Submitted by Emanuel Varela Cardoso (emanuel.varela@ufcg.edu.br) on 2018-06-12T18:53:47Z No. of bitstreams: 1 ELIZA JULIANA DA COSTA EULÁLIO – TESE (PPGEP) 2016.pdf: 7905425 bytes, checksum: 64905b4c1009f10b95551ddcb731195c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-12T18:53:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ELIZA JULIANA DA COSTA EULÁLIO – TESE (PPGEP) 2016.pdf: 7905425 bytes, checksum: 64905b4c1009f10b95551ddcb731195c (MD5) Previous issue date: 2016 / INTRODUÇÃO A Diabetes Mellitus consiste em uma doença crônica que aumenta entre brasileiros, tendo direta relação com os fatores de risco do mundo moderno. A principal complicação desta patologia são as úlceras, de difícil tratamento, pela cicatrização lentificada e pela ineficácia de alguns curativos. O avanço na área dos Biomateriais tem favorecido o desenvolvimento de produtos com tal finalidade, sendo a quitosana um polímero promissor e de extrema relevância, que pode ter sua ação terapêutica potencializada com a incorporação de fármacos, a exemplo da quercetina, um flavonóide com função anti-inflamatória comprovada. OBJETIVO Desenvolver membranas de quitosana incorporadas com quercetina, para uso em pacientes com ulcerações epiteliais, em especial, para aplicação em feridas diabéticas. METODOLOGIA Esta pesquisa foi desenvolvida no Certbio (UFCG), classificada como experimental, foram produzidas 500 membranas, obtidas nas duas fases do trabalho: Fase Exploratória e Fase Experimental. Os dados foram analisados através da estatística descritiva, após os ensaios de caracterização: MEV, EDS, FTIR, DRX, Termogravimetria (Tg), Análise de Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) e Ensaio de Citotoxicidade. RESULTADOS Os resultados da Fase Exploratória evidenciaram que, embora houvesse a incorporação da quercetina na matriz polimérica da quitosana, o contato desta com a solução básica (Hidróxido de Sódio e Hidróxido de Amônio) resultou na formação de um sal, confirmado após observação dos outros ensaios, houve também a formação de aglomerados devido a concentração elevada de fármaco, concluindo-se que não apresentaram características potenciais para aplicabilidade do produto em feridas diabéticas Os resultados da Fase Experimental evidenciaram incorporação de quercetina na matriz da quitosana, em ambas as metolodogias (X e Y), contudo na que houve reticulação em TPP (X), o fármaco ficou disperso homogeneamente, os difratogramas revelaram alteração da cristalinidade da membrana com a presença da quercetina, reforçando a interação entre ambos. As análises de TG e de DSC evidenciaram que a reticulação em TPP alterou O comportamento térmico da membrana de quitosana/ quercetina, aumentando a estabilidade do compósito e a quercetina contribuiu, de forma discreta, para as alterações das curvas de calor. O ensaio de citotoxicidade apontou que as membranas com TPP têm viabilidade para serem utilizadas como biomaterial. CONCLUSÕES Concluiu-se, que a metodologia considerada válida e eficaz para a obtenção de membranas de quitosana/ quercetina, foi a X, onde houve a reticulação em TPP, com potencial para ser testada in vivo e contribuir para regeneração tecidual e o combate ao processo inflamatório presente nas feridas diabéticas. Sugere-se que, novos ensaios sejam realizados, a fim de aprimorar algumas das características finais do produto, contudo parâmetros fundamentais das variáveis já foram estabelecidos nesse estudo. / INTRODUCTION to Diabetes Mellitus is a chronic disease which is increasing among the Brazilians; it is directly related to the modern world risk factors. The main complications of this disease are ulcers, hard treatment, slowed healing and the ineffectiveness of some curatives. The advance in the field of biomaterials has favored the development of products for this purpose, chitosan is a promising and very relevant polymer, which may have its enhanced therapeutic action with the incorporation of drugs, such as quercetin, a flavonoid with a proven anti -inflammatory function. OBJECTIVE Developing chitosan membranes incorporated with quercetin, for use in patients with epithelial ulcerations, in particular for use in diabetic wounds. METHODOLOGY The present research was developed in Certbio (UFCG), it was classified as experimental and it was produced 500 membranes obtained in the two work phases: Exploratory and Experimental phases. Data were analyzed using descriptive statistics, after the characterization tests: SEM, EDS, FTIR, XRD, thermogravimetry (Tg), Analysis of Differential Scanning Calorimetry ( DSC) and Cytotoxicity Assay. RESULTS The results of the exploration phase showed that although there was the incorporation of quercetin in the polymer matrix of chitosan, its contact with the basic solution (Sodium Hydroxide and Ammonium Hydroxide) resulted in the formation of a salt, confirmed after observation of other tests , there was also the formation of agglomerates due to the drug high concentration. It was concluded that it showed no potential features for the applicability of the product in diabetic wounds the results from experiment showed quercetin incorporated in the chitosan matrix in both metolodogias (X and Y), but there was the crosslinking of TPP (X), the drug was dispersed homogeneously, the diffraction showed crystallinity change of membrane in the presence of quercetin, strengthening the interaction between them. The analysis of TG and DSC showed that crosslinking in TPP changed the thermal behavior of the membrane of chitosan / quercetin, increasing the stability of the composite and que rcetin contributed discreetly to changes in heat curves. The cytotoxicity assay showed that membranes with TPP have the possibility to be used as a biomaterial. CONCLUSIONS It was concluded that the methodology considered valid and effective for obtaining chitosan membranes / quercetin was X, where there was crosslinking in TPP, with the potential to be tested in vivo and contribute to tissue regeneration and combating inflammatory process present in diabetic wounds. It is suggested that new tests are carried out in order to improve some of the final characteristics of the product, however basic parameters of the variables have already been established in this study.

Esta tese de doutorado fundamentou-se na preparação e caracterização de suspensões de nanocápsulas contendo quercetina (QUE) e metoxicinamato de octila (MCO), como componente do núcleo central destes sistemas. As suspensões foram preparadas pelo método de deposição interfacial do polímero pré-formado e foram posteriormente caracterizadas através da determinação dos teores totais de QUE e MCO, das taxas de associação da QUE e do MCO às nanocápsulas, dos diâmetros médios de partículas e polidispersões, dos potenciais zeta e análises morfológicas. Avaliou-se neste estudo, a influência do tipo de tesioativo utilizado (Span 60® ou Epikuron 170®) sobre as características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas. As formulações foram estudadas quanto a sua estabilidade frente à radiação UVA, durante um período de exposição de 15 dias. As suspensões apresentaram tamanhos de partícula inferiores a 500 nm e taxas de encapsulação próximas a 90 % para a QUE e MCO. Este teste permitiu verificar que as nanocápsulas são sistemas capazes de proteger parcialmente as substâncias nela associadas contra a fotodegradação. As formulações preparadas com Span 60® foram mais efetivas na proteção contra a fotodegradação tanto da QUE, quanto do MCO, no entanto, evidenciou-se que a presença destas duas substâncias contribuiu para a proteção de ambas. Os testes para avaliação do potencial antioxidante das nanocápsulas contendo QUE e MCO foram conduzidos em células de levedura de Saccharomyces cerevisiae durante um período de 35 h, com coletas em tempos específicos. Os resultados demonstraram que a presença das suspensões de nanocápsulas, contendo ambas as substâncias associadas, foi capaz de minimizar a mortalidade das células de levedura em presença do agente estressor. Além disso, foi possível perceber que este efeito de proteção se manteve ao final das 35 h comprovando a eficiência destes sistemas na liberação lenta de substâncias. As suspensões de nanocápsulas foram associadas a um gel hidrofílico e, após, foram aplicadas sobre a superfície cutânea para avaliação dos perfis de liberação do MCO após 3 e 6 h de incubação. Testes in vitro utilizando células de Franz, foram realizados para avaliar a liberação do MCO a partir das nanocápsulas. Para este experimento utilizou-se acetonitrila como solvente, devido sua capacidade de solubilizar o polímero permitindo estimar a quantidade total de MCO em cada camada da pele. Com a finalidade de avaliar a quantidade de MCO liberado por difusão das nanocápsulas nas diferentes camadas da pele com o passar do tempo (MCO livre) utilizou-se o miristato de isopropila como solvente, pois o mesmo não é capaz de solubilizar o polímero, mas solubiliza o MCO. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o MCO permanece acumulado nas camadas mais superficiais da pele, sendo a epiderme a principal barreira para a passagem deste filtro pela pele. Após aplicação e transcorrido os tempos de estudo não foi possível recuperar MCO na derme e também no líquido receptor. A utilização do miristato de isopropila permitiu demonstrar que a liberação do MCO foi diferente dependendo das camadas da pele. Setenta e oito por cento de MCO foi liberado após 6 h na superfície cutânea e cerca de 40 % no estrato córneo, sendo que este percentual diminuiu em torno de 20 % nas camadas mais profundas da pele. Os resultados permitiram inferir que a liberação do MCO difere entre a superfície da pele e as demais camadas. / This work has been based on the development and characterization of nanocapsules containing quercetin (QUE) and octyl metoxycinnamate (OMC), used as oil core of these systems. The nanocapsule suspensions were prepared by interfacial deposition of preformed polymer. The suspensions were characterized in terms of QUE and OMC contents and associated drug (QUE) within the nanoparticles, morphology, pH, mean size and polydispersity, as well as the zeta potentials. The influence of the type of surfactant (Span 60® e Epikuron 170®) on the physicochemical characteristics of suspensions was evaluated. The stability of the different formulations was evaluated under UVA radiation for 15 days. The aim of this test was to evaluate the nanocapsules ability in protecting the loaded substances against the photodegradation. The nanocapsules presented particle sizes lower than 500 nm, negative zeta potential values and QUE and OMC total contents about 90 %. The encapsulation efficiencies for QUE were 100 %. After 15 days, the formulations prepared with Span 60® and QUE/OMC showed more than 80 % of QUE content. The formulation prepared exclusively with QUE showed a content of QUE around 50 %. The totality of OMC degraded in solution, while OMC remained around 15 % stable in the nanocapsules prepared with Span 60® and QUE. After UVA exposure, QUE and OMC concentrations remained higher for the nanocapsules than for the solutions. Furthermore, the nanoencapsulation of QUE and OMC, using Span 60® improved their photostability. The antioxidant properties of the QUE-loaded nanocapsule suspensions were also evaluated and for this test Saccharomyces cerevisiae cells were used during 35 h of incubation. QUE and OMC nanocapsule suspensions showed an important in vivo antioxidant activity against the damages caused by a stressor agent that lasted for 35 h. The longer bioactivity of those nanocapsules was probably related to the slowly release of the QUE. The nanocapsule suspensions were incorporated in gel or emulsion (O/W) formulations. OMC release profiles from nanocapsules were evaluated for 3 and 6 h. In vitro measurements using static Franz diffusion cells were performed to examine the release behavior of OMC from the nanocapsules. It was used acetonitrile as solvent because it is capable to dissolve the polymer shell of nanocapsules and the sunscreen. This method gave an estimation of the total amount of OMC (encapsulated and released) in each skin layer. A new skin treatment was used, which preserved the polymer shell of the particles. Isopropyl myristate was chosen as solvent because it is not able to solubilize the polymer but it is capable to solubilize OMC released from nanocapsules. These results demonstrated that the OMC accumulated in the upper skin layers. The viable epidermis seemed to be the limiting barrier for the progression of nanocapsules penetration in the skin. Independently of the skin treatment, the same amount of OMC was recovered in the dermis and no OMC was detected in the receptor compartment indicating the absence of nanocapsules in both compartments. Moreover, the use of isopropyl miristate showed that the OMC release was different depending on the skin level. Whereas 78 % of OMC was released after 6 h at the surface of the skin and around 40 % in the stratum corneum, this percentage decreased to 20 % in the deeper skin layers. It can be thus concluded that the OMC release profile is different between the surface and the viable skin.

This master´s thesis focuses at bioactive compounds in edible berries during its culinary processing. Elderberries (Sambucus nigra L.) were selected as a representative of edible berries variety. Elderberry is known for presence of significant bioactive compound content and usage in traditional medicine. Elderberries were processed acording to common culinary recipes. Amount od selected bioactive polyphenolic compounds (chlorogenic acid, quercetin, rutin, anthocyanes) was detected accordingly. Additionally content of ascorbic acid was determined. On the basis of the experimental determination, it was found that anthocyanes and rutin are the most common compounds found in elderberries. All analytes in juices and sirups gradually decreased during the treatments and long-term storage. On the contrary, the content of quercetin increased with gradual modifications and storage. The highest decrease was observed for vitamin C content. The lowest values in the products from elderberries were reached by quercetin and ascorbic acid.

Diversos estudos têm demonstrado a atividade antioxidante de extratos de Achyrocline satureioides. Essa atividade tem sido atribuída à presença de compostos flavonoídicos, em especial, da quercetina. Neste contexto, o objetivo da presente dissertação foi desenvolver nanoemulsões de uso tópico contendo o extrato deste vegetal, bem com o flavonóide quercetina isolado. Numa primeira etapa, nanoemulsões constituídas de octildodecanol, lecitina de gema de ovo, solução extrativa de Achyrocline satureioides (NEE) ou quercetina (NEQ) e água foram preparadas por emulsificação espontânea. O procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas (IP<0,2) com um diâmetro médio de gotícula de cerca de 200 e 300 nm e potencial zeta de cerca de -27 e -42 mV, respectivamente, para NEQ e NEE. Esses resultados sugerem a localização de componentes do extrato de Achyrocline satureioides na interface das nanoestruturas, como indicado pelas imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão. Numa segunda etapa, foi revalidado um método isocrático para a quantificação da quercetina por CLAE, mostrando-se este linear, preciso, exato e específico. A quantidade de quercetina associada com as nanoemulsões foi de 100%, para a concentração de 100 μg/mL de quercetina. Após, foi realizado o estudo de retenção cutânea da quercetina a partir das formulações utilizando pele de orelha suína, em células de difusão de Franz. Os resultados indicam um maior acúmulo de quercetina na pele a partir da NEE (~16 μg/g) em comparação a NEQ (~6 μg/g), após 8 horas de permeação, indicando a influência de componentes do extrato sobre esta propriedade. Finalmente, determinou-se a atividade antioxidante da quercetina através de medidas de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Encontrou-se uma menor lipoperoxidação nos testes realizados com o extrato de Achyrocline satureioides (56%) em relação aos testes utilizando quercetina isolada (91%), sem diferença na lipoperoxidação entre a NEQ (27 %) e a NEE (22 %). A proteção oferecida pelas formulações foi determinada nas peles submetidas ao estudo de permeação, sendo detectada uma diminuição da lipoperoxidação no tecido que recebeu tratamento com NEE, contudo, essa atividade não foi detectada para NEQ. Em conclusão, os resultados obtidos nesse estudo demonstram o efeito dos constituintes das formulações sobre propriedades físico-químicas das nanoemulsões, bem como na sua retenção na pele e na atividade antioxidante. / Several studies have demonstrated the antioxidant activity of Achyrocline satureioides extracts. This activity has been attributed to the presence of flavonoids, mainly quercetin. In this context, the aim of the present work was to develop topical nanoemulsions containing extract of this plant, as well as isolated quercetin. In a first step, nanoemulsions composed by octyldodecanol, egg lecithin, Achyrocline satureioides extract (NEE) or quercetin (NEQ) and water were prepared by spontaneous emulsification procedure. This process led to monodisperse nanoemulsions presenting mean droplet size of approximately 200 and 300 nm, and zeta potencial of –27 and –42 mV for NEQ and NEE, respectively. These results suggest that Achyrocline satureioides extract compounds are located in the O/W interface of nanoemulsions, as attested by the transmition electron microscopy. In a second step, an isocratic method for quercetin quantification was revalidated. This showed to be linear, accurate, precise and specific. The amout of quercetin associated with nanoemulsions was close to 100%, for a 100 μg/mL of quercetin. After that, a study of quercetin skin retention from the formulations using pig´s skin ear was performed, in Franz diffusion cell. The results revealed a higher accumulation of quercetin in skin from NEE (~16 μg/g) compared to NEQ (~6 μg/g), after 8h of permeation, indicating the influence of the extract compounds on this property. Finally, the antioxidant activity of quercetin was measured by tiobarbituric acid reactive species (TBA-RS). It shows a minor lipoperoxidation for Achyrocline satureioides extract (56%) than isolated quercetin (91%). No difference for NEQ (27 %) and NEE (22 %) lipoperoxidation was found. The protection against oxidation by the formulations was measured in the skin and it was found a reduction in tissue treated with NEE. This reduction was not observed for NEQ. In conclusion, this study shows the effect of formulation over the physico-chemical properties of nanoemulsion’s formulation, as well as on the skin retention and its antioxidant activity.

Nanocápsulas poliméricas (NC) foram descritas como uma nova geração de veículos para bloqueadores solares. Um estudo anterior demonstrou que a presença de monoestearato de sorbitano (MS) e polissorbato 80 (P80), ao invés de fosfatidilcolina em suspensões de nanocápsulas, conferiu uma maior fotoestabilidade à quercetina (QUE) e ao metoxicinamato de octila (OMC) co-encapsulados em função do espalhamento de luz de nanocápsulas, que agem como filtro solar físico. Neste trabalho, foram investigadas as bases físico-químicas dessas descobertas. Para alcançar o objetivo, o número de partículas por volume (N) foi determinado por turbidimetria e propriedades de espalhamento de luz das NC. Análise térmica e microscopia óptica também foram realizadas. Formulações de NC contendo QUE e OMC foram preparadas pelo método de deposição interfacial da poli-e-caprolactona, utilizando dois diferentes sistemas de tensoativos: Epikuron 170® (fosfatidilcolina) ou MS e P80. As NC apresentaram adequados diâmetros, índices de polidispersão, potencial zeta e pH. Formulações preparadas com QUE não apresentaram diferença significativa (P>0,05) para o N (partículas.cm-3), curiosamente o valor de N para×as partículas preparadas com MS e P80 foi menor do que as partículas preparadas com fosfatidilcolina (P<0,05), demonstrando que o espalhamento de luz não foi consequência de um N maior. Através de espalhamento de luz estático (Razão de Rayleigh) e espalhamento múltiplo de luz (TurbiscanLab®) foi verificado que a fotoestabilidade da QUE e do OMC foi relacionada a um maior espalhamento de luz das suspensões devido à natureza de seus componentes. A análise térmica demonstrou que os tensoativos e a QUE não interagem com a porção cristalina do PCL e que o MS e o P80 propiciaram melhor estabilidade química, do que as NC que continham Epikuron 170®. Análise microscópica mostrou nanocristais de QUE nas formulações explicando a influência das QUE nas análises espectroscópicas. Concluindo, NC preparadas com MS e P80 são mais eficazes em espalhar à luz do que aquelas preparadas com fosfatidilcolina. / Polymeric nanocapsules (NC) have been described as a new generation of carriers for UV blockers. A previous study demonstrated that the presence of the stabilizers sorbitan monostearate (SM) and polysorbate 80 (P80) instead of phophatidylcholine in nanocapsule suspensions caused a better photostability of co-encapsulated quercetin (QUE) and octyl methoxycinnamate (OMC) because of the light scattering of nanocapsules, which, act as physical sunscreen. In this work, was investigated the physicochemical basis of those findings. To reach the objective, the number of particles per volume (N) was determined by turbidimetry and the light scattering properties of the NC. Thermal analyses and optical microscopy were also performed. NC formulations containing OMC and QUE were prepared by interfacial deposition of poly(e-caprolactone) using two different surfactant systems: Epikuron 170® (phosphatidylcholine) or SM and P80. The NC presented adequate mean diameters polydispersity indexes, zeta potential and pH. Formulations prepared with QUE showed similar (p>0.05) N values (particles×cm-3), interestingly the N value for particles prepared with SM and P80 was smaller than particles the prepared with phosphatidylcholine (p<0.05), demonstrating that the light scattering was not a consequence of a higher N in the suspension. Through static light scattering (Rayleigh Ratio) and multiple light scattering (TurbiscanLab®) was found that the photostability of QUE and OMC was related to a higher light scattering of suspensions due to the nature of its components. Thermal analysis demonstrated that the surfactants and QUE did not interact with the crystalline portion of PCL and that SM and P80 provided better chemical stability for the NC containing QUE than Epikuron 170®. Microscopy analysis showed QUE nanocrystals in the formulations explaining the influence of QUE in the spectroscopic analyses. In conclusion, NC prepared with SM and P80 are more effective in scatter the light than those prepared with phosphatidylcholine.

Submitted by TABATA CRUZ MANOEL null (tabatacm@hotmail.com) on 2016-03-18T13:04:54Z No. of bitstreams: 1 ultima versao defesa.pdf: 3979971 bytes, checksum: 9e1ee9e6a385c2ba53c2341fe29ccecc (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-03-21T19:29:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 manoel_tc_me_sjrp.pdf: 3979971 bytes, checksum: 9e1ee9e6a385c2ba53c2341fe29ccecc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-21T19:29:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 manoel_tc_me_sjrp.pdf: 3979971 bytes, checksum: 9e1ee9e6a385c2ba53c2341fe29ccecc (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / As ciclodextrinas são um grupo de oligossacarídeos cíclicos, que apresentam um formato de cone truncado com cavidade hidrofóbica e exterior hidrofílico. Isto faz com que as ciclodextrinas possam encapsular fármacos, o que propicia melhoras na biodisponibilidade, estabilidade e proteção das moléculas encapsulada. Por esta característica, as ciclodextrinas constituem uma nova classe de excipientes farmacêuticos de grande utilidade, por formar complexos de inclusão reversíveis com moléculas apolares e atuarem como moléculas carregadoras de substancias de interesse biológico e baixa solubilidade. Dentre os compostos com ação farmacológica encontra-se os flavonoides, em destaque a molécula de quercetina, um fármaco natural com diversas propriedades biológicas, como anticâncer, antioxidante, antialérgica, porém devido sua baixa solubilidade torna-se necessária a formação de complexos de inclusão com moléculas carregadoras como a β-ciclodextrina. O presente trabalho busca investigar, por meio de simulações computacionais, as diferentes formas de interação dos flavonoides com a ciclodextrina e do complexo formado por bicamadas lipídicas, a fim de contribuir para um melhor entendimento do processo de formação com complexo de inclusão ciclodextrina/flavonoide e de entrega do fármaco à célula. / The cyclodextrins are cyclic oligosaccharides that present a structure in form of a truncated cone, with a hydrophobic inside surfaces and hydrophilic outside. This causes the cyclodextrin can encapsulate drugs provides improvements in bioavailability, stability and protection of encapsulated molecules. By this feature, the cyclodextrins are a new class of pharmaceutical excipients useful for forming inclusion complexes with reversible nonpolar molecules and act as carrier of molecules with high biological interest and low solubility. Among the compounds with pharmacological action it is the flavonoid, featured the quercetin molecule; a drug with natural biological proprieties such as anticancer, antioxidant, antialergic, however, due to its low solubility, it becomes necessary the formation of inclusion complexes with carrier molecules. This study aims to investigate, through computer simulation, different forms of interaction of flavonoids with cyclodextrin and the complex formed by lipid bilayers, in order to contribute to a better understanding of the formation process with inclusion complex cyclodextrin/flavonoids and the drug delivery to cell.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Demyelinating diseases are severe owing to the destruction of myelin sheaths present in the central (CNS) and peripheral (PNS) nervous system. The demyelination may occur in infectious and compressive diseases of the spinal cord in dogs. The experimental model of demyelination and remyelination by Ethidium Bromide (EB) promotes impairment of locomotor activities similar to those observed in multiple sclerosis (MS). The purpose of this study was to investigate the effect of flavonoid quercetin on behavioral tests, on cholinergic neurotransmission, on parameters of oxidative stress in blood, on cholinesterase activity in blood and Acetylcholinesterase (AChE) activities in lymphocytes of rats submitted to the EB experimental demyelination model and to review cases of the atlantoaxial subluxation in the neurological records of the Veterinary Hospital. In the first paper, fourteen dogs were diagnosed as affected by atlantoaxial subluxation in dogs and the condition was more frequent in toy breeds under twenty-four month old years. The main cause found for the instability was agenesis of the odontoid process. Clinical signs ranged from cranial cervical pain to non-ambulatory tetraparesis. The surgical treatment demonstrated to be efficacious. The predominant time of recovery was 30-60 days after surgery. No correlation was found between the duration of clinical signs before surgery and the time of recovery. In the experimental study, Wistar rats were randomly distributed into four groups (20 animals per group): Control (pontine saline injection and treatment with ethanol), Querc (pontine saline injection and treatment with quercetin), EB (pontine 0.1% EB injection and treatment with ethanol), and EB+Querc (pontine 0.1% EB injection and treatment with quercetin). The animals of the groups Querc and Querc + EB were treated once daily with quercetin (50mg/kg) diluted in 25% ethanol solution (1 ml / kg) and the animals of the control groups and EB were treated once daily with 25% ethanol solution (1 ml / kg). Two stages were observed: phase of demyelination with a peak on day 7 and phase of remyelination with a peak on day 21 post-inoculation of EB. In the first manuscript, the behavioral tests (the beam walking test, foot fault test and Inclined plane test), AChE activity and lipid peroxidation in the brain structures (pons, cerebellum, hippocampus, hypothalamus, striatum and cortex) were measured. Quercetin promoted earlier locomotor recovery, prevented the inhibition of AChE activity and the increase of lipidic peroxidation. In a second manuscript, parameters of oxidative stress in blood, cholinesterase activity in blood and AChE activities in lymphocytes were measured. The experimental demyelination model by EB promoted alteration in AChE activity of non neural cells, and also modified the oxidative stress parameters in the blood. In addition, quercetin was able to modulate AChE activity and of the antioxidant enzymes, as well as reduces lipid peroxidation in demyelinated rats by EB. These results may contribute to a better understanding of the neuroprotective role of quercetin and the importance of an antioxidant diet in humans and in animals, and the therapeutic potential this flavonoid in demyelination diseases, such as ME in humans, distemper in dogs, as well as in spinal cord compression (atlantoaxial subluxation). / As doenças desmielinizantes são uma grave consequência da destruição das bainhas de mielina presentes no sistema nervoso central (SNC) e periférico (SNP). A desmielinização pode ocorrer tanto em doenças infecciosas como compressivas da medula espinhal em cães. O modelo experimental de desmielinização e remielinização pelo brometo de etídio (BE) promove a diminuição da atividade locomotora semelhantes às observadas na doença de esclerose múltipla (EM). O objetivo deste estudo foi investigar o efeito do flavonoide quercetina nos testes comportamentais, na neurotransmissão colinérgica, na atividade das colinesterases no sangue, na atividade da acetilcolinesterase em linfócitos e nos parâmetros de estresse oxidativo no sangue, durante os eventos de desmielinização e remielinização em ratos submetidos ao modelo experimental pelo BE e realizar levantamento de dados sobre cães com diagnóstico de subluxação atlantoaxial atendidos no hospital veterinário universitário. No primeiro artigo, foram diagnosticados 14 cães com subluxação atlantoaxial, sendo as raças de pequeno porte com idade inferior a 24 meses as mais acometidas. A principal causa da instabilidade foi a agenesia do processo odontóide do áxis e os sinais clínicos variaram desde hiperestesia cervical até tetraparesia não ambulatória. O tratamento cirúrgico demonstrou ser eficaz com tempo de recuperação predominante de 30-60 dias após a cirurgia, não existindo relação deste com a duração dos sinais clínicos. Para o estudo experimental, ratos Wistar foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos (20 animais por grupo): Controle (injeção de solução salina e tratamento com etanol), Querc (injeção de solução salina e tratamento com quercetina), BE (injeção de BE a 0,1% e tratamento com etanol), e BE + Querc (injeção de BE a 0,1% e tratamento com quercetina). Os animais dos grupos Querc e Querc + BE foram tratados uma vez ao dia com quercetina (50mg/kg) diluída em solução de etanol a 25% na dose de 1 ml/kg. Os animais dos grupos controle e BE foram tratados uma vez ao dia com solução de etanol a 25% na dose de 1 ml/kg. As fases avaliadas foram no pico de desmielinização (dia 7) e no pico de remielinização (dia 21), pós-inoculação de BE. No primeiro manuscrito, os testes comportamentais (teste do beam walking, teste do foot fault e teste do plano inclinado), a atividade da AChE e peroxidação lipídica nas estruturas encefálicas (hipotálamo, hipocampo, cerebelo, córtex, estriado e ponte) foram avaliadas nos dias 7 e 21 pós-inoculação de BE. O tratamento com quercetina promoveu maior velocidade de recuperação locomotora, preveniu a inibição da atividade de AChE e o aumento da peroxidação lipídica em ratos submetidos à desmielinização pelo BE. No segundo manuscrito, os parâmetros de estresse oxidativo no sangue, a atividade das colinesterases no sangue e a atividade da AChE nos linfócitos foram avaliados nos dias 7 e 21 pós-inoculação de BE. O modelo de desmielinização experimental por BE promoveu alteração na atividade da AChE no sangue total e linfócitos, e modificou os parâmetros das enzimas antioxidantes, bem como reduziu a peroxidação lipídica em ratos submetidos à desmielinização pelo BE. Estes resultados podem contribuir para uma melhor compreensão do papel neuroprotetor da quercetina, enfatizando a importância deste antioxidante na dieta humana e animal, e do potencial terapêutico deste composto em doenças desmielinizantes tais como a esclerose múltipla, a cinomose, bem como doenças traumáticas (subluxação atlantoaxial e DDIV, entre outras).

Esta tese de doutorado fundamentou-se na preparação e caracterização de suspensões de nanocápsulas contendo quercetina (QUE) e metoxicinamato de octila (MCO), como componente do núcleo central destes sistemas. As suspensões foram preparadas pelo método de deposição interfacial do polímero pré-formado e foram posteriormente caracterizadas através da determinação dos teores totais de QUE e MCO, das taxas de associação da QUE e do MCO às nanocápsulas, dos diâmetros médios de partículas e polidispersões, dos potenciais zeta e análises morfológicas. Avaliou-se neste estudo, a influência do tipo de tesioativo utilizado (Span 60® ou Epikuron 170®) sobre as características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas. As formulações foram estudadas quanto a sua estabilidade frente à radiação UVA, durante um período de exposição de 15 dias. As suspensões apresentaram tamanhos de partícula inferiores a 500 nm e taxas de encapsulação próximas a 90 % para a QUE e MCO. Este teste permitiu verificar que as nanocápsulas são sistemas capazes de proteger parcialmente as substâncias nela associadas contra a fotodegradação. As formulações preparadas com Span 60® foram mais efetivas na proteção contra a fotodegradação tanto da QUE, quanto do MCO, no entanto, evidenciou-se que a presença destas duas substâncias contribuiu para a proteção de ambas. Os testes para avaliação do potencial antioxidante das nanocápsulas contendo QUE e MCO foram conduzidos em células de levedura de Saccharomyces cerevisiae durante um período de 35 h, com coletas em tempos específicos. Os resultados demonstraram que a presença das suspensões de nanocápsulas, contendo ambas as substâncias associadas, foi capaz de minimizar a mortalidade das células de levedura em presença do agente estressor. Além disso, foi possível perceber que este efeito de proteção se manteve ao final das 35 h comprovando a eficiência destes sistemas na liberação lenta de substâncias. As suspensões de nanocápsulas foram associadas a um gel hidrofílico e, após, foram aplicadas sobre a superfície cutânea para avaliação dos perfis de liberação do MCO após 3 e 6 h de incubação. Testes in vitro utilizando células de Franz, foram realizados para avaliar a liberação do MCO a partir das nanocápsulas. Para este experimento utilizou-se acetonitrila como solvente, devido sua capacidade de solubilizar o polímero permitindo estimar a quantidade total de MCO em cada camada da pele. Com a finalidade de avaliar a quantidade de MCO liberado por difusão das nanocápsulas nas diferentes camadas da pele com o passar do tempo (MCO livre) utilizou-se o miristato de isopropila como solvente, pois o mesmo não é capaz de solubilizar o polímero, mas solubiliza o MCO. Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o MCO permanece acumulado nas camadas mais superficiais da pele, sendo a epiderme a principal barreira para a passagem deste filtro pela pele. Após aplicação e transcorrido os tempos de estudo não foi possível recuperar MCO na derme e também no líquido receptor. A utilização do miristato de isopropila permitiu demonstrar que a liberação do MCO foi diferente dependendo das camadas da pele. Setenta e oito por cento de MCO foi liberado após 6 h na superfície cutânea e cerca de 40 % no estrato córneo, sendo que este percentual diminuiu em torno de 20 % nas camadas mais profundas da pele. Os resultados permitiram inferir que a liberação do MCO difere entre a superfície da pele e as demais camadas. / This work has been based on the development and characterization of nanocapsules containing quercetin (QUE) and octyl metoxycinnamate (OMC), used as oil core of these systems. The nanocapsule suspensions were prepared by interfacial deposition of preformed polymer. The suspensions were characterized in terms of QUE and OMC contents and associated drug (QUE) within the nanoparticles, morphology, pH, mean size and polydispersity, as well as the zeta potentials. The influence of the type of surfactant (Span 60® e Epikuron 170®) on the physicochemical characteristics of suspensions was evaluated. The stability of the different formulations was evaluated under UVA radiation for 15 days. The aim of this test was to evaluate the nanocapsules ability in protecting the loaded substances against the photodegradation. The nanocapsules presented particle sizes lower than 500 nm, negative zeta potential values and QUE and OMC total contents about 90 %. The encapsulation efficiencies for QUE were 100 %. After 15 days, the formulations prepared with Span 60® and QUE/OMC showed more than 80 % of QUE content. The formulation prepared exclusively with QUE showed a content of QUE around 50 %. The totality of OMC degraded in solution, while OMC remained around 15 % stable in the nanocapsules prepared with Span 60® and QUE. After UVA exposure, QUE and OMC concentrations remained higher for the nanocapsules than for the solutions. Furthermore, the nanoencapsulation of QUE and OMC, using Span 60® improved their photostability. The antioxidant properties of the QUE-loaded nanocapsule suspensions were also evaluated and for this test Saccharomyces cerevisiae cells were used during 35 h of incubation. QUE and OMC nanocapsule suspensions showed an important in vivo antioxidant activity against the damages caused by a stressor agent that lasted for 35 h. The longer bioactivity of those nanocapsules was probably related to the slowly release of the QUE. The nanocapsule suspensions were incorporated in gel or emulsion (O/W) formulations. OMC release profiles from nanocapsules were evaluated for 3 and 6 h. In vitro measurements using static Franz diffusion cells were performed to examine the release behavior of OMC from the nanocapsules. It was used acetonitrile as solvent because it is capable to dissolve the polymer shell of nanocapsules and the sunscreen. This method gave an estimation of the total amount of OMC (encapsulated and released) in each skin layer. A new skin treatment was used, which preserved the polymer shell of the particles. Isopropyl myristate was chosen as solvent because it is not able to solubilize the polymer but it is capable to solubilize OMC released from nanocapsules. These results demonstrated that the OMC accumulated in the upper skin layers. The viable epidermis seemed to be the limiting barrier for the progression of nanocapsules penetration in the skin. Independently of the skin treatment, the same amount of OMC was recovered in the dermis and no OMC was detected in the receptor compartment indicating the absence of nanocapsules in both compartments. Moreover, the use of isopropyl miristate showed that the OMC release was different depending on the skin level. Whereas 78 % of OMC was released after 6 h at the surface of the skin and around 40 % in the stratum corneum, this percentage decreased to 20 % in the deeper skin layers. It can be thus concluded that the OMC release profile is different between the surface and the viable skin.

Diversos estudos têm demonstrado a atividade antioxidante de extratos de Achyrocline satureioides. Essa atividade tem sido atribuída à presença de compostos flavonoídicos, em especial, da quercetina. Neste contexto, o objetivo da presente dissertação foi desenvolver nanoemulsões de uso tópico contendo o extrato deste vegetal, bem com o flavonóide quercetina isolado. Numa primeira etapa, nanoemulsões constituídas de octildodecanol, lecitina de gema de ovo, solução extrativa de Achyrocline satureioides (NEE) ou quercetina (NEQ) e água foram preparadas por emulsificação espontânea. O procedimento conduziu à obtenção de nanoemulsões monodispersas (IP<0,2) com um diâmetro médio de gotícula de cerca de 200 e 300 nm e potencial zeta de cerca de -27 e -42 mV, respectivamente, para NEQ e NEE. Esses resultados sugerem a localização de componentes do extrato de Achyrocline satureioides na interface das nanoestruturas, como indicado pelas imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão. Numa segunda etapa, foi revalidado um método isocrático para a quantificação da quercetina por CLAE, mostrando-se este linear, preciso, exato e específico. A quantidade de quercetina associada com as nanoemulsões foi de 100%, para a concentração de 100 μg/mL de quercetina. Após, foi realizado o estudo de retenção cutânea da quercetina a partir das formulações utilizando pele de orelha suína, em células de difusão de Franz. Os resultados indicam um maior acúmulo de quercetina na pele a partir da NEE (~16 μg/g) em comparação a NEQ (~6 μg/g), após 8 horas de permeação, indicando a influência de componentes do extrato sobre esta propriedade. Finalmente, determinou-se a atividade antioxidante da quercetina através de medidas de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Encontrou-se uma menor lipoperoxidação nos testes realizados com o extrato de Achyrocline satureioides (56%) em relação aos testes utilizando quercetina isolada (91%), sem diferença na lipoperoxidação entre a NEQ (27 %) e a NEE (22 %). A proteção oferecida pelas formulações foi determinada nas peles submetidas ao estudo de permeação, sendo detectada uma diminuição da lipoperoxidação no tecido que recebeu tratamento com NEE, contudo, essa atividade não foi detectada para NEQ. Em conclusão, os resultados obtidos nesse estudo demonstram o efeito dos constituintes das formulações sobre propriedades físico-químicas das nanoemulsões, bem como na sua retenção na pele e na atividade antioxidante. / Several studies have demonstrated the antioxidant activity of Achyrocline satureioides extracts. This activity has been attributed to the presence of flavonoids, mainly quercetin. In this context, the aim of the present work was to develop topical nanoemulsions containing extract of this plant, as well as isolated quercetin. In a first step, nanoemulsions composed by octyldodecanol, egg lecithin, Achyrocline satureioides extract (NEE) or quercetin (NEQ) and water were prepared by spontaneous emulsification procedure. This process led to monodisperse nanoemulsions presenting mean droplet size of approximately 200 and 300 nm, and zeta potencial of –27 and –42 mV for NEQ and NEE, respectively. These results suggest that Achyrocline satureioides extract compounds are located in the O/W interface of nanoemulsions, as attested by the transmition electron microscopy. In a second step, an isocratic method for quercetin quantification was revalidated. This showed to be linear, accurate, precise and specific. The amout of quercetin associated with nanoemulsions was close to 100%, for a 100 μg/mL of quercetin. After that, a study of quercetin skin retention from the formulations using pig´s skin ear was performed, in Franz diffusion cell. The results revealed a higher accumulation of quercetin in skin from NEE (~16 μg/g) compared to NEQ (~6 μg/g), after 8h of permeation, indicating the influence of the extract compounds on this property. Finally, the antioxidant activity of quercetin was measured by tiobarbituric acid reactive species (TBA-RS). It shows a minor lipoperoxidation for Achyrocline satureioides extract (56%) than isolated quercetin (91%). No difference for NEQ (27 %) and NEE (22 %) lipoperoxidation was found. The protection against oxidation by the formulations was measured in the skin and it was found a reduction in tissue treated with NEE. This reduction was not observed for NEQ. In conclusion, this study shows the effect of formulation over the physico-chemical properties of nanoemulsion’s formulation, as well as on the skin retention and its antioxidant activity.

Nanocápsulas poliméricas (NC) foram descritas como uma nova geração de veículos para bloqueadores solares. Um estudo anterior demonstrou que a presença de monoestearato de sorbitano (MS) e polissorbato 80 (P80), ao invés de fosfatidilcolina em suspensões de nanocápsulas, conferiu uma maior fotoestabilidade à quercetina (QUE) e ao metoxicinamato de octila (OMC) co-encapsulados em função do espalhamento de luz de nanocápsulas, que agem como filtro solar físico. Neste trabalho, foram investigadas as bases físico-químicas dessas descobertas. Para alcançar o objetivo, o número de partículas por volume (N) foi determinado por turbidimetria e propriedades de espalhamento de luz das NC. Análise térmica e microscopia óptica também foram realizadas. Formulações de NC contendo QUE e OMC foram preparadas pelo método de deposição interfacial da poli-e-caprolactona, utilizando dois diferentes sistemas de tensoativos: Epikuron 170® (fosfatidilcolina) ou MS e P80. As NC apresentaram adequados diâmetros, índices de polidispersão, potencial zeta e pH. Formulações preparadas com QUE não apresentaram diferença significativa (P>0,05) para o N (partículas.cm-3), curiosamente o valor de N para×as partículas preparadas com MS e P80 foi menor do que as partículas preparadas com fosfatidilcolina (P<0,05), demonstrando que o espalhamento de luz não foi consequência de um N maior. Através de espalhamento de luz estático (Razão de Rayleigh) e espalhamento múltiplo de luz (TurbiscanLab®) foi verificado que a fotoestabilidade da QUE e do OMC foi relacionada a um maior espalhamento de luz das suspensões devido à natureza de seus componentes. A análise térmica demonstrou que os tensoativos e a QUE não interagem com a porção cristalina do PCL e que o MS e o P80 propiciaram melhor estabilidade química, do que as NC que continham Epikuron 170®. Análise microscópica mostrou nanocristais de QUE nas formulações explicando a influência das QUE nas análises espectroscópicas. Concluindo, NC preparadas com MS e P80 são mais eficazes em espalhar à luz do que aquelas preparadas com fosfatidilcolina. / Polymeric nanocapsules (NC) have been described as a new generation of carriers for UV blockers. A previous study demonstrated that the presence of the stabilizers sorbitan monostearate (SM) and polysorbate 80 (P80) instead of phophatidylcholine in nanocapsule suspensions caused a better photostability of co-encapsulated quercetin (QUE) and octyl methoxycinnamate (OMC) because of the light scattering of nanocapsules, which, act as physical sunscreen. In this work, was investigated the physicochemical basis of those findings. To reach the objective, the number of particles per volume (N) was determined by turbidimetry and the light scattering properties of the NC. Thermal analyses and optical microscopy were also performed. NC formulations containing OMC and QUE were prepared by interfacial deposition of poly(e-caprolactone) using two different surfactant systems: Epikuron 170® (phosphatidylcholine) or SM and P80. The NC presented adequate mean diameters polydispersity indexes, zeta potential and pH. Formulations prepared with QUE showed similar (p>0.05) N values (particles×cm-3), interestingly the N value for particles prepared with SM and P80 was smaller than particles the prepared with phosphatidylcholine (p<0.05), demonstrating that the light scattering was not a consequence of a higher N in the suspension. Through static light scattering (Rayleigh Ratio) and multiple light scattering (TurbiscanLab®) was found that the photostability of QUE and OMC was related to a higher light scattering of suspensions due to the nature of its components. Thermal analysis demonstrated that the surfactants and QUE did not interact with the crystalline portion of PCL and that SM and P80 provided better chemical stability for the NC containing QUE than Epikuron 170®. Microscopy analysis showed QUE nanocrystals in the formulations explaining the influence of QUE in the spectroscopic analyses. In conclusion, NC prepared with SM and P80 are more effective in scatter the light than those prepared with phosphatidylcholine.