A malária é responsável por cerca de 207 milhões de casos e 627 mil óbitos em todo o mundo. No Brasil, em 2013, foram registrados mais de 167 mil casos. Um dos grandes desafios para o controle da doença é o desenvolvimento de resistência aos antimaláricos. Dentre as cinco espécies que podem causar malária em seres humanos, Plasmodium falciparum é a que apresenta maior habilidade de desenvolver resistência a quase todas as classes de medicamentos utilizados no tratamento. Estudos com marcadores moleculares têm associado mutações em diversos genes à resistência aos antimaláricos. A mutação K76T no gene pfcrt é relacionada à resistência à cloroquina. Mutações em pfmdr1 e aumento de seu número de cópias foram associados à resistência a diversos antimaláricos, como quinino, mefloquina e derivados de artemisinina. A resistência aos antifolatos é associada a mutações nos genes pfdhfr e pfdhps. Mutações nos genes pfATPase6 e pfAP2-u têm sido relacionadas à diminuição de sensibilidade à artemisinina. O monitoramento dessas mutações e suas associações às respostas in vivo e in vitro aos antimaláricos pode contribuir para a escolha de terapêutica para o controle da doença. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil genético relacionado à resistência em P. falciparum ao longo de 27 anos. Foram analisadas amostras de P. falciparum coletadas no período entre 1984 e 2011, de pacientes atendidos em serviços de saúde nos estados do Pará e São Paulo, com infecções provenientes principalmente de países da América do Sul e África. A análise do gene pfcrt mostrou frequência de 100% da mutação K76T nas amostras de países da América do Sul ao longo das décadas analisadas. Este resultado é concordante com o fenótipo de resistência à cloroquina observado em 100% das amostras testadas in vitro para sensibilidade a este antimalárico. Amostras de países africanos apresentaram o genótipo selvagem em infecções únicas ou mistas. Com relação ao gene pfmdr1, a análise do códon 86 mostrou surgimento do mutante 86Y na última década em amostras da América do Sul e ocorrência de alelos selvagens e mutantes em amostras da África. Na análise do códon 1246 foi observada predominância do mutante 1246Y nas amostras sul-americanas e do selvagem D1246 nas africanas. Com relação ao gene pfdhfr, as amostras brasileiras apresentaram frequência de 100% dos mutantes 51I e 108N. O mutante 59R não foi observado no período 1980-1990, mas estava presente em 22,6% das amostras de 2000-2010. A análise do gene pfdhps das amostras brasileiras mostrou frequência de 100% do mutante 437G em todas as décadas e diminuição da frequência de 540E no período 2000-2010 em relação aos anteriores. O sequenciamento do gene pfATPase6 revelou a ocorrência de mutações que já haviam sido relatadas anteriormente, porém seu papel na resistência aos derivados de artemisinina ainda não foi elucidado. Na análise do gene pfAP2-? foram observadas duas novas mutações. Não foram observadas associações entre as mutações estudadas e a resposta in vivo e in vitro à mefloquina, quinino e derivados de artemisinina. Este estudo permitiu a avaliação do perfil genético de P. falciparum, com análise de marcadores moleculares relacionados à resistência a diversos antimaláricos, em amostras coletadas ao longo de 27 anos em que o parasito foi submetido à pressão de diferentes esquemas terapêuticos adotados no Brasil / Malaria is responsible for 207 million cases and 627 thousand deaths worldwide. In Brazil, in 2013, more than 167 thousand cases were reported. The major challenge for malaria control is the emergence and spread of resistance to antimalarials. Among the five species able to cause malaria in humans, Plasmodium falciparum presents ability to develop resistance to almost all classes of drugs for malaria treatment. Studies with molecular markers have associated mutations in several genes to antimalarial resistance. The mutation K76T in pfcrt is related to chloroquine resistance. Polymorphisms in pfmdr1 and increased copy number were associated to several antimalarials resistance, such as quinine, mefloquine and artemisinin derivatives. Resistance to antifolates is associated to mutations in pfdhfr and pfdhps genes. Mutations in pfATPase6 and pfAP2-u were linked to decreased sensibility to artemisinins. The monitoring of these mutations and their association with in vivo and in vitro responses may contribute to the choice of therapeutics for malaria control. The aim of the present study was to analyze the genetic profile related to resistance in P. falciparum over twenty-seven years. Samples collected from 1984 to 2011 from patients enrolled at health facilities in Para and Sao Paulo States were assessed. The origin of infections was mainly from South America and Africa countries. Pfcrt analysis showed that all samples from South America countries harbored the K76T mutation over the four decades, in agreement with the resistant phenotypic response of samples tested in vitro for chloroquine. African samples presented the wild type in mixed or single infections. Regarding to the pfmdr1 gene, the emergence of the mutant 86Y was observed in the last decade in South American samples and occurrence of both, mutant and wild type, in African ones. The analysis of 1246 showed only the mutant 1246Y in South American samples and the wild type D1246 in samples from Africa. Regarding to pfdhfr gene, the frequency of mutants 51I and 108N was 100% in Brazilian samples. The mutant 59R was not observed in the period 1980-1990 and it was present in 22.6% in samples from 2000-2010. The mutant 437G of pfdhps gene was observed in 100% of Brazilian samples in all decades and the frequency of mutant 540E decreased in the period 2000-2010 when compared to 1980-1990. The sequence analysis of pfATPase6 gene showed mutations previous described, but their role in artemisinin resistance is not well defined. Two novel mutations were observed in pfAP2-? gene. No association between the polymorphisms studied and in vivo or in vitro responses to mefloquine, quinine and artemisinin derivatives was observed. This study enabled the knowledge of P. falciparum genetic profile regarding to mutations related to resistance in samples collected over twenty-seven years, when the parasite was exposed to selective pressure of several therapeutic schemes adopted in Brazil

O Sarcoma de Ewing (ES) é um raro tumor de ossos e tecidos moles com uma característica translocação cromossomal, a fusão EWS/FLI-1, que atua sobre diversos processos oncogênicos. O desenvolvimento da resistência à quimioterapia é comum no tumor e continua como uma das principais causas na falha do tratamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de genes após a indução de resistência em linhagens celulares de ES. Foi selecionado um conjunto de genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 e SMARCB1) a partir da mineração da literatura em resistência tumoral para duas drogas utilizadas na terapia de ES, doxorrubicina e vincristina. Descrevemos a expressão de cada gene selecionado antes e após as linhagens SK-ES-1 serem submetidas a um protocolo de indução de resistência para ambos os fármacos, que obteve êxito ao induzir as células à resistência. A expressão relativa dos níveis de mRNA foi avaliada e foi encontrada em maior expressão para os genes SMARCA4, SMARCB1 e POLDIP2, e em menor expressão para os genes TUBA1A e CCAR1, quando comparadas às linhagens de controle não-resistentes de cada quimioterápico. Os resultados sugerem o envolvimento de mecanismos de reparo de dano ao DNA, remodelamento de cromatina via SWI/SNF, atividade de microtúbulos e atividade spliceossomal nos processos de resistência quimioterápica em ES. / Ewing Sarcoma (ES) is a rare bone and soft tissue tumor with a characteristic chromosomal translocation, the fusion protein EWS/FLI-1, that drives several oncogenic processes. The development of resistance to chemotherapy is common and remains as the main cause of treatment failure. The goal of this study was to evaluate the expression of selected genes in ES cell lines after induction of resistance. A set of genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 and SMARCB1) was data mined from tumoral resistance literature for two drugs used in ES therapy, doxorubicin and vincristine. We describe the expression of each selected gene before and after SK-ES-1 cell lines were exposed to a drug resistance inducing protocol for doxorubicin and vincristine. Cell lines were successfully induced to be resistant to doxorubicin and vincristine. The relative mRNA expression levels were upregulated for genes SMARCA4, SMARCB1 and POLDIP2 and downregulated for genes TUBA1A and CCAR1, when comparing resistant and non-resistant ES cell lines for each drug. The results suggest involvement of repair pathways, SWI/SNF chromatin remodeling, microtubule and spliceosomal activity processes in drug resistance mechanisms in ES.

O objetivo do presente estudo clínico foi compreender o efeito do uso prévio de agentes antimicrobianos na diversidade e a estrutura do microbioma procariótico de saliva, biofilme supragengival e canal radicular de dentes com infecção endodôntica aguda. Realizaram-se coletas microbiológicas de saliva (S), biofilme supragengival (BS) e canal radicular (CR) de pacientes que não utilizaram antibióticos (G1: n=6) e de pacientes que utilizaram antibióticos (G2: n=6). Para a caracterização das comunidades de procariotos por meio de sequenciamento de alto rendimento, foram produzidos pools de seis amostras para cada um dos sítios. A região hipervariável V3-V4 do gene 16S rRNA foi amplificada e a plataforma Illumina MiSeq foi empregada para análise das sequências geradas. Foram determinadas a presença e abundância relativa das unidades taxonômicas operacionais (OTUs) em cada amostra. Procedeu-se a análise de alfa-diversidade para cada amostra, considerando-se as métricas de Simpson, dominância, estimativa de riqueza de Chao-I e o Índice de Shannon. Os valores obtidos foram comparados por meio de testes estatísticos. Para a análise dos índices de beta-diversidade, empregou-se o método de agrupamento UPGMA, com jackknifing e método de comparação UniFrac com peso. A representação gráfica tridimensional da beta-diversidade foi realizada por meio de análise de coordenadas principais. A técnica de PCR gene específico foi empregada para determinar a presença de genes relacionados à resistência bacteriana para agentes beta-lactâmicos (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolídeos (ermB, ermC, mefA), tetraciclinas (tetM, tetQ, tetW), lincosamidas (lnuB, lsaB) e vancomicina (vanA, vanD, vanE). A similaridade para a presença/ausência de genes de resistência nas amostras de S, BS e CR em G1 e G2 foi determinada por meio de coeficiente de agrupamento, utilizando-se o método UPGMA com distância Euclidiana. Todos os pacientes apresentavam infecção endodôntica aguda, caracterizada pela presença de dor espontânea, necrose pulpar e dor à percussão vertical. Aumento de volume foi observado em 8/12 pacientes. Os pacientes do Grupo 2 utilizaram beta-lactâmicos previamente à consulta (amoxicilina = 5; cefalexina = 1). Há predomínio de integrantes do domínio Bactéria em todas S, BS e CR. Archaea pertencentes ao gênero Methanobrevibacter foram encontradas apenas em amostras de CR, constituindo menos de 1% do total de OTUs (G1-CR = 0,319%; G2-CR = 0,014%). Há predomínio de bactérias dos filos Firmicutes e Bacteroidetes em amostras de S, BS e CR. Há redução intensa no percentual de OTUs pertencentes ao Filo Firmicutes em amostras de saliva, quando antibiótico foi utilizado (G1-S = 75,371; G2-S = 35,242). Comportamento oposto ocorreu neste ecossistema para integrantes do Filo Bacteroidetes (G1-S = 12,657; G2-S = 33,947). Tanto em G1 quanto em G2, bactérias do gênero Streptococcus predominam em amostras de S e BS. Em canais radiculares, maiores percentuais de OTUs foram observados para os gêneros Porphyromonas e Prevotella. As métricas de alfadiversidade indicam que o uso prévio de antimicrobiano parece oportunizar o estabelecimento de espécies antes menos abundantes, especialmente em saliva (dominância: G1-S>G2-S; índice de Shanon: G1-S<G2-S; índice de Simpson: G1- S<G2-S; índice de Chao-1: G1-S<G2-S). A análise de beta-diversidade mostra proximidade entre G1-BS e G2-BS; há distanciamento entre G1-S e G2-S. As amostras G1-CR e G2-CR estão mais distantes de S e BS, sugerindo maior seleção imposta pelo ecossistema do CR aos procariotos. Os genes de resistência mais frequentemente detectados foram tetM, tetQ, tetM, ermB e mefA. Não foram detectados genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB e ermC. O gene ermB foi frequentemente detectado em amostras de S, BS e CR em ambos os grupos. Em pacientes que não utilizaram antibiótico, o gene tetM e o gene tetQ foram detectados simultaneamente em S, BS e CR (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). A análise multivariada não demonstrou nível de agrupamento alto entre amostras de um mesmo paciente, de um mesmo ecossistema, ou de um mesmo grupo. A partir dos resultados do presente estudo, observou-se que a utilização de agente antimicrobiano betalactâmico parece alterar parâmetros composicionais de comunidades de procariotos na cavidade bucal. Entretanto, particularidades relativas a cada ecossistema podem modular a extensão deste efeito, parecendo ser mais intensos em amostras de S do que em BS e CR. / The present clinical study aimed to assess the effect of antibiotics over the diversity and structure in prokaryotic communities of saliva, supragengival biofilm and root canal of teeth with acute primary infections. Samples of saliva (S), supragengival biofilm (BS) and root canal of teeth with acute primary infections (CR) were collected from patients, and were grouped according with the previous use of antibiotic (G1 = no antibiotics; G2 = antibiotics). Pooled samples for each community were evaluated. DNA sequencing was performed with MiSeq (Illumina). The V3-V4 hypervariable region from the 16S rRNA gene was amplified. The presence and relative abundance of the operational taxonomic units (OTUs) was determined for each sample. Alpha-diversity analysis was performed with the Simpson’s index, dominance, Chao-1 richness index and Shannon’s index. Statistical analysis was carried out to compare their values for each community.Beta-diversity was computed through UPGMA clustering and jackknifing. The principal coordinate analysis employed weighted UniFrac. Gene-specific PCR was employed to detect resistance genes to lactamics (blaTEM, blaZ, ampC, mecA), macrolides (ermB, ermC, mefA), tetracyclines (tetM, tetQ, tetW), lincosamides (lnuB, lsaB) e vancomycin (vanA, vanD, vanE). The UPGA clustering analysis with Euclidean distance was applied to investigate the existence of similar groups of samples. A dendrogram was constructed to show the arrangement of the sample groups produced by clustering. All the patients had primary acute endodontic infections, with spontaneous pain, pulp necrosis and tenderness on percussion. Swelling was observed for 8 out of 12 patients. Patients from G2 had lactamics before the urgency appointment (amoxicillin = 5; cephalexin = 1). Bacteria were predominant in S, BS and CR samples. Archaea belonging to the genus Methanobrevibacter were only detected in RC samples and comprised less than 1% of all the OTUs G1-CR = 0.319%; G2-CR = 0.014%). The great majority of the detected OTUs in S, BS, and CR belonged to the phyla Firmicutes and Bacteroidetes. Reduction in the percentage of Firmicutes was observed in G2-S (G1-S = 75.371%; G2-S = 35.242%). A distinct behavior was demonstrated by the Bacteroidetes (G1- S = 12.657%; G2-S = 33.947%). Components belonging to the genus Streptococcus were predominant in S and BS, for both G1 and G2. CR harbored high percentage of species belonging to the genus Porphyromonas and Prevotella. The alpha-diversity indexes demonstrated that the G2-S had an increase in low abundant species (dominance: G1- S>G2-S; Shanon index: G1-S<G2-S; Simpson index: G1-S<G2-S; Chao-1 index: G1-S<G2- S). Beta-diversity showed that G1-BS and G2-BS had close spatial distribution. G1-CR and G2-CR were more distant from S and BS samples. The RC may promote a most intense species selection, due to environmental conditions. The most frequently detected genes associated with resistance to antibiotics were tetM, tetQ, tetM, ermB, and mefA. The genes vanA, vanD, vanE, blaZ, mecA, lnuB, and ermC were not detected in the samples. The gene ermB was frequently detected in S, BS and CR samples. In patients from G1, tetM and tetQ were detected simultaneously in all the three environments (tetM = 4/6; tetQ = 3/6). There was no clustering behavior for samples belonging to different environments in the same patients and between the same environment samples from different groups. An overall analysis from the data allows for suggesting that the use of lactamic agents may alter compositional parameters from prokaryotic communities in the oral cavity to different extents. Specific environmental characteristics from each site may modulate the effect that seemed to be more intense for S than for BS and CR.

Um dos desafios recorrentes na prática clínica da Oncologia é o processo de repopulação, no qual células tumorais resistentes à terapia são capazes de proliferar e reconstituir o tumor. No entanto, os mecanismos envolvidos neste fenômeno ainda foram pouco explorados, sendo necessário melhor compreendê-los para evitar a falha terapêutica. Melanomas são bons modelos para estudar repopulação devido às baixas taxas de sobrevida livre de progressão e às altas taxas de resistência às terapias associadas a este tipo de tumor sólido. Sabe-se que a exposição de células tumorais a condições estressoras do microambiente, como hipóxia e hipóxia/reoxigenação, bem como ao próprio tratamento antitumoral, são pressões seletivas frequentemente encontradas em tumores sólidos que favorecem a resistência às terapias e a repopulação tumoral. Estudos prévios indicam que a sinalização mediada pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF), um lipídio bioativo relacionado à diversas funções fisiológicas, e de seu receptor, PAFR, está associada com a resistência de células de melanoma aos tratamentos citotóxicos e com crescimento tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da sinalização de PAFR frente às condições estressoras descritas acima no fenômeno de repopulação de melanomas. Os resultados de espectrometria de massa indicaram que hipóxia aumentou a geração de PAF nas linhagens de melanoma humano SKmel05 e A375, mas não na A375M, embora este aumento não tenha sido observado após a reoxigenação. Além disso, mostraram que SKmel37 exibiu os maiores níveis basais de PAF, aumentando substancialmente sua geração em diferentes tempos de exposição à hipóxia e hipóxia/reoxigenação. Investigamos também a geração de outros ligantes de PAFR, porém nenhum deles foi encontrado nas amostras. Os resultados de detecção de PAFR por Western Blot e/ou citometria de fluxo revelaram que os níveis proteicos não foram modulados por estas condições em nenhuma das linhagens e que, em termos basais, SKmel37 e SKmel05 apresentaram os maiores níveis. Estas linhagens foram, portanto, submetidas a ensaios de proliferação, os quais evidenciaram que frente ao tratamento com o antagonista de PAFR, WEB2086, em condições de hipóxia e hipóxia/reoxigenação, apenas as células SKmel37 tiveram sua proliferação reduzida e morfologia associada à morte. Ensaios de incorporação de iodeto de propídio indicaram que o tratamento destas células expostas à hipóxia/reoxigenação com WEB2086 levou a acúmulo em SG2M, morte celular e sensibilização à cisplatina. Além disso, imunofluorescência de cortes congelados de tumores induzidos com SKmel37 revelou que houve acúmulo de PAFR em áreas hipóxicas e em seu entorno. Em relação ao modelo de exposição à tratamentos antitumorais, por sua vez, curvas de concentração e tempo com Vemurafenib mostraram que SKmel37 e A375 foram resistentes à droga, ao passo que SKmel05 e UACC62 foram sensíveis. Além disso, WEB2086 potencializou o efeito de morte induzido por Vemurafenib nas linhagens sensíveis, mas não afetou as resistentes. Considerando os aspectos clínicos de resposta inicial com posterior desencadeamento de repopulação, seguimos com as linhagens sensíveis e verificamos por citometria que esta droga aumentou ROS em ambas as linhagens, mas só aumentou PAFR extracelular na SKmel05. O tratamento combinado potencializou a geração de ROS e levou a ativação de caspase3/7 apenas na SKmel05. Esta linhagem foi então submetida a ensaios clonogênicos cujos resultados mostraram que o tratamento com Vemurafenib reduziu o número de clones e que WEB2086 não potencializou este efeito. Assim, o conjunto de resultados apresentados evidencia que a sinalização de PAFR participa dos desfechos de sobrevivência frente à hipóxia/reoxigenação e/ou tratamentos antitumorais, podendo, de alguma forma, contribuir com a repopulação de melanomas / One of the recurrent challenges in the clinical practice of Oncology is the process of repopulation, in which therapy-resistant tumor cells can proliferate and reconstitute the tumor. However, the mechanisms involved in this phenomenon were still little explored. The understanding of these events is, therefore, needed to avoid therapeutic failure. Melanomas are good models for studying repopulation due to the low rates of progression-free survival and the high rates of resistance to therapies associated to this type of solid tumor. It is known that the exposure of tumor cells to microenvironmental stress conditions, such as hypoxia and hypoxia/reoxygenation, as well as the exposure to antitumor treatment itself, are selective pressures frequently found in solid tumors that favor therapy resistance and tumor repopulation. Previous studies have indicated that the signaling mediated by the Platelet Activation Factor (PAF), a bioactive lipid related to various physiological functions, and its receptor, PAFR, is associated with resistance of melanoma cells to cytotoxic treatments and with tumor growth. Therefore, the aim of this study was to investigate the involvement of PAFR signaling upon the adverse conditions described above in the phenomenon of melanoma repopulation. Mass spectrometry results indicated that hypoxia increased the generation of PAF in human melanoma cell lines SKmel05 and A375, but not in A375M, although this increase was not observed after reoxygenation. In addition, they showed that SKmel37 exhibited the highest PAF basal levels, whose generation increased substantially after different times of hypoxia and hypoxia/reoxygenation exposure. We also investigated the generation of other PAFR ligands, but none were found in the samples. The results of PAFR detection by Western Blot and/or flow cytometry revealed that protein levels were not modulated by these conditions in any of the cell lines and that, at baseline, SKmel37 and SKmel05 showed the highest levels. These lines were therefore submitted to proliferation assays, which showed that the treatment with the PAFR antagonist, WEB2086, under conditions of hypoxia and hypoxia/reoxygenation, led to proliferation reduction and death-associated morphology in SKmel37 cells only. Propidium iodide incorporation studies indicated that the treatment of these cells exposed to hypoxia/reoxygenation with WEB2086 led to accumulation in SG2M, cell death and cisplatin sensitization. In addition, immunofluorescence of frozen sections of SKmel37-induced tumors revealed that PAFR was found accumulated in hypoxic areas and its surroundings. Regarding the model of exposure to antitumor treatments, concentration and time curves with Vemurafenib showed that SKmel37 and A375 were resistant to the drug, whereas SKmel05 and UACC62 were sensitive. In addition, WEB2086 potentiated the effect of Vemurafenib-induced death on sensitive cell lines but did not affect the resistant ones. Considering the clinical aspects of initial response with subsequent repopulation triggering, we continued using the sensitive cell lines and we verified by cytometry that this drug increased ROS in both cell lines but only increased extracellular PAFR in SKmel05. The combined treatment potentiated the generation of ROS and led to the activation of caspase3/7 in SKmel05 only. This cell line was then submitted to clonogenic assays whose results showed that treatment with Vemurafenib reduced the number of clones and that WEB2086 did not potentiate this effect. Thus, the set of results presented highlights that PAFR signaling participates in the survival outcomes upon hypoxia/reoxygenation and/or antitumor treatments, and may, in some way, contribute to the repopulation of mel

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A elevada variabilidade genética do HIV tipo 1 e a seleção de mutações de resistência às drogas antirretrovirais tem representado um enorme desafio para o sucesso dos esquemas terapêuticos. Muitos estudos têm demonstrado que há padrões específicos de mutações para cada um dos subtipos de HIV-1. Os padrões do subtipo B são os mais bem definidos em função de sua presença majoritária nas epidemias da Europa e Estados Unidos. Contudo, a prevalência dos subtipos não-B, assim como a das formas recombinantes, tem aumentado significativamente em várias regiões. No Brasil, onde os subtipos B e F, e em alguns estados, também o C, coexistem, a presença de recombinantes BF vem ganhando destaque. Os objetivos deste trabalho foram comparar a região da protease do recombinante BF e do subtipo F puro quanto à possível presença de substituições diferentes, analisar o perfil mutacional e a covariação de mutações associadas ao tratamento e ao uso de inibidores específicos na protease do HIV-1 subtipo F e avaliar a reversão de mutações que já haviam sido selecionadas e a seleção de novas mutações após a troca do esquema terapêutico / The high genetic variability of HIV type 1 and the selection of antiretroviral resistance mutations have represented an enormous challenge to therapeutic schema success. Many studies have demonstrated that there are specific mutations patterns for each of the HIV-1 subtypes. Subtype B mutation profiles are the best studied due to its high presence in Europe and USA epidemics. However, prevalence of non-B subtypes, as well as recombinant forms, has been significantly increasing in many regions. In Brazil, where subtypes B and F, and in some states also C, have been co-circulating, BF recombinants are commonly found. The aims of this work were to compare protease region of BF recombinants to pure subtype F to search for different amino acid substitutions; analyzing mutation profile and co-variation of related-to-treatment mutations; verifying the relationship between the presence of groups of mutations and the use of specific antiretroviral drugs; and evaluating the selection of new mutations after changing therapeutic schema

A elevada variabilidade genética do HIV tipo 1 e a seleção de mutações de resistência às drogas antirretrovirais tem representado um enorme desafio para o sucesso dos esquemas terapêuticos. Muitos estudos têm demonstrado que há padrões específicos de mutações para cada um dos subtipos de HIV-1. Os padrões do subtipo B são os mais bem definidos em função de sua presença majoritária nas epidemias da Europa e Estados Unidos. Contudo, a prevalência dos subtipos não-B, assim como a das formas recombinantes, tem aumentado significativamente em várias regiões. No Brasil, onde os subtipos B e F, e em alguns estados, também o C, coexistem, a presença de recombinantes BF vem ganhando destaque. Os objetivos deste trabalho foram comparar a região da protease do recombinante BF e do subtipo F puro quanto à possível presença de substituições diferentes, analisar o perfil mutacional e a covariação de mutações associadas ao tratamento e ao uso de inibidores específicos na protease do HIV-1 subtipo F e avaliar a reversão de mutações que já haviam sido selecionadas e a seleção de novas mutações após a troca do esquema terapêutico / The high genetic variability of HIV type 1 and the selection of antiretroviral resistance mutations have represented an enormous challenge to therapeutic schema success. Many studies have demonstrated that there are specific mutations patterns for each of the HIV-1 subtypes. Subtype B mutation profiles are the best studied due to its high presence in Europe and USA epidemics. However, prevalence of non-B subtypes, as well as recombinant forms, has been significantly increasing in many regions. In Brazil, where subtypes B and F, and in some states also C, have been co-circulating, BF recombinants are commonly found. The aims of this work were to compare protease region of BF recombinants to pure subtype F to search for different amino acid substitutions; analyzing mutation profile and co-variation of related-to-treatment mutations; verifying the relationship between the presence of groups of mutations and the use of specific antiretroviral drugs; and evaluating the selection of new mutations after changing therapeutic schema

Um dos desafios recorrentes na prática clínica da Oncologia é o processo de repopulação, no qual células tumorais resistentes à terapia são capazes de proliferar e reconstituir o tumor. No entanto, os mecanismos envolvidos neste fenômeno ainda foram pouco explorados, sendo necessário melhor compreendê-los para evitar a falha terapêutica. Melanomas são bons modelos para estudar repopulação devido às baixas taxas de sobrevida livre de progressão e às altas taxas de resistência às terapias associadas a este tipo de tumor sólido. Sabe-se que a exposição de células tumorais a condições estressoras do microambiente, como hipóxia e hipóxia/reoxigenação, bem como ao próprio tratamento antitumoral, são pressões seletivas frequentemente encontradas em tumores sólidos que favorecem a resistência às terapias e a repopulação tumoral. Estudos prévios indicam que a sinalização mediada pelo Fator de Ativação de Plaquetas (PAF), um lipídio bioativo relacionado à diversas funções fisiológicas, e de seu receptor, PAFR, está associada com a resistência de células de melanoma aos tratamentos citotóxicos e com crescimento tumoral. Portanto, este trabalho teve como objetivo investigar o envolvimento da sinalização de PAFR frente às condições estressoras descritas acima no fenômeno de repopulação de melanomas. Os resultados de espectrometria de massa indicaram que hipóxia aumentou a geração de PAF nas linhagens de melanoma humano SKmel05 e A375, mas não na A375M, embora este aumento não tenha sido observado após a reoxigenação. Além disso, mostraram que SKmel37 exibiu os maiores níveis basais de PAF, aumentando substancialmente sua geração em diferentes tempos de exposição à hipóxia e hipóxia/reoxigenação. Investigamos também a geração de outros ligantes de PAFR, porém nenhum deles foi encontrado nas amostras. Os resultados de detecção de PAFR por Western Blot e/ou citometria de fluxo revelaram que os níveis proteicos não foram modulados por estas condições em nenhuma das linhagens e que, em termos basais, SKmel37 e SKmel05 apresentaram os maiores níveis. Estas linhagens foram, portanto, submetidas a ensaios de proliferação, os quais evidenciaram que frente ao tratamento com o antagonista de PAFR, WEB2086, em condições de hipóxia e hipóxia/reoxigenação, apenas as células SKmel37 tiveram sua proliferação reduzida e morfologia associada à morte. Ensaios de incorporação de iodeto de propídio indicaram que o tratamento destas células expostas à hipóxia/reoxigenação com WEB2086 levou a acúmulo em SG2M, morte celular e sensibilização à cisplatina. Além disso, imunofluorescência de cortes congelados de tumores induzidos com SKmel37 revelou que houve acúmulo de PAFR em áreas hipóxicas e em seu entorno. Em relação ao modelo de exposição à tratamentos antitumorais, por sua vez, curvas de concentração e tempo com Vemurafenib mostraram que SKmel37 e A375 foram resistentes à droga, ao passo que SKmel05 e UACC62 foram sensíveis. Além disso, WEB2086 potencializou o efeito de morte induzido por Vemurafenib nas linhagens sensíveis, mas não afetou as resistentes. Considerando os aspectos clínicos de resposta inicial com posterior desencadeamento de repopulação, seguimos com as linhagens sensíveis e verificamos por citometria que esta droga aumentou ROS em ambas as linhagens, mas só aumentou PAFR extracelular na SKmel05. O tratamento combinado potencializou a geração de ROS e levou a ativação de caspase3/7 apenas na SKmel05. Esta linhagem foi então submetida a ensaios clonogênicos cujos resultados mostraram que o tratamento com Vemurafenib reduziu o número de clones e que WEB2086 não potencializou este efeito. Assim, o conjunto de resultados apresentados evidencia que a sinalização de PAFR participa dos desfechos de sobrevivência frente à hipóxia/reoxigenação e/ou tratamentos antitumorais, podendo, de alguma forma, contribuir com a repopulação de melanomas / One of the recurrent challenges in the clinical practice of Oncology is the process of repopulation, in which therapy-resistant tumor cells can proliferate and reconstitute the tumor. However, the mechanisms involved in this phenomenon were still little explored. The understanding of these events is, therefore, needed to avoid therapeutic failure. Melanomas are good models for studying repopulation due to the low rates of progression-free survival and the high rates of resistance to therapies associated to this type of solid tumor. It is known that the exposure of tumor cells to microenvironmental stress conditions, such as hypoxia and hypoxia/reoxygenation, as well as the exposure to antitumor treatment itself, are selective pressures frequently found in solid tumors that favor therapy resistance and tumor repopulation. Previous studies have indicated that the signaling mediated by the Platelet Activation Factor (PAF), a bioactive lipid related to various physiological functions, and its receptor, PAFR, is associated with resistance of melanoma cells to cytotoxic treatments and with tumor growth. Therefore, the aim of this study was to investigate the involvement of PAFR signaling upon the adverse conditions described above in the phenomenon of melanoma repopulation. Mass spectrometry results indicated that hypoxia increased the generation of PAF in human melanoma cell lines SKmel05 and A375, but not in A375M, although this increase was not observed after reoxygenation. In addition, they showed that SKmel37 exhibited the highest PAF basal levels, whose generation increased substantially after different times of hypoxia and hypoxia/reoxygenation exposure. We also investigated the generation of other PAFR ligands, but none were found in the samples. The results of PAFR detection by Western Blot and/or flow cytometry revealed that protein levels were not modulated by these conditions in any of the cell lines and that, at baseline, SKmel37 and SKmel05 showed the highest levels. These lines were therefore submitted to proliferation assays, which showed that the treatment with the PAFR antagonist, WEB2086, under conditions of hypoxia and hypoxia/reoxygenation, led to proliferation reduction and death-associated morphology in SKmel37 cells only. Propidium iodide incorporation studies indicated that the treatment of these cells exposed to hypoxia/reoxygenation with WEB2086 led to accumulation in SG2M, cell death and cisplatin sensitization. In addition, immunofluorescence of frozen sections of SKmel37-induced tumors revealed that PAFR was found accumulated in hypoxic areas and its surroundings. Regarding the model of exposure to antitumor treatments, concentration and time curves with Vemurafenib showed that SKmel37 and A375 were resistant to the drug, whereas SKmel05 and UACC62 were sensitive. In addition, WEB2086 potentiated the effect of Vemurafenib-induced death on sensitive cell lines but did not affect the resistant ones. Considering the clinical aspects of initial response with subsequent repopulation triggering, we continued using the sensitive cell lines and we verified by cytometry that this drug increased ROS in both cell lines but only increased extracellular PAFR in SKmel05. The combined treatment potentiated the generation of ROS and led to the activation of caspase3/7 in SKmel05 only. This cell line was then submitted to clonogenic assays whose results showed that treatment with Vemurafenib reduced the number of clones and that WEB2086 did not potentiate this effect. Thus, the set of results presented highlights that PAFR signaling participates in the survival outcomes upon hypoxia/reoxygenation and/or antitumor treatments, and may, in some way, contribute to the repopulation of mel

Orientador: Ana Cláudia Pavarina / Resumo: Este trabalho avaliou a eficácia das Terapias Fotodinâmica Antimicrobiana (aPDT) e Sonodinâmica (SDT) na inativação de espécies de Candida. O estudo 1 avaliou a efetividade da aPDT na inativação de biofilmes de Candida albicans susceptível e resistente ao fluconazol, bem como seus efeitos sobre os fatores de virulência das cepas. Para isso, biofilmes destas cepas foram tratados com aPDT mediada pelo Photodithazine e luz LED. Após a aPDT, as células foram recuperadas e os fatores de virulência avaliados. A capacidade de adesão foi analisada pelos testes de XTT (atividade metabólica) e UFC/mL (viabilidade celular). A capacidade de formar biofilme foi avaliada pelos testes de XTT, UFC/mL e biomassa total. A síntese de exoenzimas foi avaliada por testes fluorimétricos. Os dados foram analisados por ANOVA a 2 ou 3 critérios (p≤0,05). Verificou-se que a aPDT reduziu a viabilidade das cepas, entretanto não alterou os fatores de virulência. No estudo 2, foi avaliada a efetividade da aPDT no tratamento de pacientes com estomatite protética em comparação com a Nistatina (NIS). Os pacientes do grupo aPDT (n=30) foram submetidos a 6 sessões de aPDT (3 vezes/semana, 15 dias) e os pacientes do grupo NIS (n=35) utilizaram o antifúngico 4 vezes/dia, durante 15 dias. Coletas microbiológicas das próteses e palatos foram realizadas e cultivadas em ágar sangue e chromagar (UFC/mL). Fotografias dos palatos foram tomadas para avaliação clínica da lesão. Os dados foram analisados pelo Modelo Linear... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work evaluated the efficacy of Antimicrobial Photodynamic (aPDT) and Sonodynamics (SDT) Therapies in the inactivation of Candida species. The study 1 evaluated the efficacy of aPDT in the inactivation of susceptible and fluconazole resistant Candida albicans biofilms, as well as its effect on the virulence factors of the strains. For this, biofilms were treated with aPDT mediated by Photodithazine and LED light. After aPDT, cells were recovered and the virulence factors were evaluated. The adhesion capacity was assessed by XTT assay (metabolic activity) and CFU/mL (cell viability). The ability to form biofilm was evaluated by XTT, CFU/mL and total biomass. The synthesis of exoenzymes was evaluated by fluorimetric tests. Data were analyzed by ANOVA-2 or 3 way (p≤0.05). It was found that aPDT reduced the viability of the strains, however aPDT did not alter the virulence factors. The study 2, evaluated the effectiveness of aPDT in the treatment of patients with denture stomatitis in comparison with Nystatin (NYS). Patients of the aPDT group (n=30) underwent 6 sessions of aPDT (3 times/week, 15 days). Patients of the NYS group (n=35) rinsed the antifungal, 4 times/day, for 15 days. Microbiological collections of dentures and palates were performed and cultured on blood agar and chromagar (CFU/mL). Photographs of the palates were taken for clinical evaluation. Data were analyzed by the Linear Model of Repeated Measures (p≤0.05). It was observed that aPDT was more effective in... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

O Sarcoma de Ewing (ES) é um raro tumor de ossos e tecidos moles com uma característica translocação cromossomal, a fusão EWS/FLI-1, que atua sobre diversos processos oncogênicos. O desenvolvimento da resistência à quimioterapia é comum no tumor e continua como uma das principais causas na falha do tratamento. O objetivo desse estudo foi avaliar a expressão de genes após a indução de resistência em linhagens celulares de ES. Foi selecionado um conjunto de genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 e SMARCB1) a partir da mineração da literatura em resistência tumoral para duas drogas utilizadas na terapia de ES, doxorrubicina e vincristina. Descrevemos a expressão de cada gene selecionado antes e após as linhagens SK-ES-1 serem submetidas a um protocolo de indução de resistência para ambos os fármacos, que obteve êxito ao induzir as células à resistência. A expressão relativa dos níveis de mRNA foi avaliada e foi encontrada em maior expressão para os genes SMARCA4, SMARCB1 e POLDIP2, e em menor expressão para os genes TUBA1A e CCAR1, quando comparadas às linhagens de controle não-resistentes de cada quimioterápico. Os resultados sugerem o envolvimento de mecanismos de reparo de dano ao DNA, remodelamento de cromatina via SWI/SNF, atividade de microtúbulos e atividade spliceossomal nos processos de resistência quimioterápica em ES. / Ewing Sarcoma (ES) is a rare bone and soft tissue tumor with a characteristic chromosomal translocation, the fusion protein EWS/FLI-1, that drives several oncogenic processes. The development of resistance to chemotherapy is common and remains as the main cause of treatment failure. The goal of this study was to evaluate the expression of selected genes in ES cell lines after induction of resistance. A set of genes (CCAR1, TUBA1A, POLDIP2, SMARCA4 and SMARCB1) was data mined from tumoral resistance literature for two drugs used in ES therapy, doxorubicin and vincristine. We describe the expression of each selected gene before and after SK-ES-1 cell lines were exposed to a drug resistance inducing protocol for doxorubicin and vincristine. Cell lines were successfully induced to be resistant to doxorubicin and vincristine. The relative mRNA expression levels were upregulated for genes SMARCA4, SMARCB1 and POLDIP2 and downregulated for genes TUBA1A and CCAR1, when comparing resistant and non-resistant ES cell lines for each drug. The results suggest involvement of repair pathways, SWI/SNF chromatin remodeling, microtubule and spliceosomal activity processes in drug resistance mechanisms in ES.