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La résistance aux antibiotiques a pris une ampleur considérable du fait de l’utilisation des antibiotiques dans de nombreux domaines. Pour respecter l’approche « OneHealth », il est essentiel d’avoir une image spécifique de chaque situation, afin d’orienter les recommandations et de limiter la dissémination des gènes, des plasmides et des clones. Nos objectifs étaient adaptés à nos populations d’étude (chevaux et porcs) afin d’ajuster les résultats aux besoins des filières. Dans la filière équine, nous avons quantifié les résistances phénotypiques et identifié les gènes de β-lactamases à spectre étendu (BLSE/AmpC) présents dans le microbiome des chevaux sains, et nous avons identifié les facteurs de risque associés à leur portage en France et au Québec. En France, nous avons également caractérisé les mécanismes de dissémination des gènes de BLSE/AmpC. Nous avons mis en évidence qu’en France et au Québec, les E. coli commensaux provenant de fèces de chevaux sains étaient majoritairement non susceptibles à l’ampicilline, l’amoxicilline/acide clavulanique et la streptomycine et que des E. coli multirésistants et porteurs de gènes codant pour des BLSE/AmpC étaient détectés dans respectivement environ 45% et 8% des chevaux. Le blaCTX-M-1 était majoritairement détecté bien qu’en France d’autres BLSE aient été identifiés (blaCTX-M-2 et blaCTX-M-14) ainsi que le gène AmpC blaCMY-2. L’administration d’un traitement médical, le nombre de personnes s’occupant des chevaux, le type d’activité et le fait de participer à un évènement équestre dans les trois derniers mois ont été identifiés comme des facteurs de risque du portage des E. coli multirésistants ou producteurs de gènes BLSE/AmpC, soit en France soit au Québec. En France, le plasmide IncHI1-ST9 était majoritairement associé aux gènes blaCTX-M-1/2 et à l’opéron fos. Pour la filière porcine, nos objectifs étaient de colliger les données de la base de données du laboratoire EcL entre 2008 et 2016, d’évaluer la présence d’un agrégat spatio-temporel pour les isolats ETEC:F4 non susceptibles à l’enrofloxacine et de caractériser ces isolats et les éléments génétiques mobiles qu’ils transportent. En effet, l’enrofloxacine est un antibiotique de haute importance en santé humaine, et doit donc faire l’objet d’une surveillance accrue. Nous avons trouvé que plus de 90% des isolats d’E. coli entérotoxinogènes détectés chez des cas de porcs malades soumis au laboratoire EcL de 2008 à 2016 au Québec, étaient multirésistants. Le virotype LT:STb:F4 prédominait jusqu’en 2014, puis a été dépassé par le virotype LT:STb:STa:F4. Un agrégat spatio-temporel d’isolats LT:STb:STa:F4 non susceptibles à l’enrofloxacine a été détecté entre 04/2015 et 09/2016 au centre de la Montérégie. Nous avons démontré la présence d’un clone ETEC:F4 non susceptible à l’enrofloxacine, à haut risque, qui se dissémine en Amérique du Nord depuis 2013. Les isolats appartenant à ce clone sont ST100, O149:H10. Ils sont multirésistants, et associés à une pathogénicité et une virulence augmentée par rapport aux isolats détectés avant 2000. Ils portent le réplicon IncFII. Les résistances et leur mécanisme de dissémination sont différents selon l’espèce animale. Ces divergences sont fonction de l’usage des antibiotiques, et des échanges possibles avec les différents protagonistes en contact avec les animaux. / Antimicrobial resistance has become an essential issue in the last decades because of the extensive use of antimicrobials in numerous sectors. In order to follow the OneHealth approach, it is critical to have a precise picture of each situation, to adjust recommendations and prevent resistance gene dissemination as well as plasmid and clone spread. Our objectives were adapted to the animal populations under study. Therefore, our results were compatible with each sector. In the equine sector, we quantified phenotypic resistance and identified β-lactamase (ESBL/AmpC) genes present in the intestinal microbiome of healthy horses and we identified risk factors associated with their carriage both in France and in Quebec. Then, in France we characterized ESBL/AmpC gene spread mechanisms. We demonstrated that commensal E. coli originating from the feces of healthy horses were mostly non-susceptible to ampicillin, amoxicillin/clavulanic acid and streptomycin. The presence of multidrug resistant E. coli and of E. coli carrying ESBL/AmpC genes was found in around 45% and 8% of horses respectively. The most frequently detected gene was blaCTX-M-1, although blaCTX-M-2 and blaCTX-M-14 were also identified in France. The AmpC gene blaCMY-2 was identified in both localities. Medical treatment, staff number, activity, and participation in an equestrian event within the last three months were identified as risk factors for MDR or ESBL/AmpC E. coli. In France, commensal E. coli from healthy horses most commonly possessed the IncHI1-ST9 plasmid. This plasmid carries blaCTX-M-1/2 genes and the fos operon. For the swine sector in Quebec, our objectives were to gather data provided by the Animal pathogenic and zoonotic E. coli (APZEC) database between 2008 and 2017, to assess the presence of a spatio-temporal cluster for enrofloxacin non-susceptible ETEC:F4 and to characterize these isolates and the mobile genetic elements they carry. Enrofloxacin is an antibiotic classified as highly important in human medicine and as such needs to come under higher scrutiny. For this sector, we demonstrated that more than 90% of enterotoxigenic E. coli (ETEC) isolates from diseased swine submitted to the EcL between 2008 and 2016, were multidrug resistant. The main virotype in 2014 was LT:STb:F4. It was subsequently replaced by the LT:STb:STa:F4 virotype. A spatio-temporal cluster of LT:STb:STa:F4 isolates non-susceptible to enrofloxacin was detected between 04/2015 and 09/2016 in the centre of the Monteregie region. These isolates constituted an ETEC:F4 high risk enrofloxacin non-susceptible clone, which has been spreading in North America since 2013. Isolates belonging to this clone are ST100, O149H10, phylogroup A, and fimH gene negative. These isolates are multidrug resistant and associated with a higher pathogenicity and virulence than isolates detected before 2000. They all carry the incFII replicon. Resistance and mechanisms of dissemination are different according to the animal species being studied. This is likely due to different patterns of antimicrobial use in each industry and possible interactions with different protagonists in contact with the animals. It is essential to understand the situation for each animal species in order to adapt recommendations for efficiently limiting the spread of resistance genes, plasmids and clones.

La résistance aux antibiotiques est une menace sérieuse pour la santé publique. En effet, si on ne change pas rapidement notre consommation excessive d'antibiotiques, la situation actuelle va se dégrader jusqu'à basculer dans une ère dite "post-antibiotique", dans laquelle plus aucun antibiotique ne sera efficace contre les infections microbiennes. Bien que ce phénomène de résistance apparaît naturellement, l'utilisation abusive d'antibiotiques accélère le processus. De plus, la présence de pathogènes multi-résistants neutralise l'effet des traitements existants et dans le cas de chirurgies courantes (césariennes, transplantations d'organe...), la situation peut rapidement s'aggraver voire devenir mortelle. C'est pourquoi des directives, émanant des autorités sanitaires, doivent être mises en place afin de contrôler l'utilisation des médicaments, et ce, à tous les niveaux de la société, des individus au secteur agricole en passant par les professionnels de santé et les industries pharmaceutiques. Le monde de la recherche scientifique, quant à elle, doit trouver des nouvelles stratégies pour enrayer la propagation de la résistance. Dans ce contexte, cette thèse a pour objectif le développement d'une méthode de prédiction, par calculs d'énergie libre, des mutations de β-lactamases favorables à l'hydrolyse des β-lactames. Ces travaux méthodologiques ont donc conduit au développement : (1) de nouveaux paramètres pour les enzymes à zinc, implémentés dans le champ de force OPLS-AA et validés par des simulations de dynamique moléculaire sur un panel de métalloenzymes représentatives, (2) d'un protocole de paramétrisation de ligands covalents pour étudier le comportement de certains β-lactames dans CMY-136, une nouvelle β-lactamase caractérisée au laboratoire, et (3) d'un protocole de calcul d'énergie libre évalué au moyen de compétitions internationales de prédiction. Ce dernier a ensuite été utilisé pour tenter d'expliquer pourquoi la carbamylation de la sérine catalytique n'a pas lieu dans certaines oxacillinases. Au travers de ces travaux, nous avons pu améliorer significativement notre approche computationnelle et désormais tout est en place pour une exploration exhaustive des mutations possibles dans les β-lactamases. / Antibiotic resistance is a global concern threatening worldwide health. Indeed, if we don't change our overconsumption of antibiotics, the current situation could worsen until a "post-antibiotic" era in which existing treatment would be ineffective against microbial infections. Despite the natural occurrence of antibiotic resistance, the misuse of antibiotics is speeding up the process. Furthermore, presence of multi-resistant pathogens negates the effect of modern treatments and usual surgeries (caesarean sections, organ transplantations...) might be riskier in the future, or even lethal. That's why, common guidelines have to be edicted by health authorities in order to control antibiotic use at every level of society, from individuals to healthcare industry including health professionals and agriculture sector. As for scientific research, new strategies have to be considered in order to limit the spread of antibiotic resistance. In that context, the presented thesis aimed at developing a protocol to predict, by free energy calculations, β-lactamase mutations which could promote the hydolysis of β-lactams antibiotics. In order to achieve that, we developed several methodological approaches including: (1) new parameters for zinc enzymes implemented in OPLS-AA force field and thereafter validated using molecular dynamics simulations of representative zinc-containing metalloenzymes, (2) a protocol to parameterize covalent ligands in order to analyze the dynamical behavior of some β-lactams in CMY-136, a novel β-lactamase recently characterized in our laboratory, and (3) a pmx-based free energy protocol. The latter was also assessed through several international blinded prediction challenges, and finally used to find out why carbamylation of the catalytic serine is not observed in certain OXA enzymes. Throughout this work, we made significant improvements in our protocol, and now everything is in place for an exhaustive prediction of possible mutations in β-lactamases.

Travaux de recherche effectués sous la supervision de la docteure Marylise Duperthuy (directrice) et de la docteure Catherine Paradis-Bleau (codirectrice). / L’augmentation de l’incidence des infections bactériennes par des souches résistantes, multirésistantes, voire même ultrarésistantes, aux antibiotiques, combinés à la crise de découverte de nouvelles molécules depuis les années 1960 et du sous-investissement chronique de certains états dans la recherche publique, pourrait coûter la vie à 10 millions d’êtres humains par an d’ici 2050. L’écrasante majorité des souches bactériennes résistantes aux antibiotiques sont des bactéries à Gram négatif. Ceci est notamment dû à la composition intrinsèque de leur enveloppe, leur permettant d’être insensibles à de nombreuses molécules pourtant létales pour d’autres types de bactéries. L’étude des composants et des mécanismes de biosynthèse de l’enveloppe, qui sont essentiels au maintien de l'intégrité des bactéries et peuvent être impliqués dans leur virulence, devrait permettre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans le premier chapitre, nous allons tout d’abord faire un tour d’horizon des éléments composant l’enveloppe des bactéries à Gram négatif, des mécanismes de résistance aux antibiotiques et du danger que représentent les bactéries à Gram négatif. Mes résultats de recherches, présentés sous forme de quatre articles aux chapitres deux à cinq, sont précédés d’une mise en contexte des recherches propres aux deux laboratoires, portant d’une part sur les biofilms et la mobilité de Vibrio cholerae et d’autre part sur l’enveloppe de Escherichia coli. Dans le premier article, nous avons déterminé par quel mécanisme la polymyxine B en concentration sous-inhibitrice affecte la formation de biofilm chez Vibrio cholerae. Nous avons observé que la polymyxine B affecte principalement le flagelle par une action mécanique. La formation de biofilm nécessitant le flagelle dans ses premières étapes de formation, nous avons conclu que l’action de la polymyxine B prévenait ce changement d’état. Dans le second article, nous avons conçu un protocole d’évolution expérimentale qui nous a permis d’identifier des mutations dans différents gènes permettant à Vibrio cholerae de se déplacer plus rapidement en présence de concentration sous-inhibitrice de polymyxine B. Nous avons alors identifié chez plusieurs souches différentes mutations ayant probablement réduit ou anéanti la fonction des protéines IhfA, DacB, VacJ (MlaA) et MlaF. En nous basant sur la littérature, nous proposons que la perte de fonction de ces 5 protéines induisant l’augmentation de la mobilité en présence de polymyxine B puisse s’expliquer selon trois mécanismes, impliquant la stabilité de l’enveloppe, la sécrétion de vésicules de membrane ou une altération de l’expression de différents gènes. Dans le troisième article, nous avons étudié l’implication du stress oxydatif dans l’arrêt de la synthèse de la paroi qui est fatal au mutant ∆elyC de Escherichia coli. Nous avons alors démontré que la lyse du mutant ∆elyC est causée par la surproduction de radicaux hydroxyles dans son enveloppe. Cette molécule cause des dommages dans l’enveloppe suffisamment importants pour provoquer l’arrêt de synthèse de la paroi. Le mécanisme provoquant cette surproduction de radicaux toxiques reste encore à déterminer. Par le biais de l’étude de la fonction du facteur ElyC, nous avons découvert une nouvelle vulnérabilité dans l’homéostasie de l’enveloppe qu’il nous tarde de pouvoir exploiter. Dans le dernier article, nous avons étudié l’importance de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries dans le processus létal apparaissant en l’absence du facteur ElyC. Nous avons découvert que le mutant ∆elyC accumule un élément commun aux voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries, l’undécaprényl pyrophosphate. Nous avons également découvert que l’augmentation du recyclage de cette dernière via la surexpression du gène codant pour la protéine PgpB permettait de prévenir la lyse du mutant. Notre hypothèse est que l’absence de ElyC induit une mauvaise répartition de l’undécaprényl phosphate entre les voies de synthèse de la paroi et de l’antigène commun aux entérobactéries. La suractivité de la voie de synthèse de l’antigène commun aux entérobactéries induirait l’accumulation d’undécaprényl pyrophosphate provoquant l’inhibition de Pbp1b, empêchant l’ajout de nouvelles sous-unités à la paroi conduisant ainsi à la lyse du mutant ∆elyC. Ainsi l’ensemble de ces travaux a permis de mieux comprendre et d’identifier des vulnérabilités de l’enveloppe de Vibrio cholerae et Escherichia coli, de préciser certains mécanismes ainsi que d’entrevoir le rôle de divers facteurs impliqués dans l’homéostasie de leur enveloppe. / The increased incidence of bacterial infections by resistant, multiresistant and even extensively drug-resistant strain, combined with the crisis of new molecules discovery since the 1960s and the chronic underinvestment of certain states in public research, could cost 10 million human lives per year by 2050. The overwhelming majority of resistant bacteria are the Gram-negative one. This is mainly due to the intrinsic composition of their envelope, allowing them to be insensitive to many molecules yet lethal for other types of bacteria. The study of envelope components and biosynthetic mechanisms, which are essential for the maintenance of bacterial integrity and could be involved in their virulence, should lead to the identification of new therapeutic targets. The first chapter gave an overview of the different elements composing Gram-negative bacteria envelope, mechanisms of resistance and the threat that Gram-negative bacteria represent. The presentation of my work, divided in four articles from chapter two to chapter five, was preceded by a contextualization of the research projects specific to both laboratories, on biofilm and motility of Vibrio cholerae on one hand and on Escherichia coli envelope from the other hand. In the first paper, we determined the mechanism by which a sub-inhibitory concentration of polymyxin B affects biofilm formation in Vibrio cholerae. We observed that polymyxin B mainly affected the flagellum by a mechanical action. Since biofilm formation requires the flagellum in the early stages of its formation, we concluded that the action of polymyxin B prevented this change in Vibrio cholerae lifestyle. In the second paper, we designed an experimental evolution protocol which allowed us to identify mutations in different genes that increase Vibrio cholerae motility in the presence of sub-inhibitory concentration of polymyxin B. We then identified that different mutations had altered ihfA, dacB, vacJ (mlaA) and mlaF genes in different mutants. These mutations have probably induced reduction or loss of function of the proteins for which they respectively code. Based on literature, we hypothesize that the loss function of these proteins inducing increase in mobility in the presence of polymyxin B could be explained by three 7 mechanisms involving envelope stability, secretion of membrane vesicles or altered expression of various genes. In the third paper, we investigated the involvement of oxidative stress in the fatal peptidoglycan synthesis arrest occurring in the ∆elyC mutant of Escherichia coli. We then demonstrated that lysis of the ∆elyC mutant is caused by the overproduction of hydroxyl radicals in its envelope. This molecule causes multiple and sufficiently important damages in the envelope to stop the synthesis of the wall. The mechanism causing this overproduction of toxic radicals has yet to be determined. By studying the function of the ElyC factor, we have discovered a new weakness in envelope homeostasis that we are eager to exploit. In the last paper, based on a previously formulated hypothesis, we investigated the importance of the enterobacterial common antigen synthesis pathway in the lethal process occurring in the absence of ElyC. We found that the ∆elyC mutant accumulates common element to the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, undecaprenyl pyrophosphate. We also observed that the ∆elyC mutant lysis phenotype could be suppressed by increasing undecaprenyl pyrophosphate recycling via the overexpression of the gene coding for the phosphatase PgpB. We propose that the absence of ElyC induces a misallocation of undecaprenyl phosphate between the cell wall and enterobacterial common antigen synthesis pathways, in favors the latter pathway. Overactivation of the enterobacterial common antigen pathway would induce undecaprenyl phosphate accumulation, causing inhibition of Pbp1b, thus blocking addition of new subunits to the cell wall and leading to its lysis. Ultimately, all the original data generated by my research project has led to a better understanding of envelope vulnerabilities of Vibrio cholerae and Escherichia coli, to clarify certain mechanisms but also to glimpse the role of various factors involved in the homeostasis of their envelope. / L'aumento dell’incidenza delle infezioni da batteri resistenti, multi-resistenti e anche estremamente resistenti agli antibiotici, combinata con la rarefazione della scoperta di nuove molecole fra gli anni 1960 e il sotto investimento cronico di certe nazioni nella ricerca pubblica, potrebbe costare la vita a 10 milioni di essere umano all'anno nel 2050. La stragrande maggioranza delle specie resistenti agli antibiotici sono batteri Gram- negativi. Questo è dovuto principalmente alla composizione intrinseca dei loro involucri che permette loro di essere insensibili a molte molecole che sono letali per altri tipi di batteri. Lo studio delle componenti e i meccanismi di sintesi dell’incurvo, che sono essenziali nell’integrità dei batteri e che possono essere coinvolti nella loro virulenza, dovrebbe permettere l'identificazione di nuovi bersagli terapeutici. Nel primo capitolo, avremo una panoramica dei diversi elementi che compongono l'involucro dei batteri Gram-negativi, dei meccanismi di resistenza e della minaccia che i batteri Gram-negativi rappresentano. La presentazione del mio lavoro, diviso in quattro articoli dal capitolo due a cinque, sarà preceduta da una contestualizzazione dei progetti di ricerca specifici di ciascuno dei due laboratori, sul biofilm e la motilità di Vibrio cholerae da un lato e sull'involucro di Escherichia coli dall'altro. Nel primo articolo, abbiamo determinato il meccanismo con cui la polimixina B in concentrazione sub-inibitoria influenza la formazione de biofilm in Vibrio cholerae. Abbiamo osservato che la polimixina B danneggia principalmente il flagello attraverso un'azione meccanica. Poiché la formazione del biofilm richiede il flagello nelle prime fasi della sua formazione, abbiamo concluso che l'azione della polimixina B ha impedito questo cambiamento nello stile di vita di Vibrio cholerae. Nel secondo articolo, abbiamo messo a punto un protocollo di evoluzione sperimentale che ci ha permesso di identificare diversi geni che aumentano la motilità di Vibrio cholerae in presenza di una concentrazione sub-inibitoria di polimixina B. Abbiamo quindi identificato vari mutazioni in diversi varianti che hanno probabilmente provocato la riduzione o il soppresso della funzione delle proteine IhfA, DacB, VacJ (MlaA) e MlaF. Sulla base della letteratura, proponiamo che la perdita di funzione di queste proteine inducendo un aumento della 9 mobilità in presenza di polimixina B può essere spiegato attraverso tre meccanismi coinvolgendo la stabilità dell'involucro, la secrezione di vescicole di membrana o l’alterazione dell’espressione di diversi geni. Nel terzo articolo, abbiamo studiato il coinvolgimento dello stress ossidativo nell'arresto della sintesi del peptidoglicano che è fatale al mutante ∆elyC di Escherichia coli. Abbiamo poi dimostrato con numerosi esperimenti che la lisi del mutante ∆elyC è causata dalla sovrapproduzione di radicali idrossilici nel suo involucro. Questa molecola causa importanti danni nell’involucro provocando l’inibendo della sintesi del peptidoglicano. Il meccanismo che causa questa sovrapproduzione di radicali tossici deve ancora essere determinato. Studiando la funzione del fattore ElyC, abbiamo scoperto una nuova vulnerabilità nell'omeostasi dell’involucro che siamo in fretta di sfruttare. Nel nostro ultimo articolo, basandoci su un'ipotesi precedentemente formulata, abbiamo studiato l'importanza della via di sintesi dell'antigene comune agli enterobatteri nel processo letale che si svolge in assenza di ElyC. Abbiamo scoperto che il mutante ∆elyC accumula un elemento comune alle vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri, l'undecaprenil pirofosfato. Abbiamo anche scoperto che l'aumento del riciclaggio di quest'ultimo attraverso la sovraespressione del gene pgpB previene la lisi del mutante. Proponiamo che l'assenza di ElyC induce una allocazione diffetosa del undecaprenil fosfato tra le vie di sintesi del peptidoglicano e dell'antigene comune agli enterobatteri. L'iperattivazione della via dell'antigene comune agli enterobatteri provoca l'accumulo di undecaprenil pirofosfato, causando l'inibizione di Pbp1b e dunque dell’aggiunta di nuove unità al peptidoglicano, provocandone quindi la lisi. Quindi, questo lavoro ha portato a una migliore comprensione o identificazione delle vulnerabilità dell'involucro di Vibrio cholerae ed Escherichia coli, a chiarire certi meccanismi essenziali ma anche a intravedere il ruolo di vari fattori coinvolti nell'omeostasi del loro involucro.

L'intensification de l'activité agricole depuis la deuxième moitié du 20e siècle, notamment l'utilisation de produits agrochimiques dans les bassins versants, a affecté la qualité des ressources d’eau douce. Des traces de produits agrochimiques, tels que les pesticides et les engrais, sont transportées par ruissellement de surface ou lixiviation, provoquant des effets directs ou indirects sur les organismes aquatiques. Se trouvant à la base des réseaux trophiques aquatiques, les micro-organismes sont des habitants indispensables dans les écosystèmes d’eau douce, où ils jouent également un rôle important pour les services écosystémiques en tant que propulseurs des cycles biogéochimiques. En faisant partie de l'écosystème, les communautés bactériennes sont susceptibles aux perturbations anthropiques croissantes qui se déroulent dans leurs milieux. Le but principal de cette thèse est d'étudier l'effet de perturbations agricoles simulées sur les bactéries d'eau douce par une approche expérimentale avec des réservoirs extérieurs (mésocosmes) et en utilisant le séquençage d’ADN à haut débit. Des mésocosmes ont été remplis de 1 000 litres d'eau provenant d'un lac bien préservé et, ensuite, ont été traités avec des pesticides largement utilisés au monde en combinaison avec des engrais. Les trois études présentées dans cette thèse explorent les réponses du bactérioplancton dans cette même expérience sous différents angles : la première (chapitre II) s'est concentrée sur les réponses écologiques des communautés bactériennes à de différentes combinaisons de produits agrochimiques; la deuxième (chapitre III) a examiné si les gènes de résistance aux antibiotiques pourraient changer le succès d'espèces soumises à une grave contamination par un herbicide et, finalement, la troisième (chapitre IV) a suivi les altérations évolutives parmi les espèces ayant des réponses écologiques similaires par rapport au traitement avec l’herbicide. En mettant l'accent sur la réaction des communautés exposées à un mélange de produits agrochimiques, le chapitre II complémente des études écotoxicologiques, qui se concentrent traditionnellement sur les réponses d'une seule espèce à des produits chimiques isolés. Les mésocosmes ont été exposés à de différentes concentrations d'un herbicide à base de glyphosate et d'un insecticide néonicotinoïde, séparés ou en combinaison, en plus d'apports faibles ou élevés en nutriments. Le séquençage des amplicons du gène de l'ARNr 16S et la prédiction des variantes de séquences ont étés faits pour étudier la diversité taxonomique, ainsi que le profilage de l'utilisation microbienne des sources de carbone pour décrire les changements de diversité fonctionnelle à travers le temps. Les résultats ont révélé que la stabilité des communautés microbiennes varie en fonction du type et de l'intensité de la perturbation. Bien que les communautés bactériennes n’aient pas réagi à l’introduction de l’insecticide ou d’engrais, elles sont modifiées de manière intensive sous des concentrations élevées de l'herbicide à base de glyphosate. Des aspects distincts de la diversité des communautés ont réagi différemment aux perturbations : alors que la composition fonctionnelle est restée stable face aux perturbations, la composition taxonomique au niveau taxonomique le plus fin a été sensible au glyphosate et résiliente aux échelles taxonomiques plus larges (c'est-à-dire, du genre au phylum). Ces résultats soulignent la complexité des réponses écologiques et fournissent des évidences de la redondance fonctionnelle concernant l'utilisation des sources de carbone dans les communautés microbiennes. Le chapitre III a testé l'hypothèse selon laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques, en particulier les pompes d'efflux, favorisent la survie des bactéries en présence de l'herbicide à base de glyphosate. Cette hypothèse n'a été confirmée que par des études expérimentales en laboratoire avec des cultures bactériennes et plus récemment dans les microbiomes du sol. C'était donc la première fois que cette hypothèse a été testée dans un système aquatique. Au chapitre II, on a observé que l'herbicide à base de glyphosate favorisait la domination de nombreux taxons de l'embranchement des protéobactéries, dont Agrobacterium, un genre qui code pour l'enzyme cible du glyphosate appartenant à la classe des résistants. Cependant, d'autres espèces codant pour la classe de l'enzyme sensible au glyphosate étaient également favorisées, ce qui implique le rôle d'autres mécanismes de résistance. Dans le chapitre III, les analyses de métagénomes et des génomes assemblés par métagénomes ont révélé une augmentation de la fréquence de gènes de résistance aux antibiotiques après l'administration de fortes doses de l'herbicide. D’ailleurs, l'abondance relative des espèces présentes après qu’une forte dose de l'herbicide a été administrée était mieux prédite par la présence de gènes d'efflux d'antibiotiques dans leur génome que par la présence du gène codant pour l'enzyme résistante au glyphosate. Ces résultats renforcent les études récentes et contribuent aux premières évidences provenant des communautés bactériennes d'eau douce. L'objectif du chapitre IV était de vérifier si les bactéries ayant la même réponse écologique à la contamination par l'herbicide à base de glyphosate présenteraient également des réponses évolutives similaires. En plus, ce chapitre avait pour but de contribuer aux preuves expérimentales du modèle de l'écotype stable, un modèle proéminent sur l'évolution et l'origine de la diversité dans les espèces bactériennes. On a supposé que les espèces favorisées par l'herbicide subiraient des balayages sélectifs éliminant la variation génétique dans le génome, comme le prédit le modèle évolutif de l'écotype stable. Pour tester cette hypothèse, des polymorphismes nucléotidiques ont été quantifiés au sein des populations bactériennes au cours du temps dans 12 populations bien représentées dans le séquençage métagénomique qui a été fait dans le chapitre III. Contrairement à ce que l'on attendait, les populations écologiquement prospères ont montré une variété de réponses évolutives et la diversité n'a été supprimée que dans quelques-unes d'entre elles. Les résultats montrent que d'autres mécanismes évolutifs qui maintiennent la variation génétique, tels que des balayages sélectifs à l'échelle du gène plutôt qu’à l'échelle du génome, peuvent être plus souvent impliqués dans le succès des espèces qui survivent au stress anthropique. Mis ensemble, ces résultats soulignent la complexité des réponses bactériennes face à une perturbation anthropique au niveau des communautés, des populations, des gènes et des allèles. Les connaissances apportées par cette thèse peuvent améliorer les évaluations des risques de déversements accidentels en eau douce. Le changement permanent à des niveaux taxonomiques fins et la sélection croisée pour les gènes de résistance aux antibiotiques en présence de concentrations élevées d'herbicides indiquent des risques qui devraient être mieux compris par rapport à leur prédominance et les mécanismes qui les causent. D’ailleurs, la dynamique évolutive décrite ici sur une échelle de temps de courte durée fournit des données pour soutenir une importante théorie sur la différenciation et la spéciation bactériennes. / Agriculture intensification in the second half of the 20th century, particularly the use of agrochemicals within watersheds, has affected freshwater quality. Traces of agrochemicals, such as pesticides and fertilizers, reach freshwater systems through runoff or leaching, causing direct or indirect effects on aquatic organisms. Microorganisms are essential inhabitants of aquatic systems as they are at the foundation of food webs and play roles in ecosystem functioning as important drivers of biogeochemical cycles. By being part of the ecosystem, bacterial communities are subject to the increasing anthropogenic perturbations in their environment. The main objective of this thesis is to investigate the effect of simulated agricultural perturbations on freshwater bacteria through an experimental approach with outdoor tanks (mesocosms) and using high-throughput DNA sequencing. Mesocosms were filled with 1,000 L of water from a pristine freshwater lake and treated with widely used pesticides in combination with fertilizers. The three main studies in this thesis explored the bacterioplankton responses in this experiment through different angles: the first study (chapter II) focused on ecological responses to a combination of agrochemicals; the second (chapter III) explored how changes in antibiotic resistance genes could explain the ecological success of species facing severe herbicide contamination and the third study (chapter IV) tracked evolutionary changes among species with similar ecological responses to the herbicide treatment. Chapter II aimed to complement ecotoxicological studies, that traditionally focus on single species responses to individual chemicals, by focusing on communities exposed to a mixture of agrochemicals, as typically observed in nature. For that, the mesocosms were exposed to different concentrations of a glyphosate-based herbicide and a neonicotinoid insecticide, isolated or in combination, in addition to low or high nutrient inputs. Sequencing of 16S rRNA gene amplicons and inference of amplicon sequence variants were done to study taxonomic diversity, as well as profiling microbial use of carbon sources to describe functional diversity changes through time. The results revealed that the stability of microbial communities varies according to the type and intensity of the disturbance. The highest dose of the glyphosate-based herbicide was the major driver of ecological responses within bacterial communities, which were not altered by the insecticide nor by nutrient fertilization. Distinct aspects of community diversity responded differently to perturbation: while functional composition remained stable in face of disturbances, taxonomic composition was sensitive to glyphosate at the finest taxonomic level and resilient at higher taxonomic units (i.e. genus to phylum). These results highlight the complexity of ecological responses and provide evidence of functional redundancy regarding the use of carbon sources in these communities. Chapter III tested the hypothesis that antibiotic resistance genes, particularly efflux pumps, would favour bacterial survival in the presence of the glyphosate-based herbicide. This hypothesis has only been confirmed through experimental laboratory studies with bacterial cultures and more recently in soil microbiomes, it was thus the first time it was tested in an aquatic system. As observed in chapter II, glyphosate-based herbicide favoured the dominance of many taxa of the phylum Proteobacteria, including Agrobacterium, a genus that encodes the glyphosate-resistant target enzyme. However, other species encoding the glyphosate-sensitive version of the enzyme were also favoured, implying other resistance mechanisms. In chapter III, the analysis of metagenomes and metagenome-assembled genomes revealed an increased frequency of antibiotic resistance genes following high doses of the herbicide. Additionally, the relative abundance of species after a severe herbicide pulse was better predicted by the presence of antibiotic efflux genes in their genome than by the presence of the gene encoding the resistant glyphosate target enzyme. These results reinforce recent studies and contribute to the first evidence from freshwater bacterial communities. The goal of chapter IV was to test if bacteria with the same ecological response to the contamination with the glyphosate-based herbicide would also show similar evolutionary responses. Furthermore, this chapter aimed to contribute to experimental evidence to the stable ecotype model, a prominent model on the evolution and origin of diversity in bacterial species. If assumptions of the stable ecotype model were confirmed by the experiment, species favoured by the herbicide would experience selective sweeps purging genetic variation across the genome. To test this hypothesis, single nucleotide variants were quantified within bacterial populations over time in 12 populations well-represented in the metagenomic sequencing that was performed in chapter III. Differently than expected, ecologically successful populations showed a variety of evolutionary responses and diversity was purged only in a few of them. The results show that other evolutionary mechanisms that maintain genetic variation, such as gene-wide specific sweeps rather than genome-wide sweeps, may be more often involved in the success of species surviving anthropogenic stress. Together, these results highlight the complexity of bacterial responses in the face of an anthropogenic disturbance at the level of communities, populations, genes, and alleles. The knowledge provided by this thesis may improve assessments of the potential risks of accidental spills in freshwater. The permanent change at fine taxonomic levels and the cross-selection for antibiotic resistance genes in the presence of high concentrations of herbicide indicate risks that should be better understood regarding their predominance and causing mechanisms. Moreover, the evolutionary dynamics here described in a short-term time scale provide observational data to support a theoretical background on bacterial differentiation and speciation.

L'augmentation et la dissémination de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à gram-negatif, particulièrement les Entérobactéries, les bactéries du genre Pseudomonas et Acinetobacter, représentent un problème majeur de santé publique au niveau mondial. Les infections nosocomiales causées par les bactéries multi-résistantes (BMR) ont conduit non seulement à une augmentation de la mortalité, de la morbidité, et du coût de traitement, mais aussi continuent de mettre en danger la vie des patients surtout immunodéprimés en milieu hospitalier. Bien entendu, l'utilisation abusive et non contrôlée des antibiotiques a grandement contribué à la large diffusion des déterminants de la résistance; cependant, des études récentes ont démontré que ces déterminants de la résistance pouvaient émerger à partir de sources anciennes et/ou environnementales. Ainsi, face à cette préoccupation mondiale, plusieurs études ont été rapportées avec des recommandations importantes de conduire des études épidémiologiques, moléculaires, et génomiques afin de contrôler la diffusion et l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. De plus, durant ces 10 dernières années, nous avons assisté à l'emergence et au développement de nouvelles technologies de séquençage à haut débit coïncidant avec une augmentation exponentielle du nombre de genomes bactériens séquencés. / The increase and spread of multidrug-resistant (MDR) gram-negative bacteria especially Enterobacteriaceae, Pseudomonas, and Acinetobacter (E.P.A) species have become a major concern worldwide. The hospital-acquired infections caused by MDR bacteria have led not only to an increase in mortality, morbidity, and cost of treatment, but also continue to endanger the life of patients, especially those immunocompromised. Although the frequent misuse of antibiotic drug has greatly contributed to worldwide dissemination and resistance to antibiotics; recent studies have shown that these resistance determinants could emerge from ancient or environmental sources. Front of this worldwide concern, several studies have been reported with significant recommendations to conduct molecular epidemiology, and genomic studies, in order to control the increase and the dissemination of the antibiotic resistance. Moreover, during these last 10 years, we are witnessing the emergence and development of new technologies of high throughput sequencing and coinciding with an exponential increase of number of bacterial genomes sequenced today. Therefore, it is in this context that the project of this thesis was conducted with three essential objectives: (i) the genome sequencing of clinical MDR bacteria, the analysis and the identification of the mechanisms and the genetic determinants of antimicrobial resistance (ii) the achievement of molecular epidemiology studies from clinical MDR bacteria responsible of outbreak (iii) the development and implementation of molecular tools for monitoring and diagnosis of potential MDR bacteria.

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La RMN est une méthode de choix pour la détermination de la structure tridimensionnelle des protéines et des acides nucléiques en solution. Cependant, la taille des systèmes que l'on peut étudier actuellement par RMN est limitée. Dans la première partie de ce travail, la structure du répresseur BlaI de la beta-lactamase de B. licheniformis 749/I et son interaction avec l'ADN ont été étudiées par RMN avec des méthodes classiques. Ces résultats ont permis de mieux caractériser la répression des gènes de plusieurs mécanismes de résistance aux antibiotiques, incluant la résistance à la méthicilline de la souche pathogène S. aureus. Le deuxième volet de ce travail concerne l'implémentation de filtres Hadamard qui augmentent la résolution des spectres dans certaines expériences de RMN multidimensionnelle. Ces filtres permettent de séparer les pics de corrélation des protéines et des acides nucléiques selon le type d'acide aminé et le type de base, respectivement. Ces développements ouvrent de nouveaux horizons vers l'étude de macromolécules biologiques de plus grosse taille par RMN.

Le rôle majeur de l’Helicobacter pylori dans l’étiopathogénie des maladies gastroduodénales (gastrite, ulcère gastrique et duodénal, lymphome gastrique) est bien établi aujourd’hui. L’OMS l’a reconnue comme jouant un rôle important dans la survenue des lésions cancéreuses gastriques. La prévalence de l’infection à H. pylori varie selon les pays de 20% à 90% avec des taux supérieurs à 60% dans les pays en développement, dont le Bénin. Les méthodes usuelles de diagnostic sont soit invasives nécessitant une endoscopie gastrique avec biopsies (test rapide à l’urée, histologie, culture et PCR), soit non-invasives (test respiratoire à l’urée marquée au carbone, sérologie, et détection de l’antigène dans les selles). La trithérapie associant un inhibiteur de la pompe à protons (IPP) et deux antibiotiques choisis parmi l’amoxicilline, la clarithromycine et le métronidazole est recommandée pour son traitement. La survenue de résistance des souches H. pylori aux différents antibiotiques devient une cause majeure de l’échec des régimes d’éradication.<p>Afin d’évaluer l’applicabilité et l’efficacité des régimes thérapeutiques recommandés en pratique courante, et à partir d’une étude de cohorte prospective, nous avons étudié la prévalence de l’infection à H. pylori chez les patients consultant à la clinique de Gastroentérologie de l’hôpital universitaire Erasme à Bruxelles, déterminé son taux de résistance primaire aux antibiotiques, et évalué le taux d’éradication d’H. pylori par la trithérapie. Nous avons aussi évalué la performance du test de détection de l’antigène d’H. pylori dans les selles pour le diagnostic chez l’adulte (avant traitement) comparé avec les méthodes de référence (culture, histologie), également dans le contrôle de l’éradication.<p>Au Bénin, nous avons évalué à partir d’une étude transversale prospective, la prévalence de l’infection à H. pylori dans une population en milieu urbain et rural. Nous avons déterminé la distribution par famille des sujets infectés, ainsi que l’influence des variables démographiques individuelles, et les caractéristiques socio-économiques familiales sur le risque de l’infection.<p>La prévalence de résistance primaire à la clarithromycine et au métronidazole fut observée respectivement dans 3% et 31% des souches isolées. Aucune résistance primaire à l’amoxicilline et à la tétracycline n’a été observée.<p>Les analyses en intention de traiter, ont montré que H. pylori a été éradiqué chez 80% des patients inclus dans l’étude thérapeutique. Le taux d’échec d’éradication fut de 20%. Comparé au 14C-TRU, le test HpSA avait une sensibilité de 100%, une spécificité de 91%, VPP de 69%, VPN de 100%. De même, la sensibilité du test HpSA par rapport aux deux méthodes usuelles (culture et histologie) est de 96.5% pour une spécificité de 91.2%, une VPP de 90.3% et une VPN de 96.8%. <p>Au Bénin, la prévalence de H. pylori était de 75.4% en ville et de 72.3% dans le village (p = 0.459). Aucune association n’a été observée avec l’âge, le sexe, le niveau d’instruction, la taille du ménage, l’activité économique ou le mode d’approvisionnement en eau potable. Le taux d’infection était plus élevé chez les enfants dont les parents étaient infectés et chez ceux ayant une mère H. pylori positive (p < 0.001). L’analyse multivariée par régression logistique a montré que la densité d’occupation des dortoirs [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), et le statut des mères dans le ménage ([OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67)] p < 0.001) étaient les prédicteurs indépendants de l’infection par H. pylori. Le risque de l’infection chez les enfants était 13 fois plus élevé quand les deux parents sont simultanément positifs OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22), il l’était respectivement de 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), quand la mère et le père sont positifs p < 0.001. Aussi le risque d’infection à H. pylori comparé aux enfants qui dorment seul dans leur chambre, était élevé pour ceux qui dorment avec un ou deux personnes OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05, et plus élevé chez les enfants qui dorment à 4 ou plus OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005, comparé à ceux qui dorme seuls. Donc, le contact avec des personnes infectées au sein de la famille et la vie en promiscuité, étaient associés avec un risque d’infection plus élevé indiquant une transmission intrafamiliale de l’infection par H. pylori.<p>En conclusion, nos résultats montrent une séroprévalence encore élevée de l’infection à H. pylori dans la population béninoise. Une surveillance de l’épidémiologie accompagnée de mesures de prévention ciblées sur les facteurs potentiels de risque de l’infection doit être poursuivie. La validation du test de détection de l’antigène dans les selles avant traitement et dans le contrôle de l’éradication de la bactérie pour le suivi thérapeutique des patients infectés, est une alternative intéressante notamment au Bénin. Le taux de résistance primaire pour le métronidazole est actuellement stable en Belgique, alors que la prévalence de la résistance à la clarithromycine mérite d’être précisée par d’autres études multicentriques. La trithérapie classique à base d’inhibiteur de la pompe à protons–amoxicilline-clarithromycine reste recommandable en première intention. La surveillance épidémiologique de l’infection basée sur la prévalence locale des souches clarithro-résistantes et métronidazole-résistantes devrait être poursuivie.<p><p><p><p><p><p><p><p><p><p><p>SUMMARY OF THE THESIS<p>The major role of H. pylori in the etiopathogeny of various gastroduodenal diseases (gastritis, gastric and duodenal ulcers, gastric lymphoma) is well established today. The World Health Organization concluded that H. pylori plays a causal role in the chain of events leading to cancer of the stomach.<p>The prevalence of H. pylori infection varies by country from 20% to 90%, with higher prevalence rates over 60% observed in developing countries, including Bénin. The usual methods allowing the diagnosis of the gastric infection by H. pylori are either invasive, requiring a gastric endoscopy and biopsies (fast urease test, anatomopathological examination, culture and PCR), or noninvasive (breath test with 13C or 14C marked urea, serology and stool antigen detection). Triple therapy associating a proton pump inhibitor (PPI) with two antibiotics, chosen between amoxicillin, clarithromycin and metronidazole, is currently recommended. Resistance of H. pylori strains to antibiotics becomes a major determinant in the failure of eradication of regimens.<p>To evaluate the applicability and efficacy of the therapeutic recommendations in our pratice, based on a prospective study, we studied the prevalence of H. pylori infection in the outpatient population of the Gastroenterology clinic at the Erasme University hospital in Brussels, determined its rate of primary resistance to antimicrobial agents and evaluated the rate of eradication of H. pylori by triple therapy. We also evaluated the performance of a stool antigen detection test for the diagnosis of H. pylori infection in adults (before treatment) compared with reference methods (culture and histology) as well as in control of eradication.<p>In Benin, we evaluated by a cross-sectional study the prevalence of the infection with H. pylori in the population living in urban and rural environment. We determined the family distribution of infected subjects as well as the influence of individual demographic variables and of the socio-economic family characteristics on the risk of infection.<p>In Brussels, primary resistance to clarithromycin and metronidazole was observed in 3% and 31% of the isolates, respectively. No primary resistance to amoxicillin and tetracycline was observed. By intention to treat analysis, H. pylori was eradicated in 80% of patients included in the therapeutic study. The rate of eradication failure was 20%. In comparison with 14C-Urea breath test, the H. pylori Stool Antigen test showed a sensitivity of 100%, a specificity of 91 %, PPV of 69%, and NPV of 100%. Compared to the reference methods (culture and histology), the HpSA test had a sensitivity of 96.5% and a specificity of 91.2%. PPV of 90.3% and NPV of 96.8%. <p>In Benin, the prevalence of H. pylori antibodies was 75.4% in town and 72.3% in the village (P= 0.459). No association was found between infection and age, sex, education level, size of the household, economic activity or source of drinking water. The infection rate was higher in children of parents who were both infected and also in those whose mother was infected (p < 0.001). By logistic regression analysis, the density of occupation of dormitories (more than three persons sharing dormitory, [OR (95%) = 9.82 (4.13-23.31)] p < 0.001), and mother status within the household ( [OR (95%) = 3.85 (1.53-9.67) ] p < 0.001), were independent predictors for H. pylori infection. The risk of H. pylori infection in children was 13 times higher when the two parents were simultaneously positive: OR (95% CI) = 13.6 (3.63-51.22) and it was respectively of 5.3 (1.52-18.45); 2.7 (0.47-15.44), when mother and father were positive p < 0.001. H. pylori infection risk in children was higher for a sharing a dormitory with one or two persons, OR (95% CI) = 5.2 (1.08-25.16), p < 0.05 and was even higher if a dormitory of 4 persons or more, OR (95% CI) = 16.6 (2.66-103.44), p < 0.005 as compared to sleeping alone. Family contact with infected persons and crowded living conditions were associated with increased risk of infection consistent with intrafamilial H. pylori transmission.<p>In conclusion, our results confirm a still high H. pylori seroprevalence in population in Benin. An epidemiolgic survey with prevention mesures targeted on potential risk predictors should be going on. Validation of antigen detection test in patients stools before treatment and for eradication control could be an interested alternative, notably in Benin. Primary resistance rate on metronidazole is stable today in Belgium, though the resistance prevalence on clarithromycin should be determined by other multicentric studies. Standard triple therapy by (PPI)-amoxicillin-clarithromycin is still recommended in first intention to treat. Epidemiological survey of infection based on local prevalence of claritromycin-resistant and metronidazole-resistant strains should be continued.<p><p><p><p><p><p> / Doctorat en Santé Publique / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le problème croissant de l’antibiorésistance fait en sorte que l'utilisation systématique des antibiotiques en production animale n'est plus considérée comme une pratique raisonnable et viable. De plus, la préservation de l'efficacité des antibiotiques représente un enjeu majeur pour la santé publique et la santé animale. Les Producteurs de poulet du Canada ont élaboré et mis en place une stratégie de réduction de l'utilisation des antibiotiques ayant comme objectif ultime d'éliminer l'utilisation préventive des antibiotiques d’importance en médecine humaine dans les productions de poulets à griller et de dindons. Alors que l’on sait que la réduction des antibiotiques en élevage de poulets de chair est associée à une augmentation de l’incidence d’entérite nécrotique causée par Clostridium perfringens, dont une proportion de cette population bactérienne produit l’entérotoxine qui peut engendrer des conséquences sur la santé humaine, il est difficile de prédire les impacts réels d’une telle stratégie sur les écosystèmes complexes que sont l’intestin des oiseaux et les élevages commerciaux de poulets de chair. Les principaux objectifs de la présente étude étaient donc de quantifier l'abondance des gènes de résistance aux antibiotiques, d'évaluer la présence de C. perfringens et de son entérotoxine et de caractériser la composition du microbiote cæcal dans les bâtiments de six fermes commerciales de poulets de chair, au Québec. À court terme (15 mois), les bâtiments de ces fermes ont été soumis à un régime conventionnel ou à un régime sans antibiotiques. Puis, à long terme (6 ans), les bâtiments ont utilisé un régime promouvant une utilisation judicieuse des antibiotiques ou un régime conventionnel. La mise en place d'un régime sans antibiotiques pendant une période de 15 mois n'a pas permis d’observer une réduction de l'abondance de plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques, contrairement à l'utilisation judicieuse des antibiotiques pendant 6 ans. Le retrait des antibiotiques à court terme et l’utilisation judicieuse à long terme ont modifié la composition du microbiote cæcal, les familles de Ruminococcaceae et de Lachnospiraceae étant influencées négativement, en plus de diminuer les performances zootechniques et d’augmenter les populations de C. perfringens à court terme. Le régime conventionnel à long terme dans les élevages commerciaux de poulets de chair a été associé à une augmentation de plusieurs gènes de résistance aux antibiotiques dans de nombreuses fermes. Cette étude met en évidence les impacts potentiels des différents régimes d'élevage en production avicole et aidera à orienter les futures politiques afin de réduire l'utilisation des antibiotiques et ultimement contrer le phénomène de la résistance aux antibiotiques. / The ever-increasing problem of antibiotic resistance makes routine use of antibiotics in animal production no longer considered as a reasonable and viable practice. Preserving the effectiveness of antibiotics represents a major challenge for public and animal health. The Chicken Farmers of Canada have developed and are implementing an Antimicrobial Use Reduction Strategy which ultimate goal is eliminating the preventive use of medically-important antibiotics in broiler chicken and turkey productions. While it is known that the reduction of antibiotics in broiler chicken farms is associated with an increase in the incidence of necrotic enteritis caused by Clostridium perfringens, to which a proportion of this bacterial population produces the enterotoxin who can also generates consequences for human health, very little is known about the real overall impact of an antibiotic use reduction strategy in complex ecosystems such as the bird intestine or the commercial broiler chicken farm. The main objectives of the present study were to quantify the abundance of antibiotic resistance genes, to assess the presence of Clostridium perfringens and his enterotoxin and to characterize the composition of the cæcal microbiota in broiler chicken flocks from six commercial farms located in Québec and submitted to either a short-term conventional or drug-free program (15 months) or a long-term conventional or judicious antibiotic use program (six years). Implementing an antibiotic-free program over a 15-month period did not reduce the abundance of many antibiotic resistance-encoding genes, whereas a judicious use of antibiotics over six years did. The short-term antibiotic withdrawal and the long-term judicious use strategy altered the cæcal microbiota composition, with Ruminococcaceae and Lachnospiraceae families being negatively impacted, in agreement with the lower production performance and with the increased C. perfringens populations observed for farms phasing out the use of antibiotics in a short-term antibiotic withdrawal. Adopting a long-term conventional rearing program on commercial broiler chicken farms selected for specific antibiotic resistance-encoding genes in many barns. This study highlights the potential impacts of different rearing programs in poultry production and will help guide future policies in order to reduce the use of antibiotics and ultimately reduce the phenomenon of antibiotic resistance.