La pollution atmosphérique particulaire représente un facteur de risque potentiel même à de faibles concentrations. Quelle que soit leur composition, les nanoparticules (NP) sont parmi les plus nocives en raison de leur capacité à atteindre profondément les tissus pulmonaires, la circulation sanguine et les organes. Notre travail constitue une base solide dans la compréhension des effets induits par une sélection de polluants atmosphériques représentatifs, utilisés dans un contexte environnemental réaliste. Nos résultats in vitro fournissent l'évidence d'un effet génotoxique à dominance clastogène lors de l’exposition de cellules à des NP contenant du CeO2, qui d’une part exercent une action mécanique sur le noyau, et d’autre part stimulent la production de O2•- / H2O2 via la NADPH oxydase et la mitochondrie, favorisant la production d’HO•. En présence de 1-Nitropyrène, on observe selon la dose utilisée deux mécanismes génotoxiques successifs, passant d'une dominance aneugène à clastogène, cet effet étant relié à une surproduction de HO• détectable par RPE. L'étude in vivo chez le rat a mis en œuvre un système de génération d'aérosols de NP contenant des pesticides, réalisant une exposition quotidienne et chronique à de faibles doses. Un effet direct sur la fonction hémodynamique myocardique reflétant l'apparition de dommages cellulaires irréversibles a été observée, ainsi que des lésions rénales, hépatiques, et l'installation d'un stress oxydant et d’une inflammation systémiques. Sur le long terme, l'effet des NP modifie les profils lipidiques et favorise la survenue d’une intolérance au glucose. Des modes d'action spécifiques à chaque pesticide employé ont été proposés. / Epidemiological studies have consistently reported that particulate matter in ambient air pollution is associated with increases in cardiopulmonary diseases and mortality. Because they can deeply penetrate lung tissue, reaching blood stream and organs, nanoparticles (NPs) are considered particularly harmful. Here, our foray into the specific mutagenicity and cytotoxicity of NPs focused on manufactured nano-CeO2 (a fuel additive) and NPs known to form in air from a variety of atmospheric toxicants (eg, combustion residues, pesticides). We first revealed a genotoxic effect of nanoCeO2 on human fibroblasts by a clastogenic mechanism following stimulation of the release of O2•-/H2O2 by NADPH oxidase and mitochondria. However, upon exposure of these cells to nM doses of 1-nitropyrene (a combustion byproduct) promotion of DNA damage involving an aneugenic mechanism occurred before a clastogenic effect was seen at µM doses. Second, using a home-made chamber equipped with an aerosol generator, we determined indices of oxidative stress and tissue damage in rats chronically inhaling toxicant NPs for 1-5 months at environmentally relevant doses. Long term exposure, even at low NPs doses, provoked systemic oxidative stress, lipid peroxidation, kidney damage, liver dysfunction, changes in lipid profile and occurrence of disorders of glucose tolerance. Moreover, a strong impairment of hemodynamic performance was evidenced in hearts from NP-exposed rats. By extending literature data of the in vitro toxicity of NPs to the in vivo situation, our study incriminates the nano-sized components of atmospheric particulate matter as a privileged vector of genotoxicity and cardiotoxicity.

L'efficacité du rtPA dans le traitement de l’ischémie aigue est bien reconnue avec des effets secondaires graves nécessitant l’évaluation d’autres stratégies. Un modèle d’ischémie cérébrale focale a été décrit, réalisé par injection in situ de thrombine. Dans notre première étude, nous avons utilisé l’imagerie par résonance magnétique multimodale pour documenter les lésions et les zones de pénombre dans ce modèle. Malgré une occlusion de l’artère reproductible et une hypoperfusion marquée chez tous les sujets, une reperfusion spontanée est constatée dans 38% des cas, rendant l’IRM incontournable dans l’évaluation de ce modèle. La deuxième étude a comparé l'efficacité d’un TAFI inhibiteur seul ou en combinaison avec le rtPA à faible dose. Nous avons montré que la combinaison du TAFI inhibiteur avec le rtPA à faible dose n'est pas aussi efficace que la dose standard de rtPA, avec une tendance positive, tandis que le TAFI inhibiteur seul n'est pas efficace du tout. Le modèle thromboembolique présente un intérêt particulier dans l'évaluation des stratégies thérapeutiques associées au rtPA pour améliorer la thrombolyse, surtout lorsqu'il est évalué par un suivi longitudinal en IRM / The benefit of recombinant tissue plasminogen activator (rtPA) treatment in stroke is well known with serious side effects requiring the evaluation of alternative strategies. Injection of thrombin in the middle cerebral artery of mice has been proposed as a new model of thromboembolic stroke. In the first study, we used multiparametric Magnetic Resonance Imaging (MRI), performed immediately after thrombin injection, to document occlusion and area at risk in this model. Despite similar MCA occlusion and marked hypoperfusion, half of animals showed a cortical lesion on DWI, while the other half demonstrated no or very limited lesion. Therefore, MRI measurement of basal lesion size is required to use this animal model in therapeutic studies. The second study compared efficacy between TAFI inhibitor alone and TAFI inhibitor in combination with low-dose rtPA. In conclusion, we showed that the combination of TAFI-I with low-dose rtPA is not as effective as the standard dose of rtPA, with a positive trend, while TAFI inhibition alone is not effective at all. The present thromboembolic model is of particular interest in assessing strategies rtPA association to improve thrombolysis, especially when coupled with longitudinal MRI assessment

Les femmes diabétiques de type 2 présentent un risque cardiovasculaire (CV) plus élevé que les hommes diabétiques de type 2, mais peu d’études s’intéressent au sexe féminin dans ce contexte. L’objectif de ce doctorat était i) d’étudier les altérations CV induites par le prédiabète/diabète de type 2 dans le sexe féminin ; ii) de proposer une approche thérapeutique par le Resvératrol (RSV) chez des rates diabétiques de type 2 ; et iii) d’étudier l’effet du sexe sur les modifications physiologiques induites lors d’un prédiabète et sur la tolérance myocardique à un épisode d’ischémie-reperfusion (IR). Nous avons utilisé le rat prédiabétique induit par un régime riche en graisse et en sucre (HFS), et le rat Goto-Kakizaki (GK) diabétique de type 2. Nous avons réalisé des expériences d’imagerie, de spectroscopie par résonance magnétique in vivo et ex vivo et des analyses biochimiques. Nous avons mis en évidence un épaississement et une augmentation de la perfusion myocardiques chez les femelles HFS, ainsi qu’une forte sensibilité myocardique à un épisode d’IR, impliquant un stress oxydant exacerbé. Le RSV a induit chez les femelles GK une cardioprotection en augmentant les composés riches en énergie et les protéines de la voie du monoxyde d’azote lors d’un épisode d’IR. Enfin, il n’y a pas de dimorphisme sexuel dans la tolérance myocardique à un épisode d’IR lors d’un prédiabète, bien que le régime HFS ait induit des modifications physiologiques différentes selon le sexe. En conclusion, nous avons montré que les dysfonctions endothéliale et mitochondriale jouent un rôle important dans les complications CV associées au diabète de type 2 dans le sexe féminin. / Type 2 diabetic women have a higher cardiovascular (CV) risk than type 2 diabetic men, but few studies focus on the female sex in this context. The objective of this PhD was i) to study CV alterations induced by prediabetes/type 2 diabetes in female; ii) to propose a therapeutic approach by Resveratrol (RSV) in type 2 diabetic female; and iii) to study the effect of sex on the prediabetes-induced physiological modifications and on the myocardial tolerance to ischemia-reperfusion (IR) injury. We used the prediabetic rat induced by a high-fat high-sucrose diet (HFS), and the type 2 diabetic Goto-Kakizaki rat (GK). We performed in vivo and ex vivo cardiovascular magnetic resonance imaging and spectroscopy experiments and biochemical analyses. We highlighted myocardial thickening and increased perfusion in female HFS, as well as high myocardial sensitivity to IR involving exacerbated oxidative stress. RSV treatment of female GK induced cardioprotection by increasing the high-energy compounds and the proteins of the nitric oxide pathway during IR injury. Finally, there was no sexual dimorphism in myocardial tolerance to IR injury in prediabetes, although the HFS diet induced sex-specific physiological changes. In conclusion, we have shown that endothelial and mitochondrial dysfunctions play an important role in CV complications associated to type 2 diabetes in the female sex.

In den ersten Versuchsreihen der hier vorliegenden Arbeit bestätigte sich, dass im in vitro Modell die klassische ischämische Präkonditionierung kardioprotektiv wirkt. Die Präkonditionierung bewirkte eine Infarktgrößenreduktion um 54 %; dies wird durch Literaturangaben bestätigt. Die Postkonditionierung dagegen, trotz drei verschiedener Postkonditionierungsprotokolle, ist am isoliert perfundierten Rattenherzen nicht protektiv. Im in vivo Rattenherz-Modell wurden die Präkonditionierung und die klinisch relevantere Postkonditionierung gegenüberstellend untersucht. Hier zeigte sich, dass die 3 Reperfusions-/Ischämiezyklen für jeweils 30 Sekunden der Postkonditionierung genauso protektiv wie die Präkonditionierung wirken. Infarktgrößen- und biochemische Untersuchungen belegen, dass hierbei die PI3-Kinase ein wichtiges Signaltransduktionselement ist, da einerseits durch die Inhibition der PI3-Kinase mittels Wortmannin die Infarktgrößenreduktion vollständig aufgehoben war und andererseits nach einer 1,5-minütigen Reperfusion eine vermehrte Phosphorylierung der Akt im Western-Blot auftrat. Des Weiteren konnte erstmals die Inaktivierung der GSK-3ß durch eine verstärkte Phosphorylierung über einen PI3-Kinase-vermittelten Signaltransduktionsweg nachgewiesen werden. Die Zugabe des spezifischen Inhibitors TDZD-8 der GSK-3ß verringert ebenfalls die Infarktgröße signifikant. Auch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass das mammalian target of Rapamycin in der Postkonditionierung des in vivo Rattenherzens eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Außerdem konnte neben dem PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktionsweg auch die Beteiligung des MEK1/2-ERK1/2–Wegs als Signaltransduktionsweg der Postkonditionierung im in vivo Rattenherzen nachgewiesen werden. Erstmals wurde die Apoptose in einem in vivo Herzen nach regionaler Ischämie untersucht. Die Ergebnisse des TUNEL-Tests und der Western-Blot-Analysen zeigen eine unterdrückte Apoptose durch die Postkonditionierung. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit widmete sich der Untersuchung der Postkonditionierung in pathologischen Rattenherzen. Im Gegensatz zu gesunden Herzen schlug die Postkonditionierung in hypertrophiertem Myokardium von spontan-hypertensiven Ratten mit einer signifikant arteriellen Hypertension fehl. Diese Blockierung der Kardioprotektion zeigte sich durch die fehlende Reduzierung der Infarktgröße trotz unterschiedlicher Postkonditionierungsprotokolle (3x30’’ und 6x10’’ R/I) und unterschiedlich langer Ischämiedauern (20 und 30 Minuten). Gleichfalls war auch die Phosphorylierung der GSK-3ß aufgehoben. Als Modell des metabolischen Syndroms wurde die WOKW-Ratte untersucht. Diese Ratten entwickeln in sehr jungem Alter klassische Symptome wie Dyslipidämie, Hyperinsulinämie und Fettsucht. Wie bei der Herzhypertrophie war auch beim Modell des metabolischen Syndroms die Postkonditionierung - mit 3 Reperfusions-/ Ischämiezyklen für jeweils 30 Sekunden - blockiert. Dabei konnte weder eine Infarktgrößenreduktion noch eine vermehrte Phosphorylierung der GSK-3ß nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben die Schlußfolgerung, dass das Substrat der GSK-3ß, die mPTP des Mitochondriums, eine „Schlüsselrolle“ in der Apoptose innehat - die Postkonditionierung vermindert nicht nur die Nekrose, sondern reduziert auch die Apoptose. Bemerkenswert und potentiell von klinischer Bedeutung ist die Beobachtung, dass bei Vorliegen von Risikofaktoren, wie arterielle Hypertonie und metabolischem Syndrom, solche Schutzmechanismen des Herzens aufgehoben sind. Diese Erkenntnisse sind im Hinblick auf die Therapie am Menschen von großer Bedeutung. Ob langfristig einzelne Komponenten der Signaltransduktionswege, wie PI3-Kinase, Akt, mTOR, ERK1/2 oder GSK-3ß, Angriffspunkte einer pharmakologischen Therapie sein könnten, muß in weiteren Untersuchungen geklärt werden.

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L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est une complication clinique associée à une mortalité significative. Parmi les diverses causes d'IRA, l'ischémie-reperfusion (IRI) est une étiologie importante, en particulier dans le contexte de la transplantation rénale. Les types de mort cellulaire programmée (MCP) activées dans l'IRA induite par IRI ont été étudiées par des nombreux groupes. L’atteinte tubulaire épithéliale est classiquement considérée comme le principal contributeur à l'IRA.En effet, plusieurs morts programmées de cellules tubulaires ont été démontrées dans la littérature. Cependant, les lésions endothéliales microvasculaires rénales attirent davantage l'attention en tant qu'inducteurs cruciaux de dysfonctionnement microvasculaire et de fibrose rénale progressive. Ainsi, certaines équipes de recherche, dont la nôtre a rapporté le développement de l'apoptose endothéliale rénale en association avec l’IRI. Le but de mon travail était donc de caractériser les types de mort cellulaire microvasculaires secondaires à l’IRI et leur contribution à la dysfonction rénale. Pour évaluer l'importance de l'apoptose dans l'IRA induite par IRI, nous avons utilisé un modèle murin d’IRI chez des souris caspase-3 knock-out (KO) et sauvages, avec clampage de l'artère rénale pendant 30 minutes (modèle IRA légère) ou 60 minutes (modèle IRA sévère). Dans le modèle IRA légère, notre résultat montre que la carence en caspase-3 empêche la mort apoptotique des cellules endothéliales dans toutes les phases de l'IRA, atténuant la raréfaction microvasculaire, le dépôt de collagène et la fibrose rénale. L’absence de caspase-3 favorise aussi le maintien d’une perméabilité endothéliale microvasculaire normale à long terme. Toutefois, l’invalidation de la caspase-3 aggrave la mort cellulaire tubulaire à court terme en favorisant la nécroptose, mais améliore l’homéostasie tubulaire à long terme grâce à la préservation des capillaires péritubulaires (PTCs) permettant un maintien de la perfusion tubulaire. En outre, le déficit en caspase-3 est également associé à un effet protecteur contre la raréfaction microvasculaire rénale, la fibrose rénale progressive, ainsi qu'une perméabilité endothéliale améliorée et une préservation de la fonction rénale dans le modèle d’IRA sévère. En conclusion, nos résultats démontrent l'effet crucial de l’apoptose endothéliale microvasculaire en tant qu'inducteur de dysfonctionnement microvasculaire rénal, de raréfaction microvasculaire et de fibrose rénale progressive dans la physiopathologie de l'IRA légère et sévère induite par l'IRI. Ils établissent aussi l’importance prédominante de l’atteinte microvasculaire plutôt que tubulaire épithéliale dans la prédiction de la perte de fonction rénale à long terme suite à une IRI. / Acute kidney injury (AKI) is a crucial clinical event, with increasing incidence and mortality. Among various pathogenesis of AKI, ischemia-reperfusion injury (IRI) is an important etiology, especially in the renal post-transplant scenario. The complex of programmed cell deaths (PCD) developed in IRI-induced AKI has been proven in a number of investigations. Renal tubular epithelial injury has been considered as the major contributor in AKI and multiple programmed tubular epithelial cell (TECs) deaths have been demonstrated in the literature. However, renal microvascular endothelial injury is attracting more attention as an important inducer of microvascular dysfunction and renal progressive fibrosis. Some investigators, including our team, have reported the development of renal endothelial apoptosis in the condition of ischemia. Apoptosis, a commonly known programmed cell death, has been elucidated in both renal TECs and microvascular endothelial cells (ECs) post-IRI and the activation of caspase-3 functions as the key effector of caspase-dependent apoptosis. To verify the importance of apoptosis in IRI- induced AKI, we applied the in vivo murine renal IRI model in wild-type and caspase-3 KO mice, with clamping the renal artery for 30 minutes (mild AKI model) or 60 minutes (severe AKI model). In regard to the mild AKI model, our result demonstrates that caspase-3 deficiency prevents ECs apoptotic death in all phases of AKI, attenuating microvascular rarefaction, collagen deposition, and renal fibrosis, while maintaining physical endothelial permeability in the long-term. Meanwhile, caspase-3 deletion aggravates tubular injury in the short-term by promoting TECs necroptosis but ameliorates long-term tubular injury through preserved peritubular capillaries (PTCs) function. Furthermore, caspase-3 deficiency also demonstrated a protective effect against renal microvascular rarefaction, progressive renal fibrosis, as well as enhanced endothelial permeability in the severe AKI model. Conclusively, our findings determine the crucial effect of microvascular endothelial apoptosis as an inducer of renal microvascular dysfunction, microvascular rarefaction, and progressive renal fibrosis in the pathophysiology of mild and severe AKI induced by IRI. Additionally, our results demonstrate the predominant importance of microvascular endothelial injury over tubular epithelial injury in predicting renal function loss at long-term post-IRI.

Contexte : Au cours de la dernière décennie, le nombre de personnes en attente d’une transplantation cardiaque a augmenté d’environ 25%, tandis que le nombre de greffes effectuées chaque année est resté stable. Le taux de décès des patients en attente d’une greffe cardiaque est d’environ 15-20%. Le don d’organe suite à un décès cardiocirculatoire (DDC) est une alternative au don après décès neurologique (DDN) qui a permis d’augmenter le nombre d’organes disponibles comme les poumons, les reins et les foies. Compte tenu de la survenue d’une mort cardiovasculaire dans les protocoles DDC, le cœur est rarement greffé à cause des dommages infligés durant la période d’ischémie chaude. Notre équipe a précédemment démontré que l’utilisation du Celastrol, ainsi que notre analogue synthétique inhibiteur de la HSP90 ont des effets cardioprotecteurs, quand administrés au moment de la reperfusion dans des modèles in vitro de culture cellulaire et ex vivo dans des cœurs de rats montés sur le système de perfusion Langendorff. L’objectif est d’évaluer les mécanismes cardioprotecteurs rapides d’une nouvelle formulation de l’inhibiteur HSP90, et de comprendre l’efficacité de ce nouveau composé synthétique sur deux lignées de cellules : les cardiomyoblastes H9c2 issus de rats et les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (iPSC-CMs). Méthodes/Résultats : Les cellules H9c2 et iPSC-CMs ont été cultivées. La signalisation cellulaire a été analysée par western blot pour évaluer le niveau d’activation de ces différentes voies. Suite à l’optimisation des conditions pour les cellules iPSC-CMs, les deux lignées cellulaires ont été mises en condition ischémique (sans glucose, 95% N2, 5% CO2) durant la nuit, puis reperfusées, en conditions normales, avec différentes concentrations de l’inhibiteur HSP90. La viabilité cellulaire ainsi que l’ouverture des pores mitochondriaux (mPTP) ont été évaluées à l’aide de kits d’analyses, la production de radicaux libres d’oxygène à l’aide de kits de fluorescence et l’expression des ARN messagers de gènes antioxydants à l’aide de la réaction en chaîne par polymérase (PCR). Les résultats ont montré une augmentation de l’activation des voies cytoprotectrices quand les deux lignées cellulaires étaient traitées à la concentration 10-6M du composé sans stress 4 ischémique : augmentation de HO-1 and HSP-70 dans les 30 premières minutes et AKT et ERK après 1 heure de traitement et 3 heures de récupération. Contrairement à nos attentes, le traitement au moment de la reperfusion à la concentration 10-6M a montré une diminution de la viabilité des cellules, alors que la concentration 10-7M l’a augmenté. À une concentration de 10- 7M, il y a eu diminution de la production de radicaux libres comparativement au groupe témoin. Comme attendu, cette concentration a aussi démontré une diminution de l’ouverture des mPTP. Tous ces résultats ont été observés, autant dans les cellules humaines que celles de rats. Une évaluation préliminaire de l’expression des gènes antioxydants dans les cellules H9c2 a seulement montré une augmentation de l’expression des gènes CAT et HO-1. Conclusion : Notre groupe de recherche a précédemment démontré l’efficacité des composés issus du Celastrol sur la réduction des dommages myocardiques dus à la reperfusion dans les modèles d’ischémie, incluant l’infarctus du myocarde et la donation après décès cardiocirculatoire. Ces expériences ont montré les effets bénéfiques du nouveau composé synthétique sur l’expression des gènes antioxydants, et sur l’activation d’une série de voies cytoprotectrices permettant la stabilisation de la membrane mitochondriale, réduisant aussi la production de radicaux libres, et améliorant ultimement la survie cellulaire. Des études supplémentaires sont en cours afin d’améliorer la compréhension des modes d’action, des mécanismes et des dosages optimaux du médicament, ce qui nous permettra de commencer les essais sur animaux dans le but d’introduire cette molécule en clinique dans le contexte de don d’organes. / Background: During the last decade, the number of people waiting for a cardiac transplantation has increased by about 25%, while the number of yearly transplant surgeries performed has remained steady. The death rate of patients awaiting heart transplant is about 15-20%. Organ donation after circulatory death (DCD) is an alternative to donation after neurological death (DND) that has allowed to increase the number of available organs like lungs, livers, and kidneys. However, because of the cardiac death in DCD protocols, the heart is rarely used because of the injuries suffered by the warm ischemia period. Our group has previously shown that Celastrol, along with a synthetic HSP90 inhibitor analog, have cardioprotective effects when given as postconditioning agents at the moment of reperfusion in an in vitro model on cellular cultures and an ex vivo model on rat hearts mounted on a Langendorff perfusion system. The objective is to evaluate the rapid cardioprotective mechanisms of a novel formulation of the HSP90 inhibitor compound, and to understand the efficacy of this new synthetic compound on two cell lines: rat H9c2 cardiomyoblasts and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSCCMs). Methods/Results: H9c2 rat cardiomyoblasts and human iPSC-CMs were cultured. Cell signaling was analyzed by western blot to evaluate pathway activations. Both cell lines were put in ischemic conditions (no glucose, 95% N2, 5% CO2) overnight, then reperfused (normal conditions) with different concentrations of HSP90i after optimizing the human iPSC-CMs’ stress experiment. Cell viability and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening were evaluated using assays, oxygen-free radical production by fluorescence assay and antioxidant gene messenger RNA expression via polymerase chain reaction (PCR). Results showed an increase in cytoprotective pathway activation when both cell lines were treated with 10-6M of the compound without any stress: HO-1 and HSP-70 in the first 30 minutes while AKT and ERK after 1 hour of treatment and 3 hours of recuperation. Interestingly, treatment with the compound at 10-6M at the moment of reperfusion showed decreased viability of the cells while 10-7M improved it. Free radical production was also decreased at a concentration of 10-7M 6 when compared to the baseline, and as expected, the compound also decreased mPTP opening. These results were seen in both human and rat cell lines. Preliminary evaluation of antioxidant gene expression in H9c2 cells only showed an increase in the expression of the cytoprotective CAT and HO-1 genes. Conclusion: Our research group has previously demonstrated the efficacy of Celastrol compounds in reducing reperfusion damage in myocardial ischemia models, including myocardial infarction and donation after circulatory death. These experiments have shown that the beneficial effects of this new synthetic compound include the expression of antioxidant genes and the launching of a series of cytoprotective pathways that stabilize the mitochondrial membrane, reduce free radical production, and improve cell survival. Additional studies to fully understand the mode of action, the mechanisms and the optimal dosages are underway to allow us to move to animal trials in order to ultimately introduce the molecule in the clinical field in the context of organ donation.

Mémoire en recherche-création / Creative dissertation / Objectif: Les lésions rénales aiguës causées par l'ischémie-reperfusion rénale (I/R) constituent un problème clinique majeur pour lequel les thérapies sont limitées, et dont le mécanisme sous-jacent reste mal compris. L'insuffisance rénale aiguë précède souvent la transition vers l'insuffisance rénale chronique, marquée par une inflammation soutenue, un remodelage tubulaire et une fibrose. Il est intéressant de noter que la protéine Hedgehog interacting (Hhip) a été identifiée comme un régulateur important dans la maladie rénale chronique, avec une expression notable dans les cellules endothéliales. Cependant, l'implication et le rôle de Hhip dans l'insuffisance rénale aiguë n'ont pas fait l'objet d'études approfondies. Dans ma thèse de maîtrise, nous cherchons à déterminer si le knock-out de Hhip spécifique aux cellules endothéliales peut prévenir l'insuffisance rénale aiguë induite par l’I/R in vivo, et à explorer les mécanismes moléculaires possibles par le biais d'expériences in vitro. Méthodes: Une I/R rénale unilatérale de 45 minutes ou une chirurgie sham avec néphrectomie controlatérale a été réalisée sur des souris mâles HhipEC-KO âgées de 10 semaines et sur leurs compagnons de contrôle Hhipfl/fl, respectivement. Les souris ont été divisées en quatre groupes : sham-Hhipfl/fl, sham-HhipEC-KO, IRI-Hhipfl/fl, IRI-HhipEC-KO, avec 6-8 souris dans chaque groupe. Des échantillons de sérum, d'urine et de rein ont été prélevés dans chaque groupe aux 1er, 3e et 7e jours postopératoires en vue d'analyses ultérieures. Les expériences in vitro ont consisté à exposer des cellules tubulaires proximales rénales naïves (IRPTCs) au milieu conditionné prélevé sur des cellules endothéliales de souris (mECs) dans différentes conditions, y compris la présence ou l'absence de Hhip (Hhip recombinant ou siRNA-Hhip) et le traitement au cisplatine. Résultats: Par rapport aux souris témoins sham, les souris qui ont subi une chirurgie I/R rénale ont toutes subi une perte de poids corporel significative et des lésions tubulaires rénales marquées, quel que soit le statut du knock-out Hhip. Les souris IRI-Hhipfl/fl ont présenté un taux de mortalité plus élevé et un rapport albumine/ créatinine (ACR) élevé en postopératoire par rapport aux souris IRI-HhipEC-KO. De meilleurs résultats pathologiques et une fibrose rénale réduite ont été observés chez les souris HhipEC-KO lors de lésions rénales aiguës. En outre, les niveaux d'expression du marqueur de lésions rénales-1 (KIM-1) étaient plus faibles chez les souris IRI-HhipEC-KO que chez les souris IRI-Hhipfl/fl. Notamment, l'expression des marqueurs associés à la sénescence cellulaire, y compris la β-galactosidase associée à la sénescence (SA-β-gal), la p21 et la p16, était accrue dans les tubules rénaux des souris Hhipfl/fl, mais significativement réduite chez les souris HhipEC-KO. Des expériences in vitro ont également révélé que les IRPTCs naïves cultivées dans un milieu conditionné (CM) provenant de mECs prétraitées au cisplatine présentaient une réponse de sénescence cellulaire prononcée, caractérisée par l'expression accrue de p21 et de p53. Cependant, le CM provenant de mECs silencées par Hhip, contenant également du cisplatine, a largement atténué ces effets néfastes chez les IRPTCs naïves. En outre, les reins des souris IRI-HhipEC-KO présentaient moins de fibrose et une plus faible expression de la molécule d'adhésion vasculaire-1 (VCAM-1) que les reins des souris témoins (IRI-Hhipfl/fl). Conclusion: Ces résultats suggèrent le rôle protecteur du knock-out de Hhip dans les cellules endothéliales contre les lésions tubulaires rénales induites par les lésions rénales aiguës. Cette protection potentielle peut être médiée, au moins en partie, par l'inhibition de la sénescence des cellules tubulaires médiée par Hhip. / Background/aim: Acute kidney injury (AKI) caused by renal ischemia reperfusion (I/R) stands as a major clinical issue with limited therapies, and its underlying mechanism remains poorly understood. AKI often precedes the transition to chronic kidney disease (CKD), marked by the sustained inflammation, tubular remodeling, and fibrosis. Interestingly, Hedgehog interacting protein (Hhip) has been identified as an important regulator in CKD, with notable expression in endothelial cells. However, the involvement and the role of Hhip during AKI has not been thoroughly investigated. In my master’s thesis, we aim to investigate whether endothelial cell-specific knockout of Hhip can prevents renal I/R-induced AKI in vivo, and to explore possible molecular mechanisms involved through in vitro experiments. Methods: 45-minute unilateral renal I/R or sham surgery, along with contralateral nephrectomy, was performed on 10-week-old male HhipEC-KO and its control littermate Hhipfl/fl mice, respectively. The mice were divided into four groups: sham-Hhipfl/fl, sham-HhipEC-KO, IRI-Hhipfl/fl, IRI-HhipEC-KO, with 6-8 mice in each group. Serum, urine and kidney samples were collected from each group on the 1st, 3rd, 7th postoperative days for subsequent analysis. In vitro experiments involved exposing naïve renal proximal tubular cells (IRPTCs) to the conditioned medium harvested from mouse endothelial cells (mECs) under different conditions, including presence or absence of Hhip (recombinant Hhip or siRNA-Hhip) and Cisplatin treatment. Results: Compared to sham control mice, mice that underwent renal I/R surgery all experienced significant body weight loss and marked renal tubular injury, regardless of Hhip knockout status. IRI-Hhipfl/fl mice exhibited a higher mortality rate and an elevated albumin/creatinine ratio (ACR) postoperatively compared to IRI-HhipEC-KO mice. Improved pathological outcomes and reduced renal fibrosis were observed in HhipEC-KO mice during AKI. In addition, the expression levels of kidney injury marker-1 (KIM-1) were lower in the IRI-HhipEC-KO mice than in the IRI-Hhipfl/fl mice. Notably, the expression of cellular senescence-associated markers, including senescence-associated-β-galactosidase (SA-β-gal), p21, and p16 was enhanced in the renal tubules of Hhipfl/fl mice, but significantly reduced in HhipEC-KO mice. In vitro experiments further revealed that naïve IRPTCs cultured in conditioned medium (CM) from Cisplatin-pretreated mECs exhibited a pronounced cellular senescence response, characterized by the upregulated expression of p21 and p53. However, CM from Hhip-silenced mECs, also containing Cisplatin, largely mitigated these adverse effects in naïve IRPTCs. Furthermore, kidneys of IRI-HhipEC-KO mice displayed less fibrosis and lower expression of vascular adhesion molecule-1 (VCAM-1) compared to their controls (IRI-Hhipfl/fl). Conclusion: These results hint at the protective role of Hhip knockout in endothelial cells against AKI-induced renal tubular injury. This potential protection may be mediated, at least in part, by the inhibition of Hhip-mediated tubular cell senescence.

Thesis (MScMedSc)--Stellenbosch University, 2015. / ENGLISH ABSTRACT: Obesity has reached epidemic proportions worldwide and is currently a serious health problem. It is associated with metabolic abnormalities, oxidative stress, hypertension, insulin resistance and an increased disposition for the development of cardiovascular disease. Elucidation of the pathophysiological mechanisms underlying obesity and its relationship with metabolic and cardiovascular diseases is essential for prevention and management of these disorders. Melatonin, the pineal gland hormone, is a powerful antioxidant and has been shown to protect the myocardium against ischaemia/reperfusion (I/R) injury. Long- as well as shortterm melatonin treatment also reversed several of the harmful effects of obesity in an animal model of hyperphagia-induced obesity (DIO). However, its effects on myocardial I/R injury and intracellular signalling in obesity induced by a high fat diet (HFD) are still unknown. Aims of study: (i) To evaluate the ability of a high fat diet (HFD) to induce obesity in rats. Apart from evaluating its effects on the biometric parameters and resistance to ischaemia/reperfusion injury (as indicated by infarct size in regional ischaemia and functional recovery after global ischaemia), special attention will be given on the interplay between adiponectin, AMPK, leptin, and FFA in this model. (ii) To evaluate the effect of daily oral administration of melatonin to rats on the HFD as well as their littermate controls, on the parameters listed above as well as on the development of obesity. In this study melatonin will be administered from the onset of the feeding of the high fat diet. Methods: Male Wistar rats were divided into 4 groups: (i) control rats (receiving normal rat chow) (C); (ii) control rats receiving melatonin (CM); (iii) obese rats (receiving HFD) (HFD); (iv) obese rats receiving melatonin (HM). Animals were kept on the diet for 16 weeks and melatonin treatment (10mg/kg/day, added to the drinking water) started at the onset of the feeding. Following feeding and treatment, the animals were grouped into fasted/ non-fasted of which biometric parameters were recorded and blood collected at the time of sacrifice for metabolic and biochemical assays. Hearts were perfused in the working mode for evaluation of myocardial function and infarct size determination after exposure to 35min regional ischaemia/60min reperfusion. For study of intracellular signaling, hearts were perfused in the working mode, subjected to 20min global ischaemia/10min reperfusion and freeze-clamped for Western blotting. Plasma leptin, adiponectin, free fatty acid, triglycerides, total cholesterol, phospholipids, conjugated dienes and thiobarbituric reactive substances (TBARS) levels were determined. Several kinases were investigated including, the RISK (reperfusion injury salvage kinase) (PKB/Akt and ERK p44/42) and SAFE (survivor activating factor enhancement) (STAT-3) pathways, AMPK and JNK under baseline conditions or following 10 min reperfusion. In addition, expression of UCP-3 and PGC1-α was determined. Results: Significant increases in body weight, visceral fat, blood glucose, insulin, HOMA index and leptin and a reduction in adiponectin levels were observed in the fasted high fat diet (HFD) group when compared with controls (C). Significant increases in free fatty acid and triglyceride levels were also noted the HFD group while other serum lipid parameters, including TBARS, remained unchanged. No differences in functional recovery during reperfusion or infarct size after exposure to 35 min regional ischaemia, as well as functional recovery during reperfusion after 20 min global ischaemia were observed between the control and HFD groups. Baseline and 10 min reperfusion data were similar for the RISK and SAFE pathway kinases for the control vs HFD groups. The HFD also had no effect on the expression and phosphorylation of myocardial AMPK and JNK, as well as on the expression of UCP-3 and PGC1-α, when compared to the controls. Treatment with melatonin significantly reduced body weight, visceral fat, blood glucose, HOMA index and serum leptin levels in HFD treated groups, while having no effect on the lipid profile. Although melatonin significantly reduced infarct size in both control [% of area at risk: 20.59 ± 2.29 (CM) vs 38.08 ± 2.77 (C)] and high-fat diet groups [% of area at risk: 11.43 ± 2.94 (HM) vs 38.06 ± 3.59 (H)], it was without effect on myocardial functional recovery during reperfusion. Melatonin had no effect on the intracellular signaling pathways studied. Conclusions: The HFD proved to be a useful model of diet-induced obesity with a more pronounced impact on biometric and metabolic changes compared to the DIO model. Long-term melatonin treatment successfully prevented the development of metabolic abnormalities associated with the high fat diet and obesity as well as significantly reduced myocardial infarct size. The mechanisms involved in melatonin-induced cardioprotection in obesity have not been fully elucidated in this study and require further investigation. However, the anti-obesogenic and cardioprotective properties of melatonin were very significant indeed and support the suggestion of this hormone as a potential tool in the treatment of obesity and associated cardiovascular complications. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Vetsug (obesiteit) het wêreldwyd epidemiese afmetings aangeneem en word tans as ‘n ‘n ernstige gesondheidsprobleem beskou. Vetsug word geassosieer met metaboliese afwykings, oksidatiewe stres, hipertensie, insulienweerstandigheid en is‘n belangrike risikofaktor vir die ontwikkeling van kardiovaskulêre siekte. Ten spyte hiervan, het onlangse studies ‘n gunstige effek van vetsug op die uitkomste van miokardiale infarksie in pasiënte gerapporteer, die sg obesiteitsparadoks. Kennis van die patofisiologiese meganismes onderliggend aan vetsug en die ontstaan van metaboliese afwykinge en hartsiekte is noodsaaklik vir die voorkoming en behandeling van hierdie toestande. Melatonien, die hormoon afgeskei deur die pineaalklier, is ‘n kragtige antioksidant en vry radikaal opruimer. Dit is voorheen aangetoon dat dit die hart teen iskemie/herperfusie (I/H) besering kan beskerm en sommige van die skadelike gevolge van vetsug in diermodelle kan omkeer. Die effek van melatonien op miokardiale I/H besering en intrasellulêre seintransduksie prosesse in vetsug geïduseer deur ‘n hoë vet dieet is egter nog onbekend. Doelstellings: (i) Die ontwikkeling en karakterisering van ‘n nuwe model van vetsug en insulienweerstandigheid geïnduseer deur 'n hoë vet dieet (HVD) en die evaluering van die effek daarvan op miokardiale I/H besering en die gepaardgaande intrasellulêre seintransduksieprosesse; (ii) Bepaling van die effek van daaglikse toediening van melatonien aan rotte op die HVD sowel as aan kontroles op ‘n standard dieet, op die ontwikkeling van dieet-geïnduseerde metaboliese veranderinge, miokardiale infarktgrootte en funksionele herstel na koronêre arterie afbinding, sowel as intrasellulêre seintransduksie. Metodiek: Vier groepe van manlike Wistar rotte is bestudeer: (i) kontrole rotte (op‘n standaard dieet) (K); (ii) kontrole rotte op ‘n standard dieet plus melatonien (KM); (iii) dieetrotte (op‘n HVD); (iv) HVD rotte wat melatonien ontvang (HM). Die HVD en melatonien (10mg/kg/dag in die drinkwater) is vir 16 weke toegedien. Na die periode van behandeling, is die diere in vastende en nie-vastende groepe verdeel, die biometriese parameters genoteer en bloedmonsters vir metaboliese en biochemiese bepalings versamel, tydens verwydering van die harte. Harte is geperfuseer volgens die werkhartmodel vir bepaling van miokardiale funksie en infarktgrootte na blootstelling aan 35min streeksiskemie. Vir evaluering van intrasellulêre seintransduksie, is geperfuseerde werkende rotharte blootgestel aan 15min globale iskemie/10 min herperfusie en gevriesklamp vir latere analises volgens die Western kladtegniek.hart. Serum leptien, adiponektien, vryvetsure, trigliseried, totale cholesterol, fosfolipiede, gekonjugeerde diene en tiobarbituursuur reaktiewe stowwe (TBARS) is bepaal. Met gebruik van Western kladtegniek, is die aktivering en/of uitdrukking van die RISK (PKB/ Akt en ERK p44/42) en SAFE (STAT-3) seintransduksiepaaie, AMPK, JNK, UCP-3 en PGC1-α, onder basislyn toestande of na 10 min herperfusie bestudeer. Resultate:‘n Beduidende toename in liggaamsgewig, visserale vet, die HOMA indeks, insulien en leptien vlakke is in die HVD groep waargeneem vergeleke met die kontrole (K) rotte. Adiponektien vlakke was laer in die HVD groep. Die HVD groep is ook gekenmerk deur ‘n beduidende styging in serum vryvetsuur en trigliseried vlakke, terwyl die ander lipied parameters, insluitende die TBARS vlakke, onveranderd was. Infarktgrootte en funksionele herstel tydens herperfusie na blootstelling aan 35 min streeksiskemie, asook funksionele herstel tydens herperfusie na 20 min globale iskemie het nie verskil tussen harte van die kontrole en HVD rotte nie. Aktivering van PKB/Akt, ERK p44/p42, STAT3, AMPK en JNK by basislyn en na 10 min herperfusie was soortgelyk in die kontrole en HFD groepe. Die HVD het ook geen effek op die uitdrukking van UCP-3 en PGC1-α in vergelyking met die kontrole gehad nie. Behandeling met melatonien het die liggaamsgewig, visserale vet, bloedglukose, HOMA indeks en serum leptien vlakke in die HVD groepe statisties beduidend verlaag, terwyl dit geen invloed op die lipiedprofiel gehad het nie. Melatonien behandeling het die miokardiale infarktgrootte beduidend en tot dieselfde mate verminder in beide kontrole [20.59 ± 2.29 (KM) vs 38.08 ± 2.77% (K)] en HVD groepe [11.43 ± 2.94 (HM) vs 38.06 ± 3.59% (HVD)]. Geen verskille is egter tussen die funksionele herstel gedurende herperfusie van die behandelde en onbehandelde kontrole en HVD groepe waargeneem nie. Melatonien het ook geen uitwerking op die intrasellulêre seintransduksiepaaie gehad nie. Gevolgtrekkings: Die resultate het getoon dat die HFD 'n goeie model van dieetgeïnduseerde vetsug en insulien weerstandigheid ontlok, met 'n meer uitgesproke impak op biometriese en metaboliese veranderinge as die voorheen gebruikte hoë-sukrose dieet. Langtermyn melatonien- behandeling het die ontwikkeling van metaboliese abnormaliteite geassosieer met die HVD, voorkom, asook miokardiale infarktgrootte na koronêre afbinding beduidend verminder. Die meganismes betrokke in melatonien-geïnduseerde miokardiale beskerming moet egter in meer detail ondersoek word. Die resultate verkry steun die voorstel dat melatonientoediening voordelig sal wees in die behandeling van vetsug en sy kardiovaskulêre komplikasies.

Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2006. / ENGLISH ABSTRACT: Introduction: It is well documented that insulin offers cardioprotection against the consequences of ischaemia/reperfusion injury. Insulin-induced improvements in cardiac functions are widely investigated in models of ischaemia and reperfusion. It has been shown that many signalling pathways may be involved in the cardioprotection properties of insulin under those conditions. These pathways include PI3-K, PKB/Akt, p70S6k, ERK and many others. However, little data exists on the effects of insulin on the heart under normoxic condition. Some evidence has been presented that insulin has a positive inotropic effect on the normoxic perfused rat heart, but no precise cellular mechanism has been investigated or described in this regard. We believe that an investigation into the effects of insulin on cardiac function and pathways involved under normoxic conditions may help us to better understand the mechanisms of insulin-induced cardioprotection. Aims: To determine a suitable dose of insulin at which a positive inotropic response could be detectable under normoxic conditions, to investigate the possible mechanisms involved in insulin-induced increases in contractility with specific reference to the vasculature and the coronary flow and to investigate a possible involvement of PI3-K and its downstream effectors on the insulin effects on cardiac functions under normoxic conditions. Materials and methods: Isolated rat hearts were perfused retrogradely using the Langendorff technique. After 10 minutes of stabilization hearts were perfused for 30 minutes either with standard perfusion solution i.e. Krebs-Henseleit buffer + glucose gassed with 95%O2, 5%CO2 (control hearts), or with standard perfusion solution plus insulin alone or insulin together with the nitric oxide synthase inhibitor L-NAME or the PI3-K inhibitor wortmannin. Left ventricular developed pressure (LVDevP), heart rate (HR) and coronary flow (CF) as well as phosphorylated PI3-K and PKB/Akt in heart were measured. Results: Administration of insulin alone at physiological concentrations showed improved cardiac function compared to hearts in the control group. Hearts that received insulin+L-NAME showed a significant decrease in function compared to the control hearts and the hearts that received insulin alone (p<0.05). Phosphorylated PKB/Akt (Thr308) was increased in hearts that received insulin alone and insulin+L-NAME compared to the control hearts. Phosphorylated PI3-K tended to be higher in hearts where insulin was administered alone compared to the hearts that received insulin+L-NAME or insulin+wortmannin. Conclusion: This study confirmed that physiological concentrations of insulin exert positive inotropic effects on cardiac function in normoxic perfused rat hearts as seen with the improved LVDevP. Inhibition of PI3-K by wortmannin induced a decrease in phosphorylated PKB/Akt in hearts that received insulin+wortmannin and administration of L-NAME impaired the beneficial effects of insulin on cardiac functions. Therefore these results may indicate that nitric oxide may have a role in the positive effect of insulin on cardiac function in the healthy heart perfused under normoxic conditions. L-NAME as well as wortmannin reversed the positive inotropic effects of insulin. Both inhibitors also unmasked effects of insulin via nitric oxide and PI3-K on heart rate and coronary flow. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Inleiding: Dit is welbekend dat toediening van insulien die hart beskerm teen ischemie/reperfusie-beserings, wat lei tot verbeterde hartfunksie. Hierdie effek word wyd ondersoek in modelle van ischemie en reperfusie. Dit is bewys dat ‘n verskeidenheid seintransduksie paaie, insluitend PI3-K, PKB/Akt, p70S6k en ERK, betrokke is by hierdie beskermende effek van insulien op die hart. Baie min data is egter beskikbaar rakende die effek van insulien tydens normoksiese toestande. Alhoewel dit bekend is dat insulien ’n inotropiese effek op die normale geperfuseerde hart het, is die presiese sellulêre meganismes wat dit bewerkstellig nog nie nagevors nie. Om dus ‘n beter begrip van hierdie meganismes te verkry is dit dus noodsaaklik om die effekte van insulien onder normoksiese perfusie toestande na te vors. Doelstellings: Om ‘n geskikte dosis, waarby insulien sy positiewe inotropiese effek onder normale toestande het, vas te stel, om die moontlike meganismes betrokke by insulien-geïnduseerde verbetering in hartsametrekbaarheid te bestudeer, met spesifieke verwysing na die bloedvoorsiening en koronêre vloei, en om die moontlike betrokkenheid van die PI3-K pad en sy teiken effektore onder normale suurstof-toestande te ondersoek. Materiaal en metodes: Geïsoleerde rotharte is geperfuseer deur gebruik te maak van die Langendorff tegniek. Na ‘n stabilisasie periode van 10 minute is rotharte blootgestel aan 30 minute perfusie met een van vier oplossings: ‘n standaard perfusie oplossing (Krebs-Henseleit buffer met glukose onder spesifieke gaskondisies van 95% O2, 5% CO2 – kontrole harte); standaard perfusie oplossing en insulien; standaard perfusie oplossing met insulien en die stikstofoksied sintase inhibitor L-NAME, of standaard perfusie oplossing, met insulien en die PI3-K inhibitor wortmannin. Met verloop van die perfusie protokol, is ontwikkelde linker ventrikulêre druk (LVDevP), harttempo (HR) en koronêre vloei (CF), sowel as PI3-K en PKB/Akt fosforilasie, gemeet. Resultate: Toediening van insulien teen fisiologiese konsentrasies het ‘n verbeterde hartfunksie tot gevolg, in vergelyking met harte in die kontrole groep. In teenstelling hiermee het harte wat insulien+L-NAME ontvang het ‘n betekenisvolle verlaagde funksie getoon in vergelyking met die kontrole harte en harte wat slegs insulien ontvang het (p<0.05). Harte wat slegs insulien, of insulien+L-NAME ontvang het, het ‘n verhoging in gefosforileerde PKB/Akt (Thr308) getoon in vergelyking met kontrole harte. Gefosforileerde PI3-K het ook geneig om hoër te wees in harte wat insulien+L-NAME of insulien+wortmannin ontvang het, as in harte wat slegs insulien ontvang het. Gevolgtrekking: Hierdie studie bewys dat fisiologiese konsentrasies van insulien, onder normale suurstof-toestande, ‘n positiewe inotropiese effek op hartfunksie uitoefen, soos gesien in die verbeterde LVDevP. Wortmannin-geïnduseerde inhibering van die PI3-K pad het ‘n verlaagde PKB/Akt fosforilasie tot gevolg gehad in harte wat insulien+wortmannin ontvang het, terwyl die toediening van L-NAME die voordelige effekte van insulien op hartfunksie onderdruk het. Hierdie resultate dui dus aan dat stikstofoksied ‘n rolspeler is in die positiewe inotropsiese effek van insulien op hartfunksie tydens normoksiese toestande, aangesien beide inhibitore hierdie effek onderdruk het. Beide inhibitore het ook die betrokkenheid van stikstofoksied en die PI3-K pad by die effek van insulien op harttempo en koronêre vloei onthul.