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Salmonella genomic island 1 (SGI1) est un élément intégratif mobilisable décrit pour la 1ère fois dans un clone penta-résistant de Salmonella Typhimurium DT104. Depuis, plusieurs variants et îlots apparentés (Proteus genomic island 1 (PGI1)) ont été rapportés dans différents sérotypes de Salmonella enterica et chez Proteus mirabilis. Ces îlots de résistance sont constitués d’un squelette plutôt stable et d’une région de multirésistance (MDR) variable. L’objectif de cette thèse était d’étudier ces îlots dans des souches cliniques de P. mirabilis (CHU de Dijon et Lariboisière à Paris) et de S. enterica (CHU de Dijon). La prévalence de ces îlots variait de 5 à 16% chez P. mirabilis ayant acquis au moins une résistance. L’étude génotypique a montré une grande diversité des souches mais également la présence de quelques clones porteurs de SGI1 ou PGI1. Le séquençage de ces îlots a mis en évidence la grande plasticité des régions MDR souvent en lien avec des mouvements d’IS26. Ces dernières permettent à la région MDR de s’enrichir en nouveaux gènes de résistance (ex : blaCTX-M-15) présents dans des structures antérieurement décrites sur des plasmides de clones d’entérobactéries répandus. De nombreuses espèces d’entérobactéries porteuses d’un plasmide IncA/C sont capables d’acquérir par conjugaison un îlot provenant d’une autre entérobactérie. Cet îlot s’intègre alors au niveau du site chromosomique spécifique (trmE). Sous pression antibiotique et en présence d’un plasmide IncA/C, les souches peuvent être complètement excisées de leur îlot. Ainsi, ces îlots sont des interfaces de résistance à la fois stables mais aussi dynamiques favorisant la dissémination des gènes de résistance. Une virulence accrue par la présence de ces îlots chez S. enterica n’a pas pu être confirmée ni dans le modèle d’infection expérimentale de C. elegans, ni dans une étude rétrospective chez l’homme (prévalence de 12%). En revanche, P. mirabilis avait tendance à être plus pathogène chez C. elegans lorsqu’il était porteur d’un îlot / Salmonella genomic island (SGI1) is an integrative mobilizable element initially described in an epidemic multidrug-resistant Salmonella Typhimurium DT104. Since this first report, many variants and related genomic islands (Proteus genomic island 1 (PGI1)) have been described among Salmonella enterica serovars and in Proteus mirabilis. These islands have a stable backbone and a highly variable multidrug-resistant (MDR) region. The objective of this work was to study SGI1 from clinical P. mirabilis isolates (University hospitals of Dijon and Lariboisière - Paris) and S. enterica (University hospital of Dijon) The prevalence of these islands ranged from 5% to 16% in P. mirabilis with at least one acquired resistance. The genotypic analysis revealed a wide diversity among isolates but also the presence of some clonal isolates harbouring SGI1 or PGI1. Genomic island sequencing revealed the great plasticity of MDR regions, primarily mediated by IS26. Thanks to IS26 movements, the MDR region gains resistance genes (such as blaCTX-M-15) present in structures initially detected in plasmids from widely distributed Enterobacteriaceae. Many species of Enterobacteriaceae that harbour IncA/C plasmids are able to acquire islands by conjugation. These islands are then incorporated into specific sites on the chromosome (trmE). They could also be completely excised from Enterobacteriaceae under antibiotic pressure in the presence of an IncA/C plasmid. Genomic islands should be regarded on the one hand as a steady interface of resistance and on the other hand as a dynamic interface conveying resistance genes. Finally, SGI1 of S. enterica was not found to increase virulence in a Caenorhabditis elegans model or in a retrospective clinical study (12% of prevalence). However, it seems that P. mirabilis becomes more virulent when it harbours SGI1 in Caenorhabditis elegans

Les éléments génétiques mobiles (EGM) sont des structures génétiques fréquemment associées à la dissémination de gènes de résistance aux antibiotiques (GRA). Dans ce travail, nous avons utilisé deux EGM comme « proxies », les intégrons de classe 1 et les plasmides IncP-1, afin de mieux comprendre (i) le devenir possible des GRA une fois relargués dans un écosystème fluvial (l’Orne, France), ainsi que (ii) l’effet des pressions anthropiques sur leur persistance. À partir d'analyses de l'eau des rivières, nous avons pu montrer que les deux EGM ne se comportaient pas de la même manière. L'entrée des intégrons de classe 1 dans le système fluvial semblait être diffuse plutôt que ponctuelle, tandis que l'abondance du plasmide IncP-1 est relativement stable le long de la section de la rivière étudiée (23 km), indiquant ainsi une origine plutôt indigène. Les intrants anthropiques tels que les stations d’épuration des eaux usées ne semblent pas affecter l’abondance des EGM en raison d’un niveau trop élevé de dilution des effluents. Par ailleurs, il est intéressant de noter que les bactéries porteuses d’EGM semblaient être enrichies sur les matières en suspension, susceptibles de servir de véhicule pour amener des communautés de bactéries plus riches en EGM vers les sédiments. L'analyse de deux carottes de sédiment indique clairement que seules les couches supérieures présentent un niveau élevé de bactéries porteuses d’EGM. Ces abondances diminuent dans les couches plus profondes où seules des zones ponctuelles présentent des microréservoirs avec des abondances d’EGM plus élevées. Pour une carotte sédimentaire au moins, nous avons pu montrer que l'abondance relative d’EGM corrèle négativement la présence de polluants tel que le plomb ou certains HAP / Mobile genetic elements (MGEs) are genetic structures frequently associated to the dissemination of antibiotic resistance genes (ARGs). In this work, we used two of them as proxies, class 1 integrons and IncP-1 plasmids, to better understand (i) the possible fate of ARGs once released in a river ecosystem (Orne, France), as well as (ii) the effect of anthropogenic pressures on their persistence. From river water analyses, we could show that the two MGEs do not behave the same way. The entry of class 1 integrons in the river system appeared to be diffuse rather than punctual, while the abundance of IncP-1 plasmid is relatively stable along the river section studied (23 km) thus indicating a rather indigenous origin. Anthropic inputs such as wastewater treatment plant did not seem to affect the abundance of MGEs because a too high level of effluent dilution. Interestingly, MGE-bearing bacteria appeared to be enriched on suspended material, which is likely to serve as a vehicle to drive MGE-richer communities of bacteria toward the sediments. The analysis of two sediment cores clearly indicates that only the top layers displayed an elevated level of MGE-bearing bacteria. These abundances decrease in deeper layers where only localized zones display micro-reservoirs of elevated MGE abundances. For one sediment core at least, we could show that the relative abundance of MGE negatively correlates with pollutants such as lead or certain PAHs

Les pompes d'efflux sont des complexes macromoléculaires qui permettent l'efflux des antibiotiques à travers les deux membranes (interne et externe). Ces pompes, spécifiques des bactéries Gram négatif, constituent l'un des acteurs majeurs du phénomène de résistance aux antibiotiques, en contribuant ainsi à la résistance intrinsèque et acquise de ces bactéries à de nombreuses molécules utilisées en antibiothérapie. Chez P. aeruginosa, ces pompes appartiennent pour la plupart à la famille des transporteurs RND. Ce sont des complexes tripartites constitués d'un transporteur de la membrane interne (RND), d'un adaptateur périplasmique (MFP) et d'un canal de la membrane externe (OMF). Ces composants ont été caractérisés individuellement chez de nombreuses bactéries. Cependant, les mécanismes qui régissent l'assemblage et la dissociation de la pompe, essentiels pour son fonctionnement, demeurent mal compris. Nous nous sommes donc intéressés au cours de ce travail aux pompes à efflux de Pseudomonas aeruginosa. Nous avons notamment procédé à la caractérisation structurale du canal OprN de la pompe MexEF-OprN impliquée dans la résistance aux fluoroquinolones et à la caractérisation biophysique du transporteur RND MexY de la pompe MexXY-OprM, spécifique des aminoglycosides. Nous avons étudié en parallèle le mécanisme d'ouverture du canal OprM seul in vitro (aspects structuraux) et in vivo (aspects fonctionnels) au sein de la pompe assemblée. Nos résultats montrent que les OMFs de P. aeruginosa présentent des similitudes avec les OMFs d'autres bactéries Gram négatif, mais également des différences, notamment pour OprN et OprM au niveau de l'interaction avec leurs partenaires ou encore pour OprM concernant l'ouverture du canal. Nous avons par ailleurs participé à l'étude in vitro de l'assemblage et du transport à travers la pompe MexAB-OprM, reconstituée au sein de protéoliposomes, confirmant l'importance de l'acylation de la MFP dans la formation du complexe et montrant l'importance de la force proto-motrice dans l'assemblage de la pompe mais pas dans sa dissociation. En parallèle de l'étude des pompes à efflux, nous nous sommes intéressés à un autre système de résistance, impliqué dans la dégradation des antibiotiques. Nous avons donc réalisé, en collaboration avec le Pr Patrick Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), la modélisation de mutants de la beta-lactamase AmpC de P. aeruginosa, permettant de lier les effets fonctionnels observés à des hypothèses de modifications conformationnelles. / Multidrug efflux systems are membrane transport proteins that are used to translocate a wide variety of drugs across the inner and the outer membranes of Gram-negative bacteria, leading to natural and acquired antimicrobial resistances.Most of the multidrug transporters of P. aeruginosa belong to the resistance-nodulation-cell division (RND) superfamily.They function as three-component assemblies made of an inner membrane transporter (RND), a periplasmic membrane fusion protein (MFP) and an outer membrane factor channel (OMF). Along with functional studies, many crystal structures of the individual components of the pump have been solved but the interactions underlying the complex assembly and the opening mechanism of the outer channel remain unclear. In this study, we investigated structural and functional insights of P. aeruginosa efflux pumps. We solved the crystal structure of the MexEF-OprN efflux pump outer membrane channel OprN mainly involved in fluoroquinolones resistance. Our new structure highlights the differences between P. aeruginosa and other Gram-negative bacteria OMFs that could explain their specific interaction with the cognate MFP partners. We also purified and characterized the inner membrane transporter MexY from the MexXY-OprM efflux pump, which is the major determinant of aminoglycosides resistance in P. aeruginosa. Besides, we solved the crystal structure of a mutatedform of the outer membrane channel OprM in order to understand its opening mechanism. We also investigated in vivo effect of the OprM mutants in antibiotics resistance by MIC measurements and tried to correlate with the observed structural modifications leading to the open state. Moreover, we set up a new in vitro test allowing the investigation of the assembly of the MexAB-OprM efflux pump. Our results showed the importance of MexA and its lipid anchor in promoting and stabilizing the complex assembly. In addition, as a side project with the group of Pr Plésiat (laboratoire de Bactériologie de Besançon), we built different structural models of AmpC mutants from overproducing clinical isolates,showing the possible conformational changes that lead to the resistance increase.

Depuis quelques années et dans plusieurs pays, un nouveau type de Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM), le séquence type (ST) 398, a été fréquemment retrouvé chez les porcs et chez les fermiers en contact avec ces porcs. Au Canada, très peu d’informations sont disponibles concernant le SARM d’origine porcine. Une première étude dans notre laboratoire a permis de récolter 107 isolats de SARM provenant de deux abattoirs porcins du Québec. Le présent travail vise à caractériser les gènes de virulence et de résistance aux antibiotiques de ces SARM, d’étudier leur formation de biofilm en relation avec la spécificité du groupe agr et de vérifier la localisation plasmidique et la transférabilité de ces gènes à des souches de SARM d’origine humaine. Plusieurs souches ont démontré différents patrons phénotypiques de résistance aux antibiotiques. Vingt-quatre souches représentatives de ces isolats ont été soumises à une caractérisation plus approfondie par une étude génotypique en utilisant une biopuce à ADN et un grand nombre de gènes de virulence a été détecté codant pour des entérotoxines staphylococcales, des leucocidines, des hémolysines, des auréolysines, des facteurs d’immunoévasion, des superantigènes, des facteurs d’adhésion et des facteurs impliqués dans la formation de biofilm. Des gènes de résistance envers les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les tétracyclines et les biocides ont été également détectés par biopuce et leur localisation plasmidique a par la suite été déterminée. La transférabilité de ces gènes de souches porcines à des souches de SARM d’origine humaine a été démontrée par conjugaison bactérienne; ainsi le transfert horizontal de certains gènes de résistance aux antibiotiques et de virulence a été observé. Ces travaux de recherche apportent une meilleure connaissance de la résistance aux antibiotiques et de la virulence des SARM d’origine porcine et de leur potentiel de contribution à l’émergence de certaines résistances et facteurs de virulence chez le SARM d’origine humaine. / In recent years and in several countries, a new type of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), the sequence type (ST) 398, has been frequently found in pigs and in farmers in contact with these pigs. In Canada, little information is available concerning MRSA from pigs. A previous study in our laboratory identified 107 MRSA isolates from two pig slaughterhouses in Quebec. This study was conducted to determine antimicrobial resistance and virulence genes of MRSA from abattoir pig, to study their biofilm formation in relation with agr specificity groups and to evaluate horizontal transfer of genes to a MRSA of human clinical origin. Different phenotypic patterns of antimicrobial resistance were observed in these MRSA and a representative subset of these isolates was selected for further characterization. Twenty-four porcine MRSA were characterized by a DNA microarray, the StaphyType of CLONDIAG. Our results demonstrated that the MRSA strains from the abattoirs contain several antimicrobial resistance genes responsible for macrolide and tetracycline resistance and virulence genes encoding staphylococcal enterotoxins, hemolysins, leukocidins, aureolysin, superantigens, immunoevasion, adhesion, and biofilm development. This study presents the first evidence that horizontal transfer of some of these genes can occur between MRSA of porcine and human origin. We also report for the first time biofilm formation in Livestock Associated-MRSA of porcine origin associated with agr group II. It is possible that biofilm formation favors colonization, persistence as well as zoonotic potential. This research provides a better understanding of antimicrobial resistance and virulence of MRSA from pigs and their potential contribution to the emergence of some resistance and virulence factors in MRSA of human origin.

Achromobacter xylosoxidans est un bacille à Gram négatif non fermentaire pathogène opportuniste. Il est de plus en plus fréquemment isolé chez les patients atteints de mucoviscidose, colonisant leur arbre bronchique et pouvant être responsable d'une dégradation de la fonction respiratoire. Il s'agit d'une espèce bactérienne naturellement résistante à de nombreux antibiotiques : aux céphalosporines (hors ceftazidime), à l'aztréonam et aux aminosides. Les résistances acquises sont fréquentes, en particulier dans les souches isolées d'expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Ces résistances acquises concernent des molécules antibiotiques très utilisées pour le traitement des exacerbations respiratoires de la maladie, ce qui conduit parfois à de véritables impasses thérapeutiques. Au début de notre travail, seuls quelques mécanismes de résistance acquise aux β-lactamines avaient été décrits, mais aucun mécanisme impliqué dans la multi-résistance naturelle d'A. xylosoxidans.La résistance aux antibiotiques par efflux actif de type Resistance-Nodulation-cell Division (RND) est très répandue chez les bacilles à Gram négatif non fermentaires. Nous avons identifié dans le génome d'A. xylosoxidans trois opérons pouvant coder pour des systèmes d'efflux RND. Par une technique d'inactivation génique nous avons montré que les trois systèmes d'efflux (AxyABM, AxyXY-OprZ et AxyCDJ) pouvaient exporter des antibiotiques. Deux d'entre eux participent à l'antibio-résistance naturelle d'A. xylosoxidans : AxyABM (résistance à l'aztréonam et à plusieurs céphalosporines) et AxyXY-OprZ (résistance aux aminosides)

Les entérocoques font partie de la flore normale intestinale des animaux et des humains. Plusieurs études ont démontré que les entérocoques d’origine animale pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques pour la communauté humaine et animale. Les espèces Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium sont importantes en santé publique; elles sont responsables d’environ 12% de toutes les infections nosocomiales aux États-Unis. Au Canada, les cas de colonisation et/ou d’infections à entérocoques résistants à la vancomycine ont plus que triplé de 2005 à 2009. Un total de 387 isolats E. faecalis et E. faecium aviaires, et 124 isolats E. faecalis porcins ont été identifiés et analysés pour leur susceptibilité aux antibiotiques. De hauts pourcentages de résistance envers les macrolides et les tétracyclines ont été observés tant chez les isolats aviaires que porcins. Deux profils phénotypiques prédominants ont été déterminés et analysés par PCR et séquençage pour la présence de gènes de résistance aux antibiotiques. Différentes combinaisons de gènes de résistance ont été identifiées dont erm(B) et tet(M) étant les plus prévalents. Des extractions plasmidiques et des analyses par hybridation ont permis de déterminer, pour la première fois, la colocalisation des gènes erm(B) et tet(M) sur un plasmide d’environ 9 kb chez des isolats E. faecalis porcins, et des gènes erm(B) et tet(O) sur un plasmide de faible poids moléculaire d’environ 11 kb chez des isolats E. faecalis aviaires. De plus, nous avons démontré, grâce à des essais conjugatifs, que ces plasmides pouvaient être transférés. Les résultats ont révélé que les entérocoques intestinaux aviaires et porcins, lesquels peuvent contaminer la viande à l’abattoir, pouvaient représenter un réservoir de gènes de résistance envers la quinupristine-dalfopristine, la bacitracine, la tétracycline et les macrolides. Afin d’évaluer l’utilisation d’un antisérum polyclonal SA dans l’interférence de la résistance à de fortes concentrations de bacitracine (gènes bcrRAB), lors d’un transfert conjugatif répondant aux phéromones, un isolat multirésistant E. faecalis aviaire a été sélectionné. Après induction avec des phéromones produites par la souche réceptrice E. faecalis JH2-2, l’agrégation de la souche donatrice E. faecalis 543 a été observée ainsi que des fréquences de transfert élevées en bouillon lors d’une courte période de conjugaison. Le transfert conjugatif des gènes asa1, traB et bcrRAB ainsi que leur colocalisation a été démontré chez le donneur et un transconjugant T543-1 sur un plasmide de 115 kb par électrophorèse à champs pulsé (PFGE) et hybridation. Une CMI de > 2 048 µg/ml envers la bacitracine a été obtenue tant chez le donneur que le transconjuguant tandis que la souche réceptrice JH2-2 démontrait une CMI de 32 µg/ml. Le séquençage des gènes asa1, codant pour la substance agrégative, et traB, une protéine régulant négativement la réponse aux phéromones, a révélé une association de cet élément génétique avec le plasmide pJM01. De plus, cette étude présente qu’un antisérum polyclonal SA peut interférer significativement dans le transfert horizontal d’un plasmide répondant aux phéromones codant pour de la résistance à de fortes doses de bacitracine d’une souche E. faecalis aviaire multirésistante. Des isolats cliniques E. faecium d’origine humaine et canine ont été analysés et comparés. Cette étude rapporte, pour la première fois, la caractérisation d’isolats cliniques E. faecium résistants à l’ampicilline (EFRA) d’origine canine associés à CC17 (ST17) au Canada. Ces isolats étaient résistants à la ciprofloxacine et à la lincomycine. Leur résistance envers la ciprofloxacine a été confirmée par la présence de substitutions dans la séquence en acides aminés des gènes de l’ADN gyrase (gyrA/gyrB) et de la topoisomérase IV (parC/parE). Des résistances élevées envers la gentamicine, la kanamycine et la streptomycine, et de la résistance envers les macrolides et les lincosamides a également été observées. La fréquence de résistance envers la tétracycline était élevée tandis que celle envers la vancomycine n’a pas été détectée. De plus, aucune résistance n’a été observée envers le linézolide et la quinupristine-dalfopristine. Les données ont démontré une absence complète des gènes esp (protéine de surface des entérocoques) et hyl (hyaluronidase) chez les isolats canins EFRA testés tandis qu’ils possédaient tous le gène acm (adhésine de liaison au collagène d’E. faecium). Aucune activité reliée à la formation de biofilm ou la présence d’éléments CRISPR (loci de courtes répétitions palindromiques à interespaces réguliers) n’a été identifiée chez les isolats canins EFRA. Les familles de plasmide rep6 and rep11 ont significativement été associées aux isolats d’origine canine. Les profils PFGE des isolats d’origine humaine et canine n'ont révélé aucune relation (≤ 80%). Ces résultats illustrent l'importance d'une utilisation judicieuse des antibiotiques en médecine vétérinaire afin d’éviter la dissémination zoonotique des isolats EFRA canins. Nous pensons que ces résultats contribueront à une meilleure compréhension des mécanismes de résistance aux antibiotiques et de leurs éléments mobiles ainsi qu’à de nouvelles stratégies afin de réduire le transfert horizontal de la résistance aux antibiotiques et des facteurs de virulence. / Enterococci are part of normal intestinal gut flora of animals and humans. Many studies have shown that enterococci from animal origin could represent an antimicrobial resistance genes reservoir for the human community. The two species Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium are important in public health; they are responsible for approximately 12% of all nosocomial infections in the United States. In Canada, cases of colonization and/or infections to vancomycin resistant enterococci have more than tripled from 2005 to 2009. A total of 387 poultry E. faecalis and E. faecium isolates, and 124 porcine E. faecalis isolates were identified and analyzed for their antibiotic susceptibilities. High percentages of resistance to macrolides and tetracyclines were found in both avian and porcine isolates. Two predominant phenotypic profiles were determined and analyzed by PCR and sequencing for the presence of antimicrobial resistance genes. Various combinations of antibiotic resistance genes were detected; erm(B) and tet(M) were the most common genes. For the first time, plasmid extraction and hybridization revealed colocalization of erm(B) and tet(M) on a plasmid of ~9 kb in porcine E. faecalis isolates, and of erm(B) and tet(O) on a low-molecular-weight plasmid of ~11 kb in poultry E. faecalis isolates. Furthermore, we demonstrated, through mating experiments, these plasmids could be transferred. Results indicate that the intestinal enterococci of healthy pigs and poultry, which can contaminate meat at slaughter, could be a reservoir for quinupristin-dalfopristin, bacitracin, tetracycline, and macrolide resistance genes. To assess the use of a polyclonal antiserum AS on the contact interference of a high level bacitracin resistant (bcrRAB genes) pheromone-responsive plasmid, a multiresistant E. faecalis isolate of poultry origin was selected. After induction with pheromones produced by the recipient strain E. faecalis JH2-2, clumping of the donor E. faecalis strain 543 was demonstrated as well as high transfer frequencies in short time broth mating. Conjugative transfer of asa1, traB and bcrRAB genes and their co-localization were also demonstrated in the donor strain and a transconjugant T543-1 on a plasmid band of 115 kb by PFGE and Southern blotting. A MIC to bacitracin of > 2 048 µg/ml was obtained for both strains 543 and T543-1 whereas the recipient strain JH2-2 demonstrated a MIC of 32 µg/ml. Sequencing of the asa1 gene encoding for an AS, and traB for a pheromone shutdown protein, confirmed the association of this genetic element to the pheromone-responsive plasmid related to pJM01. More significantly, this study presents the evidence that a polyclonal antiserum AS can significantly interfere with the horizontal transfer of a pheromone-responsive plasmid encoding high-level bacitracin resistance of a poultry multidrug resistant E. faecalis strain. Clinical isolates of E. faecium of human and canine origin were analyzed and compared. This report describes for the first time the characterization of canine clinical ampicillin-resistant E. faecium (AREF) isolates related to CC17 (ST17) in Canada. These isolates were resistant to ciprofloxacin and lincomycin. Resistance to ciprofloxacin was confirmed by amino acid substitutions in DNA gyrase (gyrA/gyrB) and topoisomerase IV (parC/parE) genes. High-level gentamicin, -kanamycin and -streptomycin resistances and macrolides resistance were also observed. The frequency of tetracycline resistance was high whereas vancomycin resistance was not detected. Also, no resistance was observed to linezolid and quinupristin-dalfopristin antibiotics. Data demonstrated the complete absence of enterococcal surface protein (esp) and hyaluronidase (hyl) genes among the canine AREF isolates tested while all were acm (collagen adhesin from E. faecium) positive. However, most of them were shown to harbor efaAfm gene, encoding for a cell wall adhesin. No biofilm formation or clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) elements were identified in these canine AREF isolates. rep6 and rep11 families of plasmids were significantly associated with isolates from dogs. The PFGE patterns of human and dog isolates were considered unrelated (≤ 80%). These findings also support the importance of prudent use of antibiotics in veterinary medicine to avoid zoonotic spread of canine AREF isolates. We are confident that our results may help to better understand the mechanisms of antibiotic resistance and mobile element carrying them as well as new strategies to reduce the horizontal transfer of antibiotic resistance and virulence traits.

Grâce à la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF, l'identification des bactéries est maintenant possible en quelques minutes. Mais le taux de mortalité des patients augmente lorsqu'une antibiothérapie inappropriée est utilisée et les instruments MALDI-TOF ne sont pas capables d'analyser rapidement et exhaustivement la résistance bactérienne. Actuellement, 6 à 24 heures sont nécessaires pour déterminer le phénotype de résistance. En couplant une chromatographie liquide et un spectromètre de masse à ionisation électrospray (LC-MS/MS), nous avons identifié les marqueurs de résistance en 1 à 2 heures. En 30 min, nous avons pu détecter les mécanismes de résistance aux β-lactamines, aux glycopeptides, à la méthicilline et aux fluoroquinolones, à l'aide de méthodes de type "Suivi de Réactions Sélectionnées", ou "Selected Reaction Monitoring" (SRM). Au cours de la même analyse multiplexée, des dizaines de protéines peuvent être détectées de façon hautement spécifique et sensible. Comme l'illustre l'étude de la résistance multifactorielle chez Acinetobacter baumannii, cette approche permet en outre une analyse quantitative d'un grand intérêt pour certains mécanismes de résistance. Cependant, malgré ces perspectives attrayantes, la LC-MS/MS reste, aujourd'hui, loin d'une possible implantation en routine dans les laboratoires de microbiologie. Les instruments sont trop coûteux et la technologie trop complexe pour un usage pour du diagnostic in vitro. La spectrométrie de masse pourrait déjà avantageusement compléter les technologies actuelles de biologie moléculaire. Aujourd'hui, le séquençage de nouvelle génération est la méthode de référence pour la caractérisation moléculaire des bactéries. Mais, comme démontré dans ce travail, l'annotation des gènes est perfectible. Pour quelques dizaines d'euros et quelques heures d'analyse, les peptides identifies par spectrométrie de masse facilitent l'assemblage des séquences (« scaffolds ») et la détection des gènes. De surcroît, la spectrométrie de masse permet une quantification précise des protéines. Elle apporte ainsi une nouvelle dimension analytique et une vision moléculaire plus proche du phénotype. En conclusion, la spectrométrie de masse LC-MS/MS peut être une technologie complémentaire attractive, voir une future alternative, à la biologie moléculaire pour la caractérisation des bactéries / Thanks to MALDI-TOF mass spectrometry, identification of isolated bacteria is now possible within a few minutes. But doctors also need to rapidly know the phenotype of resistance of the bacteria. Indeed, the patient mortality rate increases when the antibiotherapy is not appropriate. However, MALDI-TOF instruments are not able to analyze antibacterial resistance rapidly and comprehensively.Today, 6 to 24 hours are nedded for antibiotic susceptibility testing. When combining a liquid chromatography and a mass spectrometer with electrospray ionization (LC-MSMS), the detection of resistance biomarkers was possible within 1 to 2 hours. Using a Selected Reaction Monitoring (SRM) method, resistance mechanisms to beta-lactams, methicillin, glycopeptides and fluoroquinolones were detected in strains within 30 minutes. Tens of resistance determinants can be analyzed in a single multiplexed assay, with high specificity and sensitivity. Illustrated by the study of multifactorial resistance in Acinetobacter baumannii, the technology allows furthermore a quantitative analysis, which is of great value for some resistance mechanisms. Similarly, we identified virulent strains of enterohemorrhagic Escherichia coli by targeting toxins and serotype biomakers in the same assay. Mass spectrometry offered deeper bacterial characterization than conventional serotyping using polyclonal antibodies. However, despite all these favorable prospects, LC-MS/MS remains today far from reaching a routine use in microbiological hospital laboratories. Instruments are too expensive and the technology is too cumbersome for a daily in vitro diagnostic use. Waiting for a more suitable use, mass spectrometry could yet advantageously complement current molecular technologies. Today, the gold standard to study bacteria at molecular level is next generation sequencing. However, as demonstrated during this work, gene annotation remains imperfect. For tens of euros and few hours of analysis, peptides identified by mass spectrometry analysis of a bacteria might improve scaffold assembly and gene detection. Moreover, mass spectrometry gives an accurate protein quantitation and brings a new analytical dimension, potentially closer to the phenotype than molecular techniques. In conclusion, LC-MS/MS mass spectrometry could be an attractive complementary, or alternative technology in a near future, to conventional molecular biology techniques for deep characterization of bacteria

La tuberculose (TB), provoquée par Mycobacterium tuberculosis, est une des trois maladies prioritaires dans le monde. Les TB multi-résistantes (MDR) et ultra-résistantes (XDR-TB) représentent des obstacles majeurs pour la lutte antituberculeuse. Dans les pays à MDR-TB élevée, comme le Vietnam, la détection insuffisante de la résistance aux antibiotiques est un des facteurs principaux qui favorisent la transmission des souches résistantes. De plus, dans ces pays, encore très peu de choses sont connues sur la résistance à la pyrazinamide et aux antibiotiques de seconde ligne et sur les déterminants génétiques liés à ces résistances. Dans ce contexte, ce travail vise donc à acquérir des connaissances sur la résistance aux antibiotiques au Vietnam et à étudier comment M. tuberculosis évolue de l’état sensible à l’état ultra-résistant.260 isolats cliniques collectés au Vietnam entre 2005 et 2009 ont été inclus. Diverses techniques et analyses ont été utilisées: tests de sensibilité aux médicaments (développement d'un test à temps réduit), spoligotypage et MIRU-VNTR (24 loci) et séquençage de gènes. Les données ont été analysées par des analyses statistiques et phylogénétiques. Ce travail s’est d’abord focalisé sur la caractérisation d’isolats hautement résistants et sur la résistance à la pyrazinamide. Une forte proportion d'isolats quadruple résistants aux antibiotiques de première ligne a été identifiée comme pré-XDR et XDR et en majorité appartenant à la famille Beijing. L'analyse moléculaire a également révélé une forte proportion d'isolats, en particulier MDR, quadruple résistants et de la famille Beijing, portant des mutations associées à la résistance à la pyrazinamide.L'analyse génétique et phylogénétique globale a ensuite montré une grande diversité de profils de mutations dans chaque famille et chaque cluster MIRU-VNTR. Ces données suggèrent que M. tuberculosis peut suivre des chemins évolutifs variés pour devenir ultra-résistant. La prédominance de mutations et de combinaisons de mutations associées à un haut niveau de résistance et à un faible coût en termes de fitness suggère un effet cumulatif des mutations et un rôle de l’épistasie dans l'acquisition de la résistance multiple. De plus, une fréquence élevée de mutations compensatoires associées à la résistance à la rifampicine a été détectée chez les isolats très résistants. Ces processus semblent donc influencer fortement l'évolution de la résistance dans notre échantillon. Il est à noter que les mutations liées à des niveaux de résistance élevée et à de faibles coûts en termes de fitness, ainsi que les mutations compensatoires étaient plus particulièrement associées à la famille Beijing.En conclusion, ce travail fournit des connaissances uniques sur la résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis au Vietnam. En particulier, ces données prédisent une évolution de la résistance vers une situation de plus en plus préoccupante. Premièrement, la famille Beijing, en cours d’invasion au Vietnam, apparaît associée à de hauts niveaux de résistance, de faible coût en termes de fitness et aux mutations compensatoires. Deuxièmement, le risque élevé de résistance à la pyrazinamide remet en question son efficacité et son utilisation dans les traitements contre la MDR et la XDR-TB. Troisièmement, les données suggèrent une évolution de M. tuberculosis vers un potentiel de résistance plus élevé par effet cumulatif des mutations associés à la résistance et l’existence de phénomènes d’épistasie. Comme les échantillons étudiés dans ce travail ont été collectés, l’étape suivante est de valider nos hypothèses sur des données actualisées.Enfin, ce travail avec les données déjà publiées a permis d’établir, pour la première fois, un inventaire des mutations associées à la résistance aux antibiotiques chez M. tuberculosis au Vietnam. Cette base de données sera utilisée pour le développement d'une puce à ADN pour la détection rapide de la résistance aux antibiotiques au Vietnam. / Tuberculosis (TB) is one of the deadliest infectious diseases worldwide, mainly caused by Mycobacterium tuberculosis. Multidrug resistant (MDR) and extensively drug resistant (XDR) TB are currently main challenges for TB control. In high MDR-TB burden countries like Vietnam, one of the main factors of drug resistant strain spread is the insufficient capacity of drug resistance detection. Besides, still little is known in these countries about the resistance to second line and pyrazinamide drugs (key drugs in the MDR-TB treatment) and the genetic determinants linked to these resistances. In this context, this work aimed to acquire knowledge on drug resistance in Vietnam and to understand how M. tuberculosis evolved from sensitive to highly drug resistance form by molecular analysis.260 clinical isolates collected in Vietnam between 2005 and 2009 were included. Various techniques and analyses were used: drug susceptibility testing (development of a test with a reduced turn-around time), spoligotyping and 24-MIRU-VNTR typing and gene sequencing. The data were analyzed by statistical and phylogenetic analyses.First, this work was focused on highly drug resistant M. tuberculosis clinical isolates and pyrazinamide resistance. A high proportion of quadruple first-line drug resistant isolates (resistant to isoniazid, rifampicin, streptomycin and ethambutol) have been characterized as pre-XDR and XDR isolates, belonging especially to Beijing family. The molecular analysis revealed also high proportion of drug resistant isolates carrying highly confident pyrazinamide resistance-associated mutations, particularly in MDR and quadruple resistant isolates and in Beijing family.Second, the genetic and phylogenetic analyses showed high diversity of mutation patterns within each family and each MIRU-VNTR cluster suggesting various evolutionary trajectories towards first and second-line drug resistance. The predominance of specific mutations and combinations of mutations associated with high level of resistance and low fitness cost suggests a cumulative effect of mutations and a role for epistasis in multiple-drug resistance acquisition. In addition, high frequency of fitness-compensatory mutations associated with rifampicin resistant mutations was detected in highly drug resistant isolates. These processes may drive the evolution of drug resistance in this sample and lead to a successful spread of highly drug resistant strains. It is worth noting that Beijing family was specifically linked to high-level drug resistance and low fitness cost mutations and to compensatory mutations.In conclusion, this work provides knowledge on the resistance to the first and second-line anti-TB drugs in clinical M. tuberculosis samples collected in Vietnam between 2005 and 2009. These data predict an evolution towards a more problematic situation in terms of drug resistance. First, because the Beijing family, which is currently invading Vietnam, is associated with highly drug resistance, mutations linked to high-level drug resistance and low fitness cost and compensatory mutations. Second, the high risk of pyrazinamide resistance in our sample challenges the efficacy and the use of this drug in MDR-TB treatment. Third, our data suggest an evolution of M. tuberculosis towards a higher potential of drug resistance because of a probable cumulative effect of drug resistant mutations and epistatic interactions. Since the samples under study were collected between 2005-2009, the next step is to test our hypotheses on a recent sampling. Finally, this study together with published data allowed making, for the first time, an inventory of the drug resistance associated mutations in M. tuberculosis isolates from Vietnam.

La perméabilité membranaire joue un rôle important dans la résistance aux antibiotiques chez lesbactéries à Gram négatif.L’objectif de notre travail était de caractériser la fonction tenue par les deux régulateurs globaux dela perméabilité membranaire chez Enterobacer aerogenes: mar et ram. L’objectif initial futd’identifier le répresseur spécifique de RamA qui manquait en tant qu’élément de la cascade derégulation actuellement définie. La sélection de 60 souches nous a permis de confirmer le rôlecentral joué par RamA dans la régulation, ainsi qu’identifier des mutations pouvant être critiques, auniveau de RamR. Ainsi, l’absence variations observées dans le régulon marRAB et l’expressionmodérée des transcrits montrée par qRT-PCR laisse penser, que RamA a un rôle clef dans larégulation de l’expression des porines et des pompes d’efflux chez E. aerogenes.L’autre partie de notre travail reposait sur l’étude de la translocation des antibiotiques au traversdes porines. L’étude des interactions porine-carbapénèmes s’est faite sur la porine sauvage OmpFd'Escherichia coli et deux mutations. Les résultats indiquent également l'importance de l'aspartateen position 113 dans la sélectivité de translocation des carbapénèmes au sein de la porine OmpF.Ce travail montre ainsi que la translocation des pénicillines est aussi sous la dépendance desinteractions qui se créent entre le substrat et le résidu en position 113 de OmpF et limitent alorsleur passage au niveau du canal porine. Nous avons recherché la contribution attribuée à la porineOmp36 d'E. aerogenes dans la translocation de certaines béta-lactamines. Les mesures ont permisde conclure que les deux beta-lactamin / Genetic permeability plays an important role in antibiotic resistance of Gram-negative bacteria.Our work was to characterize and better understand of the genetic regulation of membranepermeability in E. aerogenes. We focused on two global regulators, mar and ram, in about 60clinical isolates. Alterations in the upstream region of ramA and in ramR but no mutations in marAnor marR were observed. Overexpression of ramA or ramR led to an altered antibiotic susceptibilityassociated to decrease of porins expression and over-expression of efflux-pumps. qRT-PCR pointedout the estimated importance of the ram-regulon in the regulation cascade.Another part of this work was to characterize the translocation of compounds through porins andthe role of porins in drug uptake in general. Measurement of the rate of antibiotic action of threecarbapenems in an E. coli strain solely expressing OmpF as porin clearly indicated the importanceof the aspartate at position 113 in antibiotic translocation. A multi-disciplinary three way approachof computer modeling, black-lipid-bilayer assays and measurement of antibiotic action, suggestedthat interactions with residue D113 of E. coli porin OmpF are rate-limiting for transport throughthe porin channel. Combination of biological and biophysical measurements with E. aerogenesporin Omp36 denoted that interactions between the porin channel and the antibiotic facilitate andaccelerate transport.