Als Quorum sensing (QS) wird die Kommunikation zwischen Bakterien bezeichnet. Diese basiert auf kleinen Signalmolekülen, die Autoinducer (AI) genannt werden. Durch QS werden von Bakterien Verhaltensweisen wie Fähigkeit zur Symbiose, Virulenz, Produktion von Antibiotika und Bildung von Biofilmen reguliert. Die Kommunikation kann innerhalb einer Spezies (Intraspezies-Kommunikation) oder mehreren Spezies (Interspezies-Kommunikation) erfolgen. Gram-negative Bakterien kommunizieren über acetylierte Homoserinlaktone (AHL), Gram-positive Bakterien dagegen benutzen modifizierte Oligopeptide als Autoinducer. Für die Interspezies-Kommunikation dient der Autoinducer-2 (AI-2). AI-2 entsteht auf dem Weg der spontanen Zyklisierung von 4,5-Dihydroxy-2,3-Pentadion (DPD), der von LuxS synthetisiert wird. Die Universalität des AI-2 als Signalmoleküls basiert auf dessen chemischen Eigenschaften. Als biologisch aktive Formen von DPD gelten S-THMF-Borat (bei marinen Bakterien wie Vibrio harveyi) und R-THMF (z.B. bei Enterobakterien wie Escherichia coli oder Salmonella enterica Serovar Typhimurium). AI-2 wird bei allen Bakterien von einem periplasmatischen Rezeptor gebunden. S-THMF-Borat bindet spezifisch an den Rezeptor LuxP, R-THMF dagegen an den Rezeptor LsrR. Durch die Anbindung des AI-2 verändert sich die Konformation des Rezeptors, was als Signal über weitere Proteine in die Zelle weitergeleitet wird. In E. coli ist die Expression des Operons lsrACDBFGE von AI-2 abhängig. Der lsr-Promotor wird von dem Repressor LuxR, Phospo-AI-2 sowie dem cAMP-CRP-Komplex reguliert. In dieser Arbeit wurden die molekularbiologische Grundlagen zur Entwicklung eines AI-2-Biosensors gelegt. Es wurden mehrere Fusionskonstrukte des V. harveyi AI-2 Rezeptors LuxP sowie dessen Derivate mit veränderter Affinität zur AI-2 kreiert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Auch Rezeptorproteine von Vibrio fischeri sowie E. coli konnten erfolgreich exprimiert werden. Die Expression der Proteine erfolgte in E. coli luxS- Deletionsstämmen, die hierfür konstruiert worden sind. Die AI-2-Rezeptorproteine werden in E. coli vorwiegend in Form von inclusion bodys exprimiert. Nur ein Teil des Proteins ist löslich und kann für die Aufreinigung unter nativen Bedingungen verwendet werden. Auf der Basis von E. coli luxS- Deletionsstämmen wurde ein Bioassay entwickelt, der für die Detektion von AI-2 verwendet werden kann. Hierfür wurden mehrere Reporterplasmide konstruiert, in denen das rot fluoreszierende Protein DsRed unter die Kontrolle des lsr-Promotors von E. coli kloniert wurden. Dabei konnte unter Verwendung einer dieser Reporterplasmide (pBRDsRed) sowie des luxS-Deletionsstammes KIB1 Bioassay-Bedingungen etabliert werden, die einen Nachweis von AI-2 ermöglichen. Die für den Assay benötigten AI-2-Moleküle wurden in vitro mithilfe der Enzyme Pfs und LuxS und S-Adenosyl-Homocystein (SAH) als Substrat hergestellt. Der entwickelte AI-2-Bioassay wurde für die Bestimmung der Bindeaktivität der V. harveyi LuxP-Derivate verwendet. Die resultierenden Ergebnisse wiesen eine hohe Reproduzierbarkeit (1,2 bis 11,3 % Standartabweichung) auf.

Einleitung: Biofilme gelten als die ursprüngliche Form des Lebens. Biofilme haben sich als Lebensform so gut bewährt, dass sie über die gesamte Zeit überlebt, sich weiterentwickelt und aufgrund dessen weit verbreitet haben. Ökologisch gesehen, besitzen sie eine große Bedeutung an den globalen Stoffwechselkreisläufen. Weiterhin spielen sie eine bedeutende Rolle bei der Pathogenese von chronischen Erkrankungen. So stellen im Organismus auftretende Biofilme die Ursache für zahlreiche, teils lebensbedrohliche Infektionen, wie die Endokarditis dar. In der Mundhöhle bilden die sich in der dentalen Plaque befindlichen Bakterien Säuren, welche Karies verursachen und im parodontalen Sulkus proliferierend zur Entstehung von Parodontopathien führen können. Neben ihren krankheitsauslösenden Effekten besitzen Biofilme auch lebensnotwendige Eigenschaften. Sie sind zum Beispiel Bestandteil der natürlichen Darmmikrobiota und tragen dort zur Verdauung, Immunmodulation sowie zur Versorgung des Organismus mit Vitaminen bei. Ziel dieser Übersichtsarbeit war es einen aktuellen Stand über die Ätiologie und Pathogenese von Biofilmen im Allgemeinen und die spezielle Bedeutung der dentalen Plaque bei der Pathogenese der Parodontitiden im Besonderen zu evaluieren. Material und Methoden: Die Bearbeitung der Thematik erfolgte anhand einer systematischen Literaturrecherche. Hierzu wurden internationale Quellen zusammengetragen und ausgewertet. Zum Auffinden von themenrelevanten Quellen dienten entsprechende Keywords. Diese Schlagwörter wurden einheitlich in den Datenbanken verwendet und sowohl in englischer als auch deutscher Sprache formuliert. Für die Auswahl der Datenbanken waren ausschlaggebend das Fachgebiet, der Evidenzgrad und die Zugänglichkeit. Primär erfolgte die Suche in der „Cochrane Library“, da dort Studien mit dem höchsten Evidenzgrad erfasst sind. Weiterhin wurden die Metadatenbanken „PubMed“ der American National Library of Medicine und „DIMDI“ verwendet. Zur Verwaltung der Literatur kam die Literaturverwaltungssoftware „Citavi“ zur Anwendung. Ergebnisse: Unabhängig von deren Lebensraum weisen alle Biofilme gemeinsame Merkmale auf. Am wichtigsten für die Biofilmentstehung ist die Produktion einer extrazellulären polymeren Matrix, in welche die Bakterien eingebettet und dadurch besser vor äußeren Einflüssen, wie Scherkräften und Austrocknung geschützt sind. Weitere wichtige Effekte des multibakteriellen Zusammenlebens innerhalb der Plaque sind Stoffwechseloptimierungen, die Virulenzsteigerung, eine erhöhte Resistenz gegenüber antimikrobiellen Substanzen, interzelluläre Kommunikation mittels Quorum sensing und die sich dadurch ergebende Möglichkeit der gezielten Expression von Genen. Auch die Etablierung von wachstumsfördernden Umgebungsbedingungen resultiert aus dem bakteriellen Zusammenschluss. Im Vergleich zu anderen Biofilmen zeichnet sich die orale Mikrobiota durch ihre besonders hohe Heterogenität und damit Komplexität aus. Unter normalen Bedingungen gehen die Plaquebakterien mit dem Wirtorganismus eine Symbiose ein. Dieser mutualistische Zustand wird als mikrobielle Homöostase bezeichnet. Während die residente orale Mikrobiota vom Nährstoffangebot und Lebensraum profitiert, trägt sie zur Abwehr pathogener Keime bei. Nur durch das Zusammenspiel verschiedener Einflussfaktoren, die Initiierung einer Entzündungsreaktion sowie die bakteriellen Interaktionsmöglichkeiten innerhalb des Biofilms, kommt es zur Krankheitsentstehung. Pathogene Plaquebakterien spielen eine entscheidende Rolle bei der Pathogenese der Parodontitis. Die Zusammensetzung von supragingivaler und subgingivaler Plaque differenziert deutlich voneinander. Bei chronisch und aggressiv verlaufender Parodontitis weist die subgingivale Plaquezusammensetzung keine signifikanten Unterschiede auf. Es gibt jedoch Hinweise auf spezielle Subspezies, die mit besonders schweren Verlaufsformen in Zusammenhang gebracht werden. Einzelne Bakterienspezies sind aber nicht in der Lage die Pathogenese einer Parodontitis zu initiieren. Schlussfolgerung: Neben der mechanischen Eradikation des supra- und subgingivalen Biofilms mittels verschiedener Behandlungsmöglichkeiten, stellt die Prävention, in Form einer Entzündungsprophylaxe, eine effektive Therapieoption dar. Nur wenn das natürliche Gleichgewicht zwischen oraler Mikrobiota und Wirtsorganismus aufrechterhalten wird, kann die Entwicklung einer Parodontitis vermieden werden. Neue, sich aus der Wissenschaft ableitende Therapieansätze, wie der Einsatz von Quorum sensing - Inhibitoren und probiotischen Stoffen, erfordern weitere Erforschung, um sie für den praktischen Einsatz nutzbar zu machen.

Orientador: Anita Jocelyne Marsaioli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-06T07:10:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pomini_ArmandoMateus_M.pdf: 2721194 bytes, checksum: b3d63d99fb0e61f807557af1f715e4ea (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Este trabalho abordou dois tópicos relacionados à comunicação química inter e intraespecífica. O primeiro tópico descreveu a produção de sinalizadores químicos da classe das acil-homosserina lactonas (acil-HSLs) por bactérias Gram-negativas fitopatogênicas, em mecanismos comunicativos conhecidos como quorum-sensing. Foram estudadas três espécies: Erwinia psidii RODRIGUES, que causa a principal bacteriose da goiabeira no Brasil;Pantoea ananatis SERRANO, um fitopatógeno de distribuição mundial e que causa perdas em diversas culturas agrícolas e Pantoea agglomerans EWING & FIFE, isolada da doença da ¿pinta branca do milho¿. O estudo propiciou a identificação de diversos metabólitos da classe das acil-HSLs, sendo que os produtos majoritários tiveram suas configurações absolutas estabelecidas. Avaliou-se ainda a atividade biológica de extratos, frações e produtos sintéticos com o biossensor Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), em ensaios de expressão de enzimas ß-galactosidase. Trata-se de um trabalho pioneiro no Instituto de Química da Unicamp. Na segunda linha de pesquisas desenvolvida, o enfoque recaiu sobre alomônios produzidos por opiliões (Arachnida: Opiliones) e utilizados em XII mecanismos de defesa química contra predadores e na defesa territorial. Estudou-se as secreções de defesa das espécies Goniosoma longipes ROEWER e Camarana flavipalpi SOARES, nativas do Estado de São Paulo. Este trabalho rendeu a identificação de benzoquinonas substituídas e um fenol, inclusive com a caracterização de um produto natural inédito (2-etil-3-metil-1,4- benzoquinona) / Abstract: This work encompasses two different topics, both related to the intra and interspecific chemical communication. The first part concerns to the production of acyl-homoserine lactones (acyl-HSLs), which are signalling substances of Gram-negative, plant pathogenic bacteria. These substances are responsible for their chemical communication, in a process known as quorumsensing. Three species were studied: Erwinia psidii RODRIGUES, which causes the most important bacteriosis in Brazilian guava crops; Pantoea ananatis SERRANO, a worldwide-spread phytopathogen, which causes crop losses in different plant species and Pantoea agglomerans EWING & FIFE, isolated from the ¿white spot disease¿ of maize in Brazil. This study allowed the identification of four acyl-HSLs, and the absolute configurations of the most abundant substances were established. The activities of the extracts, fractions and synthetic products were evaluated using the bioreporter Agrobacterium tumefaciens NTL4(pZLR4), in ß-galactosidase expression assays. This is a pioneer work at the Chemistry Institute at Unicamp. The second research topic was on the opilionids allomones (Arachnida: Opiliones), employed in chemical defense mechanisms against predators and in territorial defense. The exudates of Goniosoma longipes ROEWER and Camarana flavipalpi SOARES, both native from São Paulo State (Brazil), were chemically characterized, allowing the identification of a known substituted XIV benzoquinone and a phenol, including a new natural product (2-ethyl-3- methyl-1,4-benzoquinone) / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Marcelo Palma Sircili / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-15T20:40:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Esper_LucianaMariaRamires_D.pdf: 999342 bytes, checksum: 3f9fabfdcb18d73bafce5fd0ce00935e (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A contaminação de fórmulas infantis por Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) e Bacillus cereus pode ter como origem o contato do alimento com biofilmes formados em ambientes, utensílios e equipamentos empregados na sua produção ou posterior reconstituição nos locais de distribuição. A grande preocupação em relação a estas bactérias é a presença das mesmas em fórmulas infantis, produtos estes utilizados como fonte de alimentação para lactentes de forma exclusiva ou em combinação com outros alimentos. A formação de biofilmes, assim como outros mecanismos celulares como por exemplo a produção de bacteriocinas e fatores de virulência, podem ser modulados pelo processo de comunicação célula-célula ou quorum sensing - mecanismo de sinalização célula-célula mediada pelo acúmulo de uma classe ou mais de moléculas sinalizadoras produzidas pela célula e excretadas para o meio externo. Por sua vez, a quebra deste sistema, pela degradação das moléculas sinalizadoras de comunicação, denomina-se quorum quenching. Neste trabalho objetivou-se, primeiramente, a avaliação da dinâmica de formação de biofilmes mono e multi-espécies de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus em superfície de aço inoxidável utilizando-se como meios de cultivos fórmula Infantil (FI) e caldo Luria Bertani (LB) e a eficácia de soluções de ácido peracético e de hipoclorito de sódio na inativação desses biofilmes. Outro objetivo principal foi pesquisar a ocorrência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching em E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus e a possível influência das moléculas sinalizadoras na sensibilidade destas bactérias aos antimicrobianos. A formação de biofilmes ocorreu de forma mais intensa ao utilizar-se a fórmula infantil, quando comparado com o meio de cultivo LB, fato este relevante por ser a fórmula infantil o mais conhecido e importante veículo de transmissão de E. sakazakii (Cronobacter spp.). Tanto em cultivo mono-espécie quanto em cultivo misto, o nível de contagem de E. sakazakii (Cronobacter spp.) superou o de B. cereus e para ambos o maior desenvolvimento ocorreu em cultivos mono-espécie. Em todos os biofilmes de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus isoladamente e em cultura mista, produzidos em caldo LB e independente do tempo de formação, as contagens foram reduzidas a níveis inferiores a 1 logUFC/cm2 quando em contato com soluções de ácido peracético ([500mg/L]) e hipoclorito de sódio ([100mg/L]) por 15 minutos. No entanto, para os biofilmes produzidos em fórmula infantil ocorreram algumas situações, em que as contagens de microrganismos após o contato com as soluções de sanitizantes, foram superiores a 1 logUFC/cm2, evidenciando assim a ineficácia do procedimento de sanitização para alguns biofilmes formados a 5 dias ou mais e a necessidade da higienização das superfícies ser realizada o mais próximo do término do processamento ou reconstituição destes alimentos. Evidenciou-se a existência dos sistemas quorum sensing e quorum quenching, através dos testes de atividades biológicas das culturas, extratos e suas frações. Os testes com os biossensores revelaram-se positivos para a produção de homoserinas lactonas em cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e negativos para a espécie B. cereus. Em cultivo misto de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus observou-se a redução e/ou a não detecção das homoserinas lactonas fato este possivelmente associado ao fenômeno quorum quenching. A possível presença de moléculas sinalizadoras AI- 2 e AI-3 foi evidenciada, sendo confirmada a presença de moléculas sinalizadoras AI-1. A caracterização do AI-1 realizada por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massa (CG-EM) revelou a capacidade da cepa de E. sakazakii (Cronobacter spp.) em produzir três compostos, N-heptanoil-HSL, N-dodecanoil- HSL e N-tetradecanoil-HSL, substâncias estas ainda não reportadas na literatura para o microrganismo em estudo. Os autoindutores sintéticos C7-HSL, C12-HSL e C14-HSL adicionados a cultura de E. sakazakii (Cronobacter spp.) e B. cereus não exerceram efeito sobre a sensibilidade aos antimicrobianos, sugerindo que estas moléculas não estariam envolvidas em mecanismos de resistência a estes antimicrobianos. Em resumo este trabalho representa um importante passo no estudo da formação de biofilmes e dos sistemas quorum sensing e quenching para as bactérias em questão, cujos conhecimentos são de grande interesse na segurança dos alimentos / Abstract: The contamination of infant formulas by Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus can occur due to contact with biofilms formed in the environment and on equipment used in their production and reconstitution. There is concern about these bacteria due to their presence in foods used as a source of nutrition for infants. Biofilm formation as a wide spectrum of important processes is reported to be regulated by quorum sensing, including, for example, antibiotic production and virulence. Cell-to-cell communication or bacterial quorum sensing is a signaling mechanism that refers to the ability of bacteria to respond to chemical molecules called autoinducers, in response to cell density. Degradation of the signaling molecule prevents it from accumulating in sufficient amounts, leading to disruption of the communication system, known as quorum quenching. The aim of this study was first to evaluate the formation of mono and multi-species biofilms of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus on stainless steel surfaces using infant formula (FI) and Luria Bertani (LB) broth as the culture media, and the efficacy of sodium hypochlorite and peracetic acid in inactivating these biofilms. The other objective was to investigate the involvement of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) and Bacillus cereus in quorum sensing and quorum quenching systems and the possible influence of the signaling molecules on the sensibility of these bacteria to antimicrobials. The formation of biofilms was greater when using the infant formula than the Luria Bertani broth, this fact being important since the infant formula is considered to be an important vehicle in the transmission of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.) to infants. In both cases, the growth of the mono species was greater than in the multi species culture. In all the biofilms formed in the Luria Bertani broth, independent of the time of formation, the counts were reduced to less than 1 log CFU/cm2 when in contact with sodium hypochlorite ([100mg/L]) or peracetic acid ([500mg/L]). However for the biofilms produced in the infant formula, many situations occurred, with counts more than1 log CFU/cm2 in some situations after the contact with sanitizers highlighting the need for na efficient sanitization of the surfaces as soon as the processing or reconstitution of these foods has finished. The experiments with biosensors provided evidence of the occurrence of quorum sensing and quorum quenching systems using bioassays with the cultures and extracts of the microorganisms under examination. These bioassays were positive for the production of homoserine lactone by E. sakazakii (Cronobacter spp.) but negative for B.cereus. In the mixed culture a reduction and/or non-detection of the homoserine lactone was observed, a fact that could be associated with quorum quenching. A possible presence of the signaling molecules AI-2 and AI-3 was evident and the presence of AI-1 was confirmed. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses allowed for a chemical identification of the production of N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl- HSL and N-tetradecanoyl-HSLby the E. sakazakii (Cronobacter spp.), a fact not previously reported in the literature. The addition of synthetic signaling molecules (N-heptanoyl-HSL, N-dodecanoyl-HSL and N-tetradecanoyl-HSL) had no significant effect on the sensibility of the E. sakazakii (Cronobacter spp.) and B. cereus strains to antimicrobials. In summary this study represents an important step in biofilm's formation, quorum sensing and quorum quenching in these bacteria that are of great interest in food safety / Doutorado / Doutor em Tecnologia de Alimentos

O ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), substância utilizada como autoindutor nos sistemas de Quorum Sensing da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, foi utilizado como um modelo de estudos para a análise de moléculas secretadas por populações celulares utilizando técnicas eletroanalíticas. Cultivos celulares provenientes de três linhagens diferentes da bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri foram utilizados para os estudos. Uma linhagem selvagem (WT), que produzia DSF em quantidades naturalmente observadas, e duas linhagens geneticamente modificadas. Em uma linhagem (ΔC) a modificação genética resultava em elevada produção de DSF, para a segunda (ΔF) o resultado era a anulação da produção do autoindutor. As principais técnicas analíticas utilizadas foram: voltametria cíclica, eletroforese capilar e cromatografia líquida (com detecção UV-Vis e acoplada a espectrometria de massas), sendo a última para efeitos de comparação. Procedimentos de extração líquido-líquido com solventes orgânicos foram realizados como etapas de pré-tratamento de amostras, visando diminuir a quantidade de interferentes e realizar uma pré-concentração do analito. Três metodologias principais foram adotadas. Uma primeira voltada para a diferenciação dos cultivos celulares, analisando-se ou os sobrenadantes provenientes dos cultivos ou os extratos resultantes dos pré-tratamentos desses sobrenadantes, tendo como principal foco a identificação de um sinal diferencial entre os cultivos que correspondesse às quantidades de DSF, ou seja, inexistente para a linhagem ΔF, de alta intensidade para linhagem ΔC e de intensidade intermediária para a linhagem WT. A segunda metodologia foi baseada no uso de uma molécula modelo para realizar experimentos e obter dados como parâmetros físico-químicos, o ácido láurico (ácido dodecanóico) foi escolhido por sua semelhança estrutural e facilidade de obtenção, curvas de calibração e experimentos de separação de moléculas com estrutura semelhante foram realizados com a técnica de eletroforese capilar. Uma terceira metodologia foi desenvolvida utilizando o padrão do ácido cis-11-metil-2-dodecenóico (DSF), curvas de calibração foram obtidas com o padrão isolado apresentando ótimas linearidades, tanto com a técnica de eletroforese capilar quanto com cromatografia líquida com detecção UV-Vis, experimentos de adição de padrão às amostras também foram executados. Os experimentos realizados com as amostras não apresentaram os resultados esperados, os problemas foram associados principalmente à quantidade de interferentes na amostra e a baixa concentração do analito nos cultivos, sendo que os métodos de extração realizados não foram suficientes para solucioná-los. O insucesso da técnica de voltametria cíclica foi associado ao envenenamento do eletrodo, devido à alta quantidade de compostos orgânicos presentes na amostra, e dúvidas relacionadas à eletroatividade do DSF. As dificuldades encontradas com a técnica de eletroforese capilar foram associadas à alta força iônica da amostra, presença de interferentes e baixa concentração do analito nos cultivos. Mesmo os experimentos realizados com cromatografia líquida acoplada a detecção com espectrometria de massas não atenderam às expectativas, dificultando a elucidação dos problemas encontrados até então e impossibilitando o desenvolvimento de uma metodologia que atendesse aos objetivos propostos. / Cis-11-methyl-2-dodecenoic acid, also known as DSF (autoinducer of the Quorum Sensing system used by the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri) was explored as a study model for the cell secreted molecules analysis by electroanalytical techniques. Cell cultures from three different cell lines of the bacteria Xanthomonas axonopodis pv. citri were used for this study. A wild type (WT), which produced DSF in naturally observed quantities and two genetically modified ones. One of the lines (ΔC) had a genetic modification that resulted in an elevated production of DSF, and the other (ΔF) had a modification that stopped DSF production. Main analytical techniques used were: cyclic voltammetry, capillary electrophoresis and liquid chromatography (with UV-Vis detection and coupled with mass spectrometry), this last one was used with comparison purposes. Liquid-liquid extractions with organic solvents were realized as sample pre-treatment steps aiming the reduction of interfering species and analyte pre-concentration. Three main methodologies were adopted. One based in the differentiation of cell cultures analyzing or the cell culture supernatants or the resulting extracts from the pre-treatment steps. The main focus was the identification of a differential signal between the cultures that corresponded to the DSF quantities, in other words, null for the ΔF line, high intensity for the ΔC line and a an intermediary intensity for the WT line. The second methodology was based in experiments with a model molecule to obtain some data such as physical-chemistry parameters. Lauric acid (dodecanoic acid) was chosen for its structural similarity and easily acquisition. Calibration curves and similar structure molecules separation experiments were realized using capillary electrophoresis. Third and last methodology was developed using standard cis-11-methyl-2-dodecenoic acid (DSF). Calibration curves were obtained with the isolated standard showing great linearities using both capillary electrophoresis and liquid chromatography with UV-Vis detection. Experiments of standard addiction to the samples were also realized. Experiments using the samples did not show the expected results. Problems found were mainly associated with high amount of interfering species and low analyte concentration at the cultures, extraction methods used were not enough to solve this. The failures with the cyclic voltammetric techniques were associated to electrode poisoning, due to the high amount of organic compounds present at the sample, and DSF lack of electroactivity. Difficulties found with capillary electrophoresis were associated with the samples high ionic strength, presence of interfering species and low analyte concentration. Even liquid chromatography coupled with mass spectrometry experiments didn\'t attended the expectations. Making it difficult to elucidate the problems and not allowing the development of a methodology that could achieve the proposed objectives.

Parte da produção de fatores de virulência em bactérias do gênero Xanthomonas esta sob controle de um grupo de genes localizados no locus rpf (regulation of pathogenicity factors), que respondem ao aumento da densidade celular num processo chamado quorum sensing. Os genes que codificam as proteínas do sistema Rpf de Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) foram clonados no vetor pOBD por Alegria (2004), e usados como iscas em ensaios de dois híbridos, contra uma biblioteca de Xac clonada no vetor pOAD. Neste ensaio, foram observadas interações entre RpfC-RpfG, RpfC-RpfF, RpfF-RpfF e RpfC-CMF. O gene cmf tem um ortólogo, cuja função esta relacionada com o processo de quorum sensing em Dictyostelium. Para confirmar essas interações, RpfC e seus domínios, RpfG, RpfF e CMF foram expressas e purificadas, produzidos anticorpos, e foram efetuados ensaios de ligação in vitro. Em adição, o domínio HD-GYP de RpfG, que apresenta atividade de fosfodiesterase, também foi usado como isca no ensaio de dois híbridos. Interessantemente, a maioria de suas presas foi derivada de domínios GGDEF (diguanilato ciclase) de um grupo de proteínas de Xac. Em bactérias, muitos fenótipos, como a ativação da virulência, a formação de biofilme e a mobilidade, são controlados pelo processo de quorum sensing e por diGMP cíclico. Neste trabalho demonstramos uma ligação direta entre quorum sensing e diGMP cíclico, representada pela interação entre HD-GYP/GGDEF. Finalmente, estudos com um mutante para o gene cmf interrompido, envolvendo formação de biofilme, produção de goma xantana e patogenicidade, evidenciam que CMF tem uma função relevante no processo de quorum sensing em Xanthomonas. / In Xanthomonas a group of genes named regulators of the pathogenicity factors (rpf) control the synthesis of virulence factors as a function of cellular density in a process termed quorum sensing. Alegria (2002) cloned the rpf genes from Xanthomonas axonopodis pv citri (Xac) in the pOBD vector and used them as baits in two hybrid assays against a Xac prey library cloned in the pOAD vector and showed that RpfC interacts with RpfG, RpfF and CMF. Homologous of the cmf gene are found only in amoebas such as Dictyostelium, where plays a central function in the quorum sensing process. In this work, we expressed and purified RpfC and its domains, RpfG, RpfF and CMF and raised antibodies against these polypeptides. In vitro assays demonstrated the following interactions: RpfC-RpfF, RpfC-RpfG and RpfC-CMF. We show that RpfG and CMF interact with the response regulator domain of RpfC, and interactions RpfG and CMF also interact with the histidine phosphotransfer domain of RpfC. In addition, the recently characterized HD-GYP phosphodiesterase domain of RpfG was used as bait in the two hybrid assays. Interestingly, the majority of its preys were derived from a set of Xac proteins that possess GGDEF domains (diguanilate cyclase). In bacteria, many complex processes such virulence, motility and biofilm production are controlled by quorum sensing process and by levels of the second messenger cyclic diGMP. Our results demonstrate a direct link between quorum sensing and diGMP cyclic signaling pathways in the form of a direct physical interaction between the RpfG HD-GYP domain and GGDEF domains. Finally, studies with a Xac cmf-mutant show that CMF plays an important role in the quorum sensing process in Xanthomonas, including biofilm production, synthesis of xanthan gum and pathogenicity.

Orientadores: Arnaldo Yoshiteru Kuaye, Dirce Yorika Kabuki / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-26T05:00:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fernandes_MegdaSilva_D.pdf: 2553051 bytes, checksum: ee968bf858cc0b427d8f6b79c37338b7 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Enterococcus faecium e Enterococcus faecalis são espécies de patógenos oportunistas que infectam principalmente imunocomprometidos. Estas espécies são encontradas em produtos lácteos e possuem capacidade de formar biofilme em superfícies que contatam com os alimentos. A sua remoção é muito dependente dos procedimentos de higienização. Os Enterococcus spp. utilizam o sistema de comunicação célula-célula (quorum sensing) para a formação de biofilmes. A formação de biofilme mono e multiespécie, a eficácia dos procedimentos de higienização no controle destes biofilmes e a produção de moléculas sinalizadoras de quorum sensing por cepas de E. faecalis, E. faecium, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes foram avaliadas. Os ensaios foram realizados com cupons de aço inoxidável e variando-se a temperatura (7, 25 e 39 °C) e o tempo (0, 1, 2, 4, 6 e 8 dias). Após 1 e 8 dias de contato nas temperaturas de 25 e 39 °C, os cupons foram submetidos a diferentes processos de higienização. Os sanitizantes testados foram: hipoclorito de sódio (0,2%), ácido peracético (0,2%), quaternário de amônio (3,0%) e biguanida (1,0%). A detecção das moléculas sinalizadoras de quorum sensing AI-2 foi realizada através da avaliação do gene luxS e de ensaio biológico de bioluminescência. Nenhum dos micro-organismos avaliados foi capaz de formar biofilmes a 7 ?C. Enterococcus sp. foram capazes de formar biofilmes, com contagens acima de 8 log ufc/cm2 para as temperaturas de 25 e 39 °C após 8 dias de contato. Em cultivo multiespécie, a temperatura 25 °C favoreceu o desenvolvimento do biofilme de L. monocytogenes (contagens acima de 6 log ufc/cm2). Por sua vez, a 39 °C observou-se o efeito negativo no desenvolvimento do biofilme de L. monocytogenes em cultivo misto, com redução significativa nas contagens ao longo do tempo (valores abaixo de 0,4 log ufc/cm2). As contagens de B. cereus, para ambas as temperaturas em diferentes tempos de exposição situaram-se abaixo de 4,1 log ufc/cm2. Em contrapartida, a contagem de esporos de B. cereus evoluiu ao longo do tempo, atingindo contagens em torno de 4,6 log ufc/cm2. A limpeza com tensoativo aniônico complementada por outra etapa (limpeza ácida, limpeza ácida + sanitização ou sanitização) foi capaz de remover os biofilmes mono e multiespécie em todas as condições testadas. O ácido peracético foi o sanitizante mais eficiente e a biguanida o menos eficiente. Todas as cepas de Enterococcus spp. e B. cereus apresentaram o gene luxS e induziram o fenômeno de bioluminescência em Vibrio harveyi BB170, indicando a presença de autoindutores AI-2 / Abstract: Enterococcus faecium and Enteroccus faecalis are opportunistic pathogens species that infect mainly immunocompromised individuals. These species are found in dairy products and are capable of forming biofilms on surfaces that contact with food. Their removal is highly dependent on the cleaning procedures. It is known that enterococci use the cell-cell communication (quorum sensing) to biofilm formation. The formation of mono- and multi-species biofilm, the effectiveness of sanitization procedures to control these biofilms and the production of signaling molecules of quorum sensing (AI-2) by strains of E. faecalis, E. faecium, Bacillus cereus and Listeria monocytogenes were evaluated in this work. The biofilms were grown on stainless steel coupons at various incubation temperatures (7, 25 and 39 °C) and times (0, 1, 2, 4, 6 and 8 days). After 1 and 8 days of contact at 25 and 39 °C, the coupons were subjected to different sanitation procedures: anionic tensioactive cleaning, acid-anionic tensioactive cleaning, sanitization, anionic tensioactive cleaning + sanitization, acidic- anionic tensioactive cleaning + sanitization and chlorinated alkaline cleaning. The sanitizers tested were: sodium hypochlorite (0.2%), peracetic acid (0.2%), quaternary ammonium (3%), and biguanide (1%). The detection of AI-2 molecules was performed by evaluating the luxS gene and biological bioluminescence assay. None of the microorganisms evaluated was able to form biofilms at 7 °C. Enterococcus sp. were able to form biofilms, with counts above 8 log CFU/cm2 for the temperatures of 25 and 39 °C after 8 days of contact. In multi-species culture, the temperature of 25 °C favored the development of L. monocytogenes biofilms (counts above 6 log CFU/cm2). On the other hand, at 39 °C it was observed a negative effect in the development of L. monocytogenes biofilms in mixed culture, with a significant reduction in counts over time (values below 0.4 log CFU/cm2). The counts of B. cereus, for both temperatures at different exposure times were below 4.1 log CFU/cm2. In contrast, the spore counts of B. cereus evolved over time, reaching scores of around 4.6 log CFU/cm2. The anionic tensioactive cleaning complemented by an aditional step (acid cleaning, acid cleaning + sanitization or sanitization) was able to remove mono- and multi-species biofilms in all tested conditions. The peracetic acid was the most effective sanitizer and the less efficient was biguanide. All strains of Enterococcus spp. and B. cereus showed the luxS gene and induced the phenomenon of bioluminescence in Vibrio harveyi BB170, indicating the presence of AI-2 autoinducers / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutora em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Arnaldo Yoshiteru Kuaye / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:24:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piton_MariaAmeliadeJesus_D.pdf: 2566267 bytes, checksum: 93031959ddc9b768a984c049dbe3e847 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Apesar da implantação de ferramentas e programas de controle para redução da incidência de Salmonella spp. nas granjas e abatedouros avícolas, a prevalência deste patógeno na cadeia produtiva avícola ainda é representativa. A adesão dos micro-organismos à superfície de equipamentos utilizados no processamento de alimentos resulta em graves problemas, pois atua como fonte de contaminação. Estes agregados de células com altas densidades populacionais presentes na superfície podem produzir moléculas sinalizadoras de quorum sensing responsáveis pela expressão de características fenotípicas específicas, dentre elas substâncias envolvidas na formação de biofilme. Uma vez instalado o biofilme, a resistência desses organismos aumenta, dificultando a ação dos sanitizantes, comprometendo a qualidade dos alimentos, além de aumentar os riscos à saúde pública. Um total de 65 cepas de Salmonella, sendo 39 isoladas de carcaças e cortes de frango e 26 isoladas de amostras de granjas, foi caracterizado quanto aos sorotipos e resistência a 24 antimicrobianos. O sorotipo Enteritidis foi o predominante representando 67,7% das cepas, seguido do sorotipo Newport com 7,7%. Um total de 10 padrões de resistência foi identificado,sendo que 96,9% das cepas apresentaram resistência a bacitracina, 87,7% a eritromicina, 83% ao ácido nalidíxico. Um total de cinco diferentes sorotipos isolados das aves vivas e também do produto final (Typhimurium, Enteritidis,Newport, Senftenberg e Infantis) foi avaliado quanto à formação de biofilmes à temperatura de 20°C após 2, 4, 8, 16, 24 e 48 horas nos meios de cultivo caldo de soja e tripticaseína (TSB) e água peptonada tamponada (APT) a 0,1%. Após 48 horas, as cepas avaliadas foram capazes de formar biofilmes sobre a superfície de cupons de aço inoxidável nos dois meios de cultivo, sendo Newport, o sorotipo que apresentou maior contagem de células aderidas em meio TSB. Em cultivo misto de Enterococcus faecalis ATCC 7080 e Salmonella Enteritidis, em meio TSB, verificou-se que ambos são capazes de formar biofilmes sobre a superfície de aço inoxidável de forma independente com predomínio do Enterococcus faecalis após 48 horas. Porém, em meio APT 0,1%, em cultivo misto, as células de Enterococcus faecalis aderiram à superfície somente após a adesão inicial das células de Salmonella Enteritidis. Os sanitizantes FARMASEPT PLUS® 0,1% e ácido peracético 300 ml.L-¹ foram os mais eficientes, seguido do hipoclorito de sódio a 5 mg.L-¹. O dióxido de cloro estabilizado a 100 mg.L-¹ se mostrou o menos eficiente com redução de apenas 1 log UFC/cm2 de células aderidas. Todas as 65 cepas de Salmonella também foram submetidas à pesquisa dos genes luxs e sdia relacionados ao sistema quorum sensing e à pesquisa de moléculas autoindutoras AI-2, utilizando o biossensor Vibrio harveyi BB170. Todas as cepas apresentaram os genes luxs e sdia e foram positivas para AI-2 nos testes de bioluminescência,com índices que variaram entre 1,13 a 1,30. Compreender a dinâmica de comunicação intercelular por meio de moléculas autoindutoras de quorum sensing e relacionar com a expressão de fatores de virulência pode esclarecer aspectos relevantes e possibilitar o desenvolvimento de estratégias para o controle de patógenos na indústria de alimentos / Abstract: In spite of the implementation of control programs for Salmonella rating reduction in poultry breeding farms and slaughterhouses, the prevalence of this pathogenic agent, which is considered the main cause of foodborne diseases, is still significant. Microorganism adhesion and biofilm formation on food processing equipment surfaces result in severe problems, since they act as the source of food contamination. These cell aggregates have a high population density on the surface and may produce quorum sensing signaling molecules. These molecules are responsible for the expression of specific phenotypic characteristics, such as the substances involved in biofilm formation. Once the biofilm is present, the resistance of the organisms increases, impairing the action of sanitizing agents and compromising food quality, which raises the risks to public health. 65 strains of Salmonella, 39 isolated from broiler carcasses and 26 isolated from poultry breeding farms, had their serotypes and resistance to 24 antimicrobial agents characterized. The predominant serotype was Enteritidis (67.7% of the strains), followed by the Newport serotype (7.7% of the strains). A total of 10 resistance patterns were identified. 96.9% of strains were resistant to bacitracin, 87.7% to erythromycin and 83% to nalidixic acid. 5 different serotypes, isolated from poultry breeding farms and from the final product (Typhimurium, Enteritidis, Newport,Senftenberg and Infantis), had the biofilm formation evaluated at 20° C after 2, 4, 8, 16, 24 and 48 hours, in Tryptic Soy Broth (TSB) and 0.1% buffered peptone water (BPW) media. After 48 hours, the strains were able to produce biofilms on the surface of stainless steel coupons in both cultivation media. The Newport serotype, in TSB, presented the highest count of attached cells. Enterococcus faecalis ATCC 7080 and Salmonella Enteritidis, in mixed cultivation in TSB, were both able to produce biofilms on the surface of stainless steel independently, with the predominance of Enterococcus faecalis after 48 hours. However, the cells of Enterococcus faecalis attached to the surface only after the initial adhesion of Salmonella Enteritidis cells, in mixed cultivation in BPW. FARMASEPT PLUS® 0.1% and peracetic acid 300 ml.L-1 were the most efficient sanitizers, followed by sodium hypochlorite 5 mg.L-¹. Stabilized chlorine dioxide 100 mg.L-1 was the least efficient sanitizer, presenting an adhered cell reduction of only 1 log cfu/cm2. All 65 Salmonella strains were also subjected to gene probing for luxs and sdia genes, which are related to the quorum sensing system. Biosensor Vibrio harveyi BB170 was also used for all these strains to detect autoinducer AI-2 signaling molecules. All strains presented luxs and sdia genes. The bioluminescence tests were positive for AI-2, with values that ranged from 1.13 to 1.30. Understanding the intercellular communication dynamic, which occurs through quorum sensing signaling molecules, and its relation to the expression of virulence factors may clarify relevant aspects and make the development of pathogen control strategies in the food industry possible / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutora em Tecnologia de Alimentos

Codakia orbicularis est un mollusque bivalve appartenant à la famille des Lucinidae et établissant des symbioses avec des bactéries sulfo-oxydantes (symbiotes) au sein de ses branchies. Dans l’hypothèse où toute symbiose nécessite une régulation par des molécules de dialogue, une étude chimique exhaustive pourrait aboutir à la mise en évidence des métabolites impliqués. Le travail de ce manuscrit porte donc sur l'isolement de métabolites secondaires à partir des branchies de ce bivalve et sur l'évaluation de l'activité antibactérienne des molécules isolées. Douze composés ont été isolés des branchies de Codakia orbicularis et leurs structures ont été déterminées par les méthodes spectroscopiques usuelles. Parmi ces molécules, une seule est nouvelle et a été nommée orbicularisine. Elle présente un squelette indolone spirotetracyclique inédit. Parmi les molécules isolées, seules quatre d’entre elles présentent une activité antibactérienne à savoir le soufre S8, la 4-hydroxybenzaldéhyde et deux monoglycérolipides. L'orbicularisine s'est révélée inactive contre un panel de lignées cellulaires cancéreuses et de kinases. Le nouveau squelette de l’orbicularisine pourrait permettre d'aboutir à une nouvelle famille de molécules par synthèse organique et ainsi accroître la diversité moléculaire autour de ce motif inédit. Il sera également intéressant de déterminer l'origine des molécules isolées et de connaître leur(s) implication(s) dans la régulation des symbiotes du bivalve. Les résultats chimiques obtenus sur C. orbicularis et sur les Lucinidae en général sont intéressants puisque les espèces côtières appartenant aux bivalves ont été peu exploitées en chimie jusqu’à ce jour. / Codakia orbicularis is a bivalve mollusc belonging to the family Lucinidae and establishing symbiosis with sulfooxidizing bacteria (symbionts) within its gills. In the hypothesis that any symbiosis requires a regulation by molecules of dialogue, an exhaustive chemical study could lead to the demonstration of the metabolites involved. The work of this manuscript focuses on the isolation of secondary metabolites from the gills of this bivalve and on the evaluation of the antibacterial activity of the isolated molecules. Twelve compounds were isolated from the gills of Codakia orbicularis and their structures were determined by the usual spectroscopic methods. Of these molecules, only one is new and has been named orbicularisin. It presents an indolone spirotetracyclic skeleton unpublished. Among the isolated molecules, only four of them have antibacterial activity, namely sulfur S8, 4-hydroxybenzaldehyde and two monoglycerolipids. Orbicularisin has been shown to be inactive against a panel of cancer cell lines and kinases. The new skeleton of orbicularisin could lead to a new family of molecules by organic synthesis and thus increase the molecular diversity around this original motif. It will also be interesting to determine the origin of the isolated molecules and know their involvement (s) in the regulation of the bivalve symbionts. The chemical results obtained on C. orbicularis and on Lucinidae in general are interesting because the coastal species belonging to bivalves have been little exploited in chemistry to date.

Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs. / Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution.