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Yes-associated protein (Yap) transcriptional co-activator, a major downstream effector of Hippo signaling pathway, controls organ size by modulating cell proliferation and apoptosis. The Hippo signaling cascade phosphorylates Yap, and this phosphorylation inhibits the nuclear retention of Yap, which is essential for cell proliferation. Thus, the loss of Hippo pathway components leads to enlarged organs through increased Yap activity in the nucleus. Our initial study showed that Yap was expressed in the developing retina and retinal pigment epithelium (RPE), suggesting Yap's tissue-specific roles during the eye development. Intriguingly, Yap proteins were localized at the apical junctions in addition to the nucleus and cytosol of the retinal progenitor cells, adding another level of regulation. To uncover the tissue- and localization-specific functions of Yap, we generated a Yap conditional knockout mouse with Rx-Cre for the ablation of the Yap gene in the developing retina and RPE. Upon deletion of Yap, the retina showed severe lamination defects with numerous folding, which is reminiscent of the polarity and adhesion loss. The RPE, a single pigmented cell layer overlying the retina, lost pigmentation and changed into a multi-layered epithelium. The marker analysis revealed that 1) in the retina, the localization of the polarity complex proteins such as Pals1, Crb1 and atypical PKC were disrupted, suggesting Yap's indispensable role in junctional stability, and 2) the level of Otx2 in RPE decreased while those of Chx10 and beta-tubulin increased, suggesting transdifferentiation of RPE into the retina. In addition, the deletion of Yap induced a decrease in proliferation and an increase in apoptosis, ultimately resulting in microphthalmia. In conclusion, our results are consistent with the model that Yap functions in the stabilization of apical proteins for maintenance of the laminar organization, determination of RPE territory, and regulation of proliferation and apoptosis during the eye development. / Cell Biology

En este trabajo de tesis nos concentramos en dos compo-nentes principales del sistema endógeno de defensa, impli-cados en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas de la retina: la línea de defensa antioxidante, y las citoquinas de estrés. En el capitulo I, investigamos si los antioxidantes zeaxantina (ZEA), luteína (LUT), y β-caroteno (BC), los principales carotenoides de la dieta, protegen a los fotorre-ceptores del estrés oxidativo y si esa protección es sinérgica con la impartida por el ácido docosahexaenoico (DHA). Reali-zando cultivos neuronales puros de retinas de rata, encon-tramos que los pretratamientos con DHA, ZEA, LUT y BC redujeron la muerte de los fotorreceptores inducida por dos tipos de agentes oxidantes, paraquat (PQ) y peróxido de hi-drógeno (H2O2). Además de este efecto, ZEA y LUT incre-mentaron la diferenciación de los fotorreceptores, aumen-tando la expresión de opsina y promoviendo el desarrollo de procesos característicos de fotorreceptores maduros. Nues-tros resultados sugieren que las xantófilas ZEA y LUT junto al DHA podrían ser importantes factores ambientales que contri-buyen a la promoción de la supervivencia y diferenciación de los fotorreceptores. En el capitulo II, utilizamos los cultivos neuronales puros de retina de rata para estudiar el efecto protector directo de la neurocitoquina de estrés, el factor inhibidor de la leucemia (LIF), sobre fotorreceptores sujetos al estrés oxidativo inducido por PQ. Observamos que el pretrata-miento con LIF redujo la muerte celular y disminuyó la expresión de opsina en los cultivos, en una forma dependiente de la concentración. LIF activó la vía de señalización gp130/STAT3, lo que sugiere que este modelo es una poten-te herramienta para facilitar el estudio de los mecanismos que dirigen los efectos en la protección y en la diferenciación de LIF en los fotorreceptores de la retina. En el capítulo III investigamos mecanismos endógenos de neuroprotección de fotorreceptores in vivo en ratones usando un modelo de precondicionamiento con ciclos de luz/oscuridad (PC), seguido por exposición a daño agudo por luz (LD). Trabajos previos en el laboratorio del Dr. Ash demostraron que El PC induce la expresión de LIF y la activación de la vía gp130/STAT3. Aquí demostramos que el PC con luz moderada, previo al LD resultó en casi completa protección funcional y morfológica de los fotorreceptores. Estudiamos si el mecanismo de esta protección involucra la disminución en la acumulación de productos de oxidación. Hallamos que LD induce la oxidación de ADN en fotorreceptores. El PC previo redujo la oxidación de ADN como parte de la respuesta endógena de neuropro-tección inducida por este modelo. En el capítulo IV, investiga-mos si la activación de STAT3 inducida por LIF altera la actividad biológica de las células del epitelio pigmentado de la retina (RPE) in vivo. Generamos modelos de ratones knock-out para específicamente delecionar STAT3 o gp130 en el RPE, en la retina, o en ambos retina y RPE y realizamos inyecciones intravítreas de LIF en estos modelos. Establecimos que LIF regula negativamente la expresión y actividad de la isomerohidrolasa RPE65, componente clave del ciclo visual en el RPE, de manera coordinada con una reducción en la expresión de la rodopsina en los fotorreceptores, para disminuir la síntesis del fotopigmento visual. Dicha regulación se postula como neuroprotectora de la exposición al estrés por luz, o de enfermedades neurodegenerativas de la retina. Estos efectos en la retina y en el RPE fueron independientes y requirieron la activación de la vía de señalización gp130/STAT3 intrínseca de la retina y del RPE, respectivamente. / In this thesis, we focused on two main components of the endogenous defense system implicated in neurodegenerative diseases in the retina: the antioxidant line of defense and stress cytokines.In chapter I, we investigated whether the main carotenoids from the diet:zeaxantin (ZEA), lutein (LUT), and β-carotene (BC), protect photoreceptors from oxidative stress and whether this protection is synergis-tic with that given by docosahexaenoic acid (DHA). By per-forming pure neuronal cultures from rat retinas, we found that pretreatment with DHA, ZEA, LUT and BC reduced photo-receptor apoptotic cell death induced by two types of oxidants, paraquat (PQ) and hydrogen peroxide (H2O2).Also, ZEA and LUT increased the expression of opsin and promoted the development of processes that are characteristic of mature photoreceptors. Our results suggest that the xantho-phylls ZEA and LUT along with DHA could be important envi-ronmental cues contributing to the promotion of photore-ceptor survival and differentiation. In chapter II, we used pure neuronal cultures from rat retinas to study the direct effects of the stress neurocytokine, leukemia inhi-bitory factor (LIF), on photoreceptors exposed to oxidati-ve stress induced by PQ. We observed that pretreatment with LIF reduced photoreceptor cell death and decreased opsin expression in primary retinal neurons, in a dose-de-pendent manner. LIF activated the gp130/STAT3 signaling pathway, which suggests this model as a potent tool that could ease the study on mechanisms involved in the effects induced by LIF on photoreceptor survival and differentiation. In chapter III, we examined endogenous protective mechanisms of photoreceptor in 9 vivo, in mice exposed to a model of preconditioning with cycles of light/darkness (PC) followed by exposure to acute light damage (LD). Previous work in Dr. Ashs laboratory has demonstrated that the primary endogenous neuroprotective response in this model is the upregulation of LIF and increased gp130/STAT3 signaling in photoreceptors. Here, we demonstrated that PC with moderate levels of light prior to LD resulted in almost complete functional and morphological protection of photoreceptors. We studied whether the mechanism mediating this protection involved a reduction in the accumulations of oxidation products. We found that LD induced DNA oxidation in photoreceptors, but the prior treatment with PC decreased such oxidation as a part of the endogenous response induced by this model. In chapter IV, we aimed to investigate whether the activation of STAT3 induced by LIF alters the biological activities of the retinal pigmented epithelium (RPE) in vivo. We generated conditional knock-out mouse models with specific deletion of STAT3 or gp130 in the RPE, in the retina, or in both retina and RPE and we performed intravitreal injections of LIF in these animals. Our studies allowed us to establish that LIF downregulates the expression and activity of the isomerohydrolase RPE65, a key component in the visual cycle in the RPE, which is coordinated with a decrease in the expression of rhodopsin in photoreceptors, to diminish the synthesis of the visual photopigment. This coordinated downregulation is postulated to be neuroprotective in both light stress and in neurodegenerative diseases in the retina. The effects induced by LIF in the retina and the RPE were independent from each other and required the activation of the gp130/STAT3 signaling pathway intrinsic to retina and RPE, respectively.

La Retinitis Pigmentaria (RP) y la Degeneración Macular Asociada a la Edad (AMD) son enfermedades neurodegenerativas de la retina que se caracterizan por la pérdida progresiva e irreversible de las neuronas fotorreceptoras (FR). Ambas enfermedades son incurables, conducen a la pérdida de visión y no cuentan con tratamientos efectivos. Una estrategia para lograr desarrollar una terapia más adecuada para estas enfermedades es la utilización de células madre que puedan restaurar los tejidos dañados. Sin embargo, regenerar la retina requiere resolver varios problemas poco explorados: uno de ellos es la escasa actividad regenerativa de las células gliales de Müller (CGM) de la retina que, si bien han sido propuestas como células madre, poseen una efectividad muy limitada en mamíferos y son ineficientes para recuperar los FR perdidos. Otro problema es la respuesta reactiva de las CGM, la cual ocurre luego de daños en la retina y genera una inflamación crónica local que afecta la supervivencia de las neuronas regeneradas. Al respecto, recientemente se ha propuesto que los receptores X para retinoideos (RXR) son moduladores de la respuesta inflamatoria que protegerían a las neuronas durante las enfermedades neurodegenerativas del SNC. Sin embargo, aún se conoce muy poco sobre su rol en la retina. El estudio de estas enfermedades enfrenta dificultades éticas y prácticas, por lo que el uso de ratones rd1, un modelo animal de RP que presenta una mutación específica que causa la muerte por apoptosis de los FR, resulta extremadamente útil para investigar las causas de la escasa capacidad regenerativa de la retina. Con este objetivo utilizamos retinas enteras y cultivos primarios neuronales y de CGM de ratones control y rd1. También investigamos y comparamos la actividad proliferativa de las CGM y la expresión de diversos marcadores de células madre, así como la expresión de los RXR y su efectos sobre la supervivencia neuronal y reactividad glial ante el tratamiento con un agonista sintético de estos receptores. Los resultados indicaron una disminución de los marcadores de célula madre de las CGM rd1. Notablemente, la expresión de uno de ellos, Nestina, pudo ser revertida al co-cultivar las CGM rd1 con neuronas control (wt), lo que sugiere una alteración en la comunicación neuro-glial. Además, el agonista sintético de los RXR, PA024, retrasó la muerte de los FR y disminuyó la reactividad glial en cultivos de retinas rd1. En resumen, en esta tesis presentamos evidencia de que en las retinas rd1 existe una alteración en la comunicación neuro-glial que afectaría el potencial regenerativo y dispararía una respuesta reactiva en las CGM. Asimismo, hallamos que la reactividad de las CGM y la muerte de los FR en las retinas rd1 pudo ser disminuida mediante la utilización de un agonista de los RXR. Estos resultados sugieren que el potencial regenerativo de las CGM dependería de su interacción con neuronas sanas; que durante los procesos neurodegenerativos de la retina este diálogo neuro-glial estaría afectado; y que los RXR regularían, en parte, los procesos inflamatorios y la supervivencia neuronal en la retina. Estos hallazgos podrían ser de utilidad para el desarrollo de una terapia efectiva de reemplazo celular. / Retinitis Pigmentosa (RP) and Age-related Macular Degeneration (AMD) are neurodegenerative diseases of the retina which are characterized by the progressive and irreversible loss of photoreceptor neurons (PRs). Both diseases are incurable, lead to loss of vision and lack effective treatment. A strategy to develop an adequate therapy involves the use of stem cells that are able to restore damaged tissue. However, retina regeneration requires solving many unexplored issues. One of them is poor regenerative activity of Müller glial cells (MGC) of the retina. Although these cells have been postulated as stem cells, they have limited effectiveness in mammals and are inefficient to recover lost PRs. Another issue is the reactive response of MGC, which occurs after damage to the retina and causes local chronic inflammation that affects the survival of regenerated neurons. In that regard, it has recently been claimed that retinoid X receptors (RXR) are inflammatory response modulators that could protect the neurons from neurodegenerative diseases of the central nervous system. However, little is known about the role they play in the retina. Research into these diseases faces many ethical and practical challenges. Therefore, using rd1 mice, an animal model of RP with a very specific mutation which causes death by apoptosis of PRs, is extremely useful to study the causes of poor regenerative capacity of the retina. For this purpose, we have used whole retinas and primary neural and MGC cultures from control and rd1 mice. We have also studied and compared the proliferative activity of MGC and the expression of several stem cell markers, as well as the expression of RXR and their effect on neuronal survival and glial reactivity upon treatment with a synthetic agonist. Results showed decreased rd1 MGC stem cell markers. Remarkably, the expression of one of these, Nestin, could be reverted by co-culturing of rd1 MGC with control neurons (wt), which suggests an alteration in neuroglial communication. Furthermore, using the RXR synthetic agonist PA024 delayed death of PRs and decreased glial reactivity in rd1 retina cultures. In sum, throughout this thesis we have presented evidence that in rd1 retinas there is an alteration in neuroglial communication which could affect the regenerative potential and trigger a reactive response of MGC. Additionally, we found that MGC reactivity and death of PRs in rd1 retinas could be reduced by means of a RXR agonist. These results suggest that regenerative potential of MGC could depend on their interaction with healthy neurons, that neuroglial communication could be affected when neurodegenerative processes of the retina take place, and that RXR could partially regulate inflammatory processes and neuronal survival in the retina. These findings could prove useful for the development of an effective cellular replacement therapy.

Desde hace casi tres décadas, los esfingolípidos han entrado a la escena de los lípidos bioactivos. Dentro de esta gran familia, son sus versiones más simples los que han sido relacionados con importantes funciones celulares. La Ceramida (Cer), y su derivado por deacilación, la esfingosina (Sph), han sido reportados como segundos mensajeros de muerte en diversos tipos celulares. Por su parte, sus derivados fosforilados, en especial la esfingosina-1-fosfato (S1P), se han identificado con funciones proliferativas y pro-supervivencia. Diversas señales mitogénicas contribuyen no solo a la proliferación sino también a la migración celular, siendo de especial interés en ciertas patologías como el cáncer. Sin embargo, los procesos celulares invasivos son relevantes también en la retina, el tejido de interés de este trabajo de tesis. Diversas patologías, como la retinopatía diabética, presentan una proliferación exacerbada de las células gliales de Müller (CGM), el principal tipo glial de la retina, proceso conocido como gliosis. En su inicio, esta respuesta es un intento fisiológico por aislar al tejido neuronal de la injuria y reparar el daño. Sin embargo, en un estado patológico, ante la continuidad de la injuria, esta proliferación celular termina convirtiéndose en una cicatriz que afecta el normal funcionamiento del tejido retiniano, llevando en última instancia a la pérdida parcial o total de la visión. Por lo expuesto, resulta relevante investigar estos procesos proliferativos de la retina a fin de encontrar nuevos tratamientos terapéuticos. La información sobre las funciones del esfingolípido mitogénico S1P a nivel de la retina es escasa. Por ejemplo, se ha reportado que la S1P promueve la proliferación y respuestas pro-fibróticas y pro-inflamatorias en células de epitelio pigmentario y que participa en la neo-vascularización retinal y coroidal. Además, los niveles retinales y plasmáticos de S1P aumentan en un modelo inflamatorio inducido por lipopolisacárido. En el primer capítulo de este trabajo de tesis, planteamos la hipótesis de que la S1P podría estar involucrada en los procesos glióticos, participando como una señal clave para inducir la migración glial. Para contrastar nuestra hipótesis, utilizamos un modelo de cultivo primario de células gliales de Müller y analizamos la migración glial mediante el “ensayo de la herida”, un método sencillo y ampliamente utilizado para este propósito. Nuestros experimentos revelaron que la adición exógena de S1P induce modificaciones en el citoesqueleto de las CGM, detectadas en las primeras 8-10 h de tratamiento, que llevan a la formación de lamelipodios y al inicio de la motilidad glial sobre el sustrato. Esta motilidad glial fue claramente superior a la de los cultivos controles luego de 18 h de estímulo. Las CGM expresaron dos de los cinco receptores transmembrana para S1P, los S1PR, específicamente los subtipos S1P1 y S1P3, siendo la activación de este último la que desencadena el proceso migratorio, tal como lo demostraron experimentos utilizando antagonistas selectivos de ambos receptores. Nuestros resultados también mostraron que rio-abajo de la activación del S1P3 se activarían dos importantes vías intracelulares, la vía de ERK/MAPK y la vía de PI3K, ya que el pre-tratamiento con inhibidores de estas vías disminuyó significativamente el estímulo migratorio inducido por S1P. Cabe destacar que esta inducción del proceso migratorio no estuvo acompañada de un incremento significativo en la proliferación glial. Por otra parte, no solo la S1P exógena tuvo un rol en la migración glial. Encontramos que la inhibición de la síntesis endógena de S1P, utilizando un inhibidor selectivo de la enzima esfingosina quinasa 1 (Sphk1) (enzima que cataliza la síntesis de S1P), el inhibidor de SphK1 2 (SphKI2), prácticamente abolió la migración glial basal, es decir aquella observada aun en ausencia de S1P. Estos resultados demuestran que la S1P tiene un rol clave en la inducción de migración glial en la retina, y su bloqueo podría ser utilizado como una estrategia terapéutica para las enfermedades proliferativas de la retina. Otro conjunto de patologías de la retina, de creciente avance y lamentablemente aun sin tratamientos efectivos, son las enfermedades neurodegenerativas. Las mismas son un conjunto de patologías, entre las que destacan la retinitis pigmentosa y la degeneración de la mácula con una variada etiología, con múltiples factores, desde genéticos hasta ambientales como desencadenantes, pero que comparten un denominador común: la muerte de los fotorreceptores (FR). Esta degeneración progresiva de los FR lleva, como consecuencia final, a la pérdida de la visión. Como se describió, Cer y Sph son importantes mediadores de muerte celular y han despertado la atención en el campo de las enfermedades neurodegenerativas. Estudios pioneros encontraron que los niveles de Cer se encontraban aumentados en retinas pos mortem de pacientes con la enfermedad de Faber, y que los niveles de este esfingolípido aumentaban frente a la degeneración neuronal inducida por desprendimiento de retina. Posteriores reportes, incluidos los de nuestro laboratorio, establecieron que la Cer es un mediador clave en la muerte de los FR en cultivo. El daño oxidativo estimula la síntesis de Cer que desencadena la muerte de los FR y este proceso es mimetizado por la adición exógena de un análogo sintético de ceramidas endógenas, la C2-Ceramida (C2Cer). Hallazgos posteriores en diversos modelos animales de neurodegeneración retiniana permiten proponer a la Cer como un mediador central en la activación de la muerte de los FR. Pese a esto, aún no se conoce en profundidad cuáles son los mecanismos moleculares involucrados en este proceso. Esta pregunta resulta relevante, ya que la regulación de los distintos blancos intracelulares de Cer podría emerger como posible terapia para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. Ante esto, nos planteamos como objetivo en el 2º capítulo de esta Tesis, estudiar los mecanismos moleculares involucrados en la muerte de los FR mediada por C2Cer, utilizando un modelo de cultivo primario de neuronas de retina de rata. Un trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que la C2Cer, en una concentración de 10 μM induce la muerte de los FR y las neuronas amacrinas, los tipos neuronales mayoritarios en los cultivos. Estudiando el proceso de muerte de manera cronológica, encontramos que el tratamiento de cultivos neuronales con C2Cer 10 μM durante 6 h indujo selectivamente la muerte de los FR, disminuyendo el potencial de membrana mitocondrial y aumentando la formación de especies reactivas de oxígeno (ROS). En contraste, las neuronas amacrinas preservaron su viabilidad. Cabe destacar que la cantidad de células marcadas con TUNEL y de FR que expresaron caspasa-3 clivada, forma activa de la caspasa-3, permanecieron constantes y que el pretratamiento con un pan inhibidor de caspasas no evitó la muerte inducida por C2Cer. C2Cer provocó la sobre activación de la poli-ADP ribosil polimerasa-1 (PARP-1). La inhibición de PARP-1 disminuyó la muerte de los FR inducida por C2Cer. A su vez, C2Cer aumentó los niveles de polímero de poli-ADP ribosa (PAR), cuya síntesis es catalizada por PARP-1, e indujo la translocación del factor inductor de apoptosis (AIF) de las mitocondrias al núcleo de los FR, ya que dicha translocación se previno mediante la inhibición de PARP-1. El pretratamiento con un inhibidor de calpaínas y catepsinas, y con un inhibidor de la calpaína redujo la muerte de los FR, mientras que los inhibidores selectivos de catepsinas no otorgaron protección. El pretratamiento combinado con un inhibidor de PARP-1 y un inhibidor de calpaína evidenció la misma protección que cada inhibidor por sí mismo. Esto sugiere que tanto PARP-1 como calpaínas confluyen en el mismo mecanismo de acción rio-abajo de la C2Cer. Ni la autofagia ni la necroptosis estuvieron involucradas en la muerte inducida por C2Cer; no se observó un aumento en la liberación de LDH después del tratamiento con C2Cer y el pretratamiento con inhibidores de la necroptosis y de la autofagia no rescataron a los FR. Estos resultados sugieren que la C2Cer activa la muerte de los FR por un mecanismo novedoso, independiente de caspasas, que implica la activación de PARP-1, disminución del potencial de membrana mitocondrial, activación de calpaína y translocación de AIF, todas las características bioquímicas del tipo de muerte celular denominada parthanatos. Nuestros resultados, sugieren así nuevos blancos terapéuticos, y contribuyen a los avances en la búsqueda de tratamientos efectivos para las enfermedades neurodegenerativas de la retina. / For almost three decades, sphingolipids have entered the bioactive lipid scenery. Within this large family, simple sphingolipids are the ones that have been related to important cellular functions. Ceramide (Cer), and its deacylation derivative, sphingosine (Sph), have been reported as death second messengers in several cell types. On the other hand, its phosphorylated derivatives, especially sphingosine-1-phosphate (S1P) have been related to proliferative and pro-survival functions. Several mitogenic signals contribute not only to proliferation but also to cell migration, being of special interest in certain pathologies such as cancer. However, invasive cellular processes are also relevant in the retina, the tissue of interest in this thesis work. Diverse pathologies, such as diabetic retinopathy, show an exacerbated proliferation of Müller glial cells (CGM, the main glial type of the retina), a process known as gliosis. Initially, this response is a physiological attempt to isolate neuronal tissue from injury and repair the damage. However, in a pathological state, given the continuity of the injury, this cell proliferation gives rise to a scar that affects the normal functioning of the retinal tissue, ultimately leading to a partial or total vision loss. Therefore, it is relevant to investigate these retinal proliferative processes in order to find new therapeutic treatments. There is scarce information on the functions of the mitogenic sphingolipid S1P in the retina. S1P has been reported to promote proliferation, pro-fibrotic and pro-inflammatory responses in pigment epithelial cells and it also participates in retinal and choroidal neovascularization. In addition, there is an increase in retinal and plasma levels of S1P in an inflammatory model induced by lipopolysaccharide. In the first chapter of this thesis we propose the hypothesis that S1P might be involved in gliotic processes, as a key signal in the induction of glial migration. To test our hypothesis, we used a primary culture model of Müller glial cells and evaluated cell migration by the scratch-wound assay, which is a simple and widely used method. Our experiments revealed that the exogenous addition of S1P modified the CGM cytoskeleton, in the first 8-10 hours of treatment. This addition led to the formation of lamelipodia and to the onset of glial motility. This motility was markedly enhanced compared to control conditions after 18 h of S1P addition. CGM expressed two of the five transmembrane receptors for S1P (S1PR), specifically the S1P1 and S1P3 subtypes. However, only activation of S1P3 was required to induce S1P-induced CGM migration, as evidenced by experiments performed with S1P1 and S1P3 antagonists. Analysis of the signaling pathways activated downstream of S1P3 evidenced that two well-known pathways, the ERK/MAPK and PI3K pathways were activated, since pre-treatment with specific inhibitors, significant reduced S1P-induced glial migration. Of note, this induction of the migratory process was not accompanied by a significant increase in glial proliferation. On the other hand, not only exogenous S1P played a role in glial migration. Inhibition of the endogenous synthesis of S1P, using a selective inhibitor of the enzyme sphingosine kinase 1 (Sphk1) (the enzyme that catalyzes the synthesis of S1P), the SphK1 inhibitor number 2 (SphKI2), virtually blocked the basal glial migration, i.e. the migration level observed in the absence of exogenous S1P. These results demonstrated that the S1P-S1P3 axis has a key role in the induction of migration in the retina, and its targeting might provide an interesting approach in the search of new therapeutical treatments for proliferative diseases of the retina. Among retinal pathologies, neurodegenerative diseases are a set of diseases of the retina that progressively lead to vision loss and still lack effective treatments. Pathologies such as retinitis pigmentosa and macula degeneration have very diverse etiologies, varying from genetic to environmental triggers, but which share a common hallmark: the death of photoreceptors (PhRs). This progressive degeneration of PhR leads, as a final consequence, to visual disability and blindness. As described, Cer and Sph are important mediators of cell death and have attracted special attention in the field of neurodegenerative diseases. Pioneering studies found that Cer levels were increased in post-mortem retinas of patients with Faber's disease; furthermore, the levels of this sphingolipid are increased in neuronal degeneration induced by retinal detachment. Subsequent reports, including those from our laboratory, established that Cer is a key mediator in the death of PhRs in culture. Oxidative damage stimulates the synthesis of Cer, which triggers the death of photoreceptors and this process is mimicked by the exogenous addition of a synthetic analogue of an endogenous ceramide, C2-Ceramide (C2Cer). Further work using animal models of retina degeneration support a role for Cer as a crucial signal involved in the induction of PhR death. However, the molecular mechanisms involved in this process are still unknown. Uncovering them is very relevant, since regulating the different intracellular targets of Cer might provide new therapies for neurodegenerative diseases of the retina. The purpose of the second chapter of this thesis was to study the molecular mechanisms involved in the death of PhRs induced by C2Cer, using as a model primary cultures of rat retinal neurons. Previous work from our laboratory showed that 10 μM C2Cer induces the death of PhRs and amacrine neurons, the two major neuronal types in our cultures. A chronological analysis of the death process showed that treatment with 10 μM C2Cer for 6 h selectively induced the death of photoreceptors, decreasing mitochondrial membrane potential and increasing the formation of Reactive Oxygen Species (ROS). In contrast, amacrine neurons preserved their viability. Of note, the number of cells labeled with TUNEL and of photoreceptors expressing cleaved caspase-3 remained constant and a pretreatment with a pan caspase inhibitor did not prevent C2Cer-induced neuronal death. C2Cer caused over-activation of poly-ADP ribosyl polymerase-1 (PARP-1). The inhibition of PARP-1 decreased photoreceptor death induced by C2Cer. In turn, C2Cer increased poly-ADP ribose (PAR) polymer levels, the synthesis of which is catalyzed by PARP-1, and induced the translocation of apoptosis-inducing factor (AIF) from mitochondria to the nuclei, which was prevented by PARP-1 inhibition. Pretreatment with a calpain and cathepsin inhibitor, and with a selective calpain inhibitor, reduced photoreceptor death, whereas selective cathepsins inhibitors did not provide any protection. The combined pretreatment with a PARP-1 inhibitor and a calpain inhibitor showed the same extent of protection as each inhibitor by itself. This suggests that both PARP-1 and calpains converge downstream in the same mechanism. Neither autophagy nor necroptosis were involved in C2Cer-induced cell death; no increase in LDH release was observed after C2Cer treatment and pretreatment with necroptosis and autophagy inhibitors did not rescue photoreceptors. These results suggest that the C2Cer-induced photoreceptor death signaling by a novel caspase-independent mechanism, which involves PARP-1 activation, a decrease in mitochondrial membrane potential, activation of calpain and translocation of AIF, all of which are biochemical characteristics of the cell death type named parthanatos. In conclusion, our results identify a new therapeutic target, thus contributing to the advances in the search for effective treatments for neurodegenerative diseases of the retina.

Tesis por compendio / [ES] El síndrome de Usher (USH) es un trastorno raro autosómico recesivo definido principalmente por sordera neurosensorial (SNHL), y una distrofia retiniana conocida como retinosis pigmentaria (RP). La patología muestra heterogeneidad genética, puesto que se conocen al menos 10 genes responsables. No obstante, las mutaciones en USH2A son la causa más frecuente de la enfermedad, en gran medida por la recurrencia de la variante patogénica c.2299delG. En esta tesis se ha desarrollado un ensayo de edición génica para revertir dicha anomalía genética por medio del sistema CRISPR/Cas9. Se diseñaron y probaron varios complejos CRISPR específicos de locus, y el más eficiente fue usado para la corrección de la mutación c.2299delG en células derivadas de pacientes. La tasa de corrección de la mutación obtenida fue del 2.5%. Otro objetivo de esta tesis ha sido la caracterización genética de pacientes USH aún sin diagnóstico molecular. Una primera fase implicó la secuenciación masiva dirigida de las regiones codificantes de todos los genes asociados a la enfermedad. Este estudio, cuya cohorte incluyó 58 pacientes no escrutados previamente, permitió la identificación de 42 nuevas mutaciones presuntamente patológicas, y una tasa general de detección de alelos responsables de la enfermedad de prácticamente el 83%. Sorprendentemente, uno de los sujetos presentaba mutaciones en CEP250, uno de los últimos genes correlacionados con la enfermedad. Una exhaustiva revisión clínica reveló que la degeneración retiniana se trataba en realidad de una distrofia de conos y bastones en lugar de RP clásica, lo cual permitió consolidación del gen CEP250 como responsable de un fenotipo similar al USH. El resto de casos sin resolver induce a sospechar de la existencia de otros genes vinculados con USH. Así pues, se analizó el exoma íntegro de dichos casos negativos del panel por medio de secuenciación de exoma completo, lo cual proporcionó resultados relevantes en seis de las muestras estudiadas. Uno de tales sujetos resultó ser un claro caso de fenocopia de USH, al albergar mutaciones patogénicas en dos genes independientes, TECTA y REEP6, siendo el primero responsable de la SNHL y el segundo de la RP. De forma parecida, en otro paciente se detectaron variantes patológicas para RP en el gen EYS, pero no se identificó paralelamente ningún cambio genético que explicara la SNHL. Tres individuos adicionales resultaron haber sido erróneamente diagnosticados como USH, dada la conclusiva inexistencia o ambigüedad de la sordera. Uno de ellos fue definido como homocigoto de una mutación en CNGB1, ya reconocido como responsable de RP. En el segundo de dichos sujetos se identificó una mutación en homocigosis en el gen GRN, cuyos defectos en estado heterocigoto están asociados a demencia frontotemporal y más raramente combinada con RP si ambos alelos se encuentran alterados. Por otro lado, el tercer paciente fue resuelto como heterocigoto compuesto de variantes en WDR19, un gen asociado en mayor medida a una distrofia retiniana acompañada de trastornos renales y, más raramente, a la forma aislada del síntoma. En el último de los seis casos resaltados de este objetivo se detectó una mutación homocigota sin sentido en el gen ASIC5, cuyo papel en el organismo todavía se desconoce. Sin embargo, se han correlacionado funciones visuales y auditivas para miembros de la misma familia proteica. En conjunto, los hallazgos obtenidos en este trabajo avalan la importancia del uso de las más novedosas tecnologías en la búsqueda de soluciones para enfermedades raras, las cuales presentan por ahora un pronóstico terapéutico bastante desamparado. Asimismo, otras consecuencias positivas en cuanto a la caracterización genética de los pacientes son la corroboración (o rectificación) del diagnóstico inicial, así como la contribución a la estimación demográfica y correlaciones de genotipo-fenotipo, que en definit / [CA] La síndrome d'Usher (USH) és una malaltia rara autosòmic recessiu definit principalment per sordera neurosensorial (SNHL) i una distròfia retiniana coneguda com a retinosi pigmentària (RP). La patologia mostra heterogeneïtat genètica, ja que es coneixen almenys 10 gens responsables. No obstant això, les mutacions en USH2A són la causa més freqüent de la malaltia, a causa de la recurrència de la variant patogènica c.2299delG. En aquesta tesi s'ha desenvolupat un assaig d'edició gènica per a revertir la dita anomalia genètica per mitjà del sistema CRISPR/Cas9. Es van dissenyar i van probar diversos complexos CRISPR específics de locus, i el més eficient va ser usat per a la correcció de la mutació en cèl·lules derivades de pacients. La taxa de correcció de la mutació obtinguda va ser del 2.5%. Un altre objectiu d'aquesta tesi ha sigut la caracterització genètica de pacients USH encara sense diagnòstic molecular. Una primera fase va implicar la seqüenciació massiva dirigida de les regions codificants de tots els gens associats a la malaltia. Aquest estudi, la cohort de la qual va incloure 58 pacients no escrutats prèviament, va permetre la identificació de 42 noves mutacions presumptament patològiques, i una taxa general de detecció d'al·lels responsables de la malaltia de pràcticament el 83%. Sorprenentment, un dels subjectes presentava mutacions en CEP250, un dels últims gens correlacionats amb la malaltia. Una exhaustiva revisió clínica va revelar que la degeneració retiniana es tractava en realitat d'una distròfia de cons i bastons en lloc de RP clàssica. Aquestes troballes han permés la consolidació del gen CEP250 com a responsable d'un fenotip similar al USH. La resta de casos sense resoldre induïx a sospitar de l'existència d'altres gens vinculats amb USH. Així, doncs, es va analitzar l'exoma íntegre dels casos negatius del panell a través de seqüenciació d'exoma complet, cosa que va proporcionar resultats rellevants en sis de les mostres estudiades. Un de tals subjectes va resultar ser un clar cas de fenocopia d'USH, a l'albergar mutacions patogèniques en dos gens independents, TECTA i REEP6, sent el primer responsable de la SNHL i el segon de la RP. De forma semblant, en un altre pacient es van detectar variants patològiques per a RP al gen EYS, però no es va identificar paral·lelament cap canvi genètic que explicara la SNHL. Tres individus addicionals van resultar haver sigut erròniament diagnosticats com USH, donada la final inexistència o ambigüitat de la sordera. Un d'ells va ser definit com a homozigot d'una mutació en CNGB1, ja reconegut com a responsable de RP. En el segon d'aquestes subjectes es va identificar una mutació en homozigosi en el gen GRN, els defectes del qual estan associats a demència frontotemporal en estat heterozigot, i més rarament en combinació amb RP si ambdós al·lels es troben alterats. D'altra banda, el tercer pacient va ser resolt com a heterozigot compost de variants en WDR19, un gen associat en major grau a una distròfia retiniana acompanyada de trastorns renals i, més rarament, a la forma aïllada del símptoma. En l'últim dels sis casos ressaltats d'aquest objectiu es va detectar una mutació homozigota sense sentit en el gen ASIC5, el paper en l'organisme del qual encara es desconeix. Amb tot, s'han correlacionat funcions visuals i auditives per a membres de la mateixa família proteica. En conjunt, les troballes obtingudes en aquest treball avalen la importància de l'ús de les més noves tecnologies en la recerca de solucions per a malalties rares, les quals presenten per ara un pronòstic terapèutic prou desemparat. Així mateix, altres conseqüències positives quant a la caracterització genètica dels pacients són la corroboració (o rectificació) del diagnòstic inicial, així com la contribució a l'estimació demogràfica i correlacions de genotip-fenotip, que en definitiva ajuden en la compressió d'US / [EN] Usher syndrome (USH) is a rare autosomal recessive disorder defined essentially by sensorineural hearing loss (SNHL) and a retinal dystrophy known as retinitis pigmentosa (RP). The condition shows a genetic heterogeneity, since there are at least 10 genes known to be causative of the syndrome. However, mutations in USH2A are the most frequent cause of the disease, due in a large measure to the recurrence of the c.2299delG pathogenic variant. A gene editing assay to reverse this specific genetic anomaly was developed in this thesis by means of the groundbreaking CRISPR/Cas9 system. Several locus-specific CRISPR complexes were designed and tested, and the most efficient was used to proceed with the c.2299delG mutation correction on patient-derived cells. The trial resulted in a mutation correction rate of 2.5%. Another goal of this thesis was the genetic characterization of molecularly undiagnosed USH patients. Given the genetic diversity of the disease, the procedure required the implementation of high-throughput sequencing, a technology that enables in bulk sequencing of any number of selected loci (or the indiscriminate totality) of the genome. The first phase implied the targeted sequencing of the coding-relevant regions of all known causative or disease-associated genes at the moment. The study, comprising a cohort of 58 previously unscreened patients, enabled the identification of 42 novel putative pathogenic mutations, and an etiologic-allele detection ratio shy of 83%. Remarkably, one of the subjects harbored nonsense mutations in CEP250, which is one of the latest USH-associated genes. However, an exhaustive review of the clinical features unmasked the retinal degeneration as a cone-rod dystrophy rather than RP, which reinforced the linkage of the gene to an USH-like phenotype. The remaining portion of unresolved cases lead to suspicion of the existence of other genes accountable for USH. Hence, the complete exome of such panel-negative cases was screened through whole exome sequencing. This venture provided relevant findings in six of the surveyed samples. One subject was plainly exposed as an USH phenocopy by harboring pathogenic splice-site mutations in two independent genes, TECTA and REEP6, the former responsible for the SNHL and the latter for the RP. Similarly, RP-causative variants in EYS were detected in another patient, yet no pathogenic changes explaining the HL were discovered. Three additional individuals were ultimately unveiled as USH misdiagnosed cases, being the HL actually absent or ambiguous. One of the patients in this set was homozygous for a mutation in CNGB1, already known to be accountable for RP. The other two cases showed a more peculiar outcome being compound heterozygous for putatively pathogenic variants in genes generally associated to other disorders. One presented a homozygous mutation in GRN, a gene associated to frontotemporal dementia under heterozygous condition and less commonly to combined RP for homozygous alterations. The third subject was found to be a carrier of mutations in WDR19, a gene best associated with retinal disorders accompanied by renal signs and rarely with the isolated visual symptom. The last case presented a homozygous nonsense variant in the ASIC5 gene, whose role has yet to be learned. However, some correlations to visual and hearing functions have been reported for members of the same protein family. Altogether, the results obtained from this work attest to the importance of applying the most up-to-date technologies in the search of solutions for rare diseases that realistically pose a despairing therapeutic prognosis. In addition, the positive consequences of the genetic characterization of the patients are the corroboration (or else correction) of the initial diagnosis, and the contribution to the appraisal of demographic and genotype-phenotype correlations, which ultimately aid in the understanding USH and other related diseases. / This work was financially supported by the Institute of Health Carlos III and FEDER funds (ISCIII; grants PI13/00638, PI16/00425, PI16/00539, and PIE13/00046), Fundación ONCE (grant 2015/0398), XVIII Fundaluce-FARPE, and “Telemaratón: Todos Somos Raros, Todos Somos Únicos” (grant IP58). C.F.-G. is a recipient of a fellowship (grant IFI14/00021) from the ISCIII. R.P.V.-M. is a Miguel Servet researcher (grant CP11/00090 funded by ISCIII, Madrid, Spain). The funds from the ISCIII are partially supported by the European Regional Development Fund. R.-P.V.M. is also a Marie Curie fellow (grant CIG322034 from the European Commission). / Fuster García, C. (2020). Therapeutic approaches and development of genomic diagnostic tools for Usher syndrome [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/137034 / Compendio

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos caracterizados por la muerte, generalmente, progresiva de fotorreceptores y células del epitelio pigmentario retiniano. Las DHR afectan a más de 2 millones de personas en el mundo, produciendo una pérdida parcial y, en muchos casos, total de la visión, para la cual no existe ningún tratamiento que revierta o frene la progresión de la enfermedad. Se caracterizan por una elevada heterogeneidad clínica y genética, identificándose hasta la fecha mutaciones en más de 250 genes responsable de algún tipo de DHR. Esta tesis doctoral se ha centrado en el diagnóstico genético de 208 pacientes afectados de DHR no sindrómica (DHR-NS), mediante secuenciación masiva dirigida a un panel de 117 genes y cinco regiones intrónicas profundas en las que previamente se habían descrito mutaciones. Las variantes identificadas en los pacientes se priorizaron de acuerdo a la mínima frecuencia alélica y se clasificaron según los criterios de la guía del American College of Medical Genetics and Genomics. Las variantes de número de copias identificadas mediante la secuenciación del panel se validaron utilizando multiplex ligation-dependent probe amplification o array genómico. A todos los pacientes se les realizó un estudio oftalmológico, más o menos exhaustivo, incluyendo pruebas electrofisiológicas. Además, se realizaron ensayos in vitro con minigenes para comprobar la repercusión de ciertas variantes sobre el procesamiento del ARNm. Para ello, se empleó el plásmido pSPL3 en el que se introdujo la mutación a estudio, la transformación se realizó en bacterias E. coli electrocompetentes y la transfección en células HEK-293. Mediante la secuenciación del panel de genes, se obtuvo una tasa diagnóstica del 60%. Las mutaciones en los pacientes resueltos se distribuyeron en 30 genes diferentes, de las cuales 38 se describen por primera vez en este trabajo. Los genes mutados con mayor frecuencia en estos pacientes fueron ABCA4, USH2A, RPGR y PRPH2. Adicionalmente, se identificaron ocho variantes de número de copias en los genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 y ROM1, demostrando el enorme potencial de estas tecnologías. En total, se reclasificaron el 10% de las familias estudiadas y se observó variabilidad fenotípica intra e inter familiar en pacientes con mutaciones en C1QTNF5, CERKL y PROM1. Además, destacamos que el 50% de las mujeres heterocigotas para RPGR y sintomáticas presentaron retinosis pigmentaria (RP) con asimetría interocular. Asimismo, se identificó un caso con posible digenismo entre los genes CNGA1 y CNGB1, y la duplicación completa de ROM1 en dos familias no relacionadas diagnosticadas de RP. Por otra parte, se han identificado seis familias con mutaciones en dos genes que potencialmente ambos podrían ser la causa de la DHR. En el ensayo funcional mediante minigenes, se observó que seis de las variantes analizadas presentaron un splicing aberrante. Los resultados de esta tesis destacan la utilidad clínica de la secuenciación masiva dirigida para las DHR-NS y la importancia de un examen oftalmológico completo que nos permita establecer nuevas asociaciones genotipo-fenotipo y ampliar el conocimiento de este grupo de enfermedades. Identificar la causa de la enfermedad es esencial para mejorar el manejo del paciente, realizar un asesoramiento genético preciso y beneficiarse de los futuros tratamientos y ensayosclínicos basados en terapia génica. / [CA] Les distròfies hereditàries de la retina (DHR) són un conjunt de trastorns caracteritzats per la mort, generalment, progressiva de fotoreceptors i cèl¿lules de l'epiteli pigmentari retiniano. Les DHR afecten més de 2 milions de persones al món, produint una pèrdua parcial i, en molts casos, total de la visió, per la qual no hi ha cap tractament que revertisca o frene la progressió de la malaltia. Es caracteritzen per una elevada heterogeneïtat clínica i genètica, identificant-se fins a la data mutacions en més de 250 gens responsable d'algun tipus de DHR. Esta tesi doctoral s'ha centrat en el diagnòstic genètic de 208 pacients afectats de DHR no sindròmica (DHR-NS), per mitjà de seqüenciació massiva dirigida a un panell de 117 gens i cinc regions intròniques profundes en les que prèviament s'havien descrit mutacions. Les variants identificades en els pacients es van prioritzar d'acord a la mínima freqüència allèlica i es van classificar segons els criteris de la guia de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Les variants de nombre de còpies identificades per mitjà de la seqüenciació del panell es van validar utilitzant multiplex ligation-dependent probe amplification o array genòmic. A tots els pacients se'ls va realitzar un estudi oftalmològic, més o menys exhaustiu, incloent proves electrofisiològiques. A més, es van realitzar assajos in vitro amb minigens per comprovar la repercussió de certes variants sobre el processament de l'ARNm. Per a això, es va emprar el plasmidi pSPL3 en què es va introduir la mutació a estudi, la transformació es va realitzar en bacteris E. coli electrocompetentes i la transfecció en cèl-lules HEK-293. Per mitjà de la seqüenciació del panell de gens, es va obtindre una taxa diagnòstica del 60%. Les mutacions en els pacients resolts es van distribuir en 30 gens diferents, de les quals 38 es descriuen per primera vegada en este treball. Els gens mutats amb major freqüència en estos pacients van ser ABCA4, USH2A, RPGR i PRPH2. Addicionalment, es van identificar huit variants de nombre de còpies en els gens EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 i ROM1, demostrant l'enorme potencial d'estes tecnologies. En total, es van reclassificar el 10% de les famílies estudiades i es va observar variabilitat fenotípica intra i inter familiar en pacients amb mutacions en C1QTNF5, CERKL i PROM1. A més, destaquem que el 50% de les dones heterozigotes per RPGR i simptomàtiques van presentar retinosi pigmentària (RP) amb asimetria interocular. Així mateix, es va identificar un cas amb possible digenismo entre els gens CNGA1 i CNGB1, i la duplicació completa de ROM1 en dues famílies no relacionades diagnosticades de RP. D'altra banda, s'han identificat sis famílies amb mutacions en dos gens que potencialment ambdós podrien ser la causa de la DHR. En l'assaig funcional per mitjà de minigens, es va observar que sis de les variants analitzades van presentar un splicing aberrant. Els resultats d'esta tesi destaquen la utilitat clínica de la seqüenciació massiva dirigida per a les DHR-NS i la importància d'un examen oftalmològic complet que ens permeta establir noves associacions genotip-fenotip i ampliar el coneixement d'este grup de malalties. Identificar la causa de la malaltia és essencial per millorar el maneig del pacient, realitzar un assessorament genètic precís i beneficiar-se dels tractaments basats en teràpia gènica. / [EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of disorders generally characterized by the progressive death of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells. IRD affect more than 2 million people in the world, producing a partial and, in many cases, total loss of vision, for which there is no treatment that reverses or slows the progression of the disease. They are characterized by a high clinical and genetic heterogeneity, identifying mutations in more than 250 genes responsible for some type of IRD to date. This doctoral thesis has focused on the genetic diagnosis of 208 patients affected by non-syndromic IRD (NS-IRD), through targeted genomic sequencing focuses on a panel of 117 genes and five deep intronic regions in which mutations have previously been identified. The identified variants in patients are prioritized according to the minimum allelic frequency and are classified according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics guide. The copy number variants identified by panel sequencing were validated using multiplex ligation-dependent probe amplification or genomic array. All patients underwent an ophthalmological study, more or less comprehensive, including electrophysiological tests. In addition, in vitro assays with minigenes were performed to verify the impact of certain variants on mRNA processing. To do this, pSPL3 plasmid in which the mutation was introduced was used, the transformation was performed in electrocompetent E. coli bacteria and transfection in HEK-293 cells. By the panel sequencing, a diagnostic rate of 60% was obtained. The mutations in the resolved patients were distributed in 30 different genes, of which 38 were described for the first time in this work. The most frequently mutated genes in these patients were ABCA4, USH2A, RPGR and PRPH2. In addition, eight copy number variants were identified in the genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 and ROM1, that demonstrated the enormous potential of these technologies. In total, 10% of the families studied were reclassified and intra and inter-family phenotypic variability was detected in patients with mutations in C1QTNF5, CERKL and PROM1. In addition, we highlight that 50% of the symptomatic and heterozygous RPGR women showed retinitis pigmentosa (RP) with interocular asymmetry. Likewise, we identified a case with possible digenism between the CNGA1 and CNGB1 genes, and the complete duplication of ROM1 in two unrelated families diagnosed with RP. On the other hand, six families have been identified with mutations in two genes that could potentially be the cause of IRD. Functional assays by minigenes showed that six of the studied variants affected splicing. The results of this thesis highlight the clinical utility of targeted genomic sequencing in IRD and the importance of a complete ophthalmological examination that allows us to establish new genotype-phenotype associations and expand the knowledge of this group of diseases. Identifying the cause of the disease is essential to improve patient management, to perform an accurate genetic counseling and to take advantage of treatments based on gene therapy. / Rodríguez Muñoz, A. (2020). High-throughput strategies for molecular diagnosis of nonsyndromic inherited retinal dystrophies [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/139095