Orientador: Hélio Langoni / Banca: Maria Luiza Carrieri / Banca: Jane Megid / Resumo: Os morcegos há algum tempo vem recebendo crescente importância em Saúde Pública, pois são considerados os principais reservatórios do vírus da raiva em grande parte do mundo inclusive no Brasil. Apesar dos morcegos manterem ciclos epidemiológicos da raiva há séculos, foi nas últimas décadas que a raiva em morcegos teve seu reconhecimento, por meio de pesquisas sobre o papel destes animais no ciclo epidemiológico da doença e também sobre suas variantes e suas implicações no desenvolvimento de novos reservatórios para o vírus da raiva, principalmente em regiões onde a doença em cães foi controlada. O estado de São Paulo, sob coordenação do Instituto Pasteur, realiza a vigilância epidemiológica para raiva por meio dos laboratórios credenciados para seu diagnóstico, no Laboratório do Serviço de Diagnóstico de Zoonoses da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - UNESP - Botucatu - SP está credenciado recebendo material para diagnóstico de diversos municípios da região. Entre os anos de 2003 e 2010 foram diagnosticadas como positivas pelas provas de IFD e Prova Biológica, 19 amostras de quirópteros não hematófagos. Estes isolados foram caracterizados antigenicamente pelo painel de anticorpos monoclonais cedido pelo CDCOPAS (Centers of Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USAOrganização Pan-americana de Saúde), revelando que sete destes isolados pertenciam a variante 3, que tem os morcegos hematófagos da espécie Desmodus rotundus como reservatório, além de um morcego insetívoro do gênero Myotis que apresentou variante 4 característica do também morcego insetívoro Tadarida brasiliensis, além de outros três perfis não compatíveis, NC-1, NC-2 e NC-3. Todos os isolados foram submetidos a RT-PCR e seus produtos tiveram o gene da nucleoproteína (N) viral parcialmente... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: For some time ago, bats are receiving an increased importance in Public Health because they are considered the main reservoirs of rabies virus around the world, including Brazil. Although bats remain the rabies epidemiological cycles for centuries, only in the last decades the rabies in bats had its recognition, throughout researches focused on the role of these animals in the epidemiological cycle of the disease and also on their variants and their implications in the development of new reservoirs for rabies virus, mainly in regions where the disease in dogs was controlled. The state of São Paulo, coordinated by the Institute Pasteur, performs epidemiological surveillance for rabies through registered laboratories for its diagnosis. The labs of Zoonosis Diagnostic Service, School of Veterinary Medicine and Animal Science - UNESP - Botucatu - SP is registered for receiving material for diagnosis of some municipalities of the region. Between 2003 and 2010, 19 samples of nonhematophagous bats were diagnosed as positive by IFD and Biological Evidence. These isolates were antigenically characterized by the panel of monoclonal antibodies donated by PAHO-CDC (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA Pan-American Health), revealing seven of these isolates belonged to variant 3, which has the vampire bat Desmodus rotundus as reservoir, as well as an insectivorous bat of the genus Myotis presenting variant 4, characterisitc of the other insectivorous bat Tadarida brasiliensis, and other three profiles are not compatible, NC-1, NC-2 and NC-3. All isolates were assayed by RT-PCR and their products had the nucleoprotein gene (N) viral partially sequenced, generating a phylogenetic tree that grouped these isolates into four clusters, designated as lineages Nyctinomops, Myotis, Desmodus rotundus, and a new lineage of rabies virus not... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A raiva é uma zoonose nervosa, aguda e fatal que acomete todos os mamíferos e provoca enormes prejuízos para os pecuaristas. No ciclo epidemiológico rural, a doença é transmitida por morcegos hematófagos aos herbívoros e, ainda que haja um esforço por parte dos órgãos de defesa e dos produtores rurais para que se evite a ocorrência da doença, historicamente percebe-se que o combate à raiva com base somente na atuação em focos e vacinação de suscetíveis não elimina eficazmente o problema. Um dos pilares do Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros (PNCRH) do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) é o controle das populações de morcegos hematófagos pelo uso de pasta vampiricida. Porém, apesar dessa medida ser largamente utilizada como forma de controle da raiva rural, há poucas informações a respeito do real impacto que ela causa na ocorrência de focos de raiva no Espírito Santo. Através da análise de dados coletados pelo Instituto de Defesa Animal e Florestal do Espírito Santo (IDAF), pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE) e pelo Instituto Jones dos Santos Neves (IJSN) determinou-se o efeito do uso da pasta vampiricida em morcegos hematófagos na ocorrência de focos de raiva no Espírito Santo em 2011, 2012 e 2013. Para tal, foram utilizadas as coordenadas de focos de raiva e do uso de pasta vampiricida pelas equipes de captura de morcegos. As coordenadas georreferenciadas foram representadas em um Sistema de Informação Geográfica e analisadas utilizando-se o modelo de interpolação pelo método do “inverso das distâncias” A prevenção da ocorrência de focos de raiva ocorreu quando o impacto do tratamento foi alto e muito alto, porém a área de impacto é espacialmente limitada. Já nas áreas onde o impacto foi baixo ou muito baixo, a doença continuou grassando. Aspectos da biologia e ecologia dos morcegos hematófagos, como o comportamento das colônias após o uso da pasta e a possível dispersão do vírus, precisam ser melhor estudados. / Rabies is a nervous, acute and fatal zoonosis that affects mammals and causes enormous economic losses to farmers. In its rural epidemiological cycle, the disease is transmitted by common vampire bats to herbivores. There is a constant effort from cattle breeders and public veterinary services to avoid rabies occurrence. However, it has been reported that only livestock vaccination and outbreak control actions do not effectively control the problem. One of the pillars of the Herbivore Rabies National Control Program (PNCRH) from the the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply of Brazil (MAPA) is the control of vampire bat populations through vampiricid gel use. However, even though this measure is largely used as a way to control cattle rabies, there is a lack of information regarding its actual impact in the occurrence of rabies outbreaks in the state of Espírito Santo. Through analysis of data collected by the Forestry and Animal Surveillance Institute of Espírito Santo (IDAF), the Brazilian Statistics and Geography Institute (IBGE) and the Jones dos Santos Neves Institute, we were able to establish the effect of vampiricid gel use on rabies outbreaks in Espírito Santo in 2011, 2012 and 2013. In order to do so, we used the geographic coordinates of rabies occurrence and vampiricid gel use. These references were then represented on a Geographic Information System and analyzed with an in verse distance weighted (IDW) interpolation method. Outbreaks were prevented when impact was high or very high; however, the impact areas in these cases appeared to be spatially limited. In areas where impact was considered low or very low, rabies prevailed. Vampire bat ecology and biology aspects, such as colony behavior after vampiricid gel use and possible virus dispersion, should be investigated further.

No Brasil e em alguns países da América Latina, a incidência de raiva transmitida por animais domésticos tem diminuído enquanto tem aumentado em animais silvestres. Durante os últimos anos, no Brasil, a raiva tem sido diagnosticada em morcegos hematófagos ou não, primatas não-humanos, cachorros-do-mato, quatis, guaxinins, capivaras, cervos, gambás e outras espécies silvestres. O presente estudo foi realizado em parceria com biólogos, pesquisadores na área de monitoramento de fauna silvestre, e o objetivo foi pesquisar a presença do vírus rábico em mamíferos silvestres de vida livre, provenientes de uma reserva natural particular, localizado no município de Ribeirão Grande, São Paulo, região que já foi alvo de raiva nos últimos anos. Durante o período de 2002 a 2004, 104 amostras de cérebro de animais capturados foram enviadas para diagnóstico no Laboratório de Raiva da UNESP de Araçatuba, SP, acondicionadas em pipetas plásticas do tipo Pasteur individuais. Os animais pertenciam a três ordens, Chiroptera (47,1%), Rodentia (46,2%) e Marsupialia (6,7%), sendo de diferentes idades e sexos. As amostras foram submetidas ao teste de imunofluorescência direta e inoculação intracerebral em camundongos e todas apresentaram resultado negativo para a raiva. Segundo dados da Coordenação do Programa de Controle da Raiva do Estado de São Paulo a raiva é endêmica na região estudada e a porcentagem de positividade em morcegos nos últimos dez anos é de 1,8%. Embora dos diagnósticos tenham sido negativos neste estudo, não é possível afirmar que o vírus rábico não circula naquela propriedade / In Brazil and some Latin American countries, the incidence of rabies transmitted by domestic animals has decreased while it has been increasing in wild animals. During the last few years rabies has been diagnosed in hematophagous or nonhematophagous bats, nonhuman primates, crab-eating foxes, coatis, raccoons, capybaras, deers, skunks and some other species. The present study was carried out with biologists, researchers in wild fauna monitoring and the objective was to search the presence of the rabies virus in wildlife mammals from a private natural reserve, in Ribeirão Grande city, SP, region that was target of rabies in the last few years. During 2002 to 2004, 104 brain samples of captured animals were sent for diagnosis to UNESP Rabies Laboratory from Araçatuba, SP, conditioned in individuals Pasteur plastic pipettes. The animals belonged to three different orders, Chiroptera (47,1%), Rodentia (46,2%) and Marsupialia (6,7%), and to different ages and sex. The samples were submitted to direct fluorescent antibody test and mouse inoculation test and all samples resulted negative for rabies. According to data of the Rabies Control Program Coordination from São Paulo State, rabies is endemic in the studied region and the percentage of positive cases in bats during the last 10 years was 1,8%. Although all diagnosis were negative in this study, it is not possible to affirm that the rabies virus do not circulate in that property

A raiva é uma antropozoonose com alta letalidade, acomete todos os animais de sangue quente, essa doença causa enormes prejuízos econômicos ao rebanho pecuário nacional, é impossível estimar os custos reais com controle dessa doença, em decorrência do grande número de subnotificações. O uso de ferramentas moleculares permite identificar as linhagens virais circulantes, facilitando desse modo à compreensão da epidemiologia da raiva. A técnica de RT-PCR para amplificação parcial dos genes N e G, foi aplicada em 60 amostras positivas para o vírus da raiva pelas provas de imunofluorescência direta e prova biológica, procedentes dos Estados do Pará, Tocantins, Rondônia e Acre das espécies bovina, equídea, bubalina e suína. As sequências nucleotídicas obtidas para os genes N (41 amostras) e G (17 amostras) foram analisadas pelo algoritmo Neighbor-Joining e modelo evolutivo Kimura 2-parâmetros. Essa análise permitiu identificar distintas linhagens circulantes nas regiões estudadas, foi evidenciado ainda, um padrão de distribuição geográfico dessas linhagens. Além disso, este estudo possibilitou identificar marcadores moleculares para diferentes regiões geográficas, promovendo um melhor entendimento da epidemiologia molecular da raiva das linhagens circulantes da região em estudo. / Rabies is an anthropozoonosis with high mortality, affects all warm-blooded animals, this disease causes major economic losses to livestock. It is difficult to estimate the actual costs of disease control, due to sub notification of cases. Molecular techniques allow identification of genetic viral strains circulating, improving rabies epidemiology comprehension. Sixty rabies virus isolates from bovines, equines, swine and buffaloes coming from the states of Pará, Tocantins, Rondônia and Acre were analyzed in the present study. All samples were previously submitted to direct immunofluorescence test and inoculation in mice, afterwards were submitted to RT-PCR for amplification of partial Nucleoprotein and Glycoprotein genes. Nucleotide sequences from nucleoprotein (41 samples) and glycoprotein G (17 samples) genes were analyzed by Neighbor-joining algorithm and Kimura two-parameter model. This analysis allowed to identify different genetic strains circulating and its geographic distribution patterns. Moreover this study revealed molecular markers for different geographic regions, promoting a better understanding of rabies molecular epidemiology of circulating strains of study area.

Avaliou-se a correlação entre alteração ambiental e ocorrência de focos de raiva em herbívoros na região do vale do rio Paraíba do Sul paulista e alto Tiete no período de 1996 a 2006, por meio da aplicação de técnica de sensoriamento remoto e sistemas de informação geográfica. Foram utilizadas imagens do satélite Landsat-5, sensor TM, órbitas 218 e 219, ponto 76, bandas 3 e 4 na obtenção do índice de vegetação com diferença normalizada (NDVI). Foi feita a subtração de NDVI para obtenção da alteração de cobertura vegetal ou vigor de biomassa em intervalos de um ano, e dados de ocorrência de focos de raiva agregados por município corrigidos pelo efetivo herbívoro no respectivo ano. Diferenças significativas foram obtidas na comparação das médias de alteração de NDVI para ganho, perda e alteração geral em todo período pelo teste de Wilcoxon, exceto de 1996 a 1997 e seqüência de somatória de rankings negativos de 1998 a 2002. A análise de correlação entre diminuição de NDVI e focos de raiva corrigidos foi significativa em 2002 e 2003. Para ganho de NDVI, foi significativo em 1998 e 2003. Para alteração geral foi significativa em 2002. Houve correlação significativa de aumento de NDVI e focos de raiva corrigidos em 2000, 2002 e 2004, com r > 0 em todo período, exceto 2002 e observadas correlações entre alteração, geral e de perda, e tamanho de rebanho significativas em 2000, 2002, 2004 e 2006. A correlação positiva entre alteração de NDVI e rebanho herbívoro sugere a alteração do tamanho do rebanho como um fator de alteração da cobertura vegetal e conseqüente aumento da ocorrência de raiva pela alteração do habitat do morcego hematófago, principal hospedeiro do vírus rábico na América do Sul. A implantação da Coordenadoria de Defesa Agropecuária (CDA) da Secretaria de Agricultura e Abastecimento de São Paulo, em 1999 e a obrigatoriedade da vacinação contra a raiva, a partir de 2002, podem ter encoberto a correlação positiva encontrada no período anterior, de 1996 a 1999. Após o controle da raiva ter se consolidado, a alteração de NDVI voltou a apresentar correlação positiva, devendo ser considerada de fato fator de risco para a ocorrência de raiva nos herbívoros. A metodologia proposta no estudo pode ser uma alternativa no estudo de alteração ambiental como fator de risco na epidemiologia de doenças infecciosas, porém refinamento da técnica pode ser considerado a fim de controlar influências de condições atmosféricas e época do ano nas imagens utilizadas / The present work evaluated the correlation between environmental changes and herbivore rabies in eastern São Paulo State, from 1996 to 2006, using remote sensing and geographic information systems techniques. Images from Landsat-5 satellite, sensor TM, orbits 281 and 219, point 76, bands 3 and 4 were used to obtain the normalized difference vegetation index (NDVI). For each year, the subtraction of NDVI was calculated in order to evaluate the changes in vegetation coverage or biomass robustness. Also, the occurrence of rabies was obtained, for each local administrative division, called municipality, later corrected by the number of herbivores. Significative differences were obtained when comparing mean NDVI changes, being gain, loss or both using Wilcoxon test, except between 1996 and 1997. Differences were also obtained in negative rank sums from 1998 and 2002. The correlation analysis between NDVI loss and rabies occurrence was significative in 2002 and 2003. The correlation between NDVI gain and rabies occurrence was significative in 1998 and 2003. For both gain and loss of NDVI, there was significant correlation with rabies occurrence only in 2002. For corrected rabies outbreaks, there was significative correlation in 2000, 2002, 2004 and 2006. Positive correlation between NDVI changes and herbivores herds suggests that rise in number of herds impacts vegetation coverage, consequently the increase of rabies occurrence, caused by changes in vampire bat habitats. The implantation of an animal health service in São Paulo, in 1999, imposing vaccination against rabies in cattle in 2002, may have covered positive correlation from 1996 to 1999. After the consolidation of control measures, NDVI changes turned to be correlated, allowing its classification as risk factor for rabies occurrence. The proposed method can be an alternative to study environmental changes as risk factor of infectious diseases epidemiology. The improvement of the method is necessary to control atmospheric conditions and the period of images acquirement

A raiva é uma doença do sistema nervoso central que é quase invariavelmente fatal. Apesar de causar cerca de 60.000 mortes/ano, a raiva ainda permanece uma doença negligenciada na maioria dos países, principalmente naqueles em desenvolvimento. O objetivo do nosso estudo foi verificar nos microambientes meningeal, perivascular e intraparenquimatoso do sistema nervoso central, o processo inflamatório, a resposta imune do hospedeiro e a morte dos neurônios frente à infecção rábica transmitida por morcegos. Verificamos que a raiva humana transmitida por morcegos é uma meningoencefalomielite. Através de reação imuno-histoquímica caracterizamos e quantificamos in situ a distribuição do antígeno viral, o fenótipo de células inflamatórias, as células expressando citocinas pró inflamatórias, citocinas representativas de padrão Th1 e Th2 e células em apoptose. O antígeno viral foi encontrado difusamente no parênquima cerebral, em maior abundância em neurônios, não diferindo sua distribuição em relação as regiões cerebrais. As células da glia, em especial os astrócitos, estavam imunomarcadas com o antígeno da raiva, assim como as células endoteliais e células mononucleadas da luz vascular. Esses achados contribuíram para a hipótese da ocorrência de uma via hematogênica alternativa de disseminação viral, através da infecção de células endoteliais pelo vírus, posterior infecção de astrócitos e finalmente infecção de neurônios. A expressão significativa de IL-12 nos pacientes rábicos provavelmente traduz imunidade de base preservada. Identificamos, outrossim, falta de resposta efetiva das células NK e comprometimento da resposta imune adaptativa seqüencial, demonstrada pela depleção de linfócitos TCD4+ no parênquima cerebral, prejuízo da atividade citotóxica dos linfócitos TCD8+ com proporcionalmente baixa expressão de granzima e expressão rarefeita de IFN-g e IL-2r. Essa situação deve ser reflexo da manipulação do vírus sobre a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro tendo como conseqüência uma reposta ineficaz para clareamento do vírus. A expressão aumentada de citocinas pró-inflamatórias (IL-1b, IL-6 e TNF-a) contribuiu para o dano neuronal. O padrão citocínico predominante no sistema nervoso central na raiva foi o Th2, com alta expressão de IL-4 e IL-10. O TGF-b aumentado nos casos de raiva favorece um ambiente imunossupressor para manter intacta a rede neuronal, mas também contribui para permanência local do vírus. A verificação de grau pouco acentuado de neurônios apoptóticos em contraposição a apoptose expressiva de linfócitos TCD4+ e TCD8+, indicaria a utilização pelo vírus de mecanismos ora anti-apoptóticos para preservar neurônios e favorecer a disseminação viral, ora pró-apoptóticos, destruindo linfócitos e atenuando o processo inflamatório. Em síntese, o envolvimento do sistema nervoso central em decorrência da raiva se faz às custas de processo inflamatório com predomínio local de linfócitos TCD8+, um padrão Th2 de expressão de citocinas, acometendo os microambientes meningeal, perivascular e intraparenquimatoso, sendo o bulbo a região mais afetada pelo processo. / Viral disease of central nervous system almost invariable fatal, rabies causes about 60.000 deaths yearly, and still remain a neglected disease in most countries, specially in developing ones. We study the meningeal, perivascular and parenquimal environment in central nervous system from patients who dies after bat transmitted rabies, looking for the inflammatory process, host immune response and neuronal death. We show that human rabies transmitted by bats is a meningoencephalomyelitis. Immunohistochemistry allows the in situ quantification of viral antigen distribution, inflammatory cellular phenotype, expression of cytokines representing both Th1 and Th2 profile and pro-inflammatory and cell apoptosis. Viral antigen was found disseminatted in cerebral parenquima, more abundant in neurons, without cerebral area preference. Glial cells, specially astrocytes, were immunostained with rabies antigen, as well as endothelial and vascular mononuclear cells. These findings contributed for an alternative hypothesis of the occurrence of hematogenic viral dissemination, through viral infection or passage by endothelial cells, followed by astrocyte infection, and finally reaching neurons. IL-12 significant expression in central nervous system from rabies patients probably reflect preservation of immunity. The lack of effective NK cells could compromise adaptive immune response, demonstred by TCD4+ lymphocytes depletion in cerebral parenquima, ineffective TCD8+ cytotoxic activity with low granzyme expression and low expression of IFN-g and IL-2r. This situation reflects viral effect on host innate and adaptive immune response leading to an ineffective response for viral clearance. High pro-inflammatory cytokine expression, IL- 1b, IL-6 and TNF-a, contribute for neuronal damage, with predominant Th2 cytokine profile in central nervous system in rabies patients, with high expression of IL-4 and IL-10. Increased TGF-b expression also shows an immune suppressor environment, which maintains the neuronal network intact, but also contributes for viral permanence. The low degree of apoptotic neurons opposed with expressive apoptosis of TCD4+ and TCD8+ lymphocytes, could indicate viral mechanisms anti-apoptotic for neurons preservation and favour viral dissemination, or pro-apoptotic, destroying lymphocytes and attenuating the inflammatory process. In synthesis, the involvement of central nervous system in rabies is consequence of inflammatory process with TCD8+ lymphocytes predominance, Th2 profile cytokines expression, affecting all brain compartments and areas, especially the medulla oblongata.

A raiva é uma encefalomielite aguda causada por um vírus da ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus e espécie Rabies virus (RABV). É um vírus RNA de fita simples, senso negativo que acomete todas as espécies de mamíferos. Seu diagnóstico é obtido de modo definitivo por técnicas laboratoriais. A imunofluorescência direta (IFD) é uma prova de triagem rápida, considerada padrão ouro pela OMS e OIE, pois possui alta sensibilidade e especificidade diagnóstica. Esta técnica utiliza como teste confirmatório o isolamento viral em camundongos (IVC) ou em cultura de células (IVCC). Uma vez que o RABV não infecta todas as estruturas do sistema nervoso central (SNC) de modo uniforme, a detecção deste agente pode ter resultados variáveis. Algumas situações exigem o desenvolvimento e implantação de metodologias alternativas, tais como transcrição reversa seguida de reação em cadeia da polimerase (RT-PCR), RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) e imunohistoquímica (IHQ), que possuem vantagens e apresentaram resultados bastante promissores. Para tanto, foram utilizadas amostras de SNC[tálamo, córtex, hipocampo, cerebelo, tronco encefálico (bulbo, ponte e mesencéfalo) e medula cervical]de 127 bovinos provenientes da Seção de Diagnóstico da Raiva do Instituto Pasteur, durante o período de março de 2015 a abril de 2016. As diferentes regiões do SNC dos animais foram identificadas e alíquotas foram separadas para a realização das técnicas de identificação viral, totalizando 689 fragmentos. A presença viral foi observada pela IFD e confirmada tanto pelo IVC quanto pelo IVCC. A distribuição do vírus pelas diferentes porções do SNC foi observada pelas técnicas de IFD, IHQ e RT-PCR para detecção do gene N em 40 animais que foram considerados positivos. Os 40 bovinos positivos na IFD confirmaram sua positividade na IHQ e IVC, apresentando concordância de 100% dos resultados. Entretanto houve diferença em relação aos resultados dos isolamentos virais, uma vez que, dos 38 animais positivos que foram submetidosaambas as técnicas, três foram negativos para a presença do RABV no IVCC, indicando uma concordância de 92,1%, (3538) quando comparado ao IVC. Em relação às técnicas moleculares houve diferenças, a RT-PCR apresentou positividade de 100% (4040), enquanto que a RT-qPCR observou-se que 97,5% (39/40) dos bovinos foram positivos. Na IFD, de modo geral, não houve disparidade entre os fragmentos em relação à positividade, porém ocorreu diferença quando se analisou a intensidade de fluorescência entre os fragmentos. Quando comparadas, a IHQ e a IFD apresentaram resultados semelhantes, embora a IHQ tenha apresentado positividade em 100% fragmentos (209209) e a IFD em 99,51% dos fragmentos (205206). Conclui-se, pelos resultados obtidos, diferenças na intensidade da distribuição viral e na concentração de RNA viral nas diferentes porções do SNC (padrões de neuroinvasividade) em bovinos; fato este que poderia interferir nos resultados obtidos no diagnóstico de rotina da raiva. / Rabies is an acute encephalomyelitis caused by a virus belonging to the Mononegavirales order, Rhabdoviridae family, Lyssavirus genus and Rabies virus (RABV) species. It is a single-stranded RNA virus, negative sense that affects all species of mammals. The definitively diagnosis is obtained by laboratory techniques. Direct fluorescent antibody test (dFAT) is a rapid screening, considered the gold standard by WHO and OIE, as it has high diagnostic sensitivity and specificity. However, it´s recommended the mouse inoculation test (MIT) or rabies tissue culture infection test (RTCIT) as a confirmatory test. Once RABV does not infect all central nervous system (CNS) structures uniformly, the detection of this agent may have varying results Some situations require the development and implementation of alternative methods such as RT-PCR, RT-qPCR and immunohistochemistry (IHC), which have advantages and showed very promising results. Therefore, CNS structures [thalamus, cortex, hippocampus, cerebellum, brainstem (medulla, pons and midbrain) and cervical cord] from 127 cattle were selected from the Rabies Diagnostics Section of the Instituto Pasteur during the period March 2015 to April 2016. The different CNS structures were identified and aliquots were separated for carrying out the viral identification techniques, totalizing 689 structures. The viral presence was observed by dFAT and confirmed by both the MIT and the RTCIT. The distribution of the virus by different portions of the CNS was observed by dFAT, IHC and RT-PCR for detection of the N gene in 40 animals considered positive. The 40 positive cattle in the dFAT confirmed their positivity on IHC and MIT, with agreement of 100% of the results. However there was a difference from the viral isolation since the 38 positive animals tested in both techniques, three were negative for the presence of RABV in RTCIT indicating an agreement of 92.1% (35/38) when compared to MIT. The dFAT, in general, showed no disparity among the fragments relative to their positivity, however, a difference was observed when analyzing the fluorescence intensity between the fragments. When compared IHC and dFAT presented similar results, although the IHC has presented a 100% positivity in the fragments (209/209) and 99.51% in dFAT (205/206).Regarding the molecular techniques, RT-PCR showed positivity of 100% (40/40), meanwhile RT-qPCR showed 97,5% (39/40) among the positive animals studied. In conclusion, the results suggest that there is variability in the intensity of virus distribution and in the virus concentration in different parts of the CNS (neuroinvasiveness patterns) in cattle. This fact could affect the results obtained in the diagnosis of rabies routine.

Cultivos de células VERO em microcarregadores porosos de celulose (Cytopore) e porosos de gelatina (Cultispher G) com rendimento celular três vezes maior, foram obtidos em relação às culturas em microcarregadores sólidos de DEAE-dextran (Cytodex tipo 1). No Cytopore e Cultispher G atingimos 1.265 e 1.103 células/microcarregador, respectivamente e no Cytodex 1, 256 células/microcarregador. A concentração celular nos suportes porosos Cytopore aumentou 43 vezes o número de células iniciais, 37,5 vezes no Cultispher G e 17 vezes no Cytodex 1. As culturas de células VERO nos microcarregadores porosos foram utilizadas com êxito para a replicação do vírus rábico (PV/VERO), quando infectadas com MOI de 0,05. Títulos de 104,8 FFD50/mL determinados pelo método de inibição de focos fluorescentes (RFFIT) foram obtidos 96 horas após a infecção. Estudos de microscopia óptica e eletrônica de varredura e transmissão para análise da estrutura destes suportes, mostraram boa colonização celular e a eficiência da replicação viral. A padronização de metodologia para cultura e infecção viral de células VERO nos microcarregadores porosos indica a utilidade destes suportes para produção de antígenos e vacinas virais e a potencialidade do sistema para a obtenção de produtos biotecnológicos em geral. / Cultures of VERO cell on porous cellulose-coated microcarriers (Cytopore) and on porous gelatin-coated (Cultispher G) with a cellular yield 3 times higher, was obtained in relation to DEAE-dextran solid microcarriers (Cytodex type 1). In the cultures on Cytopore and Cultispher G we obtained 1.265 and 1.103 cells/microcarrier, respectively and 256 cells/microcarrier on Cytodex 1. The cell concentration for the Cytopore porous suports increased 43 times from the initial cell number, 37,5 times for the Cultispher G and 17 times for the Cytodex 1. The VERO cell cultures on porous microcarriers were efficiently used for the replication of the rabies virus (PV/VERO), when infected with 0,05 MOI. Titers of 104,8 FFD50/mL determined by the fluorescent focus inhibition method (RFFIT) were obtained 96 hours post-infection. Studies on light microscopy and scanning and transmission eletronic microscopy carried out to analyse the suports structure, showed a good cell population and efficiency of virus infection. The standardization of a methodology for culture and virus infection of VERO cells on porous microcarriers indicate the usefulness of these porous supports to the antigens and viral vaccines production and the potenciality of this system for the attainment of biotechnological products.

No interesse de reduzir os efeitos adversos relacionados às vacinas veterinárias e induzir tipos específicos de resposta imune, levou-se o desenvolvimento de numerosos novos adjuvantes. Recentemente, houve o descobrimento de um peptídeo intracelular funcional obtido através do estímulo celular com INF- γ, denominado EL28, tendo como principais características a hidrossolubilidade e a biodegradebilidade e, porém, no momento carece de ensaios de imunoestimulação associados com vacinas com potencial de mercado \"in vivo\". Neste sentido, o presente estudo teve como objetivo verificar a atividade imunoestimulante do EL28, associado ao vírus rábico inativado (VRI). Realizou-se a produção do antígeno VRI, e prepararam-se formulações vacinais: VRI associado ao EL28, VRI associado com Al(OH)3 e VRI sem presença de adjuvante, para imunização de camundongos Balb/c e avaliação da resposta imune humoral. A produção de anticorpos IgG totais, IgG1 e IgG2a foram determinados pelo ensaio de ELISA indireto. E os anticorpos neutralizantes para o vírus rábico foram quantificados através do método RIFFT. Os resultados do ELISA indireto foram expressos como Dose Imunoenzimática 50% (DI50) e mostraram que não houve aumento na produção de anticorpos na resposta imune humoral (IgG totais) entre a vacina associada ao EL28 (DI50= 3,0 X 10-3µL) e a vacina sem adjuvante (DI50=2,0 X 10-3µL). As IgG2a e IgG1 estão relacionados ao perfil da resposta Th1 e Th2 respectivamente, e mostraram diferença significativa em relação ao título da IgG1 entre a vacina associada ao EL28 (DI50= 5,9x10-4µL) e a vacina sem adjuvante (DI50=5,2x10-4µL), enquanto para os títulos de IgG2a não houve diferença significativa entre essas vacinas. O perfil da resposta Th foi obtido através da razão entre IgG2a e IgG1, o qual demonstrou que em todas as imunizações, com e sem adjuvantes, tiveram resposta predominante do tipo Th2. O método de RIFFT mostrou um aumento na potência de anticorpos neutralizantes na vacina associada ao EL28 em relação à imunização dos animais sem nenhum adjuvante. Portanto, esses resultados demonstram aumento da especificidade na resposta imunológica da vacina associada ao EL28. Sendo assim, pelos resultados apresentados, a vacina de raiva associada ao EL28 possivelmente teria uma maior eficiência e segurança. / In the interest of reducing the adverse effects related to veterinary vaccines and inducing specific types of immune response, numerous new adjuvants have been developed. Recently, a functional intracellular peptide obtained through cellular stimulus with the INF-γ, named EL28, it have as main characteristics the water solubility and the biodegradability, but at the moment it lacks immunostimulation assays associated with potencial market vaccine \"in vivo\". In this sense, the present study aimed to verify the immunostimulatory activity of EL28, associated with inactivated rabies virus (IRV). It carried out the production of IRV antigen, and prepared vaccine formulations: IRV with EL28, IRV with Al(OH)3 and IRV without the presence of adjuvant, for immunization of Balb/c mice and evaluation of the humoral immune response. The production of total IgG antibodies, IgG1 and IgG2a were determined by the indirect ELISA assay. And neutralizing antibodies to rabies virus were quantified using the RIFFT method. Indirect ELISA results were expressed as 50% Immunoenzymatic Dose (ID50) and showed no increase in antibody humoral immune response (IgG total) between the EL28 associated vaccine (ID50 = 3.0 X 10-3µL) and the vaccine without adjuvant (ID50 = 2.0 X 10-3µL). The IgG2a and IgG1 are related to the profile of Th1 and Th2 respectively, and showed a significant difference in relation to the IgG1 titer between the EL28 associated vaccine (ID50 = 5,9x10-4µL) and the non-adjuvant vaccine (ID50 = 5,2x10-4µL), while for IgG2a titers there was no significant difference between these vaccines. The Th response profile was obtained by the ratio of IgG2a and IgG1, which showed that in all immunizations with and without adjuvant, were predominantly Th2 response. The RIFFT method showed an increase of the potency of neutralizing antibodies in the vaccine with EL28 in relation to the immunization of the animals without any adjuvant. Therefore, these results demonstrate increased specificity in the immune response associated with EL28 vaccine. Therefore, from the results presented, the rabies vaccine associated with EL28 would possibly have a greater efficiency and safety.

A Organização Mundial da Saúde recomenda o teste de Imunofluorescência Direta (IFD) para a realização do Diagnóstico Laboratorial e Avaliação Sorológica da raiva. Como reveladores deste teste, são utilizados conjugados fluorescentes antirribonucleoproteínas (RNPs) do vírus da raiva, produzidos a partir de anticorpos anti-RNPs obtidos da purificação de soros hiperimunes de animais imunizados com RNPs purificadas. Os objetivos deste estudo foram: avaliar os efeitos da radiação gama na imunogenicidade das RNPs e comparar dois métodos cromatográficos de purificação de imunoglobulinas anti-RNPs. Os soros de animais imunizados com RNPs irradiadas e não irradiadas foram avaliados nos testes de Imunfluorescência Indireta e Ensaio Imunoenzimático. A partir dos resultados obtidos pode-se concluir que os animais imunizados com RNPs irradiadas necessitam de um menor número de doses para uma resposta imunológica com alto título de anticorpos. Por meio da IFD verificou-se que o conjugado produzido com anticorpos anti-RNPs irradiadas apresentou especificidade semelhante a do conjugado produzido a partir de anticorpos anti-RNPs não irradiadas, mas com melhor definição das inclusões características do vírus. Os processos de purificação de anticorpos por cromatografia de troca iônica e cromatografia de afinidade foram avaliados utilizando-se os testes de Bradford e eletroforese (SDS-PAGE). Pelos resultados obtidos pode-se concluir que, neste estudo, o processo de purificação que utilizou a cromatografia de afinidade foi o método que apresentou melhor rendimento, menor tempo de execução e obtenção de anticorpos com maior grau de pureza. / The World Health Organization recommends the direct immunofluorescence test for laboratory diagnosis and serological evaluation of rabies. To achieve this test, fluorescent anti-ribonucleoproteins (RNPs) conjugates, produced from purified IgGs of RNP-immunized animals are employed. The aims of the present study were: investigate the effects of gamma radiation on the immunogenicity of RNPs, as well as to compare two chromatographic methodologies for the purification of anti-RNPs immunoglobulins. Sera from animals immunized with either native or irradiated RNPs were compared by direct immunofluorescence and immunoenzymatic assays. Our results indicate that the animals immunized with irradiated antigen requested a lower number of doses to reach high antibody titers. The immunofluorescence assays indicated that the conjugates produced with the anti-irradiated RNPs IgGs showed similar specificity to its anti-native counterpart, but with a higher definition of the virus inclusions. The purification methods were compared by Bradford and electrophoresis assays. According to the results, we concluded that the affinity-based process resulted in higher yields, lower execution time, and higher purity of the antibodies.