Para se adaptar a diversas condições ambientais Escherichia coli regula sua transcrição gênica. Um importante regulador de adaptação da bactéria é a subunidade sigma da RNA polimerase, responsável pela transcrição da maioria dos genes relacionados com a fase estacionária e situações de estresse. O gene rpoS possui elevado grau de polimorfismo, adquirindo mutações nulas ou de atenuação em cepas cultivadas em laboratório. Na natureza, entretanto, alelos rpoS não-funcionais são, aparentemente, menos comuns. Neste trabalho foi realizado uma análise temporal do perfil de RpoS em isolados ambientais de E. coli, a fim de correlacionar o status de RpoS com as alterações físico-químicas que ocorrem ao longo do ano em águas residuárias. Concluiu-se que RpoS é altamente persistente no ambiente, e os níveis da proteína variaram muito de uma cepa para outra. Não houve grande correlação entre os fenótipos e RpoS, mas os dados demostraram a diversidade fenotípica que pode existir no ambiente e que permitem sua sobrevivência por longos períodos fora do hospedeiro. / To adapt to various environmental conditions Escherichia coli regulates its gene transcription. An important regulator of bacterial adaptation is the sigma subunit of RNA polymerase, responsible for the transcription of most genes related to stationary phase and stress situations. The rpoS gene has a high degree of polymorphism, acquiring null or attenuation mutations in strains grown in the laboratory. In nature, however, nonfunctional rpoS alleles are apparently less common. In this work a temporal analysis of the profile of RpoS in environmental isolates of E. coli was carried out, in order to correlate the status of RpoS with the physico-chemical changes occurring throughout the year in wastewater. It was concluded that RpoS is highly persistent in the environment, and protein levels varied widely from one strain to another. There was no great correlation between the phenotypes and RpoS, but the data demonstrated the phenotypic diversity that may exist in the environment and that allow its survival for long periods outside the host.

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Agustine Gentile / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T02:51:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dias_FabioOmetto_M.pdf: 10515001 bytes, checksum: 45aee75247b1cfb2cf161e57b8dcf10c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A transcrição é um evento crucial para a expressão gênica, sendo que a RNA polimerase II tem um papel destacado: são suas subunidades que interagem entre si e com os fatores de transcrição (TFs), formando um complexo que sintetiza o transcrito primário a partir da molécula de DNA. Entender como as subunidades funcionam e interagem entre si e com os TFs é um ponto fundamental para entender as bases da expressão gênica. Uma subunidade intrigante é a quarta maior subunidade, Rpb4, que juntamente com a Rpb7, a sétima maior subunidade, forma um heterodímero localizado em uma região à parte do core enzimático. Em situações de crescimento, Rpb4 encontra-se pouco associada com Rpb7. Porém, em situações de estresse a ligação das subunidades é de suma importância para a viabilidade celular. Esta tese faz a primeira caracterização do gene ScRpb4 de cana-de-açúcar, que codifica uma proteína homóloga à proteína correspondente à quarta maior subunidade da RNA Pol II de plantas. A proteína ScRpb4 foi expressa em Eschericchia coli e os resultados indicam que os maiores níveis foram observados com a construção baseada em pET-28a à 37 °C, induzidas por 4 horas com IPTG. A expressão do gene ScRpb4 foi uniforme em diferentes tecidos e condições, possuindo um ligeiro aumento da expressão na folha imatura, gema lateral, raiz e flor. Na hibridização in situ verificou-se que os transcritos foram encontrados na zona periférica do sistema vascular de folhas e no meristema apical das inflorescências, mostrando que ScRpb4 e expresso em tecidos imaturos com ativa divisão celular. A localização subcelular revelou que ScRpb4 está presente tanto no núcleo quanto no citoplasma, fato similar ao previamente reportado em leveduras. Todos os resultados encontrados estão de acordo com o provável papel de Rpb4 como parte da maquinaria transcricional, e trazem novos dados para essa subunidade em plantas / Abstract: Transcription is a crucial event for gene expression, whereas RNA Polymerase II plays an important role: its subunits interacts with each other and with the transcription factors (TFs) form a complex that synthesizes the primary transcript from the DNA molecule. Understanding how the subunits work and interact among themselves and with the TFs is a key point to understand the basis of gene expression. An interesting subunit is the fourth largest subunit, Rpb4, which together with Rpb7, the seventh largest subunit, forms a heterodimer located away from the enzymatic core. In yeast, in situations of optimal conditions, Rpb4 is often associated with Rpb7, but in non­optimal conditions, the association of the subunits is critical for cell viability. Our work does the first characterization of the ScRpb4 gene from sugarcane, which encodes a homologous protein to the proteins corresponding to the fourth largest subunit of the RNA Polymerase II from plants. The ScRpb4 protein was expressed in Eschericchia coli and results indicate that the highest levels of expression was observed with the construction based on pET-28a at 37 °C, induced with IPfG for 4 hours. ScRpb4 gene expression was uniform in different tissues and conditions, with a slightly higher expression in immature leaf, lateral bud, root and flowers. In situ hybridization showed that the ScRpb4 transcripts were found at the periphery of the vascular system in leaves and in the apical meristem of inflorescence, showing that ScRpb4 is expressed in immature tissues with active cell division. The subcellular localization revealed that ScRpb4 functions in nucleus and cytoplasm, similarly to previous reports found in yeast. All the results found are in agreement with the alleged role of the ScRpb4 as a part of the transcriptional machine and provide new data of this subunit in plants / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular

A raiva é uma doença aguda, progressiva e infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos, causada pelo vírus da raiva (RABV). Embora possa ser prevenida por vacina, continua sendo um grave problema de saúde pública, além de ser responsável pela morte de seres humanos e muitos outros animais, incluindo os de interesse econômico. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre polimorfismos dos genes que codificam as proteínas P e L de amostras de RABV pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3 e períodos de incubação e títulos em camundongos. Para isso, foram selecionadas amostras isoladas de diferentes reservatórios de raiva de mamíferos das Ordens Carnivora e Chiroptera e amostras de bovinos, de áreas endêmicas para o vírus da raiva. As sequências obtidas foram utilizadas para a construção de árvores filogenéticas para procurar os padrões de segregação de linhagens. Os resultados mostraram que não houve marcadores ou polimorfismos que explicam as variações nos períodos de incubação e de letalidade entre cepas pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3. Esta informação pode ser usada para discussões sobre a importância de reservatórios de raiva, a dinâmica do vírus da manutenção e evolução das diferentes formas desta zoonose entre os animais infectados, contribuindo para um estudo mais aprofundado sobre a busca de marcadores moleculares para patogênese. / Rabies is an acute, progressive and infectious disease of the central nervous system of mammals, caused by Rabies virus (RABV). Although preventable by vaccine, it remains a serious public health problem, and is responsible for the death of humans and many other animals, including those of economic interest. This study aimed to assess the relationship between polymorphisms in genes encoding the P and L proteins of RABV samples belonging to antigenic variants 2 and 3 and incubation periods and titers in mice. For this, samples isolated from different mammalian rabies reservoirs of the Orders Carnivora and Chiroptera and samples of cattle from endemic areas for rabies virus were selected. The sequences obtained were used to construct phylogenetic trees to search for the segregation patterns of strains. The results showed that there were no markers or polymorphisms that explain variations in incubation periods and lethality amongst strains belonging to antigenic variants 2 and 3. This information might be used for discussions about the importance of rabies reservoirs, the dynamics of the virus maintenance and evolution of the different forms of this zoonotic disease among infected animals, contributing to further study about the search for molecular markers for pathogenesis.

A raiva é uma doença aguda, progressiva e infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos, causada pelo vírus da raiva (RABV). Embora possa ser prevenida por vacina, continua sendo um grave problema de saúde pública, além de ser responsável pela morte de seres humanos e muitos outros animais, incluindo os de interesse econômico. Este estudo teve como objetivo avaliar a relação entre polimorfismos dos genes que codificam as proteínas P e L de amostras de RABV pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3 e períodos de incubação e títulos em camundongos. Para isso, foram selecionadas amostras isoladas de diferentes reservatórios de raiva de mamíferos das Ordens Carnivora e Chiroptera e amostras de bovinos, de áreas endêmicas para o vírus da raiva. As sequências obtidas foram utilizadas para a construção de árvores filogenéticas para procurar os padrões de segregação de linhagens. Os resultados mostraram que não houve marcadores ou polimorfismos que explicam as variações nos períodos de incubação e de letalidade entre cepas pertencentes a variantes antigênicas 2 e 3. Esta informação pode ser usada para discussões sobre a importância de reservatórios de raiva, a dinâmica do vírus da manutenção e evolução das diferentes formas desta zoonose entre os animais infectados, contribuindo para um estudo mais aprofundado sobre a busca de marcadores moleculares para patogênese. / Rabies is an acute, progressive and infectious disease of the central nervous system of mammals, caused by Rabies virus (RABV). Although preventable by vaccine, it remains a serious public health problem, and is responsible for the death of humans and many other animals, including those of economic interest. This study aimed to assess the relationship between polymorphisms in genes encoding the P and L proteins of RABV samples belonging to antigenic variants 2 and 3 and incubation periods and titers in mice. For this, samples isolated from different mammalian rabies reservoirs of the Orders Carnivora and Chiroptera and samples of cattle from endemic areas for rabies virus were selected. The sequences obtained were used to construct phylogenetic trees to search for the segregation patterns of strains. The results showed that there were no markers or polymorphisms that explain variations in incubation periods and lethality amongst strains belonging to antigenic variants 2 and 3. This information might be used for discussions about the importance of rabies reservoirs, the dynamics of the virus maintenance and evolution of the different forms of this zoonotic disease among infected animals, contributing to further study about the search for molecular markers for pathogenesis.

Um conjunto de quadros clínicos conhecidos genericamente por Leishmaniose, que representa um sério problema de Saúde Pública, tem como agentes etiológicos protozoários do gênero Leishmania. Em seu ciclo de vida, o parasita apresenta dois hospedeiros, um vertebrado e um invertebrado. O gênero Leishmania é dividido em dois subgêneros: Leishmania (Leishmania) e LeishmaniaViannia), de acordo com a posição ocupada pela forma promastigota no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado. Genes que codificam RNA ribossômico são exclusivamente transcritos pela RNA polimerase I. A região promotora dessa polimerase é conhecida como espécie-específica. Estudos anteriores, baseados em ensaios de expressão transiente com construções nas quais a expressão do gene repórter CAT era dirigido por diferentes regiões do promotor mostraram que em Leishmania há um reconhecimento espécie-específico, mas que espécies filogeneticamente relacionadas reconhecem melhor o promotor do que a espécie homóloga. A caracterização estrutural da região promotora de RNA pol I de L. (V.) braziliensis possibilitou mapear o sítio de início de transcrição e definir a provável região promotora de RNA pol I desse organismo. Quando comparamos o 5´ ETS da região estudada, com a região correspondente das demais espécies do subgênero L. (Leishmania), notamos uma alta similaridade tanto no tamanho, quanto na seqüência de nucleotídeos. Já na região IGS os blocos de repetição apresentam tamanho similar, porém seqüências distintas, assim como a seqüência à montante do ETS. Não foi determinado o número de blocos de repetição presente em cada cístron de L.(V.) braziliensis. Os estudos de ligação de fatores nucleares à região central do promotor mostraram que houve um reconhecimento diferencial dessa região entre a espécie homóloga L. (V.) braziliensis e as espécies heterólogas L. (V.) guyanensis, pertencente ao mesmo subgênero e L. (L.) amazonenis. Os complexos protéicos associados a essa região central apresentaram maior afinidade com a espécie heteróloga L. (V.) guyanensis. O fato de ser o ensaio de CAT trabalhoso e demorado levou à busca de outro repórter que evidenciasse a funcionalidade da região promotora ao mesmo tempo em que permitisse a quantificação dessa expressão, de modo a medir a força do promotor. Neste trabalho iniciamos a padronização para utilizar GFP como gene repórter no estudo da funcionalidade de promotores. Foi possível mostrar que a GFP é detectável em microscopia confocal e que as células que expressam GFP podem ser quantificadas em FACS, no entanto, essas detecções só foram possíveis em parasitas selecionados por uma marca de seleção, ou seja, numa transfecção estável. Assim, substituir o gene repórter CAT pelo gene GFP foi inadequado para os ensaios de transfecção transiente, impedindo que fosse medida a atividade da região promotora de L. (V.) braziliensis em diferentes espécies. / Leishmaniasis is the generic name of a serious public health problem that is caused by protozoa of the genus Leishmania. In its lifecycle, the parasite has two hosts, a vertebrate and an invertebrate. The genus Leishmania is divided into two subgenera: Leishmania (Leishmania) and Leishmania (Vianna), according to the position occupied by the promastigotes form at the gut of the invertebrate host. Genes that encode ribosomal RNA are exclusively transcribed by RNA polymerase I. The promoter region of the RNA polymerase I is known to present a species-specific recognition. Previous studies, based on transient expression assays with constructions in which the expression of the reporter gene CAT was directed by different regions of the promoter showed that RNA pol I promoter in Leishmania is species-specific, but in phylogenetically related species the expression of the reporter gene is higher than in the homologous species. The structural characterization of the promoter region of RNA pol I of L. (V.) braziliensis enabled to map the site of initiation of transcription and to define the promoter region of RNA pol I. The comparison of the determined 5\' region of the ETS region, with the corresponding region of other species of the subgenus L. (Leishmania), showed a high similarity both in size, as in the sequence of nucleotides. However, the IGS region and the repetitive blocks of nucleotides have similar size but different sequences. The studies of binding of nuclear factors to the central region of the promoter showed that there was a recognition between the species counterpart L. (V.) braziliensis and the heterologous species L. (V.) guyanensis, belonging to the same subgenus and L. (L.) amazonensis, that belongs to another subgenus. The complex protein associated with this central region showed greater affinity with the heterologous species L. (V.) guyanensis. The fact that to quantify the CAT expression represents a laborious and time consuming test lead us to search for another reporter that could identified the functionality of the promoter region and at the same time allowed the quantification of expression in order to measure the strength of the promoter. In the present work, we began the standardization for the use of GFP gene as reporter in the study of the functionality of promoters. It was possible to show that GFP is detectable in confocal microscope and the cells that express GFP can be quantified in FACS, however, these findings were made possible only in parasites selected by the mark, ie in a stable transfection. So, the replacement of CAT by GFP reporter showed to be inadequate for testing promoters in transient transfection. This prevented the measure of the activity of the promoter region of L. (V.) braziliensis in different species.

Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vaz_ThaisHaline_D.pdf: 13126521 bytes, checksum: 672f3c7b0345ee333ab24793e624068d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resposta individual das células está na base da resistência do organismo à infecção viral. O principal mecanismo de resistência envolve a participação de inúmeros genes da via de sinalização dos interferons. Vários estudos vêm sendo conduzidos em larga escala para identificar genes que respondem aos mais variados tratamentos, assim como clusters gênicos relacionados a determinadas enfermidades, como a leucemia. A função do produto de muitos destes genes ainda não foi caracterizada. Numa ampla revisão destes artigos identificamos a proteína KIAA0082/ISG95 respondendo a interferon, à infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), ao tratamento celular com oligodeoxinucleotídeos CpG, fazendo parte de um cluster de genes relacionados à leucemia e sendo super-expressa em linfócitos T ativados. Embora não possua função conhecida, esta proteína apresenta quatro domínios que indicam uma possível atividade relacionada ao metabolismo de RNA. Neste trabalho demonstramos que o promotor do gene ISG95 responde à estimulação por interferon num sistema repórter em células Vero. As atividades bioquímicas de ISG95 foram determinadas usando a proteína recombinante expressa em células de inseto Sf9. ISG95 interage com RNA e com S-adenosilmetionina, possuindo também atividade de metiltransferase in vitro. Ensaios de localização sub-celular demonstraram sua distribuição nuclear. Além disso, através do método duplo-híbrido de levedura e de ensaio de co-imunoprecipitação, foi possível identificar sua interação com o domínio C-terminal (CTD) da RNA polimerase II, o que é consistente com sua localização nuclear e com a função predita para o domínio WW localizado na extremidade C-terminal de ISG95. Os resultados indicam que ISG95 é parte da via de resposta a interferon e tem função associada possivelmente a eventos de processamento de prémRNA mediados pelo domínio CTD da RNA polimerase II / Abstract: A major mechanism of cellular resistance to viral invasion involves genes from the interferon signaling pathway, called ISGs (interferon stimulated genes). Global transcriptional profiling studies have linked increased expression of ISG95 (KIAA0082) to response to interferon treatment and to viral infection, suggesting that it may be part of the cellular defense against viral replication. In this work, we shown that the ISG95 promoter can drive interferoninduced transcription of a reporter gene in Vero cell cultures. The biochemical functions of ISG95 were assessed using recombinant protein. ISG95 shows RNA- and S-adenosyl-methionine binding and protein methyltransferase activity in vitro. ISG95 interacts with the C-terminal domain of RNA polymerase II, which is consistent with its nuclear localization and with the predicted function of the WW domain found in the C-terminal region of ISG95. The results presented in this work indicate that ISG95 is part of the interferon response pathway and functions in the pre-mRNA processing events mediated by the C-terminal domain of the RNA polymerase II / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Um conjunto de quadros clínicos conhecidos genericamente por Leishmaniose, que representa um sério problema de Saúde Pública, tem como agentes etiológicos protozoários do gênero Leishmania. Em seu ciclo de vida, o parasita apresenta dois hospedeiros, um vertebrado e um invertebrado. O gênero Leishmania é dividido em dois subgêneros: Leishmania (Leishmania) e LeishmaniaViannia), de acordo com a posição ocupada pela forma promastigota no tubo digestivo do hospedeiro invertebrado. Genes que codificam RNA ribossômico são exclusivamente transcritos pela RNA polimerase I. A região promotora dessa polimerase é conhecida como espécie-específica. Estudos anteriores, baseados em ensaios de expressão transiente com construções nas quais a expressão do gene repórter CAT era dirigido por diferentes regiões do promotor mostraram que em Leishmania há um reconhecimento espécie-específico, mas que espécies filogeneticamente relacionadas reconhecem melhor o promotor do que a espécie homóloga. A caracterização estrutural da região promotora de RNA pol I de L. (V.) braziliensis possibilitou mapear o sítio de início de transcrição e definir a provável região promotora de RNA pol I desse organismo. Quando comparamos o 5´ ETS da região estudada, com a região correspondente das demais espécies do subgênero L. (Leishmania), notamos uma alta similaridade tanto no tamanho, quanto na seqüência de nucleotídeos. Já na região IGS os blocos de repetição apresentam tamanho similar, porém seqüências distintas, assim como a seqüência à montante do ETS. Não foi determinado o número de blocos de repetição presente em cada cístron de L.(V.) braziliensis. Os estudos de ligação de fatores nucleares à região central do promotor mostraram que houve um reconhecimento diferencial dessa região entre a espécie homóloga L. (V.) braziliensis e as espécies heterólogas L. (V.) guyanensis, pertencente ao mesmo subgênero e L. (L.) amazonenis. Os complexos protéicos associados a essa região central apresentaram maior afinidade com a espécie heteróloga L. (V.) guyanensis. O fato de ser o ensaio de CAT trabalhoso e demorado levou à busca de outro repórter que evidenciasse a funcionalidade da região promotora ao mesmo tempo em que permitisse a quantificação dessa expressão, de modo a medir a força do promotor. Neste trabalho iniciamos a padronização para utilizar GFP como gene repórter no estudo da funcionalidade de promotores. Foi possível mostrar que a GFP é detectável em microscopia confocal e que as células que expressam GFP podem ser quantificadas em FACS, no entanto, essas detecções só foram possíveis em parasitas selecionados por uma marca de seleção, ou seja, numa transfecção estável. Assim, substituir o gene repórter CAT pelo gene GFP foi inadequado para os ensaios de transfecção transiente, impedindo que fosse medida a atividade da região promotora de L. (V.) braziliensis em diferentes espécies. / Leishmaniasis is the generic name of a serious public health problem that is caused by protozoa of the genus Leishmania. In its lifecycle, the parasite has two hosts, a vertebrate and an invertebrate. The genus Leishmania is divided into two subgenera: Leishmania (Leishmania) and Leishmania (Vianna), according to the position occupied by the promastigotes form at the gut of the invertebrate host. Genes that encode ribosomal RNA are exclusively transcribed by RNA polymerase I. The promoter region of the RNA polymerase I is known to present a species-specific recognition. Previous studies, based on transient expression assays with constructions in which the expression of the reporter gene CAT was directed by different regions of the promoter showed that RNA pol I promoter in Leishmania is species-specific, but in phylogenetically related species the expression of the reporter gene is higher than in the homologous species. The structural characterization of the promoter region of RNA pol I of L. (V.) braziliensis enabled to map the site of initiation of transcription and to define the promoter region of RNA pol I. The comparison of the determined 5\' region of the ETS region, with the corresponding region of other species of the subgenus L. (Leishmania), showed a high similarity both in size, as in the sequence of nucleotides. However, the IGS region and the repetitive blocks of nucleotides have similar size but different sequences. The studies of binding of nuclear factors to the central region of the promoter showed that there was a recognition between the species counterpart L. (V.) braziliensis and the heterologous species L. (V.) guyanensis, belonging to the same subgenus and L. (L.) amazonensis, that belongs to another subgenus. The complex protein associated with this central region showed greater affinity with the heterologous species L. (V.) guyanensis. The fact that to quantify the CAT expression represents a laborious and time consuming test lead us to search for another reporter that could identified the functionality of the promoter region and at the same time allowed the quantification of expression in order to measure the strength of the promoter. In the present work, we began the standardization for the use of GFP gene as reporter in the study of the functionality of promoters. It was possible to show that GFP is detectable in confocal microscope and the cells that express GFP can be quantified in FACS, however, these findings were made possible only in parasites selected by the mark, ie in a stable transfection. So, the replacement of CAT by GFP reporter showed to be inadequate for testing promoters in transient transfection. This prevented the measure of the activity of the promoter region of L. (V.) braziliensis in different species.

Trypanosoma cruzi é o agente causador da Doença de Chagas, que segundo a OMS, atinge oito milhões de pessoas principalmente na América Latina, causando danos à saúde pública, juntamente com um impacto econômico negativo. Durante o processo de infecção, uma variedade de eventos celulares ocorre apenas pelo simples contato do parasito com a célula hospedeira, levando a modificações no metabolismo celular e alterações morfológicas. O parasita é capaz de modular respostas celulares e imunológicas da célula hospedeira para sua própria sobrevivência. Além do que, pode alterar compartimentos celulares como o número e tamanho de nucléolos, sugerindo que a presença do parasita poderia estar interferindo na maquinaria nuclear. Porém, pouco se conhece sobre a organização nuclear da célula hospedeira quando infectada por Trypanosoma cruzi. O objetivo deste estudo foi de investigar pela primeira vez os compartimentos nucleares das células hospedeiras durante o curso da infecção por T. cruzi. Células LLC-MK2 foram infectadas com T. cruzi e reações de imunofluorescência indireta foram realizadas utilizando anticorpos e marcadores específicos para proteínas nucleares. As análises das imagens de microscopia confocal e quantificação das fluorescências pelo ImageJ mostraram padrões distintos nos compartimentos nucleares quando comparadas com células não infectadas. Corpos de Cajal e Speckles sofrem alterações quando a célula está infectada e isso depende do ciclo celular do parasita. Neste trabalho também foi investigado através de quantificação de imagem e immunoblotting o comportamento das Ribonucleoproteínas A1 e A2B1 durante a parasitemia. Estas análises demonstram que o T. cruzi pode modular a célula hospedeira quando infectada a favor de sua sobrevivência, promovendo alterações na dinâmica dos compartimentos nucleares durante o seu ciclo celular. Esse estudo inédito poderá auxiliar a compreender a biologia do parasita e sua interação com a célula hospedeira e desta maneira contribuir na busca de possíveis alvos terapêuticos / Trypanosoma cruzi is the causal agente of Chagas disease, that affects about eight million people mostly in Latin America according to the WHO, causing damage to public health and a negative economic impact. During infection, a variety of signaling processes occur after contact of the parasite to the host cell, what can lead to metabolic modifications as well morphological alterations in both cells. The parasite can modulate host cell cellular and immunological responses for its own survival. In addiction, the presence of T. cruzi can modify the nuclear compartments such as nucleoli, suggesting that the presence of the parasite could be interfering with the nuclear machinery. However, little is know about the nuclear organization when the host cell is infected with Trypanosoma cruzi. This study aimed to investigate for the first time the nuclear compartment of host cells infected by T. cruzi using specific antibodies and fluorescent markers for nuclear compartments, in order to investigate the morphological and functional changes in the nucleus of the host cell. Using LLC-MK2 cells infected with T. cruzi, we performed indirect immunofluorescence using distinct nuclear antibodies. Confocal microscopy analysis of infected cells showed pattern variations in the nuclear compartments when compared to uninfected cells. Cajal bodies and Speckles suffer alterations when the cell is infected and it is related to the parasite life cycle. In this work we also investigated by image quantification and immunoblotting the behavior of Ribonucleoproteins A1 and A2B1 during infection. These evidences support the idea that T. cruzi can modulate host cell response to ensure its own survival during the infection, promoting changes in the dynamics of the nuclear compartments. This unpublished data may help to understand the biology of the parasite and its interaction with the host cell and thus contributing to seek for potential therapeutic targets

Recentemente, tem sido demonstrado que a maioria dos RNAs transcritos em células humanas são RNAs não-codificadores de proteínas (ncRNAs) originados de íntrons ou regiões intergênicas. Em trabalhos anteriores realizados por nosso grupo, foram descritos longos ncRNAs transcritos de regiões intrônicas de genes codificadores e cuja expressão foi correlacionada ao grau de diferenciação de tumores de próstata, apontando para a relevância fisiológica desta classe de transcritos. Apesar de sua abundância, as propriedades, funções e regulação da grande maioria dos ncRNAs ainda não foram elucidadas. O objetivo do presente trabalho foi investigar a biossíntese de ncRNAs intrônicos em células humanas, primordialmente a contribuição da RNA Polimerase II (RNAP II), bem como aspectos de sua regulação. Primeiramente, o modelo de regulação da expressão gênica por hormônio andrógeno foi utilizado para avaliação da participação direta de um fator de transcrição de RNAP II, o Receptor de Andrógeno (AR), na modulação da transcrição de ncRNAs intrônicos. Utilizando-se a técnica de imunoprecipitação da cromatina, foi detectada a ligação do AR ao elemento de resposta a andrógeno (ARE) presente em um possível promotor de um transcrito intrônico antisenso (derivado do locus Myo5A), cuja expressão é aumentada em células da linhagem LNCaP tratadas com o hormônio. A ligação ao ARE foi induzida pelo tratamento, sugerindo que o efeito do andrógeno na expressão do ncRNA é mediado pelo AR. Em uma segunda abordagem, o efeito da inibição da transcrição por RNAP II com α-amanitina por 24 h em células LNCaP foi avaliado com o uso de microarranjos de oligonucleotídeos representando transcritos total ou parcialmente intrônicos, além de éxons de genes codificadores. A expressão de menos de 20 % dos transcritos intrônicos foi afetada, fração significativamente menor que a observada para os transcritos exônicos (40 %). Ainda que a maioria dos ncRNAs intrônicos diferencialmente expressos tenha sua abundância diminuída, interessantemente, 13 a 16 % foram aumentados, contrastando com aproximadamente 2 a 3 % de exônicos que aumentaram. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a RNAP II atua na transcrição de ncRNAs intrônicos, mas que uma fração considerável pode ser transcrita por outra RNA Polimerase. / It has been recently shown that the bulk of the transcription in human cells is comprised of non-protein-coding RNAs (or noncoding RNAs - ncRNAs) transcribed from introns and intergenic regions of the genome. Previous work from our group has demonstrated that expression of long intronic ncRNAs can be correlated to the degree of prostate tumor differentiation, underscoring the physiological relevance of these transcripts. However, the properties, functions, and regulation of this huge population of ncRNAs remain largely unknown. The present work aimed to investigate the biosynthesis of intronic ncRNAs and aspects of its regulation in human cells, focusing on the contribution of RNA Polymerase II (RNAP II). Initially, the model of regulation of gene expression by androgen hormone was used in order to evaluate the participation of the RNAP II transcription factor Androgen Receptor (AR) in the transcriptional regulation of intronic ncRNAs. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed the binding of the AR in an androgen response element (ARE) present in a putative promoter driving the expression of an antisense intronic transcript in Myo5A locus in LNCaP cells. The interaction occurred in an androgen-inducible fashion, along with the up-regulation of the transcript, suggesting that hormone activation occurred in a direct manner mediated by the AR. In a different approach, the effect of RNAP II inhibition with α-amanitin for 24 h in LNCaP cells was analyzed using an oligoarray representing totally and partially intronic transcripts, as well as exons of proteincoding genes. The expression of less than 20 % of the intronic transcripts was affected by the treatment, contrasting to a significantly higher fraction observed for exonic messages (40 %). Moreover, most differentially expressed intronic transcripts were down-regulated, but strikingly 13 to 16 % were up-regulated in cells with blocked RNAP II, while this fraction for exonic transcripts was about 2 %. The results described here demonstrate that RNAP II in fact plays a role in intronic transcription in human cells, but also highlight that another transcriptional system may account for the biogenesis of a fraction of intronic ncRNAs.

Da interação da actina com a miosina resulta a contração muscular. Esta interação é controlada pela concentração de íons cálcio, que atuam sobre um sistema regulatório associado ao filamento de actina. O sistema regulatório é composto de uma molécula de tropomiosina e um complexo protéico composto de três polipeptídeos chamado troponina. Uma das subunidades, troponina C, e o receptor de ions cálcio; outra, troponina T, liga-se à tropomiosina; e a terceira, troponina I, é a responsável pela inibição da atividade ATPásica da actomiosina. Esta dissertação descreve o desenvolvimento do processo de expressão da troponina I em bactéria, sua purificação e caracterização. Partindo de um cDNA de troponina I músculo esquelético de galinha, procedemos à construção de um vetor de expressão da proteína em E.coli com o sistema pET. Inicialmente construímos um vetor de expressão capaz de produzir a troponina I fundida a 18 aminoácidos. A proteína foi purificada e caracterizada, comportando-se de forma semelhante à troponina I selvagem. Numa segunda etapa, foram feitas mutações sítio-dirigidas para a construção de um novo sítio de restrição que possibilitou construir um vetor de expressão da troponina I a partir de sua metionina inicial. Entretanto não foi obtida expressão com esta construção. Para solucionar o problema, foram feitas novas mutações que alteraram os codons AGG presentes nos 25 primeiros codons do gene da proteína por codons CGT, sem alterar o aminoácido codificado. Nesta construção final foi obtida a expressão da proteína sem fusão, que purificada e caracterizada, comporta-se de modo idêntico à troponina I selvagem. / Muscle contraction results from the interaction of myosin with actin and this interaction is controlled by the calcium ion concentration which acts on the regulatory system associated with the actin filaments. This regulatory system comprises one tropomyosin molecule and a complex composed of three polypeptide subunits. One of this subunits, troponin C binds calcium ions; another, troponin T, binds to tropomyosin while the third, troponin I, inhibits the ATPase activity of actomyosin. This dissertation describes the development of the methodology to express troponin I in bacteria and its subsequent purification and characterization. Starting with a troponin I cDNA from chicken skeletal muscle, a pET expression vector was constructed. The initial vector resulted the expression of a troponin I fusion protein having an additional 18 amino acids. This protein was purified and characterized and found to behave like wild type troponin I. Subsequently, employing site-directed mutagenesis, a new vector was made which allowed the expression of the protein starting at its initial methionine codon and lacking the extra amino acids. However, no expression was achieved using this vector and, to circumvent this, further mutations were introduced in the first 25 codons which substituted AGG for CGT without altering the amino acid sequence. This final construct permitted the expression of a non fusion troponin I which, after purification and characterization, was found to behave identically to the wild type protein.