Orientador: Carlos Marcelo Pastre / Banca: Rômulo Araújo Fernandes / Banca: Ernesto César Leal Júnior / Resumo: Contextualização: Diante da necessidade de obtenção de níveis ótimos de recuperação, utiliza-se em campo diversas estratégias. Dentre elas, usa-se com frequência a imersão em água fria (IAF). Entretanto, notam-se, ainda, lacunas no conhecimento para definir os reais efeitos destas modalidades de recuperação em condições específicas. Objetivo: analisar e comparar os efeitos da IAF durante a recuperação pós-exercício extenuante, utilizando diferentes tempos e temperaturas, sobre variáveis biológicas, clínicas e metabólicas. Materiais e Métodos: 105 indivíduos do sexo masculino com idade entre 18 e 30 anos foram divididos em cinco grupos: um de controle (GC) e quatro de recuperações (G1, G2, G3 e G4). Os voluntários foram submetidos a um protocolo de exaustão que consistiu em um programa de saltos (10 séries de 10 saltos com um minuto de intervalo entre as séries) e ao teste de Wingate. Imediatamente após o protocolo de exaustão, os voluntários foram direcionados a um tanque com água e gelo, no qual foram imersos até a altura da espinha ilíaca ântero-superior para o procedimento de recuperação (G1: 5' a 9±1°C; G2: 5' a 14±1ºC; G3: 15' a 9±1°C; G4: 15' a 14±1°C)... / Abstract: Background: Given the need to obtain optimal levels of recovery uses various strategies in the field. Among them, it is used frequently cold water immersion (CWI). However, notice is also gaps in knowledge to define the real effects of these modalities recovery under specific conditions. Objective: To analyze and compare the effects of CWI during recovery after strenuous exercise, using different time and temperature on biological variables, clinical and metabolic. Materials and Methods: 105 male individuals between 18 and 30 years were divided into five groups: a control (GC) and four recoveries (G1, G2, G3 and G4). The volunteers were subjected to exhaustion protocol which consisted of a jumping program (10 sets of 10 jumps with a minute of rest between sets) and the Wingate test. Immediately after the exhaustion protocol, volunteers were directed to a tank with water and ice, which were immersed up to the height of the anterior superior iliac spine to the recovery procedure (G1: 5 ' 9 ± 1 ° C; G2: 5 ' to 14 ± 1 º C; G3: 15' to 9 ± 1 ° C; G4: 15 ' to 14 ± 1 ° C)... / Mestre

Orientador: Julio Wilson Dos-Santos / Banca: Camila Buonani da Silva / Banca: João Paulo Borin / Resumo: O futebol é um esporte com ações de alta intensidade, implicando em aumento de dano tecidual, que pode ser mensurado pela análise de marcadores bioquímicos, como a creatina quinase (CK), lactato desidrogenase (LDH) e mioglobina (Mb). Os testes físicos mais utilizados para determinar a aptidão física dos jogadores são: teste aeróbio intermitente de Yo-yo, velocidade de 10 e 30 metros, corridas repetidas anaeróbias (RSA, 6 x 20-20 m) e impulsão vertical squat e contra movimento (IVSQUAT e IVCMV). Entretanto, a relação entre o nível de aptidão física do jogador, seu desgaste durante a partida com a intensidade na qual ele joga e com as ações técnicas é pouco estudada. Diante disso, o presente estudo tem como objetivo: verificar se os jogadores que apresentam melhor desempenho nos testes físicos também têm maior participação com a bola e jogam em maior intensidade; verificar quais indicadores de dano muscular no jogo se relacionam com a aptidão física, as ações técnicas e a intensidade do jogo de futebol; bem como, verificar a relação entre CK, LDH e Mb com a intensidade do jogo. O presente estudo contou com 11 jogadores de futebol de uma equipe participante do Campeonato Paulista da primeira divisão. Os jogadores passaram por avaliação antropométrica e avaliação das capacidades físicas (Yo-yo, RSA, 10 e 30 metros e IV). A FC do jogo foi monitorada durante duas partidas oficiais para determinar a carga do jogo, pelo impulso de treinamento (TRIMP). Duas horas antes do início e apó... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Soccer is a sport with high intensity actions, involving an increase in tissue damage, which can be measured by the analysis of biochemical markers such as creatine kinase (CK), lactate dehydrogenase (LDH) and myoglobin (Mb). The physical tests most used to determine the physical fitness of the players are: Yo-yo intermittent aerobic test, 10 and 30 meters speed, repeated anaerobic races (RSA, 6 x 20-20 m) and vertical squat and counter-movement (IVSQUATand IVCMV). However, therelationship between the level of physical fitness of the player, his wear during the match with the intensity in which he plays and the technical actionsis little studied. Therefore, the present study has as objective: to verify if the players that present better performance in the physical tests also have higherparticipation with the ball and play in higherintensity; to verifywhich indicators of muscle damage in matches relate to physical fitness, technical actions and intensity of the soccermatch; as well as,toverifythe relationship amongCK, LDH and Mb with the intensity of the match. The present study had 11 soccer players from a team participating in the First Division Paulista Championship. The players underwent anthropometric evaluation and assessment of physical abilities (Yo-yo, RSA, 10 and 30 meters and IV). The HFof the game was monitored during two official matches to determine the loading of the game by the training impulse (TRIMP). Two hours before and after the game blood samples (5 mL) w... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

Cistinose é uma doença genética sistêmica causada pelo transporte deficiente lisossomal acumulando cistina nos lisossomos de quase todos tecidos. Apesar do dano tecidual depender do acúmulo de cistina, os mecanismos moleculares deste ainda são obscuros. Adenilatoquinase, junto com a creatinaquinase, são responsáveis pela rede de transferência de fosfato, cruciais a homeostasia energética. Considerando que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase, que as duas enzimas contem grupamentos tiólicos, e há uma forte interação entre as duas atividades, nosso principal objetivo foi investigar os efeitos da cistina na atividade da adenilatoquinase em córtex cerebral de ratos Wistar. Para os estudos in vivo, os animais foram injetados duas vezes ao dia com 1,6 mmol/g de peso corporal de cistina dimetil éster e/ou 0,46 mmol/g de peso corporal de cisteamina. Os animais foram tratados do vigésimo quinto dia ao vigésimo nono dia de vida e foram sacrificados 12 horas após a última injeção. Cistina inibiu a atividade da enzima in vitro de forma dose-dependente, ao passo que cisteamina preveniu a inibição. A atividade da adenilatoquinase diminuiu no córtex cerebral dos ratos com sobrecarga com cistina dimetiléster e a co-administração com cisteamina preveniu a diminuição da atividade de enzima. Considerando que a adenilatoquinase, juntamente com a creatinaquinase, é essencial para a homeostase energética, a liberação de cistina pelos lisossomos com consequente inibição enzimática, podem prejudicar a homeostasia energética, contribuindo para o dano tecidual em pacientes com cistinose. / Cystinosis is a systemic genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency accumulating cystine in the lysosomes of almost all tissues. Although tissue damage might depend on cystine accumulation, the molecular mechanisms of tissue damage are still obscures. Adenylate kinase, along with creatine kinase, is responsible for the enzymatic phosphotransfer network, crucial for energy homeostasis. Taking into account that cystine is known to inhibit creatine kinase activity, the two enzymes have thiol groups, and the strong interaction between the two activities, our main objective was to investigate the effect of cystine on adenylate kinase activity in the brain cortex of Wistar rats. Cystine inhibited the enzyme activity in vitro in a concentration dependent way, whereas cysteamine prevented the inhibition. For the in vivo studies, the animals were injected twice a day with 1.6 mmol/g body weight of cystine dimethylester and/or 0.46 mmol/g body weight of cysteamine from the 25th to the 29th postpartum day and sacrificed after 12 hours. Adenylate kinase activity was found diminished in the brain cortex of rats loaded with cystine dimethylester and co-administration of cysteamine prevented the diminution of the enzyme activity. Considering that adenylate kinase together with creatine kinase is crucial for energy homeostasis, the release of cystine from lysosomes with consequent enzymes inhibition could impair energy homeostasis, contributing to tissue damage in patients with cystinosis.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-18Bitstream added on 2014-06-13T19:42:29Z : No. of bitstreams: 1 akinaga_j_dr_botib_parcial.pdf: 68136 bytes, checksum: 63ef0cbc915c8aa41f833dd0c4a86b5b (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-19T18:32:50Z: akinaga_j_dr_botib_parcial.pdf,Bitstream added on 2014-12-19T18:33:36Z : No. of bitstreams: 1 000714063.pdf: 501451 bytes, checksum: 105a66a9ea99849e798ced498018eeef (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / As catecolaminas endógenas adrenalina e noradrenalina controlam importantes funções fisiológicas através da ativação de 1A-ARs, que são receptores com 7 domínios transmembrana os quais ativam proteínas G. Muitos agonistas de 1-ARs são utilizados na terapêutica, principalmente por conta de seu efeito vasoconstritor, porém, a taquifilaxia observada com a oximetazolina, um agonista de 1-ARs da classe das imidazolinas, é um efeito adverso importante e pode ser observado principalmente com a utilização de descongestionantes nasais por períodos de tempo prolongado. No presente estudo, investigamos a participação de PKC e GRK2 nos processos de fosforilação, dessensibilização e internalização de 1A-ARs induzidos pelos agonistas noradrenalina e oximetazolina. Segundo os resultados obtidos, a oximetazolina, mas não a fenilefrina, induziu taquifilaxia nas contrações de artéria caudal de rato. Além disso, 1A-ARs ativados pela oximetazolina são fosforilados principalmente pela GRK2, seguida de rápida dessensibilização e internalização. Já 1A-ARs ativados pela noradrenalina são fosforilados principalmente pela PKC, sem dessensibilização nem rápida internalização. Esses resultados em conjunto demonstram que a oximetazolina e a noradrenalina regulam os 1A-ARs através de diferentes mecanismos, envolvendo diferentes quinases / The endogenous cathecolamines epinephrine and norepinephrine control important physiological functions through activation of 1A-ARs, which are 7-transmembrane receptors that activate G proteins. Several 1-ARs agonists are therapeutically useful in reason of its vasoconstrictor effects; however, tachyphylaxis in the vasoconstrictor effects of nasal decongestant containing oxymetazoline, an imidazoline 1-ARs agonist, is an important adverse effect observed after prolonged treatment. On the present study, we investigated the roles of PKC and GRK2 on the 1A-AR phosphorylation, desensitization and internalization process after receptor activation by norepinephrine and oxymetazoline. The results show that oxymetazoline, but not phenylephrine, induce tachyphylaxis in contractions of rat tail artery. Moreover, 1A-ARs activated by oxymetazoline are phosphorylated predominantly by GRK2, followed by rapid desensitization and internalization whereas 1A-ARs activated by norepinephrine are phosphorylated predominantly by PKC and not followed by desensitization or rapid internalization. These results show that norepinephrine and oxymetazoline regulate 1A-ARs through different mechanisms, involving different protein kinases

Cistinose é uma doença genética sistêmica causada pelo transporte deficiente lisossomal acumulando cistina nos lisossomos de quase todos tecidos. Apesar do dano tecidual depender do acúmulo de cistina, os mecanismos moleculares deste ainda são obscuros. Adenilatoquinase, junto com a creatinaquinase, são responsáveis pela rede de transferência de fosfato, cruciais a homeostasia energética. Considerando que a cistina inibe a atividade da creatinaquinase, que as duas enzimas contem grupamentos tiólicos, e há uma forte interação entre as duas atividades, nosso principal objetivo foi investigar os efeitos da cistina na atividade da adenilatoquinase em córtex cerebral de ratos Wistar. Para os estudos in vivo, os animais foram injetados duas vezes ao dia com 1,6 mmol/g de peso corporal de cistina dimetil éster e/ou 0,46 mmol/g de peso corporal de cisteamina. Os animais foram tratados do vigésimo quinto dia ao vigésimo nono dia de vida e foram sacrificados 12 horas após a última injeção. Cistina inibiu a atividade da enzima in vitro de forma dose-dependente, ao passo que cisteamina preveniu a inibição. A atividade da adenilatoquinase diminuiu no córtex cerebral dos ratos com sobrecarga com cistina dimetiléster e a co-administração com cisteamina preveniu a diminuição da atividade de enzima. Considerando que a adenilatoquinase, juntamente com a creatinaquinase, é essencial para a homeostase energética, a liberação de cistina pelos lisossomos com consequente inibição enzimática, podem prejudicar a homeostasia energética, contribuindo para o dano tecidual em pacientes com cistinose. / Cystinosis is a systemic genetic disease caused by a lysosomal transport deficiency accumulating cystine in the lysosomes of almost all tissues. Although tissue damage might depend on cystine accumulation, the molecular mechanisms of tissue damage are still obscures. Adenylate kinase, along with creatine kinase, is responsible for the enzymatic phosphotransfer network, crucial for energy homeostasis. Taking into account that cystine is known to inhibit creatine kinase activity, the two enzymes have thiol groups, and the strong interaction between the two activities, our main objective was to investigate the effect of cystine on adenylate kinase activity in the brain cortex of Wistar rats. Cystine inhibited the enzyme activity in vitro in a concentration dependent way, whereas cysteamine prevented the inhibition. For the in vivo studies, the animals were injected twice a day with 1.6 mmol/g body weight of cystine dimethylester and/or 0.46 mmol/g body weight of cysteamine from the 25th to the 29th postpartum day and sacrificed after 12 hours. Adenylate kinase activity was found diminished in the brain cortex of rats loaded with cystine dimethylester and co-administration of cysteamine prevented the diminution of the enzyme activity. Considering that adenylate kinase together with creatine kinase is crucial for energy homeostasis, the release of cystine from lysosomes with consequent enzymes inhibition could impair energy homeostasis, contributing to tissue damage in patients with cystinosis.

Vários resultados na literatura fornecem fortes evidências de que o processamento de memórias requerem a participação da proteína cinase C (PKC) em estruturas sabidamente necessárias para este processamento, como o hipocampo, a amígdala basolateral (ABL) e o córtex parietal posterior (CPP). Neste trabalho mostramos que o inibidor seletivo das isoformas cálcio-dependentes da PKC, Go 6976, produz um efeito amnésico dosedependente sobre a consolidação de memória espacial de longa duração em ratos submetidos ao treino no labirinto aquático de Morris (LAM), quando infundido na região CA1 do hipocampo dorsal 15 minutos pré-treino, imediatamente pós-treino ou 15 minutos pré-teste para esta tarefa, sem alterar a atividade locomotora dos animais. Ainda na tarefa do LAM, o Go 6976 também apresentou este efeito amnésico sobre a reconsolidação de memórias espaciais de longa duração recentes e antigas, bem como sobre a consolidação da memória espacial de longa duração relativa ao treino reverso no LAM, mas não teve efeito sobre a memória espacial de curta duração nem sobre a extinção da memória espacial de longa duração. Já na tarefa de esquiva inibitória (EI) o Go 6976 produziu um efeito amnésico quando infundido na ABL imediatamente ou 30 minutos pós-treino, ou no CPP 270 ou 360 minutos pós-treino, enquanto o inibidor não-seletivo das isoformas da PKC, Go 7874, produziu os mesmos efeitos, exceto por, no CPP, causar amnésia quando infundido 180 ao invés de 270 minutos pós-treino. Estes resultados indicam que as PKCs, sobretudo as cálcio-dependentes, são importantes para o processamento de memórias espaciais e aversivas, apresentando na consolidação de memórias aversivas distintos tempos críticos de ativação em diferentes estruturas cerebrais, e sendo necessárias para a aquisição, consolidação, evocação e reconsolidação de memórias espaciais.

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, da Universidade do Extremo Sul Catarinense – UNESC, para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde. / The animal model of mania induced by dextroamphetamine (d-AMPH) has been considered a good model for the study of bipolar disorder (BD). However, some studies have shown differences between amphetamines to induce both behavioral and biochemical changes. Besides, several studies have suggested that dysfunctional energy metabolism have a central role in BD. In the present study was investigated the potency of the d-AMPH and methamphetamine (m-AMPH) on the behavior and energetic dysfunction in the brain of rats. Were investigated also the effects of the lithium (Li) and valproate (VPT) on behavioral and energy metabolism changes in brain of rats undergoing treatment with the m-AMPH. Finally, was to compare serum creatine kinase (CK) levels between bipolar disorder patients, in the various phases (depressive, manic, and euthymic). The work was divided into three parts. Part 1: Wistar rats were given single intraperitoneal (i.p) injections of saline, d-AMPH (2 mg/kg) or m-AMPH (0.25, 0.5, 1 or 2 mg/kg). Locomotor behavior was assessed using the open-field task and activities of Krebs cycle enzymes (citrate synthase and succinate dehydrogenase), mitochondrial respiratory chain complexes (I, II, III and IV) and CK were measured in brain of rats. Part 2: Wistar rats were first given m-AMPH or saline for 14 days, and then, between days 8 and 14, rats were treated with Li, VPA or saline i.p. The animals were submitted to the same behavioral and biochemical tests described in Part 1. Part 3: Was compared serum CK levels between BD patients, in the various phases (depressive, manic, and euthymic), and healthy volunteers. In the first part of the study was demonstrated that d-AMPH and m-AMPH (all doses administered) increased locomotor activity of animals. The numbers of visits to the centre were increased by d-AMPH and m-AMPH at 2 mg/kg. The m-AMPH administration at 2mg/kg increased the amount of stereotypic behavior. The amphetamines significantly decreased the activities of Krebs cycle enzymes, mitochondrial respiratory chain complexes and CK; nevertheless, this effect varied depending on the brain region evaluated. In the second part of this study we found that Li and VPA reversed m-AMPH-induced hyperactivity. Besides, Li and VPA reversed m-AMPH-induced energetic metabolism dysfunction; however, the effects of Li and VPA were dependent on the brain region analyzed. Finally, in the third part of this study was demonstrated that CK levels were higher in the manic patients than in the controls. Together these data show that: 1) at high doses, m-AMPH increased stereotyped (sniffing) behavior in rats, but d-AMPH did not. However, this study shows that d-AMPH and m-AMPH seem to have similar effects on the brains energetic metabolism; and the d-AMPH, m-AMPH is able to induced hyperactivity and energetic metabolism dysfunction, both seen in BD. In addition, Li and VPA reversed m-AMPH’s effects on locomotor activity and energetic metabolism. The clinical differences among the depressive, manic, and euthymic phases of BD are paralleled by contrasting levels of CK. However, further studies are needed in order to understand the state-dependent differences observed in serum CK activity. / O modelo animal de mania induzido por dextroanfetamina (d-AMPH) é descrito na literatura como um bom modelo animal de transtorno bipolar (TB). Entretanto, tem sido relatado diferenças entre os tipos de anfetaminas em induzir alterações comportamentais e neuroquímicas. Além disso, vários estudos sugerem que o TB está associado à disfunções no metabolismo energético. No presente estudo foi avaliado a diferença entre d-AMPH e metanfetamina (m-AMPH) sobre o comportamento e disfunção no metabolismo energético no cérebro de ratos. Foi avaliado também os efeitos de lítio (Li) e valproato (VPA) sobre as alterações comportamentais e sobre metabolismo energético induzidos por m-AMPH. Finalmente, comparamos os níveis de creatina quinase (CK) no soro de pacientes bipolares nas fases depressiva, maníaca e eutímica. Para tanto, o trabalho foi dividido em três partes. Parte 1: Ratos Wistar receberam uma injeção intraperitoneal (i.p) de salina, d-AMPH (2mg/kg) ou m-AMPH (0,25, 0,5, 1 ou 2mg/kg) e foram submetidos ao teste do campo aberto para avaliação comportamental 2 h após. Foi avaliada também a atividade das enzimas do ciclo de Krebs (citrato sintase, succinato desidrogenase e malato desidrogenase), dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial (I, II, II-III, IV) e da CK no cérebro dos ratos. Parte 2: Foi administrado m-AMPH ou salina i.p em ratos Wistar durante 14 dias e entre o 8º e o 14º dia os animais eram tratados com Li, VPA ou salina via i.p. Os animais foram submetidos aos mesmos testes comportamentais e bioquímicos descritos na Parte1. Parte 3: Foram avaliados os níveis de CK no soro de pacientes bipolares - eutímicos, depressivos e em mania – que foram comparados com voluntários saudáveis. Na primeira parte do trabalho foi demonstrado que d-AMPH e m-AMPH aumentaram a atividade locomotora nos ratos. As visitas ao centro do campo aberto aumentaram com a administração de ambas as drogas na dose de 2mg/kg. A administração de m-AMPH na dose de 2mg/kg aumentou o comportamento estereotipado dos animais (sniffing). A administração tanto de d-AMPH quanto de m-AMPH diminuiu a atividade das enzimas do ciclo de Krebs, dos complexos da cadeia respiratória mitocondrial e da CK; entretanto, estes efeitos variam de acordo com a região cerebral avaliada. Na segunda parte do trabalho foi demonstrado que Li e VPA revertem a hiperatividade e alterações no metabolismo energético induzida por m-AMPH. Por fim, na terceira parte do trabalho foi demonstrado que durante a mania, os níveis de CK estão aumentados no soro dos pacientes bipolares quando comparado com voluntários saudáveis. Estes dados demonstram que a m-AMPH, mas não d-AMPH, induz comportamento estereotípico em ratos; porém, as duas drogas parecem ter efeitos similares sobre o metabolismo energético; e que, assim como a d-AMPH, a m-AMPH é capaz de induzir hiperatividade e disfunção no metabolismo energético que são revertidos por Li e VPA. As fases maníaca, depressiva e eutímica do TB, além de apresentarem sintomatologia distinta, também podem ser diferenciadas pelo nível de CK presente no soro dos pacientes. Entretanto, mais estudos são necessários para entender as diferenças observadas na atividade da CK durante as fases do TB.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-12Bitstream added on 2014-06-13T18:09:34Z : No. of bitstreams: 1 aizemberg_r_me_arafcf.pdf: 685654 bytes, checksum: d058342c2d66649275266dc34dcb968d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A levedura Pichia pastoris vem sendo largamente utilizada como um eficiente sistema de expressão para a produção de proteínas heterólogas, pois é um sistema seguro, fácil e mais barato que sistemas de expressão de outros eucariotos. Neste trabalho, a enzima de interesse é a glicerol quinase (GK), que cataliza a transferência do fosfato terminal do ATP para o glicerol originando glicerol-3-fosfato e ADP. Esta reação pode ser utilizada na determinação da concentração de glicerol, subproduto da fermentação alcoólica. A leitura do consumo de glicerol é realizada pela determinação espectrofotométrica do NADH gerado na reação de oxido-redução catalizada pela enzima glicerol-3-fosfato desidrogenase. Este estudo de indução foi realizado em diferentes condições de crescimento da levedura Pichia pastoris. Os resultados mostraram a seleção do melhor clone da levedura Pichia pastoris para a expressão extracelular da enzima glicerol quinase, e a determinação das melhores condições do meio de cultura para a produção da enzima de interesse foram: concentração do meio de cultura BMMY (20 vezes), densidade inicial de célula (0,1 mg/mL), concentração de metanol na fase de indução (1%), natureza do tampão (fosfato de potássio), pH (6,0), suplementação de glicerol no meio BMMY (1%), peptona (marca Difco), sem adição de sulfato de amônio, caseína e glicina, uso do meio BMMY e liofilização do mesmo. Estudos de parâmetros cinéticos foram realizados e a atividade máxima da GK foi obtida em pH 9,8, a 50ºC e 2,5 μM de substrato, por metodologia clássica, além da presença de sulfato de magnésio e diluição da enzima de 30 vezes. A enzima apresentou alta estabilidade térmica ― a atividade foi completamente... / The yeast Pichia pastoris has been widely used as an efficient expression system for production of heterologous proteins because it is a safe, easy and cheaper than expression systems in other eukaryotes.In this studie, the enzyme of interest is glycerol kinase (GK), which catalizes the transfer of terminal phosphate from ATP to glycerol resulting glycerol-3-phosphate and ADP. This reaction can be used in determining the concentration of glycerol, a byproduct of fermentation. The reading of the consumption of glycerol is carried out by spectrophotometric determination of NADH generated in the redox reaction catalyzed by the enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase. This study of induction was performed in different conditions of growth of the yeast Pichia pastoris. The results show that selecting the best clone of the yeast Pichia pastoris for the expression of extracellular enzyme glycerol kinase, and determining the best conditions of the culture medium for producing the enzyme of interest were: concentration of the culture medium BMMY (20 times), initial cell density (0.1 mg/mL), methanol concentration in the induction phase (1%), nature of buffer (potassium phosphate), pH (6.0), glycerol supplementation in BMMY medium (1%), peptone (Difco), without addition of ammonium sulfate, casein and glycine in BMMY and lyophilized medium. Studies of kinetic parameters were conducted and the GK maximum activity was obtained at pH 9.8 at 50°C and 2.5 μM substrate by conventional method, besides the presence of magnesium sulfate and diluting the enzyme 30 times. The enzyme showed high thermal stability - the activity was fully maintained up to 50°C for one hour - and at pH 7.0 for 7 days and kept under refrigeration, freeze-dried extract showed a decrease in enzymatic activity. Calculated by... (Complete abstract click electronic access below)

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-10T10:55:15Z No. of bitstreams: 1 2013_DanielAugustoBarradeOliveira.pdf: 2428120 bytes, checksum: c456b5418b233575e486a336a32f5cb7 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-02-17T13:52:04Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_DanielAugustoBarradeOliveira.pdf: 2428120 bytes, checksum: c456b5418b233575e486a336a32f5cb7 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-02-17T13:52:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_DanielAugustoBarradeOliveira.pdf: 2428120 bytes, checksum: c456b5418b233575e486a336a32f5cb7 (MD5) / As proteínas quinases são importantes por atuar em processos biológicos conhecidos, como a transdução de sinais. Esses processos estão intimamente relacionados com o desenvolvimento de neoplasias malignas. Desse modo, o conhecimento da atuação de drogas, relacionadas com essas proteínas, é relavante para o tratamento de alguns tipos de câncer. Neste trabalho, procurou-se estudar inibidores da proteína quinase de adesão focal (FAK), a fim de correlacionar propriedades teóricas, obtidas pela química computacional, com atividades biológicas calculadas a partir do IC50, para auxiliar no entendimento entre essas drogas e a FAK. Para realizar os cálculos foram usadas diversas aproximações de modelagem molecular, dentre as quais, mecânica molecular, métodos ab initio, e métodos híbridos. Para a aproximação de mecânica quântica foram usados os métodos Hartree-Fock, teoria do funcional de densidade, e semi-empíricos PM3, PM6 e MNDO, para descrever a interação entre o sítio catalítico da FAK e os inibidores. O programa O programa auto-docking Vina foi usado para o ancoramento rígido. As atividades de inibidores da classe 7-h-pirrolo-pirimidina foram comparadas com dados provenientes da mecânica quântica, cujo resultado mostrou a importância dos orbitais de fronteira próximos ao aminoácido Cys502. Quanto mais estendidos esses orbitais, maior poderá ser atividade de inibição da FAK. São ainda observadas interações moleculares com os aminoácidos Arg424 e Lys454. Os inibidores dasatinib, sulfonamida e tiazole também foram estudados com métodos de química quântica. Esses inibidores mostram tendências químicas semelhantes com aqueles da classe pirrolo pirimidina, no que se refere às interações com os aminoácidos da tríade catalítica, enfatizando a necessidade dessas interações na construção de novos inibidores. Além disso, a partir da análise de componentes principais, foi mostrada uma correlação entre atividades e propriedades eletrônicas. A soma de todos esses estudos leva a novas fronteiras para o entendimento da interação de fármacos inibidores da proteína quinase e, consequentemente, a compreensão da inibição da metástase, que são uma das maiores causas de morte no mundo moderno. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The kinases proteins play important role acting in known biological process, as the signal transduction. These processes are strongly related to the development of malignant neoplasms. Therefore, the knowledge of the drug action related to the kinase protein is relevant for the cancer treatment. In this work, it was studied inhibitors of focal adhesion kinase (FAK) protein in order to correlate theoretical properties with biological activity via IC50, to understand the interaction between these drugs with FAK. In order to perform the calculations it was employed several approaches of molecular modeling, as molecular mechanics, ab initio and hybrid methods. For the quantum mechanical approach we have used Hartree-Fock, density functional theory and semi-empirical PM3, PM6, MNDO methods to describe the interaction between the catalytic site of FAK binding and the selected inhibitors. Auto Docking Vina program was employed to perform the rigid docking. The inhibitor activities of 7-h-pirrole-pirimidines were compared to the results of quantum mechanical approaches, and these results shows the important relation to the frontier orbitals close to the Cys502 aminoacid. The largest contribution of these orbitals is closely related to the FAK inhibition. The molecular interaction with Arg454 and Lys454 aminoacids were also showed. Dasatinib, sulfonamide and thiazole inhibitors also presents these main interactions, emphasizing the relevance of catalytic site interaction of FAK with new inhibitors. Furthermore, from the principal component analysis, it was shown a correlation between activity and electronic properties. The present study leads to new frontiers for the understanding the interaction between focal adhesion kinase and the inhibitors, which is related to the metastase, one o the main reason of death in the world.