Photoreceptors are highly specialized neurons within the eye and the key retinal cells sensing light. They are indispensable for our visual perception and loss of photoreceptors consequently leads to loss of vision, a sense that alone is responsible for more than 30% of the input to our brain. Vision impairment and blindness is a leading cause of disability in the industrialized world and is in many cases ultimately due to a degeneration of the photoreceptors, which cannot be halted or reversed. Retinal degenerative diseases encompass a heterogeneous group of etiologies, mainly caused by various mutations in a plethora of proteins involved in the visual process. Currently, several therapeutic options are being explored, with so far one gene therapy for a rare inherited blinding condition being clinically approved. However, the gene therapy approach requires not only the presence of remaining photoreceptors but the tailoring of the therapy to each individual mutation. An alternative, more generally applicable approach is to restore vision through photoreceptor replacement therapy. As such, research on mouse-to-mouse photoreceptor transplantations has been carried out for many years, though with mixed results. In the last decade, it has however also become possible to generate large quantities of human photoreceptors through retinal organoid technology, allowing to instead transplant human cells. While promising, this field is still in development and principal conditions for successful photoreceptor transplantation have yet to be defined. Here, human-to-mouse photoreceptor transplantations were performed and assessed with the aim to receive insights into retinal cell replacement technology with specific focus on photoreceptor maturation, polarization and functional integration. Using a cone-degeneration host line, large-scale incorporation of human photoreceptor grafts into the murine retina was shown for the first time. It was found that for human photoreceptors, the choice of developmental stage strongly affects incorporation and maturation capacity. Furthermore, the results demonstrate the necessity of adequate graft-host interaction for successful transplant maturation and function, suggesting that photoreceptor replacement strategies might benefit from transplantation in earlier rather than late stages of retinal degeneration. Taken together, this thesis lays important groundwork for the further development of human photoreceptor replacement strategies to treat retinal degenerative disease.:ACKNOWLEDGEMENTS I ABSTRACT III ZUSAMMENFASSUNG V PUBLICATIONS VII TABLE OF CONTENTS IX LIST OF FIGURES XIII LIST OF TABLES XIV GENERAL ABBREVIATIONS XV GENE AND PROTEIN ABBREVIATIONS XVII 1 INTRODUCTION 1 1.1 THE RETINA AND LIGHT PERCEPTION 1 1.1.1 General structure of the eye 1 1.1.2 General structure of the retina 1 1.1.3 General photoreceptor structure 3 1.1.4 Phototransduction 4 1.1.5 Signal transmission to the brain 6 1.1.6 Major differences between rods and cones 7 1.1.7 The role of Müller glia in photoreceptor support and light perception 9 1.2 RETINAL DEGENERATION DISEASES AND TREATMENT OPTIONS 11 1.2.1 Retinal degeneration diseases 11 1.2.2 Therapeutic approaches to treat retinal degeneration diseases 12 1.3 CELL REPLACEMENT AS TREATMENT APPROACH FOR RETINOPATHIES 14 1.3.1 Transplantations of rodent retinal tissue and cells 14 1.3.2 Transplantations of human retinal tissue and cells 17 1.4 AIM OF THIS THESIS 22 2 CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY HUMAN RETINAL ORGANOIDS AS PHOTORECEPTOR CELL SOURCE 23 2.1 AIMS 23 2.2 CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY REPORTER-EXPRESSING CELLS 23 2.2.1 Crx-mCherry expression overlaps with endogenous CRX expression and increases over time 23 2.2.2 Crx-mCherry organoids contain an outer and an inner nuclear layer 24 2.2.3 Crx-mCherry+ cells express early and mature rod and cone markers 25 2.2.4 Crx-mCherry+ cells do not express proliferation markers 27 2.3 ENRICHMENT AND CHARACTERIZATION OF CRX-MCHERRY+ DONOR CELLS 28 2.3.1 Enrichment of Crx-mCherry+ cells by FACS 28 2.3.2 Characterization of Crx-mCherry enriched cells by single cell sequencing 29 2.3.3 Characterization of D200 Crx-mCherry-enriched cells by immunocytochemistry 30 2.4 SUMMARY 31 3 TRANSPLANTATION OF HUMAN CRX-MCHERRY+ GRAFTS AGED D100, D200 AND D300 INTO CPFL1 MICE 33 3.1 AIMS 33 3.2 CRX-MCHERRY+ CELLS OF ALL AGES CAN BE TRANSPLANTED AND SURVIVE IN THE MURINE RETINA 33 3.2.1 Human grafts can be identified by RCVRN staining 34 3.2.2 D100 Crx-mCherry+ transplants are larger than D200 and D300 grafts 34 3.2.3 Graft volume increase over time is not due to in vivo proliferation 36 3.3 GRAFT MORPHOLOGY DIFFERS WITH DONOR AGES 37 3.3.1 Human grafts can adopt an intraretinal position 37 3.3.2 Graft positioning changes over time 37 3.3.3 Qualitative differences in graft morphology between donor ages 38 3.4 GRAFT MATURATION 41 3.4.1 D200 but not D100 or D300 grafts develop large quantities of inner segments 41 3.4.2 Inner segment development is associated with close proximity to the host retina 42 3.5 HUMAN IDENTITY OF INTRARETINAL GRAFTS 43 3.5.1 Intraretinal Crx-mCherry+ grafts are largely a result of true morphological incorporation 43 3.5.2 Rare indications of potential human-to-mouse material transfer 45 3.6 SUMMARY 47 4 IN DEPTH CHARACTERIZATION OF TRANSPLANTED D200 CRX-MCHERRY+ CELLS 49 4.1 AIMS 49 4.2 EARLY POST TRANSPLANTATION DYNAMICS IN GRAFT POSITIONING AND GRAFT-HOST INTERACTIONS 49 4.2.1 Intraretinal and proximal D200 grafts interact with the host retina while isolated and distal clusters show only little interaction 49 4.2.2 Incorporation of D200 grafts is first evident at 8 weeks post transplantation 50 4.2.3 Host Müller glia extend processes into the graft before host bipolar cells 51 4.2.4 MG staining in D200 grafts originates from host MG 51 4.3 INCORPORATING D200 GRAFTS POLARIZE AND FORM STRUCTURES OF MATURE PHOTORECEPTORS 53 4.3.1 Grafts and host form an outer limiting membrane (OLM)-like structure 53 4.3.2 Inner segment formation occurs where an OLM is formed 54 4.3.3 Incorporating grafts form outer segment-like structures 55 4.3.4 Incorporating grafts form synaptic structures 57 4.3.5 Transplanted Crx-mCherry+ cells become enriched for cones 58 4.3.6 Higher levels of mature photoreceptor markers in ex vivo compared to in vitro cones 60 4.4 INCORPORATION AND MATURATION CAPACITY DEPEND ON THE HOST ENVIRONMENT 63 4.4.1 Graft morphology and maturation in C57BL/6JRj recipients resembles that in Cpfl1 hosts 63 4.4.2 Graft morphology and maturation in highly degenerated rd1 and tgCR host lines differs strongly from the outcome in models with an ONL 63 4.5 SUMMARY 67 5 FUNCTIONAL ASSESSMENT OF TRANSPLANTED CRX-MCHERRY+ CELLS 69 5.1 AIMS 69 5.2 HIGH-LEVEL FUNCTION 69 5.2.1 Light-Dark Box 69 5.3 TISSUE-LEVEL FUNCTION 71 5.3.1 Multi-electrode array assessment of D200+26w grafts in Cpfl1 mice 71 5.3.2 Isolation of cone-mediated RGC response through photopic light stimulation and L-AP4 addition 71 5.3.3 Graft-containing retinal portions exhibit cone-mediated light responses 72 5.4 SUMMARY 74 6 DISCUSSION AND FUTURE PERSPECTIVES 75 6.1 HUMAN GRAFTS CAN MORPHOLOGICALLY INCORPORATE INTO THE MODERATELY DEGENERATED MOUSE RETINA 75 6.2 INTRARETINAL GRAFTS MOSTLY REPRESENT TRUE INCORPORATION EVENTS, NOT MATERIAL TRANSFER 76 6.3 GRAFT MATURATION DEPENDS ON GRAFT-HOST INTERACTION 77 6.4 ESTABLISHMENT OF GRAFT-HOST INTERACTION AND GRAFT INCORPORATION 78 6.5 D200 CRX-MCHERRY+ CELLS ARE THE PREFERABLE DONOR POPULATION COMPARED TO D100 AND D300 80 6.6 CONES SHOW PREFERENTIAL SURVIVAL POST GRAFTING 81 6.7 FUNCTIONAL ANALYSES OF TRANSPLANTED ANIMALS 82 6.8 FUTURE CLINICAL TRANSLATION 85 6.9 MAJOR CONTRIBUTION TO OTHER WORK 88 7 FINAL CONCLUSION 89 8 MATERIALS AND METHODS 91 8.1 STUDY APPROVAL 91 8.2 MATERIALS 91 8.2.1 Materials and Chemicals 91 8.2.2 Cell Line 92 8.2.3 Mouse Lines 92 8.2.4 Antibodies 93 8.3 METHODS 95 8.3.1 Cell culture 95 8.3.2 Transplantations 96 8.3.3 Functional analyses 98 8.3.4 Immunohistochemistry and Immunocytochemistry 100 8.3.5 Imaging and image processing 103 8.3.6 Statistics 106 8.3.7 Single cell sequencing 107 8.3.8 Bioinformatic analysis 108 9 BIBLIOGRAPHY 111 10 APPENDIX 128 10.1 APPENDIX 1: ERKLÄRUNGEN ZUR ERÖFFNUNG DES PROMOTIONSVERFAHRENS 128 10.2 APPENDIX 2: BESTÄTIGUNG ÜBER EINHALTUNG DER AKTUELLEN GESETZLICHEN VORGABEN 129

Severe motor vehicle accidents (MVAs) represent one of the most often occurring psychological traumas, and are a leading cause of Posttraumatic Stress Disorder (PTSD). However, not all persons develop PTSD after traumatic events and a great proportion of patients who show symptoms initially recover over time. This has stimulated research of psychological and biological factors that explain development and maintenance of the disorder. Fortunately, this highly distressing condition can be effectively treated, e.g. via cognitive behavioral therapy (CBT). However, brain mechanisms underlying changes due to psychological therapy in PTSD are almost unknown (Roffman, Marci, Glick, Dougherty, & Rauch, 2005). On the other hand there are observations of positive changes following trauma called Posttraumatic Growth (PTG), which have stimulated research of associated psychological processes and factors. However, there is a lack of research about the relation of biological variables (e.g. measures of brain function) and PTG. Theories of brain asymmetry and emotion (Davidson, 1998b, 2004b; Heller, Koven, & Miller, 2003) propose that asymmetries of brain activation are related to certain features of human emotion (e.g. valence, approach or withdrawal tendencies, arousal). Whereas an enormous increase in the understanding of structural and functional abnormalities in PTSD could be achieved in the last decades due to neuroimaging research, there are still numerous unanswered questions. Especially, there is only little research explicitly examining activation asymmetries in PTSD. Furthermore, as mentioned, research is sparse investigating alterations of brain function that are associated with successful psychological treatment of PTSD. Finally, there is no published study examining how measures of brain function are related to PTG. This thesis presents 3 studies investigating electroencephalographic (EEG) asymmetries in survivors of severe motor vehicle accidents. The first part of the thesis (chapter 2) is devoted to a literature review about description (chapter 2.1), epidemiology (chapter 2.2 and 2.3), risk factors (chapter 2.4), psychological theories (chapter 2.5), biological mechanisms particularly neuroimaging findings (chapter 2.6), and treatment of PTSD (chapter 2.7.). Chapter 2.8 gives a short review on definition and research of Posttraumatic Growth. Chapter 2.9 provides an overview of models and research regarding brain asymmetry and emotion. In chapter 3.1, a study is presented that investigated hemispheric asymmetries (EEG alpha) among MVA survivors with PTSD, with subsyndromal PTSD, and without PTSD as well as non-exposed healthy controls during a baseline condition and in response to neutral, positive, negative, and trauma-related pictures (study I). Next, the findings of study II are presented (chapter 3.2). This study examined the effect of cognitive behavioral therapy on measures of EEG activity. Therefore, EEG activity before and after CBT in comparison to an assessment only Wait-list condition was measured. In chapter 3.3 a correlational study (study III) is presented that examined the relationship between frontal brain asymmetry and selfreported posttraumatic growth after severe MVAs. Finally, in chapter 4 the findings are summarized and discussed with respect to (1) the state/trait debate in frontal asymmetry research and (2) current psychological theories of PTSD and PTG. In addition, the use of neuroscientific research for psychotherapy is discussed. Suggestions are presented for future goals for “brain” research of PTSD and treatment of PTSD. / Schwere Verkehrsunfälle stellen eines der am häufigsten vorkommenden psychologischen Traumata dar, und sind eine Hauptursache der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTBS). Jedoch entwickeln nicht alle Personen nach traumatischen Ereignissen eine PTBS und bei einem Großteil remittieren anfängliche PTBS-Symptome. Dies stimulierte die Erforschung von psychologischen und biologischen Faktoren, die die Entstehung und Aufrechterhaltung der PTBS erklären. Glücklicherweise kann die PTBS effektiv, z.B über die kognitive Verhaltenstherapie (KVT), behandelt werden. Jedoch sind Gehirnmechanismen, die mit klinischen Änderungen aufgrund der psychologischen Therapie in PTSD einhergehen, nahezu unbekannt (Roffman, Marci, Glick, Dougherty, Rauch, 2005). Auf der anderen Seite gibt es Berichte von positiven Änderungen nach traumatischen Ereignissen, die als Posttraumatische Reifung (PTR) bezeichent werden. Dies hat in kürzerer Vergangenheit die Forschung von verbundenen psychologischen Prozessen und Faktoren stimuliert. Jedoch gibt es kaum Untersuchungen über die Beziehung von biologischen Variablen (z.B Messungen der Gehirnfunktion) und PTR. Diese Arbeit präsentiert 3 Studien, die electroenzephalographische (EEG) Asymmetrien bei Opfern schwerer Verkehrsunfälle untersuchten. Der erste Teil der Arbeit (Kapitel 2) widmet sich einer Literaturrezension über: die Beschreibung (Kapitel 2.1), Epidemiologie (Kapitel 2.2 und 2.3), Risikofaktoren (Kapitel 2.4), psychologische Theorien (Kapitel 2.5), biologische Mechanismen besonders Neuroimaging Ergebnisse (Kapitel 2.6), und Behandlung der PTBS (Kapitel 2.7.). Kapitel 2.8 gibt einen kurzen Überblick über die Definition und Forschung zur Posttraumatischen Reifung. Kapitel 2.9 gibt eine Übersicht zu aktuellen Modellen und empirischen Befunden bezüglich Gehirnasymmetrien und Emotionen. Kapitel 3.1 präsentiert eine Studie, in der hemisphärische Asymmetrien (im EEG-Alpha Band) bei Unfallopfern mit PTBS, subsyndromaler PTBS, und ohne PTBS sowie gesunden Kontrollpersonen ohne Unfall untersucht wurden: während einer Ruhemessung und einer Emotionsinduktions-bedingung (neutrale, positive, negative und trauma-spezifische Bilder) (Studie I). Danach werden die Ergebnisse der Studie II (Kapitel 3.2) präsentiert. Hier wurde die Wirkung der kognitiven Verhaltenstherapie auf Messungen der EEG-Aktivität untersucht. Deshalb wurde EEG-Aktivität vor und nach einer KVT im Vergleich mit einer Warten-Gruppe gemessen. Kapitel 3.3 präsentiert eine Korellationsanalyse (Studie III), bei der die Beziehung zwischen der frontalen Gehirnasymmetrie und posttraumatischer Reifung untersucht wurde. Am Ende der Arbeit (Kapitel 4) werden die Ergebnisse zusammengefasst und in Bezug auf (1) die state/trait-Debatte im Rahmen der Asymmetrie-Forschung diskutiert sowie (2) ein Bezug zu aktuellen psychologische Theorien von PTSD und PTG hergestellt. Außerdem wird der Nutzen von neurobiologischer Forschung für die Psychotherapie besprochen. Dabei werden Vorschläge für zukünftige Projekte für die "Gehirn"-Forschung im Zusammenhang mit der PTBS, deren Behandlung und PTG gemacht.

Das Dokument enthält eine fehlerhafte Darstellung der Abbildung 3.3 (Seite 38). DieOriginalabbildung ist dem entsprechenden Fachartikel im Scandinavian Journal of Medicineand Science in Sports zu entnehmen:Mersmann, F., Bohm, S., Schroll, A., Boeth, H., Duda, G., Arampatzis, A. (2015): Muscleshape consistency and muscle volume prediction of thigh muscles. Scandinavian Journal ofMedicine & Science in Sports, 25: e208–e213 doi: 10.1111/sms.12285.The document contains a corrupted rendering of figure 3.3 (page 38). The original figurecan be obtained in the respective journal article:Mersmann, F., Bohm, S., Schroll, A., Boeth, H., Duda, G., Arampatzis, A. (2015): Muscleshape consistency and muscle volume prediction of thigh muscles. Scandinavian Journal ofMedicine & Science in Sports, 25: e208–e213 doi: 10.1111/sms.12285. / Bei jugendlichen Athleten wirken sowohl die körperliche Reifung als auch die erhöhte mechanische Belastung auf die Entwicklung des Muskel- und Sehnengewebes. Die Interaktion dieser beiden adaptationswirksamen Stimuli könnte, insbesondere bei Sportlern aus Sprungdisziplinen, Dysbalancen des Kraftpotenzials der Muskulatur und der Widerstandsfähigkeit der Sehne auslösen und somit potentiell das Verletzungsrisiko der Sehne erhöhen. Vor diesem Hintergrund untersucht die vorliegende Arbeit mittels Magnetresonanztomographie, Ultraschall und Dynamometrie die Entwicklung der morphologischen und mechanischen Eigenschaften der Knieextensoren und der Patellarsehne bei jugendlichen Kader-Volleyballathleten. Durch eine Querschnitts- und zwei Längsschnittstudien konnte Evidenz dafür erbracht werden, dass sich unter dem Einfluss der sportartspezifischen Belastung Kraft und Morphologie des Muskels in Relation zu den mechano-morphologischen Eigenschaften der Patellarsehne bei den jugendlichen Athleten nicht ausgewogen entwickeln, was zu einer erhöhten chronischen Belastung und Beanspruchung des Sehnengewebes führt. Darüber hinaus können muskulotendinöse Dysbalancen im Trainingsprozess durch erhöhte Fluktuationen der Muskelkraft und einer nicht-adäquaten Modulation der Widerstandsfähigkeit der Sehne zu episodischen Spitzen der mechanischen Beanspruchung der Sehne führen. Eine derart unausgewogene Entwicklung von Muskel und Sehne könnte für die Ausprägung von Überlastungsbeschwerden in der hier untersuchten Risikogruppe für Tendinopathien prädisponieren. Im Rahmen der Forschungsbemühungen wurde darüber hinaus ein Verfahren zur Vorhersage des Volumens von Oberschenkelmuskeln auf der Basis einfach zu erhebender Parameter entwickelt. Durch das Verfahren ließe sich zukünftig der Zeit- und Kostenaufwand muskelmorphologischer Diagnostik deutlich reduzieren. / In adolescent athletes, the development of muscle and tendon tissue is influenced both by maturation and mechanical loading. The interaction of these two driving stimuli could initiate imbalances in the development of the muscle strength capacity and tendon stiffness, especially in athletes from sports that feature a high frequency of jumps. A consequence could be an increased mechanical demand placed upon the tendon by the working muscle, which might increase the risk of tendon injury. Considering the lack of information on the effects of maturation and superimposed mechanical loading on the muscle-tendon unit during adolescence, the present work examines the development of the morphological and mechanical properties of the knee extensors and patellar tendon in adolescent elite volleyball athletes by means of magnetic resonance imaging, ultrasound and dynamometry. A cross-sectional comparison and two longitudinal studies provided evidence that the two-fold stimulus of sport-specific loading and maturation results in and imbalanced development of muscle strength and morphology in relation to the mechano-morphological properties of the patellar tendon in mid-adolescent volleyball athletes and results in increased tendon stress and strain. Moreover, during a training process, fluctuations of muscle strength and an inadequate modulation of tendon stiffness initiate episodes of high-level tendon strain during maximum muscle contractions. Such an imbalanced development of muscle and tendon could predispose for the development of tendon overuse injury in adolescent volleyball athletes, which are known to be at high risk of developing tendinopathy. Moreover, in the context of the described research endeavour, a method for the volume prediction of thigh muscles on the basis of easily measurable parameters has been developed, which could greatly reduce the time and costs involved in the diagnostics of muscle morphology in the future.

Micro RNA sind nicht-kodierende dsRNA ~22 Nukleotiden lang, die eine wichtige Rolle in der Entwicklung und Regulation in beinahe allen Eukaryoten spielen. MiRNAs binden target mRNA, was zu einer Blockierung der Proteintranslation führt. Viele Krankheiten sind bekannt, die durch veränderte miRNA Expressionsmuster entweder beeinflusst oder verursacht werden. Demnach könnte eine Manipulation der miRNA-Bildung einen therapeutischen Ansatz darstellen. MiRNA werden im Zytoplasma von längeren haarnadelförmigen prekursor RNA (pre-miRNA) durch das Enzym Dicer freigsetzt. Inhibition dieser Spaltung könnte durch spezifische pre-miRNA-bindende Moleküle erfolgen. Selektive Binder der pre-miRNA als Inhibitoren der miRNA-Reifung können durch testen von Substanzbibliotheken mit Hochdurchsatzscreening (HTS) gefunden werden. Diese Arbeit beschreibt den ersten homogenen Assay der miRNA-Reifung. Eine Fluoreszenzsonde in Form einer pre-miRNA wurde benutzt, die einen 5´-Fluorophor (FAM, Cy3, oder TMR) und einen 3´-Quencher (DABCYL) aufweist. Durch die nahe Nachbarschaft von Fluorophor und Quencher in der nativen Haarnadelstruktur erfolgt Fluoreszenzlöschung. Dicer spaltet diese Struktur effizient, was zur Dissoziation von Fluorophor und Quencher und somit zu einem Fluoreszenzanstieg führt. Der Assay wurde für HTS optimiert. Die ersten Verbindungen wurden auf deren Inhibition der miRNA-Reifung getestet. Mit einem Duplexassay, wobei zwei unterschiedliche pre-miRNA Sonden mit verschiedenen Fluorophoren eingesetzt wurden, konnte etwas spezifische Inhibition gezeigt werden. Der Assay wurde in Zellen durchgeführt und der Fluoreszenzanstieg mit Fluoreszenzmikroskopie detektiert. Somit ist ein Zell-basiertes Screening von Inhibitoren möglich. Eine einfachere Synthese der Sonde mittels in vitro Transkription und anschließender enzymatischen Ligation wurde entwickelt. Verwendung des Assays um hoch selective Inhibitoren der miRNA-Reifung zu entdecken könnte zu therapeutischen Ansätzen führen. / Micro RNAs (miRNAs) are non-coding dsRNAs of ~22 nucleotides that play a vital role in development and regulation in nearly all eukaryotes. MiRNAs bind target mRNA, thus blocking protein translation. Many diseases have been found to be influenced or caused by aberrant expression of miRNAs. A manipulation of miRNA formation may have therapeutic potential. MiRNAs are cleaved from longer hairpin precursor RNA (pre-miRNA) in the cytoplasm by the enzyme Dicer. It might be possible to inhibit this cleavage through specific pre-miRNA binding molecules. Selective binders of pre-miRNA as inhibitors of miRNA maturation can be found by testing large libraries of substances through high throughput screening (HTS) using an appropriate assay. This work describes the first homogenous assay of miRNA maturation. A fluorescent probe in the form of a pre-miRNA containing a 5´-fluorophore (FAM, Cy3, or TMR) and a 3´-quencher (DABCYL) was used. This ‘beacon’ in its native hairpin formation brings the fluorophore and quencher moieties into close proximity, resulting in fluorescence quenching. Dicer efficiently cleaves this structure, leading to dissociation of fluorophore and quencher and thus a fluorescence increase. In the presence of an RNA ligand that blocks cleavage, a lower fluorescence increase is seen. The assay was optimized for HTS. The first compounds were tested for their inhibition of miRNA maturation. Using a duplex assay, with two different pre-miRNA probes each containing a different fluorogenic group, some specific inhibition was shown. The assay was performed in cells using fluorescence microscopy to measure the fluorescence. This would allow for a cell-based screening of inhibitors. A simpler approach of beacon synthesis using in vitro transcription followed by enzymatic ligation was also established. Use of this assay to discover highly selective inhibitors of miRNA maturation may lead to disease therapeutics.

Die Bildung infektiöser Viruspartikel des humanen Zytomegalievirus (HCMV) ist ein mehr-stufiger Prozess. Sie beginnt mit der Verpackung der DNA in die Kapside im Kern, gefolgt von weiterer Reifung während des Transports durch das Zytoplasma und der abschließenden Freisetzung aus der Zelle. Im Zuge dieser Arbeit wurden zwei Proteine, die Einfluss auf die ebengenannten Prozesse haben, analysiert. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der funktionellen Charakterisierung des HCMV Pro-teins pUL77. Es ist bekannt, dass das homologe Protein pUL25 in alpha-Herpesvirinae essentiell für die DNA-Verpackung ist. Zunächst konnte das Protein als Kapsid-assoziiertes strukturelles Protein identifiziert werden. Es wurden Interaktionen von pUL77 mit DNA-Verpackungs- und Kapsidproteinen gezeigt. Weiterhin wurde die DNA-Bindungsfähigkeit von pUL77 in verschiedenen „in vitro“-Experimenten untersucht. Zusammengefasst weisen unsere Ergebnisse auf eine Funktion von HCMV pUL77 bei der DNA-Verpackung hin. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das HCMV Protein pUL71 charakterisiert, das in allen Herpesviren konserviert vorkommt, dessen Funktion jedoch nicht charakterisiert ist. Zunächst wurde das Protein als strukturelles Tegumentprotein mit “earlylate“ Expressionskinetik klassifiziert. Weiterhin wurden die subzelluläre Lokalisation sowie virale und zelluläre Interaktionspartner untersucht. Die Ergebnisse weisen auf eine Funktion von HCMV pUL71 bei der Reifung und beim Transport der Virionen im Zytoplasma hin. „In silico“-Vorhersagen zeigten ein „Leuzin Zipper“-Motiv in pUL71, das als mögliche Oligomerisationsdomäne dienen könnte. Mutationen wurden in dieses Motiv eingebracht und die resultierenden Proteine auf ihre Oligomerisationsfähigkeit mit „in vitro“-Methoden und in rekombinanten Viren untersucht. Zusammenfassend konnten wir zeigen, dass das „Leuzin Zipper“-Motiv wichtig für die Funktion von pUL71 ist und diese mit einer unbeeinträchtigten Oligomerisation des Proteins zusammen hängt. / The morphogenesis of Human cytomegalovirus (HCMV) virions starts with the capsid assem-bly and DNA insertion in the nucleus followed by maturation during transport through the cytoplasm prior to release of virus progeny. In this study we are functionally characterising two proteins that are involved in those steps. The function of essential HCMV protein pUL77 is characterised in the first part of the study. HCMV pUL77 was shown to be a structural protein associated with capsids. Furthermore, our experiments demonstrated that HCMV pUL77 interacts with DNA packaging motor compo-nents and capsid proteins. The ability of HCMV pUL77 to bind double-stranded DNA was studied in “in vitro” assays designed for this study. The homologue α-Herpesvirinae protein pUL25 is described to be involved in processes connected with DNA packaging. Data ob-tained in this study demonstrates that HCMV pUL77 might serve a similar function. In the second part of the study HCMV pUL71, conserved throughout the Herpesvirus family but to date unclassified, was functionally characterised. HCMV pUL71 was defined a struc-tural tegument protein with early-late expression kinetics. We studied the sub-cellular local-isation and interactions of pUL71 with a subset of cellular and viral proteins. Thereby we could show that HCMV pUL71 function might be connected with processes of viral egress. By in silico analyses we identified a leucine zipper motif in pUL71 that might serve as a puta-tive oligomerisation domain. In order to investigate the function of the leucine zipper motif, we performed in vitro assays and investigated the alterations of the motif in the viral context. Taken together we can conclude that (i) an intact leucine zipper motif is crucial for the func-tion of pUL71 and (ii) this function is dependent upon undisturbed oligomerisation of the pro-tein.

In den letzten Jahrzehnten ist die Zahl der Erwachsenen und Jugendlichen, die an nicht organisierten oder wettbewerbsorientierten Sportarten teilnehmen, gestiegen. In der Pubertät beeinflussen sowohl hormonelle Veränderungen als auch mechanische Belastungen die Entwicklung von Muskeln und Sehnen. Derzeit gibt es keine Informationen über die Interaktion dieser beiden Stimuli, aber es besteht die Vermutung, dass im Zuge der Pubertät bei Athleten und Nicht-Athleten im Vergleich zu Muskelkraft und Sehnensteifigkeit ungleiche Verhältnisse auftreten können. Die Folge dieses Ungleichgewichts könnte eine höhere mechanische Belastung für die Sehnen sein, was weiter zu Verletzungen führen kann. Angesichts der unzureichenden Beweise für die Entwicklung des muskulotendinösen Gewebes während der Pubertät und des Mangels an Kenntnissen darüber, wie die Reifung die Muskel-Sehnen-Einheit, insbesondere die Interaktion mit überlagerten mechanischen Belastungen, beeinflusst, untersucht diese Arbeit die morphologische und mechanische Entwicklung von Knieextensoren und Patellasehne, indem Nicht-Athleten und Athleten aus drei Altersgruppen verglichen werden (frühe Pubertät: 12–14 Jahre, engl.:EA; späte Pubertät: 16–18 Jahre, engl.: LA; Erwachsene: 20–35 Jahre, engl.: YA). Athleten erreichten häufiger Dehnungsgrößen von mehr als 9% Dehnung im Vergleich zu Nicht-Athleten, was auf einen erhöhten mechanischen Bedarf an der Sehne hinweist. Obwohl das Training die Eigenschaften der M. quadriceps femoris-Sehnen-Einheit verbessert, bleibt ihre Entwicklung von früher Pubertät bis zum Erwachsenenalter bei Athleten und Nicht-Athleten ähnlich, mit dem Hauptunterschied zwischen früher Pubertät und später Pubertät. Alter und sportliches Training waren jedoch mit einer höheren Prävalenz von Ungleichgewichten innerhalb der Muskel-Sehnen-Einheit und einer damit einhergehenden erhöhten mechanischen Belastung oder Beanspruchung für die Patellasehne verbunden. / In recent decades, the number of adults and especially adolescents who participate in some kind of non-organized or competitive sports has been increasing. During adolescence, the development of muscle and tendons is affected both by maturation, due to hormonal changes, and by mechanical loading. However, there is no information currently on the interaction of this double fold stimulus although there is reason to believe that during adolescence in athletes and non-athletes there may be imbalances developing between muscle strength capacity and tendon stiffness. The result of this imbalance could be the tendon exposure to high mechanical demand by the associated working muscles, which might further lead to tendon injury. Considering the not satisfactory evidence of the musculotendinous tissue development during adolescence, and the lack of knowledge about how maturation affects the muscle-tendon unity, especially in interaction with superimposed mechanical loading, this thesis investigates the morphological and mechanical development of the knee extensors and patellar tendon, by comparing non-athletes and athletes in three different age groups (i.e., early adolescents: EA 12–14 years; late adolescents: LA 16–18 years, and young adults: YA 20–35 years). Athletes were more likely to reach strain magnitudes higher than 9% strain compared to non-athlete controls indicating an increased mechanical demand for the tendon. Although athletic training enhances the properties of the quadriceps femoris muscle-tendon unit, their development from early-adolescence to adulthood remains similar in athletes and non-athletes with the major alterations between early and LA. However, both age and athletic training were associated with a higher prevalence of imbalances within the muscle-tendon unit and a resultant increased mechanical demand for the patellar tendon.

miRNA sind kurze 21 – 23 nukleotidlange nicht kodierende RNAs endogenen Ursprungs und regulieren auf post-transkriptionaler Ebene die Genexpression. Da aberrante Expressionsmuster der miRNAs im Zusammenhang mit verschiedenen Krankheiten stehen, ist das Interesse groß, Kontrolle über die miRNA-vermittelte Genexpression zu erhalten. Bei Krankheitsbildern, die eine Überexpression der miRNA aufweisen, kann die Inhibition der miRNA Reifung als Therapieansatz dienen. Inhibition kann z. B. durch peptidische Strukturen und durch small molecules, wie Aminoglykoside erfolgen. Ziel dieser Arbeit war die nahezu vollständig festphasenbasierte Synthese von zyklischen Peptiden und Peptid-Aminoglykosid-Konjugaten als potentielle Inhibitoren der miRNA Reifung. Ferner sollte die Guanidinylierung an fester Phase mit verschiedenen Testsubstraten gezeigt werden. In der vorliegenden Arbeit wurden im ersten Teilprojekt zehn zyklische Peptide mit Hilfe eines bisfunktionalen Linkermoleküls in den Seitenketten zweier im Peptid enthaltener Cysteine synthetisiert und isoliert. Basierend darauf wurden neun weitere zyklische Peptide an fester Phase synthetisiert, mit ausgewählten Aminoglykosiden in einer CuAAC gebunden und erfolgreich isoliert. Im zweiten Teilprojekt dieser Arbeit wurde die Guanidinylierung an fester Phase mittels des Goodman’s Reagent gezeigt. In ersten Studien wurden vier Testpeptide an fester Phase guanidinyliert. Im Anschluss wurde die Limitierung dieser Methode geprüft. Dazu wurden Aminoglykoside mittels CuAAC an verschiedene Peptid- und Peptid PNA-Rückgrate geknüpft und guanidinyliert. Nicht für alle Substrate konnte die vollständige Guanidinylierung an fester Phase gezeigt werden. Ein weiteres Teilprojekt zeigte die Funktionalisierung von kommerziell erhältlichen Polymeren für die SPPS in Hinsicht auf fluorophorbasierte „Hochdurchsatz Screening-Methoden“. Dazu wurde ein peptidischer Spacer entworfen, der eine Knüpfungsstelle für Fluorophore mittels CuAAC enthielt. / miRNA are short long non-coding RNAs endogenous origin with a length of 21 – 23 nucleotides. MicroRNAs regulate the gene expression on post-transcriptionally level. Starting in the nucleus, primary transcripts are processed into precursor-miRNAs. Accordingly, the miRNA matures after export into cytosol. Since aberrant expression patterns are related to different diseases, it’s from interest to gain control about miRNA mediated gene expression. Some diseases are related to over expression of miRNA. For that reason, the inhibition of the miRNA maturing is object of research. The inhibition can be resulted from peptide structures or with small molecules like aminoglycosides. Aim of this work was the solid phase synthesis of cyclic peptides derivatives and peptide aminoglycoside conjugates as potential inhibitors of the miRNA maturing. In addition, the guanidinylation on solid phase should be evidenced with different substrates. In the first part of the project ten cyclic peptides were synthesized on solid phase. The cyclization was carried out with a bifunctional linking molecule in the side chains of two cysteines. Based on that nine cyclic peptides were synthesized and elected aminoglycosides were bound with help of CuAAC. The second part of this work showed the guanidinylation on solid phase by using Goodman’s reagent under mild conditions. Four peptides were used for initial studies. Due to the success of this method the limit was evaluated. Therefore, aminoglycosides were bound via CuAAC to different peptide and peptide-PNA backbones. By mischance, not all the chosen substrates were fully guanidinylated on solid phase. A further short project showed the functionalization of commercially available resins for solid phase peptide synthesis in relation to fluorophore based high throughput screening methods. For this purpose, a peptide spacer was devised with a binding site for fluorophores via CuAAC.

Biological cells consist of many subunits that form distinct compartments and work together to allow for life. These compartments are clearly separated from each other and their sizes are often strongly correlated with cell size. Examples for those structures are centrosomes, which we consider in this thesis. Centrosomes are essential for many processes inside cells, most importantly for organizing cell division, and they provide an interesting example of cellular compartments without a membrane. Experiments suggest that such compartments can be described as liquid-like droplets. In this thesis, we suggest a theoretical description of the growth phase of centrosomes. We identify a possible mechanism based on phase separation by which the centrosome may be organized. Specifically, we propose that the centrosome material exists in a soluble and in a phase separating form. Chemical reactions controlling the transitions between these forms then determine the temporal evolution of the system. We investigate various possible reaction schemes and generally find that droplet sizes and nucleation properties deviate from the known equilibrium results. Additionally, the non-equilibrium effects of the chemical reactions can stabilize multiple droplets and thus counteract the destabilizing effect of surface tension. Interestingly, only a reaction scheme with autocatalytic growth can account for the experimental data of centrosomes. Here, it is important that the centrioles found at the center of all centrosomes also catalyze the production of droplet material. This catalytic activity allows the centrioles to control the onset of centrosome growth, to stabilize multiple centrosomes, and to center themselves inside the centrosome. We also investigate a stochastic version of the model, where we find that the autocatalytic growth amplifies noise. Our theory explains the growth dynamics of the centrosomes of the round worm Caenorhabditis elegans for all embryonic cells down to the eight-cell stage. It also accounts for data acquired in experiments with aberrant numbers of centrosomes and altered cell volumes. Furthermore, the model can describe unequal centrosome sizes observed in cells with disturbed centrioles. Our example thus suggests a general picture of the organization of membrane-less organelles. / Biologische Zellen bestehen aus vielen Unterstrukturen, die zusammen arbeiten um Leben zu ermöglichen. Die Größe dieser meist klar voneinander abgegrenzten Strukturen korreliert oft mit der Zellgröße. In der vorliegenden Arbeit werden als Beispiel für solche Strukturen Zentrosomen untersucht. Zentrosomen sind für viele Prozesse innerhalb der Zelle, insbesondere für die Zellteilung, unverzichtbar und sie besitzen keine Membran, welche ihnen eine feste Struktur verleihen könnte. Experimentelle Untersuchungen legen nahe, dass solche membranlose Strukturen als Flüssigkeitstropfen beschrieben werden können. In dieser Arbeit wird eine theoretische Beschreibung der Wachstumsphase von Zentrosomen hergeleitet, welche auf Phasenseparation beruht. Im Modell wird angenommen, dass das Zentrosomenmaterial in einer löslichen und einer phasenseparierenden Form existiert, wobei der Übergang zwischen diesen Formen durch chemische Reaktionen gesteuert wird. Die drei verschiedenen in dieser Arbeit untersuchten Reaktionen führen unter anderem zu Tropfengrößen und Nukleationseigenschaften, welche von den bekannten Ergebnissen im thermodynamischen Gleichgewicht abweichen. Insbesondere verursachen die chemischen Reaktionen ein thermisches Nichtgleichgewicht, in dem mehrere Tropfen stabil sein können und der destabilisierende Effekt der Oberflächenspannung unterdrückt wird. Konkret kann die Wachstumsdynamik der Zentrosomen nur durch eine selbstverstärkende Produktion der phasenseparierenden Form des Zentrosomenmaterials erklärt werden. Hierbei ist zusätzlich wichtig, dass die Zentriolen, die im Inneren jedes Zentrosoms vorhanden sind, ebenfalls diese Produktion katalysieren. Dadurch können die Zentriolen den Beginn des Zentrosomwachstums kontrollieren, mehrere Zentrosomen stabilisieren und sich selbst im Zentrosom zentrieren. Des Weiteren führt das selbstverstärkende Wachstum zu einer Verstärkung von Fluktuationen der Zentrosomgröße. Unsere Theorie erklärt die Wachstumsdynamik der Zentrosomen des Fadenwurms Caenorhabditis elegans für alle Embryonalzellen bis zum Achtzellstadium und deckt dabei auch Fälle mit anormaler Zentrosomenanzahl und veränderter Zellgröße ab. Das Modell kann auch Situationen mit unterschiedlich großen Zentrosomen erklären, welche auftreten, wenn die Struktur der Zentriolen verändert wird. Unser Beispiel beschreibt damit eine generelle Möglichkeit, wie membranlose Zellstrukturen organisiert sein können.

Severe motor vehicle accidents (MVAs) represent one of the most often occurring psychological traumas, and are a leading cause of Posttraumatic Stress Disorder (PTSD). However, not all persons develop PTSD after traumatic events and a great proportion of patients who show symptoms initially recover over time. This has stimulated research of psychological and biological factors that explain development and maintenance of the disorder. Fortunately, this highly distressing condition can be effectively treated, e.g. via cognitive behavioral therapy (CBT). However, brain mechanisms underlying changes due to psychological therapy in PTSD are almost unknown (Roffman, Marci, Glick, Dougherty, & Rauch, 2005). On the other hand there are observations of positive changes following trauma called Posttraumatic Growth (PTG), which have stimulated research of associated psychological processes and factors. However, there is a lack of research about the relation of biological variables (e.g. measures of brain function) and PTG. Theories of brain asymmetry and emotion (Davidson, 1998b, 2004b; Heller, Koven, & Miller, 2003) propose that asymmetries of brain activation are related to certain features of human emotion (e.g. valence, approach or withdrawal tendencies, arousal). Whereas an enormous increase in the understanding of structural and functional abnormalities in PTSD could be achieved in the last decades due to neuroimaging research, there are still numerous unanswered questions. Especially, there is only little research explicitly examining activation asymmetries in PTSD. Furthermore, as mentioned, research is sparse investigating alterations of brain function that are associated with successful psychological treatment of PTSD. Finally, there is no published study examining how measures of brain function are related to PTG. This thesis presents 3 studies investigating electroencephalographic (EEG) asymmetries in survivors of severe motor vehicle accidents. The first part of the thesis (chapter 2) is devoted to a literature review about description (chapter 2.1), epidemiology (chapter 2.2 and 2.3), risk factors (chapter 2.4), psychological theories (chapter 2.5), biological mechanisms particularly neuroimaging findings (chapter 2.6), and treatment of PTSD (chapter 2.7.). Chapter 2.8 gives a short review on definition and research of Posttraumatic Growth. Chapter 2.9 provides an overview of models and research regarding brain asymmetry and emotion. In chapter 3.1, a study is presented that investigated hemispheric asymmetries (EEG alpha) among MVA survivors with PTSD, with subsyndromal PTSD, and without PTSD as well as non-exposed healthy controls during a baseline condition and in response to neutral, positive, negative, and trauma-related pictures (study I). Next, the findings of study II are presented (chapter 3.2). This study examined the effect of cognitive behavioral therapy on measures of EEG activity. Therefore, EEG activity before and after CBT in comparison to an assessment only Wait-list condition was measured. In chapter 3.3 a correlational study (study III) is presented that examined the relationship between frontal brain asymmetry and selfreported posttraumatic growth after severe MVAs. Finally, in chapter 4 the findings are summarized and discussed with respect to (1) the state/trait debate in frontal asymmetry research and (2) current psychological theories of PTSD and PTG. In addition, the use of neuroscientific research for psychotherapy is discussed. Suggestions are presented for future goals for “brain” research of PTSD and treatment of PTSD. / Schwere Verkehrsunfälle stellen eines der am häufigsten vorkommenden psychologischen Traumata dar, und sind eine Hauptursache der Posttraumatischen Belastungsstörung (PTBS). Jedoch entwickeln nicht alle Personen nach traumatischen Ereignissen eine PTBS und bei einem Großteil remittieren anfängliche PTBS-Symptome. Dies stimulierte die Erforschung von psychologischen und biologischen Faktoren, die die Entstehung und Aufrechterhaltung der PTBS erklären. Glücklicherweise kann die PTBS effektiv, z.B über die kognitive Verhaltenstherapie (KVT), behandelt werden. Jedoch sind Gehirnmechanismen, die mit klinischen Änderungen aufgrund der psychologischen Therapie in PTSD einhergehen, nahezu unbekannt (Roffman, Marci, Glick, Dougherty, Rauch, 2005). Auf der anderen Seite gibt es Berichte von positiven Änderungen nach traumatischen Ereignissen, die als Posttraumatische Reifung (PTR) bezeichent werden. Dies hat in kürzerer Vergangenheit die Forschung von verbundenen psychologischen Prozessen und Faktoren stimuliert. Jedoch gibt es kaum Untersuchungen über die Beziehung von biologischen Variablen (z.B Messungen der Gehirnfunktion) und PTR. Diese Arbeit präsentiert 3 Studien, die electroenzephalographische (EEG) Asymmetrien bei Opfern schwerer Verkehrsunfälle untersuchten. Der erste Teil der Arbeit (Kapitel 2) widmet sich einer Literaturrezension über: die Beschreibung (Kapitel 2.1), Epidemiologie (Kapitel 2.2 und 2.3), Risikofaktoren (Kapitel 2.4), psychologische Theorien (Kapitel 2.5), biologische Mechanismen besonders Neuroimaging Ergebnisse (Kapitel 2.6), und Behandlung der PTBS (Kapitel 2.7.). Kapitel 2.8 gibt einen kurzen Überblick über die Definition und Forschung zur Posttraumatischen Reifung. Kapitel 2.9 gibt eine Übersicht zu aktuellen Modellen und empirischen Befunden bezüglich Gehirnasymmetrien und Emotionen. Kapitel 3.1 präsentiert eine Studie, in der hemisphärische Asymmetrien (im EEG-Alpha Band) bei Unfallopfern mit PTBS, subsyndromaler PTBS, und ohne PTBS sowie gesunden Kontrollpersonen ohne Unfall untersucht wurden: während einer Ruhemessung und einer Emotionsinduktions-bedingung (neutrale, positive, negative und trauma-spezifische Bilder) (Studie I). Danach werden die Ergebnisse der Studie II (Kapitel 3.2) präsentiert. Hier wurde die Wirkung der kognitiven Verhaltenstherapie auf Messungen der EEG-Aktivität untersucht. Deshalb wurde EEG-Aktivität vor und nach einer KVT im Vergleich mit einer Warten-Gruppe gemessen. Kapitel 3.3 präsentiert eine Korellationsanalyse (Studie III), bei der die Beziehung zwischen der frontalen Gehirnasymmetrie und posttraumatischer Reifung untersucht wurde. Am Ende der Arbeit (Kapitel 4) werden die Ergebnisse zusammengefasst und in Bezug auf (1) die state/trait-Debatte im Rahmen der Asymmetrie-Forschung diskutiert sowie (2) ein Bezug zu aktuellen psychologische Theorien von PTSD und PTG hergestellt. Außerdem wird der Nutzen von neurobiologischer Forschung für die Psychotherapie besprochen. Dabei werden Vorschläge für zukünftige Projekte für die "Gehirn"-Forschung im Zusammenhang mit der PTBS, deren Behandlung und PTG gemacht.