Orientador: Paulo Roberto de Madureira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T21:12:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Nascimento_PauloVictorFernandesSouza_D.pdf: 2007565 bytes, checksum: e01eda41bcffc893c044e9ae75f35532 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As infecções relacionadas à assistência à saúde são responsáveis pela elevação do custo assistencial, aumento da morbimortalidade hospitalar e aumento do tempo de internação. Uma característica peculiar dessas infecções diz respeito à resistência dos microrganismos envolvidos. Protocolos de tratamento de infecções graves, como pneumonia e sepse, indicam o uso inicial de associações antimicrobianas de largo espectro, caso o paciente apresente fatores de risco para resistência. Posteriormente, com o resultado das culturas, o esquema terapêutico inicial seria readequado. Entretanto, esse processo conhecido como "descalonamento" ocorre de forma infrequente. Assim, no momento da escolha inicial dos antimicrobianos para o tratamento de síndromes infecciosas graves, os profissionais se deparam com um dilema: Utilizar um esquema de amplo espectro para a maior proteção do paciente, mas que raramente será revisto e contribuir para o aumento da resistência da microbiota hospitalar, ou tentar o uso de esquemas menos abrangentes? Com o objetivo de auxiliar o médico nesse momento da prescrição, procurou-se identificar possíveis características dos pacientes que pudessem servir como fatores preditores para infecção ou colonização para microrganismos multirresistentes. Em um hospital geral de 90 leitos, na cidade de São José dos Campos, no Estado de São Paulo, Brasil, foi conduzido um estudo de caso-coorte, entre junho de 2009 e junho de 2011, em que todos os pacientes que realizaram pelo menos um exame de cultura foram incluídos (753 pacientes). Os casos foram definidos como todos os pacientes que apresentaram culturas clínicas com o isolamento de pelo menos um microrganismo multirresistente (146 pacientes). A multirresistência foi definida conforme o consenso do Centro de Controle de Infecções e Doenças dos Estados Unidos da América em associação com o Centro Europeu para Prevenção e Controle de Doenças. Os controles foram todos os pacientes que se submeteram a culturas as quais não demonstraram crescimento de um agente multirresistente. Foram avaliadas quatorze variáveis demográficas e clínicas, comumente identificadas como fatores de risco. Foram construídos três modelos de predição clínica: regressão logística, árvore de classificação e floresta aleatória. No modelo de regressão logística, em função de intensa colinearidade, optou-se pela eliminação das variáveis pelo método backward. Na validação interna deste modelo, foi utilizada a técnica de reamostragem por bootstrap. O novo modelo foi calibrado com um fator de shrinkage de 0,91. Os modelos de árvore de classificação e floresta aleatória identificaram, de maneira semelhante, as variáveis mais importantes para predição que foram: história de internação nos últimos 180 dias, tempo de internação até a realização da cultura, Índice de comorbidades de Charlson, presença de cateter nasoentérico, traqueostomia e cateter venoso central. Foi realizada a validação externa temporal com uma nova amostra coletada entre julho e dezembro de 2011, num total de 342 pacientes. As acurácias dos modelos de regressão logística, árvore de classificação e floresta aleatória foram avaliadas por curvas ROC (Receiver operating characteristic). As áreas sobre a curva foram respectivamente: 72,4%, 66,2% e 69,2%. O modelo final da regressão logística com o total de pacientes estudados (1092) apresentou uma área sob a curva ROC corrigida do otimismo de 77,1% / Abstract: Healthcare-associated infections are responsible for rising health care costs, increasing morbidity, mortality, and longer hospital stays. A peculiar characteristic of such infections is the resistance of the involved microorganisms. The presence of infectious agents resistant to multiple classes of antimicrobials is increasing in such infections. Thus, multidrug resistance brings a real challenge to everyday clinical practice. Protocols for treatment of severe infections such as pneumonia and sepsis indicate the use of broad-spectrum antimicrobial associations as the initial therapy if the patient has a risk factor for resistance. Later, with the result of cultures, an adjustment of the initial therapeutic regimen would be expected. However, this process, known as de-escalation, occurs infrequently. Thus, at the moment of choosing the initial antibiotics for treating serious infectious syndromes, physicians are challenged with a dilemma: either to prescribe broad-spectrum antibiotics and contribute to increasing antibiotic resistance or to use a narrow spectrum of antimicrobials and put patients' prognosis at risk. The aim of this study was to identify potential predictors for the harboring of multidrug-resistant bacteria and to build a clinical prediction model that could help physicians to recognize patients with different risks for infection or colonization by these microorganisms. We conducted a case-cohort study in a 90-bed general hospital, at São José dos Campos, São Paulo State, Brazil, with all patients that performed at least one culture (753 patients). Cases were defined as patients that had had a culture demonstrating a multi-resistant agent (146 patients). Controls were all other patients that had had at least one culture. The consensus definition from the Center for Disease Control and the European Centre for Disease Prevention and Control was used to describe antibiotic multi-resistance. Fourteen traditional risk factors were evaluated as predictors. We constructed three clinical prediction models: logistical regression, classification tree, and random forest. In the logistical regression model, due to severe collinearity, we chose to eliminate variables by the backward method. In this model, for internal validation, we used the bootstrap resampling procedure. The new model was calibrated with the use of a shrinkage factor of 0.91. Similarly, the classification tree and random forest models identified that the most important variables for prediction were: admission history of 180 days, tube feeding, and length of hospital stay before culture, Charlson comorbidity index, central venous catheter, and tracheostomy. A temporal external validation was performed with a new sample collected between July and December 2011, with 342 patients. The accuracies of logistic regression, classification tree and random forest models were evaluated by ROC (Receiver operating characteristic) curves. The areas under the curve were 72.4%, 66.2% and 69.2%, respectively. The final logistical regression model with the overall study population (1092 patients) is described and shows an optimism-corrected area under the ROC curve of 77.1% / Doutorado / Epidemiologia / Doutor em Saude Coletiva

O descobrimento do primeiro antimicrobiano foi início do desenvolvimento de inúmeros antimicrobianos. No entanto, proporcionalmente a amplitude deste arsenal terapêutico, o seu consumo tornou-se excessivo e inadequado, levando ao quadro atual, no qual a resistência das bactérias a estes medicamentos vem dificultando a farmacoterapia de doenças infecciosas. Assim, o estudo do consumo destes medicamentos deve ser realizados para que estratégias sejam elaboradas no combate ao uso irracional de antimicrobianos. Portanto, o objetivo deste estudo é avaliar o consumo de antimicrobianos com finalidades terapêuticas e profiláticas em um hospital de alta complexidade por um período equivalente a um ano, bem como de seus respectivos setores de internação. Sendo assim, decidiu-se realizar um estudo observacional, retrospectivo, descritivo com desenho transversal no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP com pacientes adultos internados que receberam prescrição de antimicrobianos durante o ano de 2014. A coleta de dados será realizada por meio dos sistemas eletrônicos de informação do hospital. Assim, os dados coletados consistiram no registro dos pacientes, nas informações sociodemográficas, nas informações sobre a internação do paciente, resultados dos exames de cultura e antibiograma, e informações sobre a prescrição do antimicrobiano. A análise descritiva dos dados sociodemográficos, de internação, dos resultados dos exames, e da prescrição de antimicrobianos foi feita por meio de medidas resumos (média e desvio padrão) e distribuição de frequências absoluta e relativa. A comparação das médias de consumo entre os grupos profilaxia x tratamento e tratamento empírico x direcionado foi feita pelo teste t de Student para amostras dependentes. A Análise de Componentes Principais e análise de agrupamentos por método hierárquico foram ferramentas utilizadas para a análise exploratória do consumo de antimicrobianos profiláticos. Foram encontrados 7287 pacientes com 90475 prescrições de antimicrobianos (entre prescrições profiláticas, terapêutica empírica e direcionada). O consumo de antimicrobianos profiláticos abrange 11,7% de todo o consumo destes medicamentos, sendo que mais da metade deste consumo provém da ortopedia, unidade de terapia intensiva pós-operatória e unidade pós-operatória tórax e cardiovascular, além disso a cefazolina foi o medicamento mais consumido para profilaxia (52,0%). Dentre o consumo para o tratmento, 84% aconteceu de maneira empírica com utilização de antimicrobianos de amplo espectro de ação. Ao observar os antimicrobianos utilizados de maneira direcionada, destaca-se o aparecimento da oxacilina, polimixina B e os aminoglicosídeos. Diante dos resultados, há um elevado consumo profilático de antimicrobianos em alguns setores de internação, além de uma proporção maior de consumo no tratamento empírico, assim maiores investigações devem ser feitas para entender o comportamento deste excesso na utilização destes medicamentos / The discovery of the first antimicrobial was the beginning of the development of numerous antimicrobials. However, proportionately the amplitude of this therapeutic arsenal, its consumption has become excessive and inadequate, leading to the current situation, in which the resistance of bacteria to these drugs has been making difficult the pharmacotherapy of infectious diseases. Thus, the study of the consumption of these drugs must be carried out so that strategies are developed in the fight against the irrational use of antimicrobials. Therefore, the objective of this study is to evaluate the consumption of antimicrobials for therapeutic and prophylactic purposes in a hospital of high complexity for a period equivalent to one year, as well as of their respective sectors of hospitalization. Therefore, it was decided to carry out a study observational, retrospective, descriptive and cross-sectional study at Hospital das Clínicas of the Medical School of Ribeirão Preto - USP with hospitalized adult patients who received antimicrobial prescription during the year 2014. The data collection will be performed through the hospital\'s electronic information systems. Thus, the data collected consisted of patient registration, sociodemographic information, patient hospitalization information, culture and antibiogram examination results, and information on antimicrobial prescription. Descriptive analysis of sociodemographic data, hospitalization, test results, and antimicrobial prescription was done by means of summary measures (mean and standard deviation) and absolute and relative frequency distribution. The comparison of the means of consumption between the prophylaxis vs treatment groups and empirical x direct treatment was done by the Student t test for dependent samples. The Principal Component Analysis and Hierarchical grouping analysis were tools used for the exploratory analysis of prophylatic antimicrobial consumption. We found 7287 with 90475 antimicrobial prescriptions (between prophylactic prescriptions, empirical and targeted therapy). The consumption of prophylactic antimicrobials covers 11.69% of all consumption of these drugs, and more than half of this consumption comes from orthopedics, a postoperative intensive care unit and a postoperative chest and cardiovascular unit. In addition, cefazolin was the Most commonly used medication for prophylaxis (52%). Among the consumption for the treatment, 84% happened in an empirical way with the use of broad-spectrum antimicrobial agents. When looking at the antimicrobials used in a targeted manner, we highlight the appearance of oxacillin, polymyxin B and aminoglycosides. In view of the results, there is a high prophylaxis of antimicrobial use in some hospitalization sectors, in addition to a greater proportion of consumption in empirical treatment, so further investigations should be made to understand the behavior of this excess in the use of these drugs

No presente trabalho avaliamos fenotípica e molecularmente isolados de P. vivax da Amazônia Ocidental Brasileira. A avaliação fenotípica de sensibilidade à cloroquina (CQ) foi realizada por meio do ensaio de maturação de esquizonte. A avaliação molecular efetuou-se por tipagem de cinco polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) não-sinônimos do gene pvmdr-1 (A266G, A1498G, A2722C, A2927T e T3226C) e variações no número de cópias deste gene. Em decorrência, o fenótipo de susceptibilidade à CQ nos 36 isolados analisados não foi estabelecido devido ao escasso desenvolvimento ex-vivo dos parasitos. Mutações na posição Y976F, potencialmente associada à resistência à CQ, não foram observadas nos 80 isolados testados. Além disso, 10% das amostras apresentaram a mutação F1076L, que frequentemente acompanha a mutação Y976F. Finalmente, apenas dois isolados (0,9%) dos 215 analisados apresentaram duas cópias do gene pvmdr-1, sugerindo que a duplicação gênica, potencial mecanismo de resistência à mefloquina, ainda não está disseminada nas populações de parasitos desta região. / In this study, we performed a molecular and phenotypic evaluation of isolates of P. vivax from Brazilian Western Amazon. The phenotypic evaluation of chloroquine (CQ) sensitivity was performed using the schizont maturation assay. The molecular evaluation was made by typing of five non-synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the pvmdr-1 gene (A266G, A1498G, A2722C, T3226C and A2927T) and variations of the copy number of this gene. As a result, the CQ susceptibility phenotype in 36 isolates of P. vivax analyzed was not established, due to the scarce ex-vivo development of the parasites. Mutations at position Y976F, potentially associated with CQ resistance, were not observed in 80 isolates tested. In addition, 10% of the isolates had the mutation F1076L, which often accompanies the mutation Y976F. Finally, two isolates (0,9%), from a total of 215 had two copies of the pvmdr-1 gene, suggesting that the gene duplication, a potential mechanism of mefloquine resistance, is not spread in the parasites populations of this region.

Como entre 25-50% dos isolados de Mycobacterium tuberculosis resistentes à INH não apresentam mutações nos genes katG, inhA, ahpC e kasA que possam justificar sua resistência, foi proposta a influência de mutações específicas no gene nat nos mecanismos de resistência e atividade da NAT. Todos os isolados obtidos (n=125) foram identificados e caracterizados através da amplificação pela PCR da IS6110 e por MIRU-VNTR, respectivamente. A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) foi realizada pelo método REMA. Após triagem de mutações nos genes caracteristicamente envolvidos com resistência pela PCR-SSCP, seguida de seqüenciamento de DNA, foram selecionados 45 isolados para o estudo de mutações específicas (pela PCR e sequenciamento) e expressão gênica do mRNA do gene nat através da RT-PCR em tempo real. Confirmou-se que mutação no gene katG é a mais correlacionada com a resistência à INH, pois 68,4% das cepas resistentes apresentaram mutação neste gene. Mutações na região promotora do gene inhA, na região intergênica oxyR-ahpC e no gene kasA foram encontradas em 8,8%, 5,6% e 21,6% dos isolados, respectivamente. Mutações no gene nat, das quais 4 não haviam sido descritas previamente, foram encontradas em 40,0% dos isolados. Apesar dessas mutações causarem alterações na proteína, não foi observada uma relação direta com aumento na CIM. Também não foi observada relação entre a variação da expressão do mRNA do gene nat com os valores de CIM e com o número de mutações, tanto específicas do gene nat como em outros genes caracteristicamente relacionados com resistência à INH. / Since around 25-50% of the Mycobacterium tuberculosis strains resistant to INH do not present any mutation in katG, inhA, ahpC and kasA genes that could explain their resistance, we proposed to evaluate the influence of specific mutations in the nat gene in the mechanisms of resistance and in the activity of NAT. All strains were identified and characterized molecularly by the amplification by PCR of the IS6110 region and by MIRU-VNTR, respectively. The minimal inhibitory concentration (MIC) was performed using the REMA method. After screening of mutations in the resistant-related genes by PCR-SSCP followed by DNA sequencing, 45 strains were selected to be evaluated for specific mutations (by PCR and sequencing) and mRNA expression of nat by real time RT-PCR. It was showed that mutations in the katG gene were the most frequent and related to INH resistance since 68.4% of all resistant strains presented mutation in this gene. Mutations in the promoter region of inhA gene, oxyR-ahpC intergenic region and kasA gene were found in 8.8%, 5.6% and 21.6% of the strains, respectively. Mutations in the nat gene, four of them not previously described, were found in 40.0% of the strains. Although those mutations influence in the protein produced it was not observed a direct relation in an increase in CIM. It was also noted no relation between the expression of mRNA of nat gene neither with the MIC values nor with the number of mutations, both specific of nat gene as well in the other genes characteristically related to INH resistance.

INTRODUÇÃO: Nas últimas décadas, a resistência antimicrobiana tornou-se um problema de saúde pública em nível global. A interação entre o consumo de antibióticos e o desenvolvimento de resistência é de particular interesse com relação aos bacilos Gramnegativos (BGN), cuja crescente resistência aos antibióticos disponíveis tem representado um grande desafio ao tratamento das infecções por eles causadas. OBJETIVO: Avaliar o impacto da restrição ao uso da cefepima sobre o perfil de sensibilidade a antimicrobianos dos BGN envolvidos em infecções hospitalares em um hospital ortopédico terciário. MÉTODOS: Em maio de 2007, o uso da cefepima foi restrito no IOTHCFMUSP. Foram analisados e comparados os dados relativos a ocupação, mortalidade hospitalar e taxas gerais de infecção hospitalar em ambos os períodos, além dos dados relativos ao consumo de antimicrobianos e perfil de resistência dos BGN relacionados a infecções hospitalares de dois períodos: de maio de 2005 a maio de 2007 (24 meses anteriores à restrição ao uso da cefepima primeiro período) e maio de 2007 a maio de 2009 (24 meses posteriores à restrição segundo período). RESULTADOS: Não houve diferenças entre os dois períodos na média de permanência hospitalar em dias e na taxa de mortalidade hospitalar. Não houve diferença significante nas taxas gerais de infecção hospitalar entre os períodos. O consumo de amicacina, aztreonam, ertapenem e levofloxacino aumentou de forma estatisticamente significante (p<0,05) no segundo período, enquanto o consumo de cefepima, colistina e imipenem/cilastina diminuiu de forma significante (p<0,05). Não houve diferença na incidência de BGN como causadores de infecção hospitalar entre os dois períodos estudados. A. baumanii, P. aeruginosa, K. pneumoniae e Enterobacter spp. foram os BGN mais freqüentes em ambos os períodos. Após a restrição da cefepima, a sensibilidade de A. baumanii melhorou frente à gentamicina (p=0,001) e piorou frente ao imipenem (p<0,001). Não houve diferença no perfil de sensibilidade aos antimicrobianos testados para P. aeruginosa entre os dois períodos. No segundo período do estudo, a sensibilidade de K. pneumoniae melhorou frente ao ciprofloxacino (p=0,049). Após a restrição da cefepima, a sensibilidade de Enterobacter spp. melhorou de forma frente ao ciprofloxacino (p=0,043). Não houve alteração significativa na incidência de enterobactérias produtoras de betalactamase de espectro estendido (ESBL). CONCLUSÕES: Após a implantação da restrição à cefepima, não houve diferenças na incidência geral dos BGN como causadores de infecção. Para A. baumanii, após a restrição, houve melhora no perfil de sensibilidade frente à gentamicina e piora frente ao imipenem. Para P. aeruginosa, não houve alterações significantes no perfil de sensibilidade. Com relação a K. pneumoniae e Enterobacter spp. houve melhora significante na sensibilidade frente ao ciprofloxacino. Não houve diferenças nas incidências de K. pneumoniae e E. coli produtoras de ESBL entre os dois períodos estudados / BACKGROUND: In recent decades, antimicrobial resistance has become a public health problem globally. The interaction between antibiotic consumption and resistance development is of particular interest with respect to the Gramnegative bacilii (GNB), whose growing resistance to available antibiotics has represented a great challenge for the treatment of infections caused by them. OBJECTIVE: To evaluate the impact of the restriction on the use of cefepime on the profile of antimicrobial susceptibility of GNB involved in nosocomial infections in a orthopaedic tertiary hospital. METHODS: In May 2007, the use of cefepime was restricted at our hospital. We compared the data on occupation, hospital mortality rates and general hospital infection in two periods: from May 2005 to May 2007 (24 months prior to the restriction on the use of cefepime first period) and May 2007 to May 2009 (24 months after this restriction second period). Data on antimicrobial consumption and antimicrobial resistance profile of GNBrelated nosocomial infections in both periods were also analyzed and compared. RESULTS: There were no differences between the two periods in the average hospital stay in days and in hospital mortality rate. There was no significant difference in overall rates of nosocomial infection between periods. The use of amikacin, aztreonam, ertapenem and levofloxacin increased statistically significant (p <0.05) in second period, while consumption of cefepime, imipenem/cilastin and colistin decreased significantly (p <0.05). There was no difference in the incidence of GNB as agents in cases of nosocomial infection in the two periods studied. A. baumanii, P. aeruginosa, K. pneumoniae and Enterobacter spp. were the most frequent GNB in both periods. After the restriction of cefepime, the susceptibility of A. baumanii improved to gentamicin (p = 0.001) and worsened to imipenem (p <0.001). There was no difference in susceptibility to antimicrobials for P. aeruginosa between the two periods. In the second period of this study, the susceptibility of K. pneumoniae improved to ciprofloxacin (p = 0.049). After the restriction of cefepime, the susceptibility of Enterobacter spp. improved to ciprofloxacin (p = 0.043). There was no significant change in the incidence of Extented spectrum beta lacmamasis (ESBL)producing Enterobacteriaceae. CONCLUSIONS: After implementation of the restriction to cefepime, there was no difference in overall incidence of GNB as cause of infection. For A. baumanii, after the restriction, there was an improvement in the susceptibility to gentamicin and worsening to imipenem. For P. aeruginosa, no significant changes in susceptibility were observed. Regarding K. pneumoniae and Enterobacter spp. significant improvement in sensitivity to ciprofloxacin was observed. There were no differences in the incidence of ESBLproducing K. pneumoniae and E. coli between the two periods studied

Atualmente a alta incidência de isolados multirresistentes a antibióticos utilizados na clinica tem-se tornado alarmante. Estudos recentes demonstraram que um dos motivos que contribuem para o aumento da resistência a antibióticos em bactérias é a ocorrência de linhagens que apresentam o fenótipo mutador. Deficiências nos genes do complexo mut, que incluem os sistemas de reparo dependente de metilação (MMR do inglês methyl-directed mismatch repair), e o sistema de reparo oxidativo (GO) podem gerar linhagens com um fenótipo mutador, que, por sua vez, levam ao aumento das taxas mutacionais espontâneas. Isolados clínicos com fenótipo mutador foram descritos em amostras de Escherichia coli patogênica empregando-se a resistência para antibióticos como rifampicina, cloranfenicol e quinolonas mas não há registros de estudos envolvendo o possível impacto do fenótipo mutador sobre a frequência de mutações espontâneas que levem à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. No presente trabalho estudamos a ocorrência do fenótipo mutador frente à resistência aos antibióticos beta-lactâmicos de amplo uso clínico em linhagens de E. coli patogênicas de origem humana, incluindo 48 amostras de E. coli uropatogênica (UPEC) e 5 amostras de E. coli associadas a infecções entéricas. Foram utilizadas como controles positivos para o fenótipo mutador linhagens de E. coli K12 deficientes nos genes mutY ou mutS. Testes qualitativos revelaram a ocorrência de 6 amostras de UPEC e 2 amostras de EHEC com fenótipo mutador para cefalotina, ceftazidima e rifampicina. Entre as amostras estudadas, 3 linhagens de UPEC (amostras 29, 32 e 47) e 1 linhagem de EHEC (amostra 80) apresentaram fenótipo mutador frente à cefalotina e à ceftazidima confirmado em testes quantitativos com valores de mutação espontânea variando entre 0,68 x 10-4 e 0,8 x 10-6. Os resultados baseados em amplificação por PCR revelaram ausência de alterações estruturais em 3 genes do complexo mut (mutS, mutY e mutL) nos quatro isolados que apresentaram fenótipo mutador. O trabalho também envolveu a determinação dos níveis de resistência em clones derivados das 4 linhagens mutadoras após exposição à cefalotina ou à ceftazidima. As colônias obtidas também foram analisadas para a determinação da natureza de mutação que resultou na resistência aos antibióticos beta-lactâmicos. Os resultados obtidos apontam para aumento nos níveis de expressão de uma beta-lactamase para os derivados resistentes da amostra 32, possíveis alterações de permeabilidade do envoltório celular, e, indiretamente, modificação dos alvos celulares para esses antibióticos. Esses resultados revelam a elevada ocorrência do fenótipo mutador entre amostras de UPEC oriundas da clínica e destacam a importância do fenômeno sobre a ocorrência de resistência aos beta-lactâmicos de uso clínico. / Currently the high incidence of isolates with multiple resistance to antibiotics used in the clinic is alarming. Recent studies show that one of the reasons that may contribute to increased resistance in bacteria is the occurrence of strains with the mutator phenotype. Deficiencies in mut genes complex including methylation-dependent repair system (MMR from English methyl-directed mismatch repair) and oxidative repair system (GO) can generated strains with a mutator phenotype, which in turn leads to increasing spontaneous mutation rates. Clinical isolates with the mutator phenotype were reported among pathogenic Escherichia coli with antibiotics such as rifampicin, chloramphenicol and quinolones. Nonetheless, there are no studies describing the involvement of the possible impact of the mutator phenotype on the frequency of spontaneous mutations leading to resistance to beta-lactam antibiotics. In this work we studied the occurrence of the mutator phenotype leading toresistance to beta-lactam antibiotics use in clinics. For this purpose we tested a set of pathogenic E. coli strains of human origin, including 48 strains of uropathogenic E. coli (UPEC) and 5 strains of E. coli associated with enteric infections. As positive controls for the mutator phenotype we used E. coli K12 strains deficient in mutY or mutS genes. Qualitative tests revealed 6 UPEC samples and 2 EHEC strains with mutator phenotype for cephalothin, ceftazidime and rifampicin. Three UPEC strains (samples 29, 32 and 47) and one EHEC strain (sample 80) showed spontaneous mutation frequencies ranging from 0.68 x 10-4 to 0.8 x 10-6 to cephalothin and ceftazidime. The results based on PCR amplification revealed no structural changes in the mut gene complex (mutS, mutY and mutL) in the four mutator strains. The work also involved determination of the resistance level to cephalothin or ceftazidime of clones derived from the mutator strains. The colonies obtained were also analyzed to determine the nature of mutation leading to beta-lactam resistance. The results indicated increased expression levels of of a beta-lactamase in derivatives of the 32 strain, possible reduction in cell envelope permeability and, indirectly ,modification of cellular targets for these antibiotics. These results showed the high occurrence of mutator phenotype among UPEC strains derived from clinical settings and highlight the importance of the phenomenon on the occurrence of resistance to beta-lactam antibiotics in clinical use.

Nos últimos anos a incidência de infecções causadas por bactérias Gram-negativas multirresistentes aumentou expressivamente. Esse fenômeno não foi acompanhado pelo desenvolvimento de novos antimicrobianos, resultando em infecções cuja opção de tratamento é a combinação de antimicrobianos. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa e Serratia marcescens são importantes agentes de infecções relacionadas à assistência à saúde (IRAS), e capazes de adquirir resistência a várias classes de antimicrobianos, como os carbapenêmicos e polimixinas. Os testes que avaliam sinergismo in vitropodem ser uma ferramenta importante na escolha do tratamento antibiótico adequado para infecções causadas por microrganismos multirresistentes. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de sinergismo in vitroque possam ser utilizados na rotina de laboratórios de microbiologia clínica como alternativa ao método considerado padrão ouro (time-kill). Foram selecionados para o estudo 48 isolados Gram-negativos não fermentadores (20 A. baumannii e 28 P. aeruginosa) e 14 fermentadores (S. marcescens) do banco de cepas do LIM-54 com diferentes mecanismos de resistência identificados por PCR e sequenciamento total do genoma. Foram realizados, concentração inibitória mínima dos antimicrobianos e avaliação do sinergismo pelos métodos time-kill (TK), disco aproximação (DA) e CIM:CIM razão.A concordância dos métodos foi avaliada por teste de kappa e os resultados discordantes foram classificados em tipos de erros baseado no FDA.Os isolados apresentaram alta proporção de resistência a meropenem e 7 isolados de A. baumanniiapresentaram resistência a colistina. A combinação de colistina com fosfomicina ou meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de A. baumanniiresistentes a colistina pelo DA e TK. Por outro lado, a combinação de fosfomicina-meropenem apresentou concordância boa pelo teste de kappa e baixo número de erros entre os métodos TK e DA para todos os isolados de A. baumannii. Para os isolados de P. aeruginosa não foram detectados efeitos sinérgicos pelos métodos DA e CIM:CIM razão.O método CIM:CIM razão apresentou alta concordância com o TK entre os isolados de A. baumannii resistentes a colistina. A combinação ceftazidima-avibactam com meropenem apresentou elevado efeito sinérgico para os isolados de S. marcescensportadores do gene blaKPC-2 pelo DA e TK. O método de DA apresentou uma boa correlação com o TK para a combinação de fosfomicina-meropenem e ceftazidima-avibactam-meropenem, com baixa porcentagem de erros menores, podendo ser utilizado para avaliar sinergismo in vitro para essas combinações. Não foi identificado no estudo efeito antagônico, portanto, foram encontrados somente erros menores / In recent years, the incidence of infections caused by multiresistant Gram-negative bacteria has increased. This event has not been accompanied by the development of new antimicrobials, resulting in infections which treatment option is the combination of antimicrobials. Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa and Serratia marcescens are important causesof Hospital Acquired Infection (HAI), and able to acquire resistance to multiple classes of antimicrobials, such ascarbapenems and polymyxins. Synergism testing may be an important tool in choose the appropriate antibiotic treatment. The aim of this study was to evaluate in vitro synergism methods that can be used in a clinical microbiology laboratory as an alternative to the method considered the gold standard (time-kill).For the study were selected 48 non-fermenting (20 A. baumannii and 28 P. aeruginosa)and 14 fermenting(S. marcescens) Gram-negativeisolates from LIM-54strains bench with different resistance mechanisms identified by PCR and total genome sequencing.Minimum antimicrobial inhibitory concentration and synergism evaluation by time-kill (TK), disk approximation (DA) and MIC: MIC ratio were performed. Agreement of the methods was evaluated by kappa test and the discordant results were classified in types of errors based on the FDA. The isolates showed high proportion of resistant to meropenem and 7A. baumannii isolates showed resistance to colistin. The combination of colistin with fosfomycin or meropenem showed high synergistic effect for colistin-resistant A. baumannii isolates by DA and TK.On the other hand, the combination of fosfomycin-meropenem showed good concordance by kappa test and low number of errors between TK and DA for all A. baumannii isolates.For P. aeruginosa isolates no synergistic effects were detected by DA and MIC: MIC ratio.The method MIC: MIC ratio showed high concordance with the TK among the colistin-resistant A. baumannii isolates.The combination ceftazidime-avibactam with meropenem showed high synergistic effect for the isolates of S. marcescenscarryingblaKPC-2 gene by DA and TK. The DA showed a good agreement with TK for the combination of fosfomycin-meropenem and ceftazidime-avibactam-meropenem, with a low percentage of minor errors, and could be used to evaluate synergism in vitro for these combinations

No presente trabalho avaliamos fenotípica e molecularmente isolados de P. vivax da Amazônia Ocidental Brasileira. A avaliação fenotípica de sensibilidade à cloroquina (CQ) foi realizada por meio do ensaio de maturação de esquizonte. A avaliação molecular efetuou-se por tipagem de cinco polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) não-sinônimos do gene pvmdr-1 (A266G, A1498G, A2722C, A2927T e T3226C) e variações no número de cópias deste gene. Em decorrência, o fenótipo de susceptibilidade à CQ nos 36 isolados analisados não foi estabelecido devido ao escasso desenvolvimento ex-vivo dos parasitos. Mutações na posição Y976F, potencialmente associada à resistência à CQ, não foram observadas nos 80 isolados testados. Além disso, 10% das amostras apresentaram a mutação F1076L, que frequentemente acompanha a mutação Y976F. Finalmente, apenas dois isolados (0,9%) dos 215 analisados apresentaram duas cópias do gene pvmdr-1, sugerindo que a duplicação gênica, potencial mecanismo de resistência à mefloquina, ainda não está disseminada nas populações de parasitos desta região. / In this study, we performed a molecular and phenotypic evaluation of isolates of P. vivax from Brazilian Western Amazon. The phenotypic evaluation of chloroquine (CQ) sensitivity was performed using the schizont maturation assay. The molecular evaluation was made by typing of five non-synonymous single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the pvmdr-1 gene (A266G, A1498G, A2722C, T3226C and A2927T) and variations of the copy number of this gene. As a result, the CQ susceptibility phenotype in 36 isolates of P. vivax analyzed was not established, due to the scarce ex-vivo development of the parasites. Mutations at position Y976F, potentially associated with CQ resistance, were not observed in 80 isolates tested. In addition, 10% of the isolates had the mutation F1076L, which often accompanies the mutation Y976F. Finally, two isolates (0,9%), from a total of 215 had two copies of the pvmdr-1 gene, suggesting that the gene duplication, a potential mechanism of mefloquine resistance, is not spread in the parasites populations of this region.

Introdução: Com o aumento da resistência bacteriana à antibioticoterapia tornou-se necessário o desenvolvimento de técnicas antimicrobianas alternativas. Assim, na busca de novas metodologias contra microrganismos, estudos usando a Terapia Fotodinâmica (TFD) antimicrobiana tem sido realizados. Objetivo: Realizar análise morfométrica, radiográfica e molecular do processo de reparo alveolar após a TFD antimicrobiana em ratos Wistar. Material e Métodos: Foram utilizados 85 ratos, divididos nos seguintes grupos: GRUPO C: Animais com alvéolo não tratado (grupo controle); GRUPO S+L: Animais com alvéolo preenchido com soro fisiológico e tratado apenas com aplicação do Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2; GRUPO ATO: Animais com alvéolo tratado apenas com aplicação tópica de azul de toluidina - O (ATO) na concentração de 100 µg/mL e GRUPO ATO+L: Animais com alvéolo tratado com aplicação tópica de azul de toluidina O (ATO) na concentração de 100 µg/mL + aplicação de Laser de baixa intensidade (660 nm), com fluência de 50 J/cm2. Os animais foram sacrificados aos 6, 15 e 28 dias pós-operatório. O mapeamento térmico foi realizado em um animal para confirmar a ausência de efeito térmico do Laser sobre o local irradiado. Foram realizadas as análises microscópicas: qualitativa e quantitativa de tecido conjuntivo, tecido ósseo, coágulo sanguíneo, vaso sanguíneo, infiltrado inflamatório e espaço vazio; radiográfica: por meio do valor de pixel e dimensão fractal e molecular: quantitativa da expressão de genes envolvidos no processo de reparo: colágeno tipo I (COL-I), fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcina (OCN) e fosfatase alcalina (ALP), por meio da PCR Real Time. Resultados e Conclusão: Os resultados demonstraram que a TFD antimicrobiano não atuou negativamente na evolução do processo de reparo alveolar; a análise radiográfica por meio dos valores de pixel pode ser usada como indicador para avaliar a neoformação óssea no processo de reparo alveolar em ratos; a expressão de VEGF pode ser usada como marcador molecular para a angiogênese no processo de reparo alveolar em ratos e a expressão de fosfatase alcalina pode ser usada como marcador molecular nos estágios iniciais do metabolismo ósseo no processo de reparo alveolar em ratos. / Introduction: Antibiotics resistance made the development of antimicrobial alternative techniques necessary. Consequently, others alternatives such as antimicrobial photodynamic therapy (PDT) have been studied. Objective: The objectives were to perform morphometric, radiographic and molecular analyses of alveolar repair process in rats after antimicrobial photodynamic therapy. Methods: Eighty-five rats were used in this study, divided according to the following groups: C: untreated socket; S+L: socket treatment with physiologic saline solution and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2); ATO: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100 µg/mL) and ATO+L: socket treatment with topic application of toluidine blue-O (100µg/ml) and low intensity laser therapy (660nm - 50J/cm2). The animals were sacrificed at a postoperative period of 6, 15 and 28 days. Thermal variation was carried out in an animal to confirm the absence of Laser thermal effect on irradiation area. Quantitative and qualitative microscopic analyses were performed to evaluate the connective tissue, bone tissue, blood clot, blood vessel, inflammatory infiltrate and empty space. Fractal and Pixel radiographic analysis were performed. A quantitative analysis was performed using a RealTimePCR to evaluate the genes expression involved Collagen Type I (COL-I), vascular endothelial growth factor (VEGF), runt-related transcription factor 2 (RUNX2), osteocalcin (OCN), alkaline phosphatase (ALP), in the alveolar repair process. Results and Conclusions: Based in the results, it can be concluded that antimicrobial photodynamic therapy did not act negatively in the socket bone repair evaluation. Pixel values analysis could be used as indicators to evaluate the dry socket bone neoformation. The VEGF molecular marker could be used as angiogenesis indicator to evaluate the dry socket bone neoformation as well as alkaline phosphatase as a molecular marker in the early stage of bone neoformation.

Introdução: a infecção hospitalar tem se tornado um problema de saúde pública, no Brasil e na maioria dos países do mundo, sobretudo devido ao aumento gradativo da resistência dos microrganismos aos antimicrobianos. Nos pacientes que apresentam deficiências no sistema imunológigo como os indivíduos que vivem com o vírus da imunodeficiência humana (HIV) ou com a síndrome da imunodeficiência adquirida (aids) o quadro clínico dessas infecções pode se tornar extremamente grave, aumentando a morbimortalidade. Objetivo: determinar a prevalência de microorganismos gram-negativos em indivíduos com HIV/aids internados num hospital escola do interior paulista. Material e Método: trata-se de um estudo de corte transversal, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Escola de Enfermagem de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. No período de 01 agosto de 2011 a 28 de fevereiro de 2013, foram abordados 365 indivíduos internados em duas unidades especializadas de um hospital escola público do interior paulista, sendo a população do presente estudo composta por 220 sujeitos. Os dados sociodemográficos, clínicos e hábitos de saúde foram obtidos por meio de entrevista individual e consulta aos prontuários. Coletou-se também amostras de saliva e swab nasal nas primeiras 24 horas de internação, as quais foram processadas pelo Laboratório de Microbiologia do referido hospital. Os dados foram inicialmente digitados em planilha do Microsoft Office Excel for Windows 2011, realizada dupla digitação e validação dos dados, a fim de identificar possíveis erros de digitação. Posteriormente, a planilha definitva foi transportada para o programa Statistical Package for the Social Science (SPSS), versão 17.0 for Windows, onde foi estruturado o banco de dados e realizada análise estatística. Resultados: a prevalência de microorganismos gram negativos nos indivíduos com HIV/aids foi de 15,4% independente do sítio onde foi isolado. Pseudomonas aeruginosa foi o micoorganismo mais frequentemente isolado tanto na saliva (50%), quanto no swab nasal (37,5%), seguida por Klebsiella pneumoniae (30,7%) isolada somente na saliva. Em relação aos aspectos clínicos 29,4% dos indivíduos com amostras positivas para microorganismos gram negativos tinham carga viral acima de 1000.000 cópias,ml, CD4 menor que 200 céluas/mm3 (50%), tiveram internações prévias (52,9%), estavam em uso de antimicrobiano (64,7%), não usavam antirretrovirais (52,9%) e tinham algum procedimento invasivo no momento da coleta (67,6%). Nenhum microorganismo apresentou resistência aos antimicrobianos. Conclusão: a prevalência de microorganismos gram-negativos foi maior na saliva (11,8%) que no swab nasal (3,6%), indicando que coletar amostras de mais de um sítio pode favorecer a identificação de indivíduos colonizados e ou infectados / Introduction: the hospital infection has become a public health problem in Brazil and in most countries of the world, mainly due to the gradual increase of resistance of microorganisms to antibiotics. In patients who have deficiencies in the immune system such as individuals living with human immunodeficiency virus (HIV) or acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), the clinical picture of these infections can become very serious, increasing morbidity and mortality. Objective: to determine the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS hospitalized at a teaching hospital in the interior of São Paulo state. Material and Method: this is a cross-sectional study, approved by the Ethics Research Committee of the University of São Paulo at Ribeirão Preto College of Nursing. In the period from August 01, 2011 to February 28, 2013, 365 individuals hospitalized in two specialized units of a public teaching hospital in the interior of São Paulo state were approached, and the study population was comprised of 220 subjects. The sociodemographic and clinical data and health habits were obtained through individual interviews and medical records. Saliva samples and nasal swabs were collected in the first 24 hours of admission, which were processed by the Microbiology Laboratory of the hospital. The instrument variables were coded and cataloged in a dictionary (codebook). The data were initially recorded in a Microsoft Office Excel spreadsheet for Windows 2011, performed a double entry and data validation in order to identify possible typing errors. Subsequently, the final worksheet was transported to the Statistical Package for Social Science (SPSS), version 17.0 for Windows, in which database was structured and statistical analysis was performed. Results: the prevalence of gram-negative microorganisms in individuals with HIV/AIDS was 15.4% regardless of where it was isolated. Pseudomonas aeruginosa is the most frequently isolated microorganisms both in saliva (50%) and in nasal swabs (37.5%), followed by Klebsiella pneumoniae (30.7%) isolated only in saliva. In regard to clinical aspects, 29.4% of individuals with positive samples for gram-negative microorganisms had viral load above 1000,000 copies/ml, CD4 less than 200 cells/mm3 (50%), had previous hospitalizations (52.9%), were using antimicrobials (64.7%), did not use antiretroviral drugs (52.9%) and had some invasive procedure at the time of collection (67.6%). No microorganism was resistant to antimicrobials. Conclusion: the prevalence of gram-negative microorganisms was higher in saliva (11.8%) than in nasal swabs (3.6%), indicating that collecting samples from more than one location may facilitate the identification of individuals colonized and/or infected