En la presente Tesis Doctoral se describe la síntesis de nuevos compuestos bioactivos derivados de 1,2,3-triazol. La reacción de cicloadición 1,3-dipolar de Huisgen se llevó a cabo sobre distintos sustratos de interés, empleando nanopartículas de cobre (CuNPs) como catalizador de la reacción. Las mismas fueron obtenidas a través del sistema CuCl2-Li-DTBB empleado en nuestro grupo de investigación, tanto para la generación de NPs desnudas como soportadas. En todos los casos se obtuvieron los 1,2,3-triazoles 1,4-disustituídos con excelente regioselectividad. En el Apartado I (p.1-33), a modo de introducción general, se detallan antecedentes en la síntesis de 1,2,3-triazoles y las distintas actividades biológicas que poseen este tipo de compuestos. De manera similar se analizan distintos tipos de compuestos fosforados. En el Apartado II (p.34) se detallan los objetivos generales de esta Tesis Doctoral, que se desarrollarán en los siguientes tres capítulos. En el Apartado III (p.35-126), se desarrollará el Capítulo I que explora la síntesis de nuevos moduladores alostéricos del receptor nicotínico α7. Se describe la optimización de las condiciones de reacción para la cicloadición y los estudios de relaciones estructura-actividad realizados. A su vez se detalla la evaluación biológica de estos compuestos, realizada en colaboración con el grupo de la Dra. Cecilia Bouzat (INIBIBB-CONICET). En el Apartado IV (p.127-188) se desarrollará el Capítulo II, donde se describe la síntesis de 1,2,3-triazoles conteniendo derivados de indol. Se detalla la síntesis de los precursores, y la optimización de la reacción de cicloadición 1,3-dipolar para cada tipo de sustrato. Además, se especifican los ensayos biológicos realizados. Este trabajo se realizó en el marco de una estancia pre doctoral en el grupo de Neurofármacos del Instituto de Química Médica (IQM-CSIC) bajo la dirección de la Dra. Ma. Isabel Rodríguez-Franco. En el Apartado V (p.189-222), se desarrolla el Capítulo III donde se expone la síntesis de 1,2,3-triazoles di y trisustituidos, empleados como candidatos para reemplazar el anillo A de la vitamina D. Se discuten también los métodos de acoplamiento empleados para incorporarlos en el biciclo CD de vitamina D. / In this work, the synthesis of novel bioactive compounds, derived from 1,2,3-triazole moiety, is described. 1,3-dipolar cycloaddition (Huisgen reaction) was carried out with different substrates, using copper nanoparticles (CuNPs) as reaction catalyst. These NPs were obtained by reduction of the corresponding metal salt through the CuCl2-Li-DTBB reactive system. In this way, supported and unsupported CuNPs were generated. In all cases, the corresponding 1,4-disubstituted 1,2,3-triazoles were obtained with excellent regioselectivity. In Section I (p.1-33), by way of general introduction, synthesis of 1,2,3-triazoles, and their biological activities, are detailed. In the same way, different types of phosphorated compounds are analysed. In Section II (p.34), the general objectives of this thesis, which will be developed in the next three chapters, are detailed. In Section III (p.35-126), Chapter I will be developed, in which the synthesis of novel allosteric modulators of the α7 nicotinic receptor is explored. The optimization of reaction conditions for the 1,3-dipolar cycloaddition, and the structure-activity relationship (SAR) studies conducted, are described. The biological evaluation of these compounds, carried out in collaboration with Dra Cecilia Bouzat research group (INIBIBB-CONICET), it’s also described. In Section IV (p.127-188), Chapter II will be developed, in which the synthesis of 1,2,3- triazole-Indole derivatives is described. The synthesis of precursors, and the optimization of Huisgen reaction for each type of substrate, is described. The bioassays conducted for these compounds are also detailed. This work was carried out within the framework of a pre-doctoral stay in the NeuroDrugs group of the Medicinal Chemistry Institute at the Spanish National Research Council (IQM-CSIC), under the supervision of Dra. Ma. Isabel Rodríguez-Franco. In Section V (p.189-222), Chapter III will be developed, in which the synthesis of di and trisubstituted 1,2,3-triazoles, used as candidates to replace vitamin D ring A, is described. Coupling methods used to incorporate them into the vitamin D CD bicycle are also discussed.

Orientador: Nailton Monteiro do Nascimento Júnior / Banca: Cintia Duarte de Freitas Milagre / Banca: Natanael Dante Segretti / Resumo: Os nAChRs (receptores nicotínicos de acetilcolina) são canais iônicos pentaméricos que respondem ao neurotransmissor endógeno acetilcolina, com os subtipos α4β2 e α7 sendo expressos em grandes quantidades no cérebro humano. Esses receptores estão envolvidos em desordens neurológicas como a doença de Alzheimer, esquizofrenia, dor crônica e autismo, bem como no vício em nicotina. Neste contexto, o SBDD (structure-based drug design) é uma ferramenta poderosa para o desenvolvimento de novos candidatos à fármacos visando estes receptores. Neste trabalho, aplicou-se a metodologia dbCICA (docking-based comparative intermolecular contacts analysis) para a identificação das condições de ancoragem molecular ótimas para estes dois receptores. Em resumo, compostos bioativos atuando em cada um dos dois receptores foram coletados da literatura científica e ancorados nos receptores α4β2 e α7, explorando diferentes condições de ancoragem. Em seguida, os resultados foram pós-processados através da metodologia dbCICA, uma abordagem baseada em algoritmo genético, visando a identificação de contatos críticos para o reconhecimento molecular entre os ligantes ancorados e os resíduos do sítio ativo. Através dessa análise, foi possível determinar as condições ótimas de ancoragem para ambos os receptores trabalhados. Os contatos críticos identificados através do dbCICA estão em acordo com relatos da literatura sobre interações críticas dessa classe de receptores. As condições ideais de ancoragem para... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The nAChRs (nicotinic acetylcholine receptors) are pentameric ligand-gated ionic channels that respond to the endogenous neurotransmitter acetylcholine, with the α4β2 and α7 subtypes highly expressed in human brain. Those receptors are involved in many neurologic disorders such as Alzheimer's disease, Schizophrenia, chronic pain, autism, as well as in nicotine addiction. In this context, SBDD (structure-based drug design) is a powerful tool for designing novel drug candidates targeting those receptors. In this work, we applied dbCICA (docking-based comparative intermolecular contacts analysis) to identify optimal docking conditions for these two receptors. Briefly, bioactive compounds acting on each receptor were gathered from the scientific literature and docked into the binding sites of the α4β2 and α7, exploring different docking conditions. Then, the results were post-processed through dbCICA, a genetic algorithm based approach, aiming to identify critical contacts for molecular recognition involving the docked ligands and binding site residues. Through this analysis it was possible to determine the optimal docking conditions for both receptors. The critical contacts identified by dbCICA are in agreement with the literature about critical interactions from this class of receptors. The optimal docking conditions for receptor α4β2 were used to select 8 from 116 novel molecular fragments with potential biological activity towards this subtype, to be synthesized in future ste... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A vareniclina é uma substância química sintética utilizada para o tratamento de tabagismo; atua como agonista de receptores colinérgicos nicotínicos, em especial, como agonista parcial em receptores α4β2 e α3β4, e como agonista total do receptor α7. Levando em consideração que há uma tendência de ampliação do uso clínico da vareniclina para o tratamento da dependência à diversas substâncias de padrão abusivo e que há poucos estudos relacionados aos seus efeitos sobre o comportamento, cognição e sistema motor, tornam-se necessários mais estudos sobre essa substância. Assim, no presente trabalho foram estudados os efeitos da exposição prolongada (28 30 dias) de ratos à vareniclina, avaliando-se o consumo de água e de ração, o ganho de peso e o comportamento animal, por meio dos testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado, interação social, comportamento estereotipado, labirinto de Barnes e esquiva passiva. Ainda foram feitas as avaliações dos níveis de neurotransmissores e seus metabólitos em diferentes estruturas cerebrais, bem como avaliações hematológicas, bioquímicas séricas, urinárias e estudos anatomopatológicos e histopatológicos. Foram utilizadas três doses de vareniclina: 0,03 (dose terapêutica para o ser humano), 0,1 e 0,3 mg/kg, por via oral (gavagem). Os resultados mostraram que a exposição prolongada de ratos à diferentes doses de vareniclina não provocou toxicidade, uma vez que não houve alteração no consumo médio de água e de ração e no ganho de peso avaliados semanalmente. Quanto às avaliações comportamentais, observou-se leve aumento da atividade geral no campo aberto, bem como diminuição do tempo de interação social, não sendo capaz de alterar parâmetros neuroquímicos, hematológicos, bioquímicos séricos, urinários, anatomopatológicos e histopatológicos de ratos expostos à vareniclina. / Varenicline is a synthetic chemical used for the smoking addiction treatment; it acts as an agonist of nicotinic cholinergic receptors, in particular, as a partial agonist of receptors α4β2 and α3β4 and as a full agonist of the α7 receptor. More studies about this substance are necessary, given that its clinical use is increasingly being applied to the treatment of addiction to a variety of abusive drugs. Moreover, there are few studies on vareniciline effects on behavior, cognition and the motor system. Thus, in this study the effects of prolonged (28-30 days) exposure of rats to varenicline were evaluated. It was analyzed the water and food consumption, the weight gain and the animal behavior, through open field, elevated plus maze, social interaction, stereotyped behavior, Barnes maze and passive avoidance tests. The neurotransmitter levels and their metabolites in different brain structures were measured and hematological, serum biochemistry, urinary evaluations and pathological and histological studies were carried out. We used three doses of varenicline: 0.03 (therapeutic dose for humans), 0.1 and 0.3 mg/kg orally (gavage). The results showed that prolonged exposure of rats to different doses of varenicline did not cause toxicity, since there were no changes in average weekly consumption of water or food nor body weight gain, which were measured weekly. As for behavioral assessments, there was a slight increase in overall activity in the open field as well as decreased time of social interaction. Varenicline was not able to change neurochemical, hematological, serum biochemical, urinary, pathology and histopathology parameters of rats.

Orientador: Nailton Monteiro do Nascimento Júnior / Banca: Claudio Viegas Júnior / Banca: Adriano Defini Andricopulo / Resumo: Visando a obtenção de compostos inéditos com atividade agonista em receptores nicotínicos de acetilcolina do subtipo α7 (nAChRs α7) para o tratamento da doença de Alzheimer, este trabalho foi iniciado a partir da estrutura cristalográfica do receptor α7 co-cristalizado com a lobelina, seguido de posterior validação do modelo in silico por redocagem e com ligantes da literatura com atividades in vitro conhecidas. Os ligantes foram construídos considerando o estado de protonação em pH fisiológico utilizando o programa Discovery Studio Visualizer e otimizados através do método semiempírico PM7 com o programa MOPAC 2016. A validação por redocagem do modelo do nAChR α7 foi baseada na análise de diferentes funções de pontuação (ChemPLP, ChemScore, GoldScore e ASP) para avaliar a orientação espacial dos ligantes (RMSD) e as interações ligante-receptor relevantes. Discovery Studio foi utilizado para analisar as interações previstas, as quais foram obtidas no programa GOLD e visualizadas no programa PyMol. De todas as funções de pontuação analisadas, a ASP forneceu os melhores resultados, apresentando pequenas variações de pontuação entre a pose com menor RMSD e a pose com melhor pontuação. Além disso, o modelo in silico foi capaz de prever corretamente as interações-chave entre os resíduos de aminoácidos com os quais a lobelina interage e das moléculas da literatura. Dessa forma, essa metodologia foi utilizada na triagem virtual dos 28 compostos planejados como ligantes do nAChR α7, ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Aiming to achieve novel compounds with agonist activity at 7 nicotinic acetylcholine receptors (7 nAChRs) for the treatment of Alzheimer's disease, this work has started by using the crystallographic structure of 7 receptor co-crystallized with lobeline followed by validation of the in silico model with ligands from the literature with known in vitro activities. The ligands were constructed considering the protonation state at physiological pH using the Discovery Studio software and using the PM7 semiempiric method with MOPAC 2016. The validation for the nAChRα7 model was based on the analysis of several scoring functions (ChemPLP, ChemScore,GoldScore and ASP) for a spatial orientation of ligands (RMSD) and as relevant ligand-receptor interactions. Discovery Studio was used to analyze the expected interactions, performed in the GOLD software and viewed in the PyMol software. Of all the analyzed scoring functions, the ASP provided the best results, presenting small variations between the pose with lower RMSD and the pose with the best score. In addition, the in silico model was able to correctly predict the interactions between the amino acid residues with which lobelin interacts and the molecules of the literature. Thus, this methodology was applied in the virtual screening of the 28 nAChRα7 ligands, in combination with the molecular docking results of the bioactive compounds in the literature. In parallel, molecular dynamics studies were applied in order to optimize the ... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A vareniclina é uma substância química sintética utilizada para o tratamento de tabagismo; atua como agonista de receptores colinérgicos nicotínicos, em especial, como agonista parcial em receptores α4β2 e α3β4, e como agonista total do receptor α7. Levando em consideração que há uma tendência de ampliação do uso clínico da vareniclina para o tratamento da dependência à diversas substâncias de padrão abusivo e que há poucos estudos relacionados aos seus efeitos sobre o comportamento, cognição e sistema motor, tornam-se necessários mais estudos sobre essa substância. Assim, no presente trabalho foram estudados os efeitos da exposição prolongada (28 30 dias) de ratos à vareniclina, avaliando-se o consumo de água e de ração, o ganho de peso e o comportamento animal, por meio dos testes de campo aberto, labirinto em cruz elevado, interação social, comportamento estereotipado, labirinto de Barnes e esquiva passiva. Ainda foram feitas as avaliações dos níveis de neurotransmissores e seus metabólitos em diferentes estruturas cerebrais, bem como avaliações hematológicas, bioquímicas séricas, urinárias e estudos anatomopatológicos e histopatológicos. Foram utilizadas três doses de vareniclina: 0,03 (dose terapêutica para o ser humano), 0,1 e 0,3 mg/kg, por via oral (gavagem). Os resultados mostraram que a exposição prolongada de ratos à diferentes doses de vareniclina não provocou toxicidade, uma vez que não houve alteração no consumo médio de água e de ração e no ganho de peso avaliados semanalmente. Quanto às avaliações comportamentais, observou-se leve aumento da atividade geral no campo aberto, bem como diminuição do tempo de interação social, não sendo capaz de alterar parâmetros neuroquímicos, hematológicos, bioquímicos séricos, urinários, anatomopatológicos e histopatológicos de ratos expostos à vareniclina. / Varenicline is a synthetic chemical used for the smoking addiction treatment; it acts as an agonist of nicotinic cholinergic receptors, in particular, as a partial agonist of receptors α4β2 and α3β4 and as a full agonist of the α7 receptor. More studies about this substance are necessary, given that its clinical use is increasingly being applied to the treatment of addiction to a variety of abusive drugs. Moreover, there are few studies on vareniciline effects on behavior, cognition and the motor system. Thus, in this study the effects of prolonged (28-30 days) exposure of rats to varenicline were evaluated. It was analyzed the water and food consumption, the weight gain and the animal behavior, through open field, elevated plus maze, social interaction, stereotyped behavior, Barnes maze and passive avoidance tests. The neurotransmitter levels and their metabolites in different brain structures were measured and hematological, serum biochemistry, urinary evaluations and pathological and histological studies were carried out. We used three doses of varenicline: 0.03 (therapeutic dose for humans), 0.1 and 0.3 mg/kg orally (gavage). The results showed that prolonged exposure of rats to different doses of varenicline did not cause toxicity, since there were no changes in average weekly consumption of water or food nor body weight gain, which were measured weekly. As for behavioral assessments, there was a slight increase in overall activity in the open field as well as decreased time of social interaction. Varenicline was not able to change neurochemical, hematological, serum biochemical, urinary, pathology and histopathology parameters of rats.

En treballs anteriors del nostre grup de recerca es va demostrar que l’antagonista específic del receptor nicotínic α7, metillicaconitina (MLA), inhibia in vitro la producció d’espècies reactives d’oxigen (EROS) i protegia de la neurotoxicitat in vivo induïda per metamfetamina (METH) i per la 3,4-metilendioxi-N-metamfetamina (MDMA). En aquesta tesi, es descriu un nou mecanisme d’acció dels derivats amfetamínics. Mitjançant assajos de fixació de radiolligands, es va comprovar que ambdós derivats amfetamínics competien amb els radiolligands específics dels receptors nicotínics α7 ([3H]Metillicaconitina), i dels heteromèrics ([3H]Epibatidina), el que indicava que en les cèl•lules PC12, el nostre model experimental, i també en una preparació de cervell total de ratolí, aquestes substàncies interaccionaven directament amb els receptors nicotínics. L’MDMA mostrava més afinitat per ambdós subtipus de receptors. Està descrit que el tractament crònic amb nicotina provoca un augment en la densitat de receptors nicotínics tan in vivo com in vitro en cèl•lules PC12. Ambdós derivats amfetamínics van provocar una regulació a l’alça dels dos subtipus de receptors ja a les 6 hores de pretractament. A la vegada, in vivo, l’MDMA i la Nicotina van provocar la regulació a l’alça que va ser potenciada per la seva associació en determinades zones cerebrals on s’expressen cada subtipus de nAChR. De l’estudi dels mecanismes implicats en aquesta regulació a l’alça, mitjançant inhibidors a diferents nivells, es va concluir que, igual com passa amb la nicotina, es produeixen a nivell postraduccional. A nivell funcional, vam determinar que aquests derivats amfetamínics eren capaços d’activar els receptors nicotínics i, d’acord amb les hipòtesis de treballs anteriors, induir una entrada de calci i de sodi que podria estar implicada en els esdeveniments que comportarien la seva neurotoxicitat. Per una banda, l’MDMA i la METH es van comportar com agonistes parcials dels nAChR α7 induïnt un increment de Ca2+ citosòlic. Per altra banda, l’MDMA es va comportar com antagonista dels nAChR heteromèrics i la METH com agonista parcial induint l’entrada de Na+ de la mateixa manera, el qual explicaria diferències a nivell de dependència, ja que els nAChR α4β2 estan implicats en la via mesolímbica o de recompensa. Paral•lelament a l’increment de fixació de radiolligands, es va determinar que la preincubació amb MDMA indueix un increment en la resposta per activació de receptors nicotínics, demostrant que l’ MDMA també indueix regulació a l’alça funcional. Alhora, es va observar que la preincubació de les cèl•lules durant 24 hores amb MDMA dona lloc a un increment perllongat dels nivells basals de Ca2+, el qual indica que l’MDMA inhibeix la desensibilització dels receptors i fa que entri calci durant un temps més llarg. Aquesta entrada persistent podria estar implicada en fenòmens de neurotoxicitat ja que va seguida de l’activació de vies dependents de calci com la calpaïna i la caspasa-3. / During the last years, our emphasis has focused in the study of the neurotoxic effects of MDMA and methamphetamine (METH) on central nervous system and their pharmacological prevention. It has been demonstrated that these amphetamine derivatives produce oxygen species (ROS) in an in vitro model of synaptosomes. In previous works, we demonstrated that blockade of alpha7 nicotinic receptors with methyllycaconitine (MLA) prevented ROS production induced by MDMA and METH, consequently the alpha7 receptor would be involved in the neurotoxicity induced by these drugs. Studies at molecular level, using radioligand binding assays, showed the interaction of METH and MDMA with homomeric alpha7 nAChR and heteromeric subtypes of nicotinic receptors, such as aplha4 beta2. In addition, we investigated the effects of pretreatment with METH and MDMA on nAChR densities. We used PC 12 cells as an experimental model due to the fact other authors have similarly utilised them to evaluate the neurotoxicity of amphetamines. Moreover, they not only express nAChR, including the alpha7 subtype, but also provide an in vitro model for the up-regulation of nAChR, which occurs in vivo following chronic exposure to nicotine. In recent works, we demonstrated in vitro that Ca2+ chelation with EGTA prevented the production of reactive oxygen species (ROS) to a similar extent as nAChR blockade. This indicates that calcium influx, probably through alpha7 nAChR, is a key step in this process. Consequently, one of the objectives of this work was to use a fluorimetric method to investigate the effect of MDMA on Ca2+ and Na+ levels in cultured PC12 cells and the involvement of different nAChR subtypes and other cell pathways related to Ca2+ mobilization. In addition, we used electrophysiology in transfected Xenopus oocytes to corroborate the effects on alpha7 and alpha4 beta2 nAChR. Moreover, pretreatment with MDMA induced functional upregulation by potentiating the effects of specific nAChR agonists or whether it provoked a persistent Ca2+ increase, leading to calpain, caspase 3, NFκB, GSK-3 and Cyt C activation, which was involved in toxicity.

Introdução: A hiperidrose primária (HP) é uma desordem que afeta negativamente a qualidade de vida de seus portadores. A fisiopatologia da HP não é bem compreendida e acredita-se que uma complexa disfunção do sistema nervoso simpático esteja relacionada com sua etiologia. A ressecção de um ou mais gânglios da cadeia simpática torácica constitui-se como o método mais eficiente de controle da HP; apesar disso, pouco se sabe sobre o funcionamento dos gânglios simpáticos em indivíduos normais e em portadores de HP. Objetivos: Analisar a expressão de acetilcolina e das subunidades 3 e 7 de seu receptor nicotínico neuronal em gânglios da cadeia simpática torácica de portadores de HP palmar e comparar estes resultados com os obtidos de não portadores; avaliar se existe diferença de tamanho entre esses gânglios. Métodos: Estudo transversal, no qual foram analisados dois grupos de 20 participantes: no grupo Hiperidrose, portadores de HP palmar, candidatos a simpatectomia torácica; no grupo Controle, doadores falecidos de órgãos sem história prévia de sudorese excessiva. Em todos os indivíduos foram realizados: ressecção do 3º gânglio simpático esquerdo; aferição do maior diâmetro do gânglio; avaliação imunohistoquímica pela quantificação das áreas de expressão forte e fraca de anticorpos primários contra acetilcolina e contra as subunidades 3 e 7 de seu receptor nicotínico neuronal. Resultados: A mediana da idade dos participantes foi menor no grupo Hiperidrose em relação ao Controle; a proporção de homens e mulheres foi de 3:17 no grupo Hiperidrose e 9:11 no Controle. A expressão da subunidade 3 foi semelhante em ambos os grupos (p = 0,78 para expressão forte e p = 0,31 para expressão fraca). A área de expressão forte da subunidade 7 correspondeu a 4,85% da área total em portadores de HP e a 2,34% nos controles (p < 0,001), enquanto a área de expressão fraca foi de 11,48% no grupo Hiperidrose e de 4,59% no Controle (p < 0,001). Expressão forte da acetilcolina foi encontrada em 4,95% da área total no grupo Hiperidrose e 1,19% no Controle (p < 0,001); expressão fraca foi encontrada em 18,55% e 6,77%, respectivamente (p < 0,001). O diâmetro dos gânglios ressecados foi de 0,71cm no grupo Hiperidrose e de 0,53cm no Controle (p < 0,001). Conclusões: Existe um aumento da expressão de acetilcolina e da subunidade 7 do seu receptor nos gânglios simpáticos de portadores de HP; a subunidade 3 do receptor nicotínico de acetilcolina tem expressão semelhante em gânglios simpáticos de portadores de HP e de não portadores; gânglios da cadeia simpática torácica apresentam diâmetro maior em portadores de HP / Introduction: Primary hyperhidrosis (PH) is a disorder that impairs the quality of life of its bearers. The PH physiopathology is not well understood and a complex sympathetic nervous system dysfunction seems to be related with its etiology. The resection of one or more thoracic sympathetic chain ganglia is the most effective PH treatment; however sympathetic ganglia function in normal subjects and in PH patients is unknown. Objectives: Analyzing the immunohistochemical expression of acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 3 and 7 subunits in thoracic sympathetic ganglia of PH patients and compare the results with those obtained from subjects without this disorder; identifying possible differences in size of these ganglia. Methods: Cross-sectional study, in which two groups of 20 subjects were analyzed: the Hyperhidrosis group, with palmar PH patients eligible to thoracic sympathectomy and the Control group, with organ donators after brain death without hyperhidrosis historical. For each subject it were performed: resection of the third left sympathetic ganglion; measurement of the ganglions diameter; immunohistochemical evaluation by quantification of intense and mild expression areas of primary antibodies against acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 3 and 7 subunits. Results: The median of participants age was smaller in Hyperhidrosis group than in Control; the male/female ratio was 3:17 in Hyperhidrosis group and 9:11 in Control. The 3 subunit expression was similar in both groups (p = 0.78 for intense expression and p = 0.31 for mild expression). Intense 7 subunit expression area was 4.85% in PH patients and 2.34% in controls (p < 0.001) whereas mild expression area was 11.48% in Hyperhidrosis group and 4.59% in Control (p < 0.001). Intense acetylcholine expression was found in 4.95% of total area in Hyperhidrosis group and in 1.19% in Control (p < 0.001); mild expression was found in 18.55% and 6.77%, respectively (p < 0.001). Ganglia diameter was 0.71cm in Hyperhidrosis group and 0.53cm in Control (p < 0.001). Conclusions: There is a higher expression of acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 7 subunit in sympathetic ganglia of PH patients; the 3 subunit of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor shows similar expression in sympathetic ganglia of PH patients and subjects without this disorder; thoracic sympathetic chain ganglia diameter is bigger in PH patients

Orientador: Selma Maria Michelin Matheus / Banca: Maeli Dal Pai / Banca: Fausto Viterbo / Banca: Elaine Minatel / Banca: Carlos Eduardo Assumpção de Freitas / Resumo: A bupivacaina é um anestésico utilizado na prática médica e odontológica para bloqueio do nervo periférico e alívio da dor pré e pós-operatória devido à sua ação analgésica de longa duração. Suas principais limitações são a miotoxicidade, a neurotoxicidade e a inflamação. A laserterapia de baixa potência (LBP) tem sido utilizada para várias propostas terapêuticas, apresentando ação anti-inflamatória, regenerativa e analgésica. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do laser de Arseneto de Gálio (AsGa) sobre a morfologia das junções neuromusculares, fibras musculares e nervo associados ao músculo esternomastóideo de ratos após injeção de bupivacaina. 32 ratos Wistar machos adultos foram divididos em 2 grupos: Grupo Controle (C: n=16) e Grupo Laser (L: n= 16). Os grupos foram subdivididos seguindo os antímeros e substâncias injetadas: direito (bupivacaina 0,5%), esquerdo (Cloreto de sódio 0,9%). Após 24 horas houve aplicação de LBP (AsGa 904nm, 50mW, 4,8J) durante 5 dias consecutivos. A seguir, os animais foram eutanasiados, o sangue foi coletado para determinação da creatina kinase (CK); a porção superficial dos músculos esternomastóideos e os nervos associados foram dissecados, removidos e submetidos às seguintes análises: análise histopatológica e ultraestrutural; análises morfológica e morfométrica das JNMs (reação Esterase inespecífica), microscopia confocal de varredura a laser e análise ultraestrutural; e os nAChRs (alpha, beta e gama) e os níveis de TNF foram quanti... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Bupivacaine is an anesthetic used in medical and dental practice as a peripheral nerve block and for relief of pre and postoperative pain due to its long duration analgesic action. Its principle limitations are myotoxicity, neurotoxicity, and inflammation. Low-level laser therapy (LBP) has been used for various therapeutic approaches, presenting an anti-inflammatory, regenerative, and analgesic action. The aim of the study was to evaluate the effects of the Arsenide Gallium laser (GaAs) on the morphology of neuromuscular junctions, muscle fibers, and the nerve associated with the sternomastoid muscle of rats after injection with bupivacaine. In total, 32 adult male Wistar rats were divided into 2 groups: Control group (C: n = 16) and Laser Group (L: n = 16). The groups were subdivided according to the antimeres and injected substances: right (0.5% bupivacaine), left (sodium chloride 0.9%). Twenty-four hours after the injection, LBP was applied (GaAs 904nm, 50mW, 4.8J) for 5 consecutive days. Subsequently, the animals were euthanized; blood was collected for determination of creatine kinase (CK); the surface portion of the sternomastoid muscles and associated nerves were dissected, removed, and submitted to the following tests: histopathological and ultrastructural analysis; morphological and morphometric analysis of the JNMs (nonspecific esterase reaction), confocal laser scanning microscopy and ultrastructural analysis; and the nAChRs (alpha, beta, and gamma) and TNF levels were quantified by Western blotting; in addition, nerve morphometry and quantification of muscle CK were performed. No alterations were observed in the antimere which received the sodium chloride, with or without laser application. The muscles receiving bupivacaine presented higher levels of inflammation, atrophy and necrosis, and muscle CK values; a greater number of central nuclei and... (Complete abstract electronic access below) / Doutor

Introdução: A hiperidrose primária (HP) é uma desordem que afeta negativamente a qualidade de vida de seus portadores. A fisiopatologia da HP não é bem compreendida e acredita-se que uma complexa disfunção do sistema nervoso simpático esteja relacionada com sua etiologia. A ressecção de um ou mais gânglios da cadeia simpática torácica constitui-se como o método mais eficiente de controle da HP; apesar disso, pouco se sabe sobre o funcionamento dos gânglios simpáticos em indivíduos normais e em portadores de HP. Objetivos: Analisar a expressão de acetilcolina e das subunidades 3 e 7 de seu receptor nicotínico neuronal em gânglios da cadeia simpática torácica de portadores de HP palmar e comparar estes resultados com os obtidos de não portadores; avaliar se existe diferença de tamanho entre esses gânglios. Métodos: Estudo transversal, no qual foram analisados dois grupos de 20 participantes: no grupo Hiperidrose, portadores de HP palmar, candidatos a simpatectomia torácica; no grupo Controle, doadores falecidos de órgãos sem história prévia de sudorese excessiva. Em todos os indivíduos foram realizados: ressecção do 3º gânglio simpático esquerdo; aferição do maior diâmetro do gânglio; avaliação imunohistoquímica pela quantificação das áreas de expressão forte e fraca de anticorpos primários contra acetilcolina e contra as subunidades 3 e 7 de seu receptor nicotínico neuronal. Resultados: A mediana da idade dos participantes foi menor no grupo Hiperidrose em relação ao Controle; a proporção de homens e mulheres foi de 3:17 no grupo Hiperidrose e 9:11 no Controle. A expressão da subunidade 3 foi semelhante em ambos os grupos (p = 0,78 para expressão forte e p = 0,31 para expressão fraca). A área de expressão forte da subunidade 7 correspondeu a 4,85% da área total em portadores de HP e a 2,34% nos controles (p < 0,001), enquanto a área de expressão fraca foi de 11,48% no grupo Hiperidrose e de 4,59% no Controle (p < 0,001). Expressão forte da acetilcolina foi encontrada em 4,95% da área total no grupo Hiperidrose e 1,19% no Controle (p < 0,001); expressão fraca foi encontrada em 18,55% e 6,77%, respectivamente (p < 0,001). O diâmetro dos gânglios ressecados foi de 0,71cm no grupo Hiperidrose e de 0,53cm no Controle (p < 0,001). Conclusões: Existe um aumento da expressão de acetilcolina e da subunidade 7 do seu receptor nos gânglios simpáticos de portadores de HP; a subunidade 3 do receptor nicotínico de acetilcolina tem expressão semelhante em gânglios simpáticos de portadores de HP e de não portadores; gânglios da cadeia simpática torácica apresentam diâmetro maior em portadores de HP / Introduction: Primary hyperhidrosis (PH) is a disorder that impairs the quality of life of its bearers. The PH physiopathology is not well understood and a complex sympathetic nervous system dysfunction seems to be related with its etiology. The resection of one or more thoracic sympathetic chain ganglia is the most effective PH treatment; however sympathetic ganglia function in normal subjects and in PH patients is unknown. Objectives: Analyzing the immunohistochemical expression of acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 3 and 7 subunits in thoracic sympathetic ganglia of PH patients and compare the results with those obtained from subjects without this disorder; identifying possible differences in size of these ganglia. Methods: Cross-sectional study, in which two groups of 20 subjects were analyzed: the Hyperhidrosis group, with palmar PH patients eligible to thoracic sympathectomy and the Control group, with organ donators after brain death without hyperhidrosis historical. For each subject it were performed: resection of the third left sympathetic ganglion; measurement of the ganglions diameter; immunohistochemical evaluation by quantification of intense and mild expression areas of primary antibodies against acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 3 and 7 subunits. Results: The median of participants age was smaller in Hyperhidrosis group than in Control; the male/female ratio was 3:17 in Hyperhidrosis group and 9:11 in Control. The 3 subunit expression was similar in both groups (p = 0.78 for intense expression and p = 0.31 for mild expression). Intense 7 subunit expression area was 4.85% in PH patients and 2.34% in controls (p < 0.001) whereas mild expression area was 11.48% in Hyperhidrosis group and 4.59% in Control (p < 0.001). Intense acetylcholine expression was found in 4.95% of total area in Hyperhidrosis group and in 1.19% in Control (p < 0.001); mild expression was found in 18.55% and 6.77%, respectively (p < 0.001). Ganglia diameter was 0.71cm in Hyperhidrosis group and 0.53cm in Control (p < 0.001). Conclusions: There is a higher expression of acetylcholine and its neuronal nicotinic receptors 7 subunit in sympathetic ganglia of PH patients; the 3 subunit of the neuronal nicotinic acetylcholine receptor shows similar expression in sympathetic ganglia of PH patients and subjects without this disorder; thoracic sympathetic chain ganglia diameter is bigger in PH patients

Orientador: Léa Rodrigues Simioni / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-18T22:38:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moraes_DelkiaSeabrade_M.pdf: 1400052 bytes, checksum: a886434537e4c9307797b649e17cd63c (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Bothrops alcatraz é uma serpente do Arquipélago de Alcatrazes no litoral norte do estado de São Paulo, Brasil, recentemente descrita. Neste trabalho foram analisados os efeitos neuromusculares do veneno de B. alcatraz em preparações isoladas de biventer cervicis de pintainho (BC) e nervo frênico-diafragma de camundongo (NFD), sob estimulação elétrica indireta (0.1 Hz; 0.2 ms). Em preparações BC, o veneno causou bloqueio neuromuscular completo e irreversível nas concentrações de 10, 50 e 100 g/ml em 90 ± 2, 80 ± 1 e 50 ± 1 min, respectivamente (n = 6-9). Nestas mesmas concentrações, as respostas contraturantes evocadas pela adição exógena de ACh (110 mM) foram 27±10, 8±4 e 0%, respectivamente, e do KCl (20 mM) em 45±11, 24±6 e 39±7%, respectivamente. O veneno de B. alcatraz mostrou-se pouco ativo na preparação NFD de camundongo, pois mesmo ensaiado na concentração de 100 g/ml (n=4) causou apenas 30±4% de bloqueio neuromuscular após 120 min de incubação. Em preparações BC previamente curarizadas (d-Tc, 10 g/ml), seguida pela adição do veneno (10 g/ml), por 120 min de incubação, observou-se o retorno da resposta contrátil em 81±7% (n= 4), após sucessivas lavagens. O veneno de B. alcatraz exibiu baixa atividade fosfolipásica quando comparado ao veneno de Crotalus durissus terrificus (A425nm 0,06 ± 0,02 vs 0,2 ± 0,03; n = 4). A análise morfológica in vitro da preparação BC, mostrou, em ambas as concentrações de veneno analisadas (10 e 100 g/ml), dano musculares, sendo 18,1±1,5% e 24,7±6,6% (n= 5), respectivamente, quando comparadas ao controle (7,9±2,4%). Paralelamente também foi observado um aumento significativo na medida da liberação de CK, de 1441 ± 173 (10 g/ml) e 1797 ± 343 (100 g/ml) vs 282 ± 27 U/L da preparação controle, aos 120 min. O estudo sobre a neutralização do veneno pelo antiveneno botrópico comercial, mostrou que foram necessárias altas concentrações do antiveneno (15 vezes mais que o recomendado pelo fabricante) para neutralizar a ação do veneno de B. alcatraz (10 g/ml). Conclui-se que o veneno de B. alcatraz promove bloqueio neuromuscular total e irreversível em preparações de ave, por atuar inicialmente nos receptores colinérgicos e por causar efeito miotóxico tardio; todos estes efeitos foram neutralizados pelo antiveneno botrópico comercial dependendo da concentração de veneno utilizada / Abstract: Bothrops alcatraz is a recently described pitviper from the Alcatrazes Archipelago off the northern coast of São Paulo state, Brazil. The neuromuscular effects of B. alcatraz venom were examined in chick isolated biventer cervicis preparations. In indirectly stimulated preparations, venom (10, 50 and 100 g/ml, n=6-9) caused progressive, irreversible neuromuscular blockade that was complete in 90±2, 80±1 and 50±1 min (mean±SEM), respectively. Venom (10 and 100 g/ml) also inhibited contractures to exogenous ACh (110 ?M) (by 73% and 100%, respectively), but only partially inhibited contractures to KCl (20 mM) (by 55% and 61%, respectively). These same venom concentrations increased the proportion of damaged fibers from 7.9±2.4% (saline control) to 18.1±1.5% and 24.7±6.6%, respectively (p<0.05) and increase in the activity of CK release (1441 ± 173 and 1797 ± 343 vs 282 ± 27 U/L respectively). Bothrops alcatraz venom had low PLA2 activity compared to South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom (A425nm 0.06±0.02 vs 0.2±0.03; n=4). Pretreating the preparations with d-tubucurarine (10 g/ml) prevented the neuromuscular blockade. Commercial bothropic antiserum effectively neutralized the neuromuscular action of B. alcatraz venom. In conclusion, B. alcatraz venom causes neuromuscular blockade by interfering with cholinergic receptors but is only mildly myotoxic. Commercial antivenom neutralizes the neuromuscular blockade / Mestrado / Mestre em Farmacologia