such as nanoemulsions and nanocapsules, formulated with different polymers, and then to study its rate of degradation against ultraviolet (UV) radiation and the hydroxyl radical. To carry out the above, protocols for the manufacture of different nanovehicles containing curcumin were developed, these were characterized according to their size, zeta potential, polydispersity index, encapsulation efficiency and yield. In addition, an analytical methodology was optimized by UV-visible spectrophotometry, which allowed the quantification of curcumin present in nanovehicles. Finally, a study of degradation of curcumin was carried out in the different nanovehicles, being subjected to UV radiation and oxidizing agents. The slopes of degradation of curcumin were compared in the nanosystems, determining which is the formulation that presents a larger protection of the active. The results showed that curcumin, when included in nanovehicles of oily nucleus, show a lower degradation against light and oxidative stimuli. In addition, the incorporation of a polymer coating on these nanosystems (nanocapsules) increases the protection of the active, resulting in a seven times lower degradation by UV radiation when compared with free in a solution, and in the case of oxidation, the degradation is four times slower when it is encapsulated. In addition, formulations with 100% percentage of encapsulation and association efficiencies over 80% were obtained

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Previamente hemos demostrado que el sistema Cu2+/ascorbato puede inhibir la actividad enzimática de algunas proteínas tiólicas a través de dos mecanismos: oxidación inducida por ROS y unión inespecífica de Cu2+ a dichas proteínas. Así por ejemplo, la actividad GSH-transferásica citosólica total fue inhibida por Cu2+ 50 μM ya sea en ausencia o presencia de ascorbato. Al igual que el cobre, el hierro es un metal de transición y sus iones generan ROS a través de las reacciones de Haber Wiess y/o Fenton. Por lo tanto, los iones Fe3+ podrían por un lado oxidar grupos tiólicos de proteínas como también unirse a ellos inespecíficamente, inhibiendo así su actividad biológica. En este trabajo describimos la inhibición de la actividad GSH-transferásica total citosólica de hígado de rata inducida por Fe3+/ascorbato. Esta actividad enzimática fue inhibida por concentraciones micromolares de Fe3+ en presencia de ascorbato, efecto que fue revertido por DTT y cisteína de una forma concentración-respuesta. Este efecto inhibitorio se describe en función de los parámetros cinéticos aparentes de la GST-transferasa. Por otra parte, Fe3+/ascorbato redujo el contenido de tioles microsómicos. Sin embargo, concentraciones micromolares de Fe3+ en ausencia de ascorbato, no alteraron la actividad control de la GSH-transferásica, a pesar de que se ensayaron concentraciones hasta 500 μM. Cabe señalar además, que en nuestras condiciones de ensayo, la capacidad redox de los iones Fe3+ fue menor que la de Cu2+, ya que se necesitaron mayores concentraciones de estos iones para obtener efectos lipoperoxidativos microsómicos similares (Fe3+ 250 μM vs Cu2+ 250 ηM). Los mecanismos que pueden explicar las diferencias observadas entre los iones cobre e hierro, se discuten al final de este manuscrito / We previously reported that Cu2+/ascorbate may change some enzymatic activities of thiol proteins through two mechanisms: ROS-induced oxidation and unspecific Cu2+ binding to it. Thus, total cytosolic GST activity was inhibited by 50 or more μM Cu2+ concentrations in either absence or presence of ascorbate. Similar to copper, iron is also a transition metal and the iron ions also generate ROS through Haber Weiss and/or Fenton reactions. Thus, iron ions may alter the biological activity of thiol proteins through ROS-induced oxidation and also by Fe3+-binding to protein’s thiol groups. The present work describes the inhibition of total cytosolic GST activity from rat liver by Fe3+/ascorbate. Micromolar Fe3+ in the presence of ascorbate inhibited the total cytosolic GST activity, inhibition which was prevented by DTT and cysteine as a concentrationdependent manner. We further described this inhibition effect in terms of GST apparent kinetic parameters. In the similar assay conditions Fe3+/ascorbate reduced the microsomal thiol content. Interestingly, μM Fe3+ in the absence of ascorbate did not affect GST activity, although until 500 μM Fe3+ was used. Moreover, to develop similar microsomal lipoperoxidative effects, a greater iron ions concentration (250 μM Fe3+/ascorbate) than of copper (250 ηM Cu2+/ascorbate) was needed. Finally, we discuss the mechanisms which could explain the differences between copper and iron ions observed

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El metabolismo proteico es altamente regulado. Los eucariontes poseen diferentes sistemas degradativos como lisosomas y el sistema ubiquitina/proteosoma. Este último, responsable de la degradación de más del 80% de las proteínas intracelulares, regula una amplia gama de procesos intracelulares. Alteraciones en este sistema han sido observadas en enfermedades neurodegenerativas, detectándose acumulación de agregados de proteínas poliubiquitinadas. Las células evitan la acumulación de estos agregados mediante su degradación por el proteosoma y autofagia. Sin embargo, una vez formados, estos cuerpos son refractarios a la proteólisis y se acumulan en agresomas (cuerpos de inclusión asociados a microtúbulos). Recientemente, amplios depósitos proteicos se han detectado en enfermedades cardiacas, aún cuando el papel del sistema ubiquitina/proteosoma no ha sido dilucidado. El objetivo de esta memoria fue investigar qué efecto producen diferentes condiciones de estrés celular, asociados a procesos de isquemia cardiaca como privación de glucosa, estrés hiperosmótico mediado por sorbitol, privación de aminoácidos y suero, sobre el sistema ubiquitina/proteosoma en cardiomiocitos. Estudios de inmunofluorescencia mostraron la formación de agregados proteicos poliubiquitinados, distribuidos ampliamente en el citoplasma, y después de 18 h post tratamiento se observaron grandes agregados proteicos, concentrados en estructuras tipo agresomas, orientados a un lado de la zona perinuclear. La aparición de estas estructuras no se debió a un incremento en el nivel de las proteínas poliubiquitinadas (excepto en células privadas de glucosa) o a una alteración del sistema enzimático de conjugación de ubiquitina o inhibición del proteosoma. La desorganización de los microtúbulos con Vinblastina y colocalización con Hsp70 confirmó que estas estructuras correspondían a agresomas. Además, los agresomas colocalizaron con Rab24, una GTPasa pequeña implicada en autofagia, y con la proteína LC3-GFP, confirmando una estrecha relación entre agresomas y la autofagia. Resultados similares se encontraron al utilizar inhibidores del proteosoma. Finalmente, la inducción de la autofagia con rapamicina facilitó la remoción de los agresomas. En conclusión, condiciones de estrés celular inducen la formación de agresomas en cardiomiocitos. La formación de agresomas no es dependiente de la inhibición del proteosoma o a una alteración en el sistema enzimático de conjugación de la ubiquitina y la inducción de la autofagia facilitó su remoción / Protein metabolism is highly regulated. Eukaryotic cells have two main degradative systems: lysosomes and ubiquitin-proteasome system (UPS). UPS is responsible over 80% intracellular protein degradation and regulates many cellular processes. Alterations in this system has been reported in neurodegeneratives disorders in which polyubiquitin protein aggregates were detected. Cells can avoid protein aggregate accumulation by degradation through UPS or autophagy. Nevertheless, once aggregate accumulates, they are refractory to proteolytic degradation and then tend to accumulate in aggresomes (microtubules-associated inclusion bodies). These protein deposits have been recently detected in cardiovascular diseases, although the precisely role of UPS remains unclear. The aim of this work was to determine the effects of several cardiac ischemiarelated stress conditions such us glucose deprivation, hyperosmotic stress mediated by sorbitol, starvation and serum deprivation on the UPS in cultured neonatal rat cardiomyocytes. Poly-ubiquitin protein immunofluorescence detection showed that the four treatments induced the deposit of polyubiquitin-protein aggregates widely distributed in the cytoplasm. After 18 h post treatment, highly concentrated polyubiquitin-protein deposits in aggresome-like structures in the perinuclear zone were detected. The formation of these structures was independent to the level of polyubiquitin-protein increase (except in glucose deprivated cells) or changes in enzymatic ubiquitinconjugating system or proteasome activity inhibition. Vinblastine-dependent microtubules disruption and colocalization with Hsp70 confirmed that these structures were aggresomes. Moreover, we observed aggresome colocalization with Rab24, a small GTPase implicated in autophagy and GFP-LC3. This last result suggest a link between aggresomes and autophagy. Similar results were observed in proteasome inhibited cells. Autophagy induction with rapamycin facilitated aggresome remotion. In summary, stress conditions induce aggresome formation in primary cultures of cardiac myocytes, being this process independent of proteasome inhibition or alteration in ubiquitin-conjugating system. Autophagy induction facilitated aggresome remotion in these cells

No description available.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En el corazón, los fibroblastos, las células más abundantes, tienen funciones estructurales, actúan como sensores de los cambios del entorno, reaccionan frente a estímulos externos secretando factores de crecimiento, tienen una alta capacidad proliferativa y de secreción de proteínas de matriz extracelular. El retículo endoplasmático (RE) es el responsable de la síntesis y correcto plegamiento de las proteínas, pero cuando por diferentes estímulos se ve alterado el correcto proceso de plegamiento se produce lo que se conoce como estrés de retículo endoplasmático. La acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE contribuye al desarrollo de un gran número de enfermedades neurodegenerativas, inmunes, endocrinas y cardiovasculares. En el RE existe toda una maquinaría traduccional que mantiene un correcto flujo de la información para el correcto plegamiento proteico, entre las que destacan los sensores de estrés de RE como PERK, IRE, ATF6, las chaperonas BiP y PDI y la proteína CHOP que funciona como un inductor de apoptosis. Este es el primer estudio que considera evaluar el efecto del estrés de RE sobre la viabilidad celular y la secreción de proteínas de la MEC en fibroblastos cardiacos de ratas neonatas y para ello utilizamos Tunicamicina (Tn), un antibiótico que induce estrés de RE. Nuestros resultados mostraron que los fibroblastos cardiacos presentan una alta sensibilidad a la apoptosis inducida por Tn, junto con un cambio en la expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Además de lo anterior, nuestros resultados mostraron que el pre-tratamiento con TGFβ1 (un agente pro-fibrótico de marcada acción sobre fibroblastos cardiacos) fue capaz de prevenir la muerte por apoptosis inducida por Tn en los fibroblastos cardiacos, a través de un mecanismo de adaptación al estrés de RE, modificando los niveles de expresión de las proteínas marcadoras de estrés de RE. Sin embargo, TGFβ1 no fue capaz de revertir la disminución en la secreción de colágeno inducida por efecto de Tn. En conclusión, TGFβ1 protege de la apoptosis inducida por Tn, abriendo perspectivas como un mecanismo de prevención de patologías en las que participa el estrés de RE / In the heart, fibroblasts, the cells more abundant, have structural features, act as sensors of the changing environment, react to external stimuli secreting growth factors, have a high proliferative capacity and secretion of extracellular matrix proteins. The endoplasmic reticulum (ER) is responsible for the synthesis and proper folding of proteins, but when a stimulus alters the proper folding process occurs endoplasmic reticulum stress. The accumulation of bad folded proteins into the ER lumen contributes to the development of a large number of neurodegenerative diseases, immune, endocrine and cardiovascular disorders. In ER there is a whole translational machinery that maintains the proper flow of information to the proper protein folding, including ER stress sensors as PERK, IRE1α, ATF6, proteins like BiP and PDI and the protein CHOP that works as an inducer of apoptosis. This is the first study that considers assess the effect of ER stress on the feasibility of cell and secretion of the MEC proteins in neonate rat cardiac fibroblasts and for that we use Tunicamicina (Tn), an antibiotic that induces stress of ER. Our results showed that cardiac fibroblasts have a high sensitivity to apoptosis induced by Tn, along with a change in the expression of the protein marker of stress ER. In addition, our results showed that pre-treatment with TGF β1 (an agent with marked pro-fibrotic action on cardiac fibroblasts) was able to prevent death by apoptosis induced by Tn in cardiac fibroblasts, through a mechanism of adaptation to ER stress, by changing levels of expression of the protein marker of stress RE. However, TGF β1 was not able to reverse the decline in the secretion of collagen induced by effect of Tn. In conclusion, TGF-β1 protects apoptosis induced Tn, opening prospects as a mechanism for the prevention of diseases in which participates ER stress

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En esta Memoria se desarrolló una metodología por HPLC, para ser empleada en el estudio de estabilidad hidrolítica del fármaco hipocolesterolémico pravastatina. Las condiciones óptimas fueron alcanzadas luego de llevar a cabo el ensayo de aptitud del sistema (system suitability test, USP XXVII), y consistieron en una fase móvil isocrática: acetonitrilo/tampón fosfato 30 mM, pH 2.0 (28/72), flujo 1 mL/min a 40 ºC. Las condiciones óptimas se seleccionaron en base a la combinación adecuada entre los valores de resolución (R), factor de capacidad (k’), selectividad (α),tiempos de retención de cada señal y el tiempo de corrida del cromatograma. En estas condiciones pravastatina exhibió un tiempo de retención (tr) promedio de 8.95 min (n=10), R= 2.1, k’= 5.5 y =1.16. La metodología exhibió características analíticas de repetibilidad (CV=0.11 %) y reproducibilidad (CV=0.49 %) adecuadas para ser empleada en estudios de estabilidad. Para la cuantificación se empleó el método de la curva de calibración, que estuvo descrita por la ecuación: ABC = 2.74×1010 [c] + 72267 (r= 0.99992; n= 7). Los límites de detección y cuantificación calculados fueron 3.4×10-7 M y 3.7×10-6 M, respectivamente. El estudio de estabilidad se realizó a cuatro concentraciones iniciales, tres temperaturas y cinco pH en tampón fosfato 30 mM, con el fin de lograr interpretar la influencia de estas variables sobre la velocidad de degradación de pravastatina. En todas las condiciones de pH y temperatura ensayadas se obtuvo una cinética mixta, en las cuales se ajustó a una cinética de seudo primer orden hasta aproximadamente el 50 % de degradación del fármaco. Para evaluar la influencia del pH en la degradación, se ensayaron los pH 3, 5, 7, 9 y 12. A pH < 7 los cromatogramas presentan cinco nuevas señales correspondientes a los productos de degradación, a tr de 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min y 19.47 min. A pH > 7 sólo se observa la aparición de una nueva señal, a tr de 1.90 min. En todos los casos estudiados, las nuevas señales presentan un espectro UV análogo al de pravastatina, lo cual indica que la hidrólisis no afecta la estructura cromófora del fármaco. Con el objeto de evaluar la influencia de la temperatura sobre la degradación de pravastatina, se llevaron a cabo experimentos a 40, 60 y 80 ºC, obteniéndose que la constante de velocidad de degradación (k) aumenta en forma concomitante con el incremento de la temperatura. Además se reportan los valores de energías de activación, vidas medias y t90 calculadas para la degradación de pravastatina. Adicionalmente se estudió la reactividad de pravastatina frente a radicales libres y peroxinitrito, como modelos predictivos de su estabilidad oxidativa tanto en preformulaciones como in vivo. Se empleó como técnica analítica la espectrofotometría UV-Visible y como generadores de radicales alquilo ABAP+ N2, radicales alquilperoxilo ABAP + O2, y ABTS (radicales ABTS+). Para evaluar la reactividad frente a peroxinitrito se empleó SIN-1. La reactividad frente a ABAP y SIN-1 se llevó a cabo siguiendo la señal del fármaco a 240 nm, empleando el método de la curva de calibración (A = 2.04×10-8 [c] + 4.55×10-9). Para ABTS+ se siguió el decaimiento de su señal a 734 nm. Pravastatina (40 M a 100 M) fue reactiva frente a todos los compuestos ensayados, encontrándose que el orden de reactividad fue: peroxilo (k=1.13×10-2 min-1)  alquilo (k=7.07×10-3 min-1) > peroxinitrito (k=2.68×10-3 min-1)  ABTS.+ (k=1.20×10-3 min-1). Además, se informa la reactividad de estos compuestos frente otros análogos estructurales de la pravastatina: los profármacos lovastatina y simvastatina, y sus análogos de cadena abierta obtenidos experimentalmente por hidrólisis alcalina exhaustiva. / In this Thesis a methodology by high HPLC was developed, with aim to be used in the stability study in front of hydrolysis of the hypocholesterolemic drug pravastatin. The optimal conditions were reached after carried out the system suitability test according to USP XXVII, which consisted of an isocratic mobile phase of 30 mM acetonitrile/phosphate buffer, pH 2.0 (28/72), flow rate of 1 mL/min at 40 ºC. The optimal conditions were selected on the basis of the combination between the values of resolution (R), capacity factor (k'), selectivity (α), the retention times of each signal and the run time of the chromatogram. In these conditions pravastatin exhibited a retention time (Rt) average of 8.955 min (n =10), R = 2.1, k' = 5.5 and α = 1.16. The methodology exhibited analytical characteristics of repeatability (CV=0.11 %) and reproducibility (CV=0.49%) adequate to be used in stability studies. For the quantification the calibration curve method was used, and was described by the equation: ABC=2.74×1010 [c] + 72267 (r =0.99992; n=7). The detection and quantification limits were 3.4×10-7 M and 3.7×10-6 M, respectively. The stability study were carried out at four initial concentrations, three temperatures and five pH in 30 mM phosphate buffer, with the aim of evaluate the influence of these variables on the pravastatin degradation. In all the tested conditions of pH and temperature a mixed kinetic was obtained, in which it adjusted to a pseudo-first order kinetic until approximately 50% of degradation of the drug. In order to evaluate the effect of pH on the degradation, pH 3, 5, 7, 9 and 12 were assayed. At pH<7, five new signals corresponding to degradation products appears in the chromatograms, with Rt of 10.21 min; 11.83 min; 15.91 min; 17.60 min and 19.47 min. At pH>7 only a new signal in the chromatograms was observed, at the same Rt of 1.90 min. In all the studied cases, the new signals display an UV spectrum similar to that of pravastatin, which indicates that the hydrolysis process does not affect the chromophore structure of the drug. With the aim to evaluate the influence of temperature on the hydrolytic degradation; experiments at 40, 60 and 80 ºC were carried out. From these experiments was obtained that the degradation rate constant (k) increases concomitantly as the temperature increase. Also, activation energies values, half lives and t90 values for the degradation of pravastatin are reported. Additionally, the reactivity of pravastatin in front of free radicals and peroxinitrite, as predictive models of its oxidative stability in both preformulations and in vivo, were studied. For this study UV/Vis spectrophotometry was used as analytical technique and ABAP + N2 as alkyl radical’s generator, ABAP + O2 as alkylperoxyl radical’s generator, and ABTS (ABTS+). The reactivity with peroxynitrite was evaluated by using SIN-1. The reactivity of pravastatin in front of ABAP and SIN-1 was assess following the spectrophotometric signal of the drug at 240nm, using the calibration curve method (A = 2.04×10-8[c] + 4.55×10-9). For ABTS+ the decay of its signal at 734 nm was used. Concentrations of pravastatin in the range of 40 μM to 100 μM were studied. The drug was reactive in front to all the compounds assayed, and the reactivity ranking was: ABAP+O2 (k=1.13×10-2 min-1) ≥ ABAP+ N2 (k=7.07×10-3 min-1) > SIN-1 (k=2.68×10-3 min-1) ≥ ABTS (k=1.2×10-3 min-1), that means: alkylperoxyl ≥ alky > peroxynitrite ≥ ABTS•+. In addition, the reactivity of these compounds in front other structural analogous of pravastatin: the prodrugs lovastatin and simvastatin, and their analogous of open chain experimentally obtained by exhaustive alkaline hydrolysis are reported.

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico