INTRODUÇÃO: A inflamação das vias aéreas na asma envolve respostas imunes inatas. Os receptores do tipo Toll (Toll-like receptors, TLRs) e a citocina linfopoetina do estroma tímico (thymic stromal lymphopoietin, TSLP) estão envolvidos na inflamação brônquica da asma, mas a expressão destas proteínas em vias aéreas grandes e pequenas de asmáticos ainda não foi investigada. Os objetivos deste estudo foram analisar a expressão protéica de TLR2, TLR3, TLR4 e TSLP em vias aéreas grandes e pequenas de asmáticos, comparar sua expressão entre asmáticos tabagistas e não tabagistas e investigar se a expressão dos TLRs está associada à infecção por Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae. MÉTODOS: Foram analisadas por método imuno-histoquímico e análise de imagens as expressões de TLR2, TLR3, TLR4 e TSLP em vias aéreas grandes e pequenas de 24 indivíduos falecidos por asma (13 não tabagistas e 11 tabagistas) e 9 controles não asmáticos. A análise das proteínas foi realizada em quatro regiões das vias aéreas: camadas epitelial, interna, muscular e externa. A presença de C. pneumoniae e M. pneumoniae no tecido pulmonar foi investigada por meio de reação em cadeia da polimerase em tempo real. RESULTADOS: Os indivíduos asmáticos apresentaram maior expressão de TLR2 nas camadas epitelial e externa de vias aéreas grandes e pequenas, e maior TLR2 na camada muscular de vias aéreas pequenas. Asmáticos tabagistas tiveram menor expressão de TLR2 nas camadas interna e externa de vias aéreas pequenas do que asmáticos não tabagistas. Indivíduos asmáticos tiveram maior expressão de TSLP na camada epitelial e externa de vias aéreas grandes, aumento de TLR3 na camada externa de vias aéreas grandes e aumento de TLR4 na camada externa de vias aéreas pequenas. O DNA de C. pneumoniae e M. pneumoniae não foi detectado em nenhum indivíduo asmático ou controle. CONCLUSÕES: Os receptores da imunidade inata TLR2, 3 e 4 e a citocina TSLP estão aumentados nas vias aéreas de pacientes falecidos por asma, e a expressão dos TLRs não está associada à presença de Chlamydophila pneumoniae e Mycoplasma pneumoniae nos pulmões. O tabagismo em asmáticos parece reduzir a expressão de TLR2 em vias aéreas pequenas. Estes resultados sugerem que os TLRs 2, 3 e 4 e a TSLP podem contribuir com a inflamação brônquica presente em exacerbações graves de asma e que as bactérias C. pneumoniae e M. pneumoniae não estão envolvidas em óbitos por asma / INTRODUCTION: Airway inflammation in asthma involves innate immune responses. Toll-like receptors (TLRs) and the cytokine thymic stromal lymphopoietin (TSLP) are involved in bronchial inflammation in asthma, but the expression of these proteins in large and small airways of asthmatics has not been investigated. The aims of this study were to analyze the protein expression of TLR2, TLR3, TLR4 and TSLP in large and small airways of asthmatics, to compare their expression in smoking and nonsmoking asthmatics and to investigate if TLR expression in associated with infection by Chlamydophila pneumoniae and Mycoplasma pneumoniae. METHODS: Using immunohistochemistry and image analysis, we investigated the expression of TLR2, TLR3, TLR4 and TSLP in large and small airways of 24 fatal asthma patients (13 nonsmokers and 11 smokers) and 9 nonasthmatic controls. The protein expression was analyzed in four regions of the airways: epithelial, internal, airway smooth muscle and outer layers. C. pneumoniae and M. pneumoniae presence in lung tissue was analyzed by real-time polymerase chain reaction. RESULTS: Fatal asthma patients had increased expression of TLR2 in the epithelial and outer layers of large and small airways, and also higher TLR2 in the muscle layer of small airways. Smoking asthmatics had lower TLR2 in the inner and outer layers of small airways than nonsmoking asthmatics. TSLP was increased in the epithelial and outer layers of large airways. Asthmatics also had greater TLR3 in the outer layer of large airways and greater TLR4 in the outer layer of small airways. C. pneumoniae and M. pneumoniae DNA was not detected in asthmatics or controls. CONCLUSIONS: Innate immunity receptors TLR2, 3 and 4 and innate cytokine TSLP are increased in the airways of fatal asthma patients, and TLRs expression is not associated with the presence of Mycoplasma pneumoniae and Chlamydophila pneumoniae in the lungs. Smoking may reduce TLR2 expression in the small airways of asthmatics. These results suggest that TLR2, 3, 4 and TSLP may contribute to the bronchial inflammation seen in severe exacerbations of asthma and that M. pneumoniae and C. pneumoniae are not involved in fatal asthma exacerbations

O objetivo deste trabalho foi caracterizar a formação e progressão de lesões periapicais induzidas experimentalmente em dentes de camundongos knockout para receptores toll-like 2 (TLR2 KO) comparados a animais wild-type (WT). As lesões periapicais foram induzidas nos primeiros molares inferiores de 28 camundongos WT e de 27 camundongos TLR2 KO. Decorridos 7, 21 e 42 dias da indução da lesão periapical, os animais foram submetidos à eutanásia em câmara de CO2, as mandíbulas foram removidas e submetidas ao processamento histotécnico. A seguir, cortes representativos foram corados com hematoxilina e eosina (HE), para descrição do tecido pulpar e das regiões apical e periapical, em microscopia óptica convencional, e mensuração da área das lesões periapicais, em microscopia de fluorescência. Espécimes sequenciais foram avaliados por meio de: histoenzimologia para a atividade da TRAP, para identificação de osteoclastos; coloração de Brown & Brenn, para localização de bactérias; e imunoistoquímica, para identificação de marcadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL, OPG). Os resultados numéricos obtidos da análise morfométrica da extensão da área das lesões periapicais e do número de osteoclastos foram submetidos à análise estatística por meio dos testes não-paramétricos de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis, utilizando o software SAS (Statistical Analysis System) for Windows versão 9.1.3. O nível de significância adotado foi de 5%. Os resultados da coloração de Brown & Brenn e Imunoistoquímica foram expressos de maneira qualitativa. O grupo de animais WT apresentou diferença significante na extensão da área das lesões periapicais e no número de osteoclastos entre os períodos experimentais de 7 e 42 dias (p<0,05) e entre 21 e 42 dias (p<0.05). Por outro lado, no grupo de animais TLR2 KO, as diferenças para a extensão da área das lesões periapicais e número de osteoclastos foram encontradas entre os períodos experimentais de 7 e 21 dias (p<0,05) e entre 7 e 42 dias (p<0,05). Quando os períodos dos grupos foram comparados entre si, foram encontradas diferenças estatísticas entre todos os períodos experimentais, tanto para a análise morfométrica da extensão da área das lesões periapicais, quanto para o número de ostoclastos (p<0,05). A análise descritiva do tecido pulpar e das regiões apical e periapical, por meio da coloração de HE, bem como da localização das bactérias, por meio da coloração de Brown & Brenn, não mostrou diferenças entre os dois grupos de animais. Com relação à Imunoistoquímica, as marcações foram semelhantes entre os dois grupos de animais, exceto para as marcações de RANK, as quais não foram encontradas nas lesões periapicais do grupo de animais TLR2 KO. A partir das metodologias empregadas e dos resultados obtidos pode-se concluir que na ausência do TLR2, os animais desenvolveram lesões periapicais significantemente maiores (com maior presença de osteoclastos) quando comparados aos animais WT, sugerindo o importante papel desse receptor na resposta imune e inflamatória do organismo no sentido de combater a infecção do sistema de canais radiculares e dos tecidos perirradiculares. / The aim of the present study was to characterize the formation and progression of periapical lesions experimentally induced in the teeth of toll-like receptors 2 knockout (TLR2 KO) mice compared to wild-type (WT) mice. Periapical lesions were induced in the lower first molars of 28 WT and 27 TLR2 KO mice. After 7, 21 and 42 of periapical lesion induction, the animals were euthanized in a CO2 chamber, and the mandibles were removed and subjected to histotechnical processing. Representative histological sections were stained with hematoxylin and eosin (HE) for description of the features of the pulp tissue and the apical and periapical regions under conventional optical microscopy, and for determination of the size of the periapical lesions under fluorescence microscopy. Sequential specimens were evaluated by: TRAP histo-enzymology for identification de osteoclasts; Brown & Brenn staining for localization of bacteria; and immunohistochemistry for identification of osteoclastogenesis markers (RANK, RANKL, OPG). Data from the morphometric evaluation of the size of periapical lesions and the number of osteoclasts were subjected to statistical analysis by the nonparametric Mann-Whitney and Kruskal-Wallis tests, using the SAS (Statistical Analysis System) software for Windows version 9.1.3. A significance level of 5% was set for all analyses. Data from the Brown & Brenn staining and immunohistochemical analysis were displayed qualitatively. The group of WT mice presented statistically significant difference in the periapical lesion size and number of osteoclasts between the 7- and 42-day experimental periods (p<0.05) as well as between 21 and 42 days (p<0.05). On the other hand, in the group of TLR2 KO mice, significant differences in the periapical lesion size and number of osteoclasts were found between the 7- and 21-day experimental periods (p<0.05) as well as between 7 and 42 days (p<0.05). Comparison of the periods within each group revealed statistically significant differences among all experimental periods for the morphometric evaluation of the size of the periapical lesions and number of osteoclasts (p<0.05). Descriptive analysis of pulp tissue and apical and periapical regions by HE staining and localization of bacteria by Brown & Brenn staining did not show significant differences between the two groups of animals. The immunohistochemical results showed similar immunostaining in both groups of animals, except for RANK expression, which was not observed in the periapical lesions of the TLR2 KO mice. Based on the employed methodology and the obtained results it may be concluded that in the silence of TLR2, the animals developed superior size of periapical lesions (with higher presence of osteoclasts) compared to WT animals, suggesting the important role of this receptor during the immune and inflammatory response against the infection of root canal system and periapical tissues.

A aterosclerose é um processo complexo, multifatorial que ainda não está totalmente esclarecido. Foi proposto que a resposta imune mediada por processos infecciosos e/ou inflamatórios influencia na patogênese de lesões ateroscleróticas. Os receptores TolI-likes (TLRs) estão envolvidos na resposta inata e em outros eventos fisiológicos através da interação com seus ligantes endógenos e exógenos e talvez envolvidos no processo aterogênico. Tem por objetivo analisar a expressão dos receptores Toll-like 2 e 4 (TLR2 e TLR4) associando o processo de sinalização com a presença de agentes infecciosos tais como a Chlamydia pneumoniae (CP) e Mycoplasma pneumoniae (MP), em pacientes com infarto do miocárdio (MI) e em aneurismas aórticos. Foram obtidos fragmentos de aortas ascendentes de pacientes submetidos à cirurgia de revascularização do miocárdio (G1, n=13) e de fragmentos de pacientes submetidos à cirurgia de correção de aneurisma aórtico (G2, n=14). Amostras congeladas e parafinadas foram analisadas por Imunohistoquímica (lHO) e Hibridização in situ (HIS) para detecção e localização da presença dos patógenos e TLRs. Realizou-se uma semiquantificação em microscópio (O, ausente; 1, discreto e focal; 2, moderado e focal e 3, intenso e difuso). Observou-se o grau de inflamação e de acúmulo de gordura. Outrossim, realizou-se PCR em tempo real (SYBR Green) para pesquisa de DNA de CP e MP, como também análise da expressão de mRNA de TLR2 e de TLR4. Na lHQ, constatou-se presença de MP, CP, TLR2 e TLR4 (G1 e G2), maior quantidade de MP (p=0,012) e de TLR4 (p=0,017) no G2. Houve correlação de CP com MP (r=0,810 e p=0,003) e de TLR2 com TLR4 (r=0,569 e p=0,034). Na HIS, constatou-se presença de MP, CP, TLR2 e TLR4 (G1 e G2), não houve diferenças significativas comparando-se os grupos (G1 x G2), porém houve correlação, no G1, de CP com TLR4 (r=0,730 e p=0,040) e de infiltrado inflamatório com células adiposas (r=0,700 e p=0,036). No G2, houve várias correlações: MP com CP (r=0,620 e p=0,016), MP com TLR4 (r=0,662 e p=0,010), CP com TLR2 (r=O,733 e p=0,003), CP com TLR4 (r=0,589 e p=0,027) e de TLR2 com TLR4 (r=0,714 e p=0,004). A PCR em tempo real mostrou presença de CP, pela segunda extração de DNA realizada (G2). Não houve diferença de expressão dos TLRs entre os grupos. A expressão de TLR2 foi maior do que de TLR4 no G1 (p=0,006). O grau de inflamação e o acúmulo de gordura foram maiores no G2 do que no G1(p=0,001). Estes dados sugerem uma relação da co-infecção CP e MP, na gravidade do processo inflamatório presente em placas ateroscleróticas e em pacientes com infarto do miocádio, como também, participação dos receptores Toll-like 2 e 4. / The atherosclerosis is a complex and multifactorial process that is not still completely elucidated. It has been proposed that immune-mediate response to inflammatory and/or infectious processes is implicated in the pathogenesis of the atherosclerotic lesions. Toll-like receptors (TLRs) are involved in the innate response and other physiological events through binding to endogenous and exogenous ligands and it may be involved in the atherogenic process To investigate the Toll-like receptor 2 (TLR2) and Toll-like receptor 4 (TLR4) expression in atheroma plaques and its association with the presence of infectious agents such as Chlamydia pneumoniae (CP) and Mycoplasma pneumoniae (MP) in patients with myocardial infarction (MI) and aortic aneurysms. Fragments of ascending aorta were obtained from MI patients submitted to surgeries of revascularization of the myocardium (G1, n=13) and correction of aortic aneurism (G2, n=14). Frozen and paraffined samples slices were analyzed by Immunohistochemistry (lHQ) and in situ Hybridization for detection and localization of TLR2 and TLR4 expression and CP and MP antigens. There was semiquantification in microscope (0, absent; 1, discreet and focal; 2, moderate and focal; and 3, intense and diffuse). Histopathology was also carried out to investigate the inflammation degree and fat accumulation in these tissues. Real time PCR using SYBR Green System detection was used to stydy DNA CP and MP, also to analyze expression of mRNA TLR2 and TLR4. Using lHQ, it was verified presence of MP, CP, TLR2 and TLR4 (G1 and G2), larger amount of MP (p=0.012) and TLR4 (p=0.017) in G2. In G1 group, MP was positively correlated with CP (r=0.810, p=0.003), in G2, TLR2 with TLR4 (r=0.569, p=0.034). Using HIS, it was verified presence of MP, CP, TLR2 and TLR4 (G1 and G2), there were not significant differences between groups (G1 x G2), however, It was shown correlation between in G1, CP with TLR4 (r=0.730, p=0.040) and also inflammation with fat accumulation (r=0.700, p=0.036). In G2, there were several correlations: presence of MP with CP (r=0.620, p=0.016), MP with TLR4 (r=0.662, p=0.010), CP with TLR2 (r=0.733 p=0,003), CP with TLR4 (r=0.589, p=0.027) and TLR2 with TLR4 (r=0.714, p=0.004). Real time PCR showed presence of CP DNA using second purification accomplished (G2). There was not difference of expression TLRs among the groups. The expression of TLR2 was higher than TLR4 in G1 (p=0.006). Increased degree of inflammation and fat accumulation was also find in G2 than in G1 (p=0.001). These results are suggesting that the gravity of the inflammatory process in atherosclerotic plaques strongly are related to the presence of MP and CP co infection and expression of TLR2 and TLR4, as well in MI patients under myocardial revascularization.