Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les cellules déficientes pour la recombinaison homologue (RH) présentent un ralentissement des fourches de réplication, un nombre aberrant de centrosomes et une aneuploïdie même en absence de stress exogène (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). De plus, la fréquence des mitoses présentant des chromosomes surnuméraires est plus élevée dans ces cellules.L’ensemble des ces résultats suggéraient que le ralentissement des fourches de réplication dans les cellules déficientes pour la RH pourrait avoir un impact direct sur la formation de centrosomes surnuméraires. De plus, nous voulions savoir si cela pouvait également influencer la ségrégation des chromosomes au cours de la mitose. Les résultats que nous avons obtenus sont rassemblés dans l’article intitulé : “Homologous Recombination protects against mitotic defects and unbalanced chromosome segregation caused by spontaneous replication stress”.Le traitement des cellules compétentes pour la RH avec 5µM d’hydroxyurée (HU), un inhibiteur de l’enzyme de synthèse des dNTPs, induit un ralentissement des fourches de réplication parfaitement comparable à celui observé dans les cellules déficientes pour la RH. Après traitement à l’HU des cellules compétentes pour la RH, la fréquence de mitoses présentant des chromosomes surnuméraires augmente et devient similaire à la fréquence de mitoses avec des chromosomes surnuméraires pour les cellules déficientes pour la HR non traitées à l’HU. Nous avons mesuré l’impact de l’HU sur l’apparition des ponts anaphasiques et sur des défauts de ségrégation des chromosomes lors de la mitose. En l’absence de traitement, nous observons une fréquence plus élevée de ponts anaphasiques et de défauts de ségrégation dans des cellules déficientes pour la RH. Des traitements avec 5µM d’HU augmentent la fréquence des ponts anaphasiques et des erreurs de ségrégation dans les cellules compétentes pour la RH, pour atteindre un niveau comparable aux cellules déficientes pour la RH. Ainsi, une altération de la dynamique de réplication consécutive à une déficience de RH ou à un traitment avec de faibles doses d’HU induit des défauts au cours de la mitose. Un lien direct entre une dynamique de réplication anormale et l’apparition d’un nombre aberrant de centrosomes pourrait être la persistance en mitose d’ADN non répliqué ou endommagé.  Comme l’ADN non répliqué ou les fourches bloquées induisent la formation d’ADN simple brin couvert par RPA, nous avons compté le nombre de cellules en G2/M présentant des foyers de RPA, et observé que la fraction de cellules ayant plus de 5 foyers de RPA augmente dans des cellules déficientes pour Brca2. En conclusion, nous proposons un lien direct entre des altérations de la cinétique de réplication, l’apparition de centrosomes surnuméraires et des défauts de ségrégation des chromosomes en mitose dans les cellules déficientes pour la RH même non soumises à un stress exogène. L’utilisation de faibles doses d’HU dans des cellules compétentes pour la RH mime les phénotypes observés dans les cellules déficientes pour la RH et confirme notre modèle.Nous avons également cherché à comprendre les causes du ralentissement des fourches de réplication observé dans les cellules déficientes pour la RH. Il est ainsi possible que les arrêts de fourches spontanés soient une conséquence d’un stress oxydatif endogène. Dans les cellules compétentes pour la RH, le redémarrage des fourches bloquées est possible et assure une progression normale de la réplication de l’ADN. Ceci favorise une ségrégation équilibrée des chromosomes, le maintien de la diploïdie et la stabilité du génome. Dans des cellules déficientes pour la RH, les blocages de fourches devraient être délétères puisque les principaux mécanismes de redémarrage des fourches ne sont pas fonctionnels. De plus, l’arrêt prolongé des fourches ainsi que les cassures double brin générées par l’effondrement des fourches devraient activer des voies de signalisation. Nous avons néanmoins observé que les cellules ne sont pas bloquées dans le cycle cellulaire, ce qui suggère qu’un seuil supérieur de dommages doive être atteint pour induire l’arrêt du cycle. Les stress endogènes ne semblent donc pas suffisamment élevés pour atteindre ce seuil : même si l’ensemble des fourches parcourant le génome sont ralenties, l’activation d’origines cryptiques permet de compenser et ainsi de maintenir la progression dans le cycle. Mais puisque les cellules ne sont pas arrêtées dans le cycle, des fourches bloquées, de l’ADN endommagé ou non répliqué pourraient persister jusqu’à la transition G2/M et in fine perturber le déroulement de la mitose. Des centrosomes multipolaires provoquent la formation de fuseaux multipolaires et favorisent la ségrégation déséquilibrée des chromosomes, entraînant l’aneuploïdie, la déstabilisation du génome et le développement de cancers. / HR deficient cells show slow replication kinetics, aberrant centrosome number and aneuploidy even in the absence of any exogenous stress (Bertrand P 2003, Daboussi F 2005, 2008, Deng 1999, 2002, Griffin 2000, Kraakman-van der Zwet 2002). Frequency of mitosis with extra centrosomes is elevated and replication kinetics decreased in HR deficient compared to HR proficient cells, in the absence of exogenous stress. Thus the question arose, if replication slowing down in HR deficient cells has direct impact on the appearance of supernumerary centrosomes. Furthermore we wanted to know if this might directly impact chromosome segregation. The results we gained are brought together in the paper “Homologous recombination suppression causes spontaneous mitotic alterations through endogenous replication stress”. By treating our HR proficient cells with 5µM HU we found the perfect concentration to mimic replication dynamics of HR deficient cells in an HR proficient background. This concentration was applied to HR proficient cells. After HU treatment the frequency of mitosis with extra centrosomes was elevated in HR proficient cells. Now they showed the same frequency of mitosis with extra centrosomes, than unchallenged HR deficient cells. We measured the impact of HU treatment on occurrence of anaphase bridges or aberrant mitotic segregation. In the absence of treatment higher frequency of anaphase bridges and aberrant mitotic segregation was detected for HR deficient cells. With 5µM HU the frequency of anaphase bridges and aberrant mitosis could be elevated in HR proficient cells. Now they showed aberrant mitotic features with the same frequency than unchallenged HR deficient cells. A direct link between abnormal replication kinetics and aberrant centrosomes might be unreplicated or damaged DNA, that enter mitosis. Unreplicated or blocked DNA might harbour ss DNA bound RPA. Thus we counted G2/M cells with RPA foci. Indeed the fraction of cells that harbour more than 5 RPA foci was elevated in Brca2 deficient in comparison to Brca2 proficient cells. In conclusion we propose a direct link between delayed replication, supernumerary centrosomes and aberrant chromosome segregation in unchallenged HR deficient cells. If we mimicked replication kinetics of HR deficient cells in an HR proficient background, we also mimicked frequency of mitosis with extra centrosome number and aberrant chromosome segregation. Furthermore we investigated the causes of replication slowing down in HR deficient cells. It can be hypothesized that endogenous oxidative stress is implicated in spontaneous fork arrest. In HR proficient cells, reactivation of stalled replication forks and therefore normal replication progression is assured. This favours balanced chromosome segregation, diploidy and genetic stability.In HR deficient cells, replication fork blockage might be detrimental as the main restart mechanism for blocked forks is absent. Prolonged fork blockage or DSB’s arising by fork collapse or resolution of blocked replication forks might activate signalling pathways. However cells are not arrested in cell cycle progression, suggesting that a threshold should be reached to activate cell cycle arrest. Endogenous stress is not sufficient high to reach this threshold. Replication is genome wide slowed down. In this context, the activation of cryptic origins compensates at least partly the slow replication velocity. However, because cells were not arrested in cell cycle progression, some blocked replication forks and damaged or unreplicated DNA regions might persist until G2/M phase and affect centrosome duplication and chromosome segregation. Multipolar centrosomes cause multipolar spindles and favour unbalanced chromosome segregation leading to aneuploidy, genetic instability and cancer development.

La recombinaison homologue est un mécanisme de réparation de l’ADN extrêmement contrôlé et particulièrement chez les eucaryotes supérieurs. Dans les cellules méiotiques de ces derniers, où les cassures doubles brin de l’ADN sont programmées, les voies de crossing-over de la recombinaison homologue, qui génèrent de nouvelles combinaisons de gènes, sont restreintes. Dans les cellules somatiques, la recombinaison illégitime, qui assure majoritairement la réparation des cassures double brin de l’ADN, limite l’intégration ciblée du transgène par recombinaison homologue. Les entreprises de biotechnologie convoitent de maitriser la recombinaison homologue afin de contrôler d’une part le brassage génomique qui a lieu pendant la méiose, et d’autre part l’intégration du transgène dans le génome. Cette étude a porté sur le développement d’outils afin d’atteindre ces deux objectifs. Afin d’augmenter le brassage du génome, ayant lieu pendant la méiose, une version du promoteur OsDmc1b, active dans les cellules méiotiques, a été caractérisée chez le maïs. Des plantes sur-exprimant le gène ZmSpo11.1, sous contrôle de ce promoteur, ont ainsi été développées afin d’obtenir des lignées potentiellement hyper-recombinantes. Si la surexpression de ZmSpo11.1 permet effectivement d’augmenter le taux de crossing-over, il pourra être utilisé par les sélectionneurs afin d’accélérer l’introgression d’allèles d’intérêt dans des variétés élites. Concernant la mise en place d’une technique de ciblage de gène, deux stratégies, reposant sur l’utilisation de la méganucléase I-SceI, ont été testées. La démarche a nécessité trois éléments : un locus cible contenant le site de coupure I-SceI, une matrice de réparation et la séquence codant I-SceI (ou I-SceI::GR). La première stratégie, consistant à retransformer les lignées présentant le locus cible avec la matrice de réparation et I-SceI, ne semble pas exploitable car aucun évènement de ciblage de gène n’a été mis en évidence. La seconde stratégie, reposant sur l’assemblage des trois éléments par croisement, est beaucoup plus prometteuse. Malgré la faible activité d’I-SceI::GR, des évènements de recombinaison homologue ont été observés dans les tissus foliaires de certaines plantes. Du cal embryogène, développé à partir de ces dernières, a permis de régénérer des plantes présentant des évènements de ciblage de gène. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans l’élaboration contrôlée d’OGM. / Homologous recombination is a DNA repair mechanism highly regulated in higher eukaryotes. In their meiotic cells, where DNA double-stranded breaks are programmed, the crossing-over pathway of homologous recombination, which generates new gene combinations, is limited in activity and genomic distribution. In somatic cells, illegitimate recombination, which mainly ensures DNA double-strand repair, limits the targeted integration of transgenes by homologous recombination. Biotechnology companies aim to master homologous recombination to control on the one hand the genomic mixing that occurs during meiosis, and on other hand, the integration of transgenes into the genome. This study focuses on the development of tools to achieve these two objectives.To increase genome mixing occurring during meiosis, a version of the OsDmc1b promoter active in maize meiotic cells was isolated. Then, plants over-expressing the ZmSpo11.1 gene under control of this promoter have been developed to obtain potentially hyper-recombinant lines. If ZmSPO11.1 overexpression increases the crossing over rate, it can be used by breeders to accelerate the introgression of alleles of interest into elite varieties. For the establishment of a gene targeting technique, two strategies based on the use of the I-SceI meganuclease were tested. These approaches involved the use of three elements which are: a target locus containing the cleavage site of I-SceI, a repair template and the sequence encoding I-SceI (or ISceI::GR). The first strategy, consisting of the retransformation of target locus lines with the repair template and I-SceI, does not seem workable because no gene targeting events were isolated. The second strategy, based on the assembly of the three components by crossing, is more promising. Despite the low activity of I-SceI::GR, homologous recombination events were observed in leaf tissues of certain plants. Embryogenic callus, developed from these plants, permitted the regeneration of plants with gene targeting events. This work opens new perspectives in the development of controlled GMO production.

Les tumeurs mammaires sont connues pour présenter une grande hétérogénéité intratumorale qui contribue à l’échec thérapeutique et à la progression de la maladie. L’origine de dette hétérogénéité s’explique principalement par l’organisation hiérarchique des tissus tumoraux où plusieurs sous-populations de cellules souches de cancer du sein (bCSC) sont capables de s’auto-renouveler et de maintenir l’architecture oligoclonale de la tumeur. Dans la mesure où les bCSC stimulent la croissance tumorale, résistent aux thérapies conventionnelles et initient le développement des métastases, il est indispensable de développer des thérapies spécifiques ciblant ces cellules. L’élaboration d’une telle stratégie nécessite la compréhension des propriétés moléculaires intrinsèques des bCSC. Pour mieux comprendre leur biologie, nous avons isolé les bCSC de différentes xénogreffes dérivées de tumeurs de patientes et établit leurs profil d’expression génique. Nous avons identifié un programme transcriptionnel pouvant être impliqué dans la réduction du stress réplicatif (SR) des bCSC . Nous avons montré que comparé aux non-bCSC, les bCSC présentent une sur-activation de la recombinaison homologue qui leur permet de réduire leur niveau de SR. Nous avons ensuite montré en réalisant un essai clinique que l’inhibition de cette voie permet de les sensibiliser à des agents génotoxique. Ces travaux identifient le SR comme le talon d’Achille des bCSC et mettent en évidence la recombinaison homologue comme cible potentielle pour sensibiliser les BCSC aux thérapies conventionnelles. / Breast tumors are known to present a major intratumoral heterogeneity that contributes to therapy failure and disease progression. The origin of this cellular heterogeneity is mainly explained by a hierarchical organization of tumor tissues where several subpopulations of self-renewing breast cancer stem cells (bCSCs) sustain the long-term oligoclonal maintenance of the neoplasm. bCSCs drive tumor growth, resist to conventional therapies and initiate metastasis development. Thus, developing bCSC-targeting therapies is becoming a major challenge requiring the understanding of the unique molecular circuitry of bCSC as compared to non-bCSC. To better understand the biology of these cells, we isolated bCSCs from different patient–derived xenografts (PDXs), derived fom breast tumors, and established their gene expression profiles. We identified a bCSC core transcriptional program that may be implicated in the reduction of the replicative stress in CSC: overexpression of genes implicated in dNTP metabolism and homologous recombination (HR). Our results show that HR plays a major role in SR regulation of bCSC and that bCSC are more resistant to RS than non-bCSC, We realized a preclinical assay in PDX and showed that HR inhibition prevent bCSC expansion Cisplatin-induced, suggesting a sensitization of the bCSC to the chemotherapy. Our results identify replication stress as the Achilles’ heel of bCSC and highlights HR as potential targets for anti-bCSC therapy.

L'hormone thyroïdienne (T3) a des fonctions pléiotropiques au cours du développement. Un déficit congénital de T3 est responsable d'un retard mental sévère. Grâce à des souris possédant un transgène rapporteur, nous avons montré que l'activité de l'hormone est très hétérogène dans le cerveau pré et post-natal. T3 agit via les récepteurs nucléaires TR pour réguler la transcription de gènes-cibles. De nouveaux gènes-cibles ont été identifiés dans le cervelet post-natal, mais la cascade de signalisation demeure inconnue, en raison d'interactions cellulaires complexes. Pour supprimer la réponse à T3 à un moment donné, dans une cellule donnée, des souris exprimant de façon conditionnelle un récepteur TR?1 muté ont été générées. Les mutants constitutifs ont un phénotype très proche de l'hypothyroïdie, ce qui confirme l'implication majeure du récepteur TR?1 non lié à T3 dans la pathogénie de l'hypothyroïdie. Le système conditionnel permettra de disséquer le mécanisme d'action de T3 in vivo.

Grâce au développement des technologies de métagénomique au cours des dix dernières années, il a été constaté que les micro-organismes représentent la plus grande ressource de diversité métabolique et génétique sur Terre. En effet, un gramme de sol contient 109 cellules bactériennes et 103-104 différentes espèces bactériennes. Certaines sont en mesure de réaliser des réactions enzymatiques conduisant à la dégradation complète de certains polluants toxiques pour l'environnement comme les composés organiques tels que la quinoléine. Cependant, l'immense réservoir de molécules et enzymes microbiennes n'a pas encore été exploité, car plus de 99% d'entre elles ne sont, pour l'instant, pas cultivables in vitro. Mon travail s'inscrit dans le cadre d'une collaboration entre l'Université SJTU (Shanghai Jiao Tong Université en Chine) et le groupe de G. M.E (Génomique Microbienne Environmentale) du laboratoire Ampère à l'Ecole Centrale de Lyon. Nos partenaires à l'Université SJTU ont construit un réacteur de dénitrification à l'échelle du laboratoire capable de dégrader la quinoléine en retirant la demande chimique en oxygène. Un nouvel outil appelé "Genefish" a été developpé dans notre laboratoire comme une méthode alternative de la métagénomique pour aider à la découverte de nouveaux gènes d'intérêt industriel ou environnemental. A la suite des premiers travaux réalisés dans notre laboratoire, ma thèse présentée ici comporte deux parties.Dans la première partie de ce travail, nous avons étudié le potentiel de dégradation de la quinoléine présente dans les bactéries d'un sol de référence largement étudié au laboratoire. Pour cela nous avons mis en place des expériences de microcosme qui visent à révéler la diversité potentielle des bactéries responsables de la dégradation de la quinoléine. Des analyses comparatives des profils RISA (Ribosomal Intergenic Spacer analysis) nous ont permis de mettre en évidence des changements dans la structure de la communauté des bactéries du sol incubé en conditions aérobie et anaérobie en présence de quinoléine. La dégradation de la quinoléine a été confirmée par technique de GC/MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry). Les travaux futurs seront de vérifier la communauté de bactéries responsables de la dégradation de quinoléine en utilisant la technique de NGS (Next Generation Sequencing).Le deuxième objectif de ma thèse a été d'utiliser Genefish dont la finalité est de capturer des gènes ciblés (le gène bcr qui serait responsable de la degradation de quinoléine dans le réacteur de nos partenaires) dans l'ADN métagénomique extrait du sol. Genefish consiste à élaborer une souche d'E.coli incluant un plasmide de capture permettant de pêcher les gènes recherchés dans un échantillon d'ADN metagénomique par recombinaison homologue. Le plasmide de capture comprend une cassette de deux gènes toxiques pour la souche qui activés par induction chimique vont permettre la sélection positive directe des clones recombinants, et deux sites multiples de clonage dans lesquels sont insérées les zones de recombinaison qui vont jouer le rôle d'hameçons. Nous avons testé la capacité de Genefish à capturer des produits PCR du gène bcr, l'efficacité de recombinaison reste faible à cause de la persistance de plusieurs copies du plasmide suicide dans la cellule après l' évenement de recombinaison. Par conséquent, trois stratégies ont été essayées pour améliorer l'efficacité: la co-électroporation, la ségrégation de plasmide et la construction de plasmide suicide en mono-copie. Finalement, la stratégie de la ségrégation plasmidique fonctionne mais l'efficacité de recombinaison est encore trop faible peut-être due à l'incertitude des modèles de recombinaison homologue. Les travaux futurs se concentreront sur l'amélioration des fréquences de recombinaison par transfert de fragments du plasmide de capture dans le chromosome de la souche Genefish.

La stabilité génomique des organelles de plantes suscite un grand intérêt dans le domaine de la biologie végétale. En effet, plusieurs études récentes suggèrent que ce type d’instabilité génomique pourrait mener à l’isolation de traits intéressants en l’agronomie. Plusieurs protéines sont d’ailleurs déjà été identifiés comme étant impliqués dans le maintien de la stabilité de ces génomes, tels que MSH1, la famille des POLI, OSB1, les protéines Whirly et les Recombinases A (RECA). Le génome nucléaire d’Arabidopsis thaliana encode trois protéines s’apparentant à la Recombinase A bactérienne et qui sont ciblées à la mitochondrie et/ou au chloroplaste, soit RECA1, RECA2 et RECA3. Globalement, ces gènes partagent une similarité de séquence de 61% avec leur homologue bactérien chez Escherichia coli. Chez les bactéries ces protéines jouent un rôle essentiel dans la recombinaison homologue et sont impliquées dans la réparation de l’ADN. Chez Arabidopsis, il a été démontré que RECA2 et RECA3 sont nécessaires au maintien de l’intégrité du génome mitochondriale. Toutefois leur contribution à la stabilité du génome chloroplastique ainsi que le rôle de RECA1 restent obscures. Le but de ce projet est donc de déterminer la contribution éventuelle des protéines RECA d’Arabidopsis dans la réparation de l’ADN chloroplastique et plus précisément le rôle du gène RECA1. Nous énonçons l’hypothèse que les RECA de plantes se comportent effectivement comme leurs orthologues bactériens en étant impliqués dans la recombinaison homologue. Dans le cadre de ce projet, nous avons tenté d’isoler des lignées mutantes pour chacun des gènes RECA d’Arabidopsis. En somme, nous avons pu obtenir des lignées convenables pour notre étude que dans le cas du gène RECA1. Ces lignées ont été utilisées pour évaluer la contribution de ce gène à la stabilité du génome du chloroplaste. Ensuite, pour étudier la relation épistatique des gènes RECA1, WHY1 et WHY3, un croisement des différentes lignées mutantes pour ces gènes a été réalisé. Nous avons ensuite étudié la sensibilité de toutes ces lignées mutantes à la ciprofloxacine, un agent causant des bris double brin exclusivement dans les organelles de plantes. Finalement, iii nous avons testé la présence de réarrangements dans le génome du chloroplaste en condition normal ou en présence de stress génotoxique. Nos résultats démontrent que les protéines Whirly et RECA1 sont impliquées dans deux voies de réparation de l’ADN différentes et que les Whirly sont suffisantes pour s’occuper des bris d’ADN double brin en l’absence de RECA1. Nous démontrons également que l’absence de Whirly et RECA1 entraine une forte augmentation de la quantité de réarrangements dans le génome du chloroplaste. De plus nous proposons que la polymérase POLIB est impliquée dans la même voie de réparation que RECA1. Finalement nous proposons un modèle pour expliquer nos résultats et impliquons RECA1 dans un mécanisme de réparation d’ADN et aussi un rôle potentiel dans la réplication. / The stability of plant organelles genomes elicits a great interest in the domain of plant biology. In fact, numerous studies suggest that genomic instability can lead to the isolation of interesting traits in the field of agronomy. Some factors such as MSH1, the POLI family, OSB1, the Whirly proteins and the Recombinase A (RECA), have already been identified has being implicated in the maintenance of genome stability. The nuclear genome of Arabidopsis thaliana encodes three proteins, RECA1, RECA2 and RECA3, that shares a high resemblance with bacterial Recombinase A. They are targeted to the mitochondria and/or to the chloroplast. Globally, these genes share a similarity of sequence of 61% with their bacterial homologue in Escherichia coli. In bacteria these proteins play an essential part in homologous recombination and are implicated in DNA repair. In Arabidopsis, RECA2 and RECA3 have been shown as being essential to maintain the integrity of the mitochondrial genome but their contribution to the stability of the chloroplast as well as the role of RECA1 remains obscure. The goal of this project is to establish the eventual contribution of the Arabidopsis RECA proteins in the repair of chloroplast DNA and more precisely the role of the RECA1 gene. We propose the hypothesis that plants RECA act in the same fashion as their bacterial orthologues by being implicated in homologous recombination. Within the framework of this project, we have attempted to isolate mutant lines for each RECA gene of Arabidopsis. In the end, we were able to obtain appropriate lines for our study only for the RECA1 gene. These lines were then used to evaluate the contribution of the gene to chloroplast genome stability. Afterwards, in order to study the epistatic relationship between the RECA1, WHY1 and WHY3 genes, a cross between different mutant lines of these genes was realised. We then studied the sensitivity of all of those mutant lines to ciprofloxacine, an agent causing double stranded breaks exclusively in plant organelles. Finally, we evaluated the presence of rearrangements in the chloroplast genome under normal conditions and under the presence of a genotoxic stress. Our v results show that the Whirly and RECA1 proteins are implicated in two separate pathways of DNA reparation and that the Whirly proteins are sufficient to take in charge DNA double strand breaks generated by the absence of RECA1. We also demonstrate that the absence of Whirly and RECA1 causes an increasein the quantity of rearrangements in the chloroplast genome. Furthermore, we propose that the polymerase POLIB is implicated in the same repair pathway as RECA1. Finally we propose a model to explain our results and implicate RECA1 in a DNA repair mechanism and propose a role for RECA1 in DNA replication.

L'élimination programmée d'ADN spécifique de la lignée germinale pour former un nouveau noyau somatique a été décrite chez les eucaryotes. Ces réarrangements sont initiés par l'introduction de cassures double brin (CDB) de l'ADN et la préservation de l'intégrité du génome requiert une réparation efficace. Chez Paramecium tetraurelia, le génome est largement réarrangé pendant le développement du nouveau noyau somatique, après l'introduction de milliers de cassures double brin programmées par la transposase domestiquée PiggyMac (Pgm)Ces réarrangements consistent en l'excision précise de dizaines de milliers de séquences uniques et non codantes (IES) qui interrompent 47% des gènes dans la lignée germinale ; et l'élimination hétérogène de séquences répétées qui mène à des délétions internes de taille variable ou à la fragmentation des chromosomes avec addition de télomères aux extrémités.L'implication de la voie du Non Homologous End Joining (NHEJ) dans l'excision précise des IES a été prouvée. Dans des cellules déplétées de Ligase IV ou XRCC4, les cassures aux bornes des IES sont introduites normalement mais il n'y a pas de jonctions d'excision formées et les extrémités cassées s'accumulent sans être dégradées. Mais la voie de réparation impliquée dans les réarrangements imprécis est encore inconnue. L'hypothèse d'une réparation par la voie NHEJ alternative (alt-NHEJ), indépendante de Ku et impliquant la résection des extrémités et l'utilisation de microhomologie, a été émise. C'est pourquoi pendant ma thèse je me suis intéressé à ma thèse au rôle des protéines Ku.Deux gènes KU70 et trois gènes KU80 ont été identifiés dans le génome de la paramécie. KU70a et KU80c sont spécifiquement induits pendant les réarrangements programmés du génome et les protéines localisent dans les noyaux somatiques en développement. Des expériences d'extinction de ces gènes par ARN interférence ont prouvé que ces gènes étaient indispensables. Au niveau moléculaire, l'ADN non réarrangé est amplifié dans les cellules déplétées de Ku. De plus, les cassures double brin programmées ne sont pas introduites aux bornes des IES.Mes résultats suggèrent que Ku fait partie d'un complexe de pré-excision, avec la transposase domestiquée Pgm, et est nécessaire pour l'introduction des cassures double brin programmées pendant les réarrangements programmés du génome.

No description available.

Le facteur de transcription homéotique Cdx2 est un suppresseur de tumeurs et son expression est réduite de manière hétérogène dans les tumeurs coliques. Or, le cancer colorectal demeure un problème de santé publique par sa fréquence et sa gravité. Au travers de 3 sous-projets, cette thèse visait à comprendre le mode d’action de Cdx2. Premièrement, la cadhérine Mucdhl a été identifiée et caractérisée en tant que nouvelle cible de Cdx2 : Mucdhl inhibe la croissance des cellules cancéreuses coliques et s’oppose à l’activité de la -caténine. Deuxièmement, un effet inattendu de Cdx2 sur le cytosquelette et la rigidité cellulaire a été montré. Ceci pourrait expliquer comment Cdx2 intervient dans l’organisation structurale des entérocytes ou la migration. En parallèle, une lignée cellulaire rapportrice de l’expression de Cdx2 a été créé qui, après validation, sera un outil précieux pour l’étude des mécanismes moléculaires qui conditionnent l’hétérogénéité tumorale. Par la mise en évidence de nouvelles fonctions et cibles de Cdx2, cette thèse permet de mieux appréhender son rôle physiologique et son action de suppresseur de tumeurs dans l’intestin. / Colorectal cancer is a major public health problem because of its frequency and propensity to metastasize. Cdx2 plays the role of a tumor suppressor and its expression is frequently but heterogeneously reduced in colon tumors. Through three sub-projects, this thesis aimed to better understand the mode of action of Cdx2. First, the Cadherin Mucdhl was identified and characterized as a new direct target gene of Cdx2. Mucdhl was also shown to inhibit the growth of colon cancer cells and to oppose -catenin activity. Second, an unexpected effect of Cdx2 on the cell cytoskeleton and rigidity of a cancer cell monolayer was uncovered. This gives new clues about how Cdx2 contributes to the structural organization and differentiation of enterocytes but also nhibits cell migration. In parallel, a reporter cell line for Cdx2 expression was created. After its validation, this cell line will be a precious tool to study the molecular mechanisms underlying tumor heterogeneity in vivo. Altogether, this thesis unraveled new functions and target genes of Cdx2 that permit to better apprehend its physiological function and its action as a tumor suppressor in the intestine.