Considerando os diversos efeitos adversos que a matéria particulada (MP) atmosférica e os contaminantes químicos ambientais causam aos ecossistemas e à saúde humana, o presente estudo procurou avaliar, o potencial mutagênico e recombinogênico de (i) extratos orgânicos de MP10, com diâmetro <10Xm e de particulados totais em suspensão (PTS), coletados na região metropolitana de Canoas nos meses de Novembro de 2003 (primavera) e Janeiro de 2004 (verão) — que sofre a influência de diversas indústrias e principalmente do intenso tráfego veicular da BR 116 e (ii) quatro nitro-derivados de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (NHAPs), ambientalmente importantes — 1-Nitronaftaleno (1NN), 1,5-Dinitronaftaleno (1,5DNN), 9-Nitroantraceno (9NA) e 2-Nitrofluoreno (2NF). Para tanto foi empregado o Teste para Detecção de Mutação e Recombinação Somática (SMART) em Drosophila melanogaster, que permite a detecção simultânea de mutação gênica e cromossômica, assim como de eventos relacionados com recombinação mitótica — possibilitando quantificar a contribuição deste último parâmetro genético para a genotoxicidade total dos contaminantes. No que se refere à MP não foram observados resultados positivos na coleta de verão no cruzamento padrão, embora nas amostras da primavera tenham sido obtidos dois resultados positivos, referentes às amostras cruas (100%) de MP10 e de PTS. Entretanto, enquanto as genotoxinas presentes na MP10 induziram exclusivamente recombinação homóloga, as amostras de PTS apresentaram aproximadamente 62% de ação recombinacional e 38% de atividade mutacional, gênica e/ou cromossômica. Esta resposta genotóxica diferencial pode ser relacionada a diferenças na composição dos contaminantes presentes nestas duas frações de partículas aéreas. Adicionalmente no cruzamento aprimorado as amostras coletadas na primavera — MP10 e PTS — induziram aumentos significativos na freqüência de clones mutantes nas doses de 50 e 100% — que são induzidos exclusivamente por recombinação mitótica e estão relacionadas à presença de genotoxinas geradas no processo de metabolização via citocromo P450. Na coleta de verão foi diagnosticado um resultado positivo para o 100% de MP10, que não foi detectado no cruzamento padrão para esta mesma estação, indicando que os altos níveis de enzimas de metabolização, característicos deste cruzamento, funcionaram como mecanismo de ativação das genotoxinas presentes na fração orgânica das partículas inaláveis. Os resultados obtidos para os nitrocompostos apontaram para efeitos positivos no genótipo trans-heterozigoto para os quatro NHAPs avaliados, produzindo aumentos estatisticamente significativos na freqüência total de manchas, que representa a genotoxicidade total da amostra. Nos indivíduos heterozigotos para o cromossomo balanceador TM3, apenas o 1,5DNN induziu aumentos significativos no total de manchas — indicando que além da ação recombinacional o 1,5DNN também induz mutação. Nos demais compostos — 1NN, 9NA e 2NF — a ausência de diferenças significantes em relação aos controles negativos no genótipo heterozigoto para o cromossomo TM3 é indicativo de que a ação tóxico-genética destes NHAPs deve-se basicamente à indução de recombinação mitótica entre cromossomos homólogos. O 1NN foi o composto com a maior potência genotóxica, induzindo cerca de 10 clones /105 células/ mM — seguido pelo 9NA. Observa-se também que o 1NN é cerca de 333 vezes mais genotóxico que os compostos igualmente menos potentes — 1,5DNN e 2NF. Esta diferença em termos de potência genotóxica pode ser correlacionada à presença de um grupo nitro no 1NN e de dois grupos nitro no seu correspondente 1,5 DNN — sugerindo que o primeiro é provavelmente mais acessível à transformação metabólica do que o segundo. Todas estas observações validam as investigações voltadas para a caracterização dos extratos orgânicos e dos contaminantes ambientais quanto a sua ação como indutores de recombinação homóloga (RH) in vivo. A RH é um evento associado a diferentes etapas do processo de tumorigênese, e a poluição aérea é responsável por ~10,7% dos casos de câncer de pulmão e ~1% de outros tipos de câncer — o que torna a avaliação da indução de RH fundamental para a obtenção de dados referentes ao risco genético imposto por contaminantes ambientais. / Considering the several adverse effects of atmospheric particulate matter (PM) and of the environment chemical contaminants on the ecosystems and human health, the present study aimed to assess the mutagenic and recombinagenic potential of PM10 organic extracts measuring less than 10 μm and of total suspended particulates (TSP) collected in the Greater Canoas region, in November 2003 (spring) and January 2004 (summer). The region is under the influence of diverse industrial activities and most specially of intense motor vehicle traffic from BR116. This study also investigated four nitropolycyclic aromatic hydrocarbons (NPAHs) of environmental relevance: 1- Nitronaphthalene (1NN); 1,5-Dinitronaphthalene (1,5DNN); 9-Nitroanthracene (9NA); and 2-Nitrofluorene (2NF). The Somatic Mutation and Recombination Test (SMART) in Drosophila melanogaster was used. The assay allows the simultaneous detection of gene and chromosome mutations, as well as of events related to mitotic recombination, which affords to quantify the contribution of this last genetic parameter to total genotoxicity of contaminants. As regards PM, no positive results were observed in the standard cross for the summer collection, although the spring samples generated two positive results for the raw (100%) PM10 and TSP samples. Nevertheless, while the genotoxins present in PM10 induced only homologous recombination, the TSP samples presented roughly 62% of recombinational activity and 38% of gene and/or chromosome mutation activity. This distinct genotoxic response may be related to the different composition of contaminants present in these two fractions of airborne particles. Additionally, the spring samples — PM10 and TSP, at the 50 and 100% doses — induced significant increases in mutant clone frequency in the high-bioactivation cross. These mutant clones are induced exclusively by mitotic recombination and are related to the presence of genotoxins produced in the cytochrome P450 metabolization process. For the summer samples, positive results were recorded for 100% of PM10, which was not detected in the standard cross for the same season, which suggests that the high levels of metabolization enzymes, typical of this cross, For the summer samples, positive results were recorded for 100% of PM10, which was not detected in the standard cross for the same season, which suggests that the high levels of metabolization enzymes, typical of this cross, work as an activation mechanism for genotoxins present in the organic fraction of inhalable particles. The results obtained for the nitrocompounds point to the positive effects on the trans-heterozygous for the four NPAHs assessed, which produced statistically significant increases in total spot frequencies, representing the total genotoxicity of the sample. Concerning the balancer chromosome TM3, only 1,5DNN induced significant increases in total spot frequencies in heterozygous individuals, which also indicated that apart from the recombinational action, 1,5DNN also induces mutation. For the other compounds, 1NN, 9NA, and 2NF, the absence of significant differences in comparison to the negative controls in the heterozygote genotype for chromosome TM3 indicates that the genotoxic action of these NPAHs is essentially due to the mitotic recombination between homologous chromosomes. 1NN was the compound with the highest genotoxic potential, inducing approximately 10 clones /105 cells/ mM, followed by 9NA. It was also observed that 1NN is roughly 333 times more genotoxic than the equally less potent compounds — 1,5DNN and 2NF. This difference, in terms of genotoxic potential, may be related to the presence of one nitro group in 1NN and to two nitro groups in its counterpart, 1,5DNN. This suggests that the former is probably more susceptible to metabolic transformation than the latter. All these observations validate the investigations directed towards the characterization of organic extracts and of the environmental contaminants as regards their action as inducers of in vivo homologous recombination (HR). HR is an event associated to the different stages of tumorigenesis, and airborne pollution is accountable for ~10.7% of lung cancer cases and ~1% of other types of cancer — which makes the evaluation of HR essential to obtain data of the genetic risk posed by environmental contaminants.

No começo do século XX, Wolfgang Köhler descreveu uma forma súbita de resolução de problemas, diferente da tentativa-e-erro, e chamou-a de insight. Para estudar essa forma de resolução, Epstein et al. (1984) elaboraram um teste de deslocamento de caixa, utilizando pombos como sujeitos. Nesse estudo, somente os pombos que aprenderam separadamente todos os comportamentos requisito conseguiram recombinar esses comportamentos e resolver a tarefa. Em estudos posteriores, foram utilizados ratos como sujeitos na mesma tarefa. Estes, porém, não puderam resolvê-la de forma súbita, direta e contínua. Portanto, o objetivo deste trabalho é desenvolver e avaliar um novo procedimento de deslocamento de caixa, que permita observar a resolução de problemas por recombinação de comportamentos aprendidos separadamente em roedores de pequeno porte, com topografia de resolução direta e contínua. Para isso, realizou-se uma adaptação do procedimento de deslocamento de caixas de Epstein et al. (1984), na qual utilizaram-se cereais açucarados como reforçadores para ensinar separadamente dois comportamentos aos ratos (n=2): empurrar um cubo de acrílico em direção a uma divisória iluminada, e subir no cubo e em uma plataforma. Em seguida, foi realizado um teste, no qual o cubo estava distante da plataforma e, para conseguir um pedaço de cereal açucarado, os ratos precisariam empurrá-lo até junto à plataforma, subir nele e em seguida na plataforma. Ambos puderam resolver o problema em uma topografia satisfatória para os critérios de insight. Um segundo teste foi realizado somente com um dos ratos, a fim de identificar qual estímulo controlava o comportamento do animal: a plataforma (objeto), ou sua localização (posição). O resultado desse teste revelou que a posição da plataforma controlava o desempenho do animal na tarefa. Por conta disso, foi então realizada mais uma fase de treino, que considerou a posição da plataforma como variável a ser controlada, e ambos os ratos foram expostos novamente ao problema. O resultado demonstrou que o re-treino foi efetivo em estabelecer controle da plataforma (objeto) sobre o desempenho do rato na tarefa, e verificou-se uma nova resolução do problema satisfatória para os critérios de insight. Concluiu-se que o procedimento adotado possibilitou e favoreceu a recombinação de comportamentos com topografia direta e contínua / In the beginning of the 20th century, Wolfgang Köhler described a new sudden way to solve problems, different from try-and-error. He called it insight. To study this new way of problem solving, Epstein et al. (1984) proposed a box displacement test with pigeons as subjects. In this study, only pigeons that separately learned all required behaviors could recombine these behaviors and solve the task. However, in later studies, rats were used as subjects in the same task, and they could not solve the task in a sudden, direct and continuous way. Therefore, the aim of this work is to develop and evaluate a new procedure of box displacement that allows the observation of problem resolution by recombination of behaviors learned separately in small rodents, with a direct and continuous resolution topography. To that end, an adaptation of Epstein et al. (1984) study\'s procedure was carried out, in which two repertoires were taught separately to the rats (n = 2) with sugary cereals as reinforcement: pushing an acrylic cube to an illuminated section; and climbing on the cube and on a platform. After teaching these behaviors, a test was carried out, in which the cube was far from the platform and, to get a piece of sugary cereal, the rats had to push the cube onto platform, climb on it and then on the platform. The test results showed that both rats could solve the problem in a satisfactory topography for insight criteria. A second test was performed with only one of the rats to identify which stimulus controlled the behavior of the animal: the platform (object) or its location (position). The results of this test revealed that the position of the platform controlled the performance of the animal in the task. Hence, a further training phase was carried out, which considered the position of the platform as a variable to be controlled, and both rats were exposed again to the problem. The results showed that the re-training was effective in establishing control of the platform (object) on the performance of the rats, and a new resolution of the problem was satisfactory for the insight criteria. Based on the results, it is possible to conclude that the procedure adopted allowed and favored the recombination of behaviors with direct and continuous topography

O P3HB é um tipo de poliéster sintetizado por bactérias como reserva de carbono e energia, e mobilizado na escassez destes. Um estudo com mutantes de Burkholderia sacchari, indicou o envolvimento de PhaZa1 e LonA na mobilização de P3HB. Este estudo avaliou o papel de PhaZa1 e LonA neste processo. A complementação heteróloga dos mutantes de B. sacchari, a partir dos genes phaZa1 e lonA de Ralstonia eutropha, restabeleceu a capacidade de mobilização dessas cepas, confirmando o envolvimento de seus produtos no processo. A partir de cepas recombinantes de Escherichia coli, abrigando tanto os genes de acúmulo de P3HB como de mobilização de R. eutropha, obteve-se cepas abrigando os genes phaZa1 e lonA isoladamente e outra abrigando os dois genes simultaneamente. Quando separados, tanto phaZa1 quanto lonA, não apresentaram papel significante na mobilização porém, quando os dois genes são expressos simultaneamente, as taxas de mobilização atingem mais de 50%, indicando que deva ter uma interação entre PhaZa1 e LonA para que o processo de mobilização seja efetivo. / The P3HB is a type of polyester synthesized by bacteria like carbon and energy source, and is mobilizated when there is a shortage of these. A study with mutants of Burkholderia sacchari, showed the involvement of PhaZa1 and LonA in mobilization of P3HB. The present study evaluated the role of PhaZa1 and LonA in this process. The heterologous complementation of mutants of B. sacchari, with phaZa1 and lonA genes from Ralstonia eutropha, reestablished the mobilization capacity in these strains, confirming the involvement of their products in this process. From the recombinant strain of Escherichia coli, harboring accumulation and mobilization genes from R. eutropha, we obtained strains harboring phaZa1 and lonA genes singly and another harboring both genes simultaneously. When expressed singly, both phaZa1 as lonA, had no significant role in mobilization but, when both genes were expressed simultaneously, the rates of mobilization reached more than 50%, appointing that an interaction must occur between PhaZa1 and LonA for the mobilization process to be effective.

O cão é um animal que, após dezenas de milhares de anos, está ecologicamente adaptado à vida na sociedade humana. Dessa maneira, desempenha diversos papéis na sociedade e sua cognição e comportamentos têm sido do interesse de pesquisas experimentais. Pesquisas com o objetivo de descrever o desempenho de resolução de problemas com cães, geralmente, têm buscado por processos cognitivos comuns entre esse animal e o humano. Contudo, os experimentos de resolução de problemas não expuseram cães às condições dos experimentos clássicos da psicologia com a tarefa de deslocamento de caixa. O presente estudo teve como objetivo observar o desempenho de cães em dois experimentos de resolução de problemas. No primeiro experimento foi disponibilizada para o cão uma placa branca e uma caixa no ambiente experimental. A resolução do problema se daria acaso o cão emitisse as classes operantes de empurrar a caixa em direção à placa branca, parar de empurrar debaixo desta, subir na caixa e tocar com o focinho na placa branca. No segundo experimento foi disponibilizado um pedaço de alimento dependurado e uma caixa no ambiente experimental. A satisfatória resolução do problema compreenderia a emissão das classes operantes de empurrar a caixa em direção ao pedaço de alimento, parando-a por debaixo do alimento, subindo e pegando o alimento. Os cães dos dois experimentos foram expostos a um pré-teste com essas duas situações problema configuradas, uma situação para cada participante em cada experimento. Após foram treinados a emitir as duas classes operantes pré-requisito. A primeira foi a classe operante de empurrar a caixa em direção a um estímulo monocromático. A segunda foi subir na caixa, fixa no chão, e tocar com o focinho em uma placa branca, Experimento 1; subir na caixa, fixada no chão, e pegar o pedaço de alimento, Experimento 2. Ambos os participantes solucionaram as situações problema apresentando um desempenho súbito e direcionado, característico do insight. CPB, Experimento 1, solucionou a situação problema empurrando a caixa em direção à placa branca, o fez na primeira tentativa do teste de resolução que a caixa esteve presente na posição do treino, assim, após iniciada a tentativa e o cão tocar a primeira vez na caixa, a empurrou em direção à placa branca, parou de empurrar debaixo desta, ajeitou a caixa com a pata e 30 segundos depois de iniciar a classe operante de empurrar, subiu na caixa e tocou com o focinho na placa branca. O participante CAL, Experimento 2, também solucionou a situação problema no teste de resolução, assim, engajou-se na classe operante de empurrar em direção à vasilha contendo o pedaço de alimento, parou de empurrar debaixo desta, subiu e pegou o alimento, essa resolução transcorreu em 4 segundos após iniciar a classe operante de empurrar / After tens of thousands years, dogs are ecologically adapted to human societies. This species has a diversity of roles in human societies and their cognition and behavior are of interest in experimental research. Common cognitive processes between humans and dogs are the objective on most problem solving researchs with this participants. However, problem solving research did not observed the behavior of this species on the box displacement task. The objective of this work was to observe the performance of two dogs at two diferente experiments with problem situations. On the first one a white board and a box were available. The problem solving occurred if the dog pushed the box toward the white board, stop pusing below it, climbed at the box and snout poked the board. On the second one, food was suspended and a box was available at the experimental environment. The readily problem solving comprehend pushing the box toward the food, stop pushing below it, climbing at the box and grabbing the food. Each dog was subject to a problem situation pre-test. After, they were trained on two prerequisite operant classes. To push a box toward a monochromatic stimuli and to climb on the box. For one dog, Experiment 1, this second operant class was to climb the box and snout poke a white board, for the other one, Experiment 2, was to climb the box and grab the food. Both dogs solved the problem situations in a sudden and directedness behavior, insight like performance. CPB, Experiment 1, solved the problem situation by pushing the box toward the white board, did so on the first attempt in the recombination test with the box on the training position, on this attempt, the dog pushed the box toward the white board, stop pushing below it, straightened the box using his paw and climbed the box and poked the white board, the whole operant recombination lasted 30 seconds. CAL, Experiment 2, resolved the problem situation by pushing the box toward the food, climbed on it and grabbed the food, the whole operant recombination lasted 4 seconds

Através da análise de microssatélites e SNPs, incluindo tanto marcadores neutros como sujeitos a seleção, neste trabalho se demonstrou que: 1) As populações brasileiras de P. vivax (Pv) são mais diversas que as populações simpátricas de P. falciparum (Pf), porém ambas apresentam desequilíbrio de ligação. 2) Os polimorfismos neutros apresentam alta variabilidade ao longo do tempo em ambas as espécies, em contraste com a estabilidade observada nos marcadores sob seleção. 3) As altas taxas de recorrências por Pv na Amazônia brasileira são causadas, em sua maioria, por parasitas geneticamente não relacionados. 4) A recombinação não meiótica contribui substancialmente à diversidade dos domínios repetitivos de PvCSP. 5) Os SNPs nos genes pvmdr1 e pvcrt-o de isolados de Pv resistentes à cloroquina não se associam ao seu fenótipo in vivo. Finalmente, através da genotipagem de 57 SNPs do cromossomo 8 de Pv em 234 isolados do Brasil e da Ásia observou-se que, em Pv, a diversidade e a recombinação mitótica não se associam aos níveis de endemicidade como acontece em Pf e que Pv apresenta estrutura populacional continental e subcontinental no Brasil. / Through the analysis of microsatellites and SNPs, including both neutral and under selection markers, this work showed that: 1) The Brazilian populations of P. vivax (Pv) are more diverse than sympatric P. falciparum (Pf) populations, but both exhibit linkage disequilibrium. 2) For both species, neutral polymorphisms showed high variability over time, contrasting with the stability of under markers under selection. 3) The high rate of Pv recurrences in the Brazilian Amazon region is mostly due to genetically unrelated parasites. 4) Non-meiotic recombination substantially contributes to PvCSP repetitive domain diversity. 5) SNPs at pvmdr1 and pvcrt-o genes of chloroquine resistant isolates of Pv are not associated with the in vivo phenotype. Finally, 57 SNP genotyping of chromosome 8 of Pv among 234 isolates from Brazil and Asia showed that, in Pv, diversity and mitotic recombination are not associated with levels of endemicity as in Pf and that Pv presents continental population structure and subcontinental structure in Brazil.

A doença de Chagas é uma doença causada pelo protozoário parasita Trypanosoma cruzi, que afeta cerca de 10 milhões de pessoas, principalmente nas Américas. O T. cruzi utiliza aminoácidos como importante fonte de energia e em vários processos biológicos como diferenciação, resistência a condições de estresse e invasão de células hospedeiras. A serina está envolvida em muitas vias biosintéticas. Uma das funções relevantes da serina é a formação de compostos C1 para a biossíntese de nucleotídeos. O uso de serina para esse fim é iniciado pela Serina Hidroximetiltransferase, cuja atividade foi detectada em T. cruzi, mas seu papel na biologia do parasita permanece pouco explorado. Neste trabalho, identificamos um gene que codifica uma Serina Hidroximetiltransferase putativa com dupla localização (citoplasmática e mitocondrial). Por recombinação homóloga, obtemos parasitas knockouts heterozigotos nos quais um alelo de SHMT foi substituído pelo gene da neomicina fosfotransferase. Os parasitas knockouts não mostraram diferenças na taxa de crescimento das formas epimastigotas ou na metaciclogênese in vitro. Porém, os parasitas knockouts mostraram uma diminuição significativa tanto no índice de infecção como no número de tripomastigotas liberados de células CHO-K1 infectadas com formas metacíclicas knockout. / Chagas disease is a disorder caused by the protozoa parasite Trypanosoma cruzi, which affects about 10 million people, mainly in the Americas. T. cruzi uses amino acids as an important energy source and in several biological processes such as differentiation, resistance to stress conditions and in the host-cell invasion. Serine is involved in many biosynthetic pathways. One of the relevant functions of serine is the formation of C1 compounds for the biosynthesis of nucleotides. The use of serine for that purpose is initiated by Serine Hydroxymethyltransferase, whose activity was detected in T. cruzi but its role in the biology of parasite remains poorly explored. In this work we identified a putative gene encoding a SHMT with dual localization, cytoplasmic and mitochondrial. We generated a single knockout cell line by homologous recombination in which one allele of SHMT was replaced by the neomycin phosphotransferase gene. Knockout parasites showed no difference in epimastigote growth rate or in in vitro metacyclogenesis. However, knockout parasites showed a significant decrease in both, infection index and in the number of trypomastigotes released from CHO-K1cells infected with knockout metacyclic forms.

Entre cepas diferentes de P. falciparum existe uma grande variação entre as sequências das famílias de genes variantes. Um motivo para esta grande variedade é o fato que a maioria dos genes variantes se encontra em regiões subteloméricas e que o parasita é capaz de recombinar telômeros heterólogos durante a meiose (recombinação ectópica), levando a uma nova distribuição e a criação de novos genes variantes. Além desse fenômeno que ocorre durante a fase sexual do parasita, foi considerado que recombinações também podem ocorrer durante a fase mitótica na fase assexuada sanguínea. Neste estudo, procuramos monitorar a importância desta recombinação ectópica na geração de novos genes var em amostras de campo da Amazônia brasileira. Em experimentos paralelos elucidamos se existe recombinação ectópica também durante divisões puramente mitóticas. Observamos que muitos genes var que são compartilhados entre isolados mudam raramente ou não mudam de posição cromossômica. Observamos que no caso de mudança de posição cromossômica muitas vezes ocorreu duplicação do lócus. Muitos dos genes var compartilhados se encontraram em cromossomos 5-6 e 9-7. Por monitoramento de clones de 3D7 após 180 gerações não observamos nenhuma translocação de genes var subtelomérico ou telomérico indicando que a recombinação ectópica em mitoses é de fato um evento raro. / Different strains of the causative agent of malaria, Plasmodium falciparum, possess greatly varying repertoires of variant antigen encoding gene families. One reason for this variety lies in the fact that most of the variant gene families are found in subtelomeric regions. The parasite is able to recombine heterologous telomers during meiosis through a process coined ectopic recombination, potentially leading to a new distribution and creation of variant genes. Due to morphological similarities of chromosome end clustering in sexual as well as in asexual forms, it was hypothesized that ectopic recombination may also occur in mitotic asexual blood stage parasites. Herein we monitor the occurrence of ectopic recombination in field samples from the Brazilian Amazon. In parallel, we elucidated whether ectopic recombination also takes place in purely mitotic divisions. We observed that many var genes which are shared among isolates rarely change their chromosomal position. When a change occurred, we often observed chromosomal locus duplication and many of the shared genes were found on chromosomes 5-9 or 5-10. After outgrowth of the 3D7 strain for 200 generations with intermittent cloning we did not observe any translocation of telomeric or subtelomeric var genes, indicating that ectopic recombination in mitosis is a rare event.

Juntamente com o processo de mutação, a recombinação intragênica, vista como a troca recíproca de material genético entre genomas, é um dos principais fatores geradores da diversidade genética. De fato, os diversos mecanismos de recombinação existentes na natureza (sexo, por exemplo) são freqüentemente citados como invenções do processo de evolução via seleção natural para combater o efeito acumulativo de mutações deletéria, responsável pelo decréscimo gradual, mas contínuo, da adaptação (fitness) média de populações assexuadas de tamanho finito, num processo conhecido como catraca de Muller. Nesta dissertação, investigamos, através de simulações numéricas, como os mecanismos de recombinação afetam a velocidade da catraca de Muller em situações em que o efeito das mutações é multiplicativo, ou seja, o efeito deletério de uma nova mutação em um indivíduo independe das mutações anteriores. Trabalhamos com indivíduos haplóides de L genes que se reproduzem sexuadamente e estão sob a ação da seleção. Investigamos analiticamente o caso limite de população infinita e L = 2 genes, em que a catraca não atua. Para o caso específico de L = 1 onde, por construção, a recombinação não ocorre, derivamos a solução analítica da dinâmica evolutiva para qualquer tempo. De uma maneira geral, verificamos que a velocidade da catraca é retardada pelo acréscimo da taxa de recombinação. Em alguns dos casos estudados, essa velocidade tende a ser nula, indicando que o sexo pode evitar que populações sujeitas à ação de mutações deletérias sejam extintas. Nossos resultados numéricos também mostram que, como esperado, a movimentação da catraca tende a diminuir à medida que o tamanho da população aumenta. / Together with the mutation process, the intragenic recombination, viewed as the reciprocal exchange of genetic material between genomes, is one of the main factors responsible for genetic diversity. Indeed, the mechanisms of recombination existing in nature (e.g., sex) are frequently cited as inventions of the evolution process via natural selection to avoid the cumulative effect of deleterious mutations, responsible for the gradual but continuous decline in mean fitness of finite asexual populations, in a process known as Muller\'s ratchet. In this dissertation, we investigate, through numerical simulations, how the recombination mechanisms affect the rate of Muller\'s ratchet in situations in which the effect of mutations is multiplicative, that is, the deleterious effect of a new mutation in an individual does not depend on the mutations it already carries. We work with haploid individuals of L genes which reproduce sexually and are under the effect of selection and recombination. We analytically investigate the limit case of infinite population and L = 2 genes, where the ratchet does not operate. For the specific case in which L = 1 where, by construction, recombination doesn\'t occur, we derive the analytical solution of the evolution dynamics for any time. In general, we verify that the ratchet \'s rate is retarded by the increase in the recombination rate. In some of the cases we studied, this rate tends to be null, indicating that sex may provide means to avoid extinction of populations subjected to the action of deleterious mutations. Our numerical results also show, as expected, that the ratchet\'s rate tends to slow down according to the increase in population size.

A inserção de DNA exógeno no genoma hospedeiro é conseguida principalmente através da utilização de vias de reparo como a junção de pontas não homólogas, que possui caráter aleatório, e a recombinação homóloga, que possibilita o gene targeting. Algumas ferramentas como as TAL Effector Nucleases (TALENs) e o RNA interferência (RNAi) podem ser utilizadas para aumentar a taxa de integração específica e assim melhorar a eficiência e o direcionamento da edição gênica. Nesse trabalho utilizamos o silenciamento gênico mediano por short interference RNA (siRNA) para inibição temporária dos genes ATF7IP uma metiltrasferase, EP300 uma acetiltransferase e KU70 (NHEJ) e um par de TALENs complementares a uma região do gene da distrofina canina. Células Caninas MDCK I foram transfectadas por lipofectamina 2000 (Invitrogen) com 320pmol de siRNAs para ATF7IP e Ep300; e 64 pmol do SiRNA para KU70 em diferentes grupos, 40 horas depois as células foram transfectadas com 15 &mu;g vetor molde derivado do pEGFP-N1 (Clonatech) e com 10 &mu;g dos RNAm das TALENs. A seleção se deu em meio DMEM high com 600&mu;g/ mL de G418 (Lonza) por 14-16 dias. As colônias coletadas através de biópsias foram analisadas por Polimerase Chain Reaction e sequenciamento gênico. Três pares de primers foram utilizados; um controle endógeno (GAPDH), um controle interno do inserto (Neo qPCR) e um para confirmação da recombinação homóloga (DMD3). Os grupos apresentaram grande variação na taxa de mortalidade celular e consequentemente no número de colônias: Com o grupo ATF7IP+Vetor (648c) apresentando maior número de colônias e o grupo EP300+Ku70+Vetor+TALENs o menor (1c). A maior taxa de recombinação ocorreu nos grupos no grupo ATF7IP +Ku70+Vetor+TALENs com 40% das células positivas para neomicina apresentado o evento gene targeting, um aumento considerável na taxa de recombinação quando comparada a porcentagem de 3,1% do controle transfectado somente com o vetor molde. Mostrando que o uso conjunto das TALENs com siRNAs foi um sucesso para o aumento de eventos de edição gênica direcionada. / The insertion of exogenous DNA into a host genome is achieved primarily through the use of DNA repair pathways such as Non-Homologous End Joining (NHEJ) and the Homologous Recombination (HR). The integration by NHEJ has a random feature and is much more common than HR insertions, which are more likely to produce gene targeting events . TAL effector nucleases (TALENs) and RNA interference (RNAi) can be used to increase the rate of specific integration and thus improving the efficiency of gene editing. In this work, we used short interference RNA (siRNA)-mediated gene silencing for transient inhibition of genes ATF7IP (implicated in histone methylation), EP300 (acetyltransferase) and Ku70 (essential to NHEJ) and a pair of TALENs RNAm complementary to canine muscle dystrophin (DMD) gene. MDCK I Canine Cells were transfected by lipofectamine 2000 (Invitrogen) with 320 pmol of siRNAs for ATF7IP and EP300; and 64 pmol of siRNA for Ku70 in different groups. After 40 hours cells were transfected with 15 &mu;g of a vector derived from pEGFP- N1 (Clontech) containing two regions homologous to the canine DMD gene (left arm length: 873 bp and right arm length: 1370 bp) and 10 &mu;g of TALEN mRNA. The cell selection was achieved with DMEM high glucose with 600&mu;g/ml G418 for 14-16 days. The colonies collected through biopsies were analyzed by polymerase chain reaction and gene sequencing. Three pairs of primers were used; an endogenous control (GAPDH) , an internal control of the insert (Neo qPCR) and a primer set to confirm the occurrence of homologous recombination events (DMD3). .Groups showed great variation in cell death rate and consequently in the number of colonies: ATF7IP+Vector had highest number of colonies (648c) and the group EP300+Ku70+Vetor+TALENs the lowest one (1c) The highest rate of homologous recombination was in ATF7IP +Ku70+Vetor+TALENs group that had 40% of the neomycin positives cells confirmed as gene targeting events, a considerable increase in the recombination rate compared to the 3.1% in the control group transfected only with the template vector. That shows that the combined use of siRNAs and TALENs was a success for increasing directed gene editing events.

Esta tese apresenta um estudo experimental em sistemas eletrônicos multicamadas formados em diversas heteroestruturas semicondutoras de alta qualidade crescidas por epitaxia de feixes moleculares. Especificamente, poços quânticos isolados baseados em InGaAs/InP e super-redes baseadas em GaAs/AlGaAs foram caraterizados por meio de medidas de fotoluminescência (PL) em função da temperatura, potência de excitação e do campo magnético. O estudo de efeitos na dinâmica de processos de recombinação destes sistemas eletrônicos é a base principal deste trabalho. Além disso, exploramos os efeitos da desordem sobre os processos de recombinação e demonstramos que o espalhamento por rugosidade interfacial é responsável pela resposta óptica destes sistemas. Nas amostras de InGaAs/InP com maior largura do espaçador observamos um novo efeito, o tempo de recombinação Auger aumenta notavelmente com a potência de excitação. Atribuímos este novo efeito à distribuição de elétrons fotoexcitados em diferentes vales da banda de condução. E em amostras de menor largura do espaçador, o relaxamento da regra de seleção do momento induzido pela desordem faz que o tempo de recombinação Auger diminua com o aumento da potência. Por outro lado, nas amostras de GaAs/AlGaAs, evidenciamos que a desordem gerada pela rugosidade interfacial afeta consideravelmente o transporte dos elétrons da banda de condução, e em poços quânticos de largura apropriada resulta em uma transição metal-isolante. A borda de mobilidade Ec, energia crítica que separa os estados estendidos dos estados localizados, foi determinada a partir das medidas do tempo de recombinação em função da energia de emissão de PL. Para uma desordem crítica, a Ec mostra uma interseção com a energia do nível de Fermi, a qual corresponde à transição metal-isolante. Além disso, realizamos medidas de PL resolvida no tempo em função do campo magnético. Observamos que a redistribuição espacial de elétrons causada pelo campo magnético afeta os tempos de recombinação. Nas amostras metálicas, os resultados mostraram deslocamento da Ec para altas energias, devido à quantização da energia dos elétrons provocada pelo campo magnético. No entanto, nas amostras isolantes, o campo magnético foi responsável pelo relaxamento significativo da regra de seleção do momento, que aumenta a probabilidade de recombinação dos elétrons localizados com os buracos fotoexcitados da banda de valência e, por consequência, diminui o tempo de recombinação. / This thesis presents an experimental study in multilayer electronic systems formed in several high quality semiconductor heterostructures grown by molecular beam epitaxy. Specifically, GaAs/AlGaAs based superlattices and isolated quantum wells based on InGaAs/InP were characterized by photoluminescence (PL) measurements as a function of temperature, pump power and magnetic field. The study of effects on the dynamics of the recombination processes of these electronic systems is the principal goal of this work. In addition, we explore the effects of the disorder on the recombination processes and show that the interfacial roughness scattering is responsible for the optical response in these systems. In the small spacer InGaAs/InP samples, we observed a new effect, the Auger recombination time becomes larger with the increasing the pump power. We propose that the distribution of photoexcited electrons over different conduction band valleys might account for this effect. In large spacer quantum wells, the non-radiative recombination time is reduced with the increasing pump power, as a consequence the disorder-induced relaxation of the momentum rule. On the other hand, in GaAs/AlGaAs samples, we showed that the disorder generated by interfacial roughness considerably affects transport of the conduction band electrons and at appropriate quantum wells width results in a metal-to-insulator transition. The mobility edge energy Ec was determined from the measurements of the recombination time as a function of energy allowed. At a critical disorder, the mobility edge energy demonstrates intersection with the Fermi level energy which correspond to the metal-insulator transition. In addition, we perform time-resolved PL measurements as a function of the magnetic field. We observed that the spatial distribution of electrons caused by the magnetic field influence on the recombination time. In the metallic samples was observed a shift of the mobility edge to higher energy due to the magnetic field quantization of conduction band electron energy. However, in the insulating samples, the magnetic field was responsible to cause a significant relaxation of the momentum selection rule which enhances the probability of recombination of the localized electrons with the photoexcited holes of the valence band, and consequently the recombination time is reduced.