Estudos com resveratrol (RSV) tiveram um crescimento exponencial nos últimos anos, especialmente focando seu efeito benéfico na saúde humana. Recentemente, foram publicados trabalhos mostrando um forte efeito neuroprotetor, não somente reduzindo lesões cerebrais, mas também promovendo a recuperação funcional após a isquemia cerebral. Entretanto, as bases moleculares para a neuroproteção ainda são desconhecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pelo resveratrol em modelos experimentais de isquemia cerebral. Inicialmente, demonstramos que o tratamento com RSV, administrado durante 7 dias antes da indução da lesão isquêmica, diminuiu a morte neuronal em hipocampo e córtex cerebral de ratos submetidos a isquemia cerebral global. Em paralelo, reduziu a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Este efeito foi associado com o aumento de antioxidantes endógenos, além da prevenção do aumento da peroxidação lipídica e da diminuição da atividade da Na+K+-ATPase induzidos pela isquemia cerebral global. Tendo em vista que o insulto isquêmico aumentou rapidamente os níveis de espécies reativas de oxigênio, investigamos o efeito do resveratrol sobre o perfil lipídico, e demonstramos que ele foi capaz de prevenir a diminuição de gangliosídeos, fosfolipídios e colesterol observada em hipocampo e córtex de ratos isquêmicos. A análise de vias de sinalização possivelmente envolvidas, mostrou que o efeito neuroprotetor do resveratrol envolve a modulação da via de sobrevivência PI3- K/Akt através da ativação de seus substratos GSK-3β e CREB. Adicionalmente, vias que controlam a neuroinflamação foram moduladas por resveratrol, o qual diminuiu a ativação glial, reduziu a fosforilação da JNK, diminuiu a translocação nuclear de NF- κB, reduzindo sua ativação e seus possíveis substratos iNOS e COX-2. A seguir avaliamos o efeito do resveratrol em promover a angiogênese em células endoteliais cerebrais e demonstramos que ele foi capaz de promover a proliferação, migração e indução da formação de tubo vascular in vitro. Além da função da célula, o RSV mostrou mudar o aspecto morfológico de células endoteliais do cérebro associadas com o rearranjo do citoesqueleto e relocalização de β-catenina e VE-caderina. A avaliação de vias de sinalização associadas com a angiogênese promovida pelo resveratrol, mostrou o envolvimento das vias PI3-K/Akt e MAPK/ERK, que regularam eNOS modulando os níveis de VEGF e metaloproteinases. Considerando que angiogênese e neurogênese são processos acoplados, investigamos o efeito do RSV no aumento de fatores tróficos e na plasticidade neuronal. Demonstramos que o RSV promoveu a recuperação funcional e está intimamente relacionada com o aumento da angiogênese e neurogênese após a isquemia cerebral focal. Em conjunto, nossos resultados abrem a perspectiva para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da isquemia cerebral. / Recent studies with resveratrol (RSV) have been growing exponentially throughout the years, especially focusing on its beneficial effect on human health. Recently published studies, showing strong neuroprotective effects of RSV, not only reduce brain damage, but also promotes functional recovery after stroke. However, the molecular basis for neuroprotection is still unknown. In this study, we evaluated various mechanisms that are modulated by RSV in experimental models of cerebral ischemia. Initially, we demonstrated that by administering RSV, for 7 days prior to global cerebral ischemia, decreased neuronal cell death in the cerebral cortex and hippocampus of rats as well as reducing the generation of oxygen and nitrogen reactive species. The observed neuroprotection was associated with increased endogenous antioxidants, a decrease of Na+ K+ ATPase, and the prevention of lipid peroxidation. With an ischemic insult, levels of ROS rapidly increase which may lead to a decrease in lipids. However, we investigated the effects of RSV on lipid profiles and it showed that it was able to prevent a decrease in the amount of gangliosides, phospholipids, and cholesterol observed in the hippocampus and cortex of ischemic rats. There are several possible signaling pathways of RSV. Analysis of these pathways reveals that the neuroprotective effects of RSV involve the modulation of PI3-K/Akt survival pathway by activating its substrates GSK-3β and CREB. Furthermore, RSV modulates pathways involved in neuroinflammation, decreasing glial activation, phosphorylation of JNK, nuclear translocation and activation of NF- κB and its possible substrates of iNOS and COX-2. Additionally, we also investigated the effects of RSV on angiogenesis in brain endothelial cells. Results showed that RSV was able to promote proliferation, migration and vascular tube formation in vitro. Signaling pathways associated with angiogenesis by RSV, involves PI3-K/Akt and MAPK/ERK pathways which both regulate eNOS in the modulation of VEGF and metalloproteinase levels. Furthermore, RSV showed that the morphological change of brain endothelial cells was associated with cytoskeletal rearrangement and relocation of β-catenin and VE-cadherin. Considering that angiogenesis and neurogenesis are coupled processes, we investigated the effects of RSV on the increase of trophic factors and neuronal plasticity. We demonstrate that RSV increased functional recovery as well as intimately related to the increase of angiogenesis and neurogenesis after focal cerebral ischemia. Therefore, our results open the perspective for the development of a new therapeutics for the treatment of stroke.

A fibrose e a cirrose hepática são doenças crônicas do fígado que representam uma das maiores causas de mortalidade humana. A GRX é uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que estão associadas ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, acarreta em cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotas lipídicas. Danos contínuos ao fígado desencadeiam uma resposta que gera estímulos autócrinos e parácrinos mediados por citocinas e espécies reativas de oxigênio. Este quadro leva a uma modulação destas células ao fenótipo ativado ou miofibroblástico, relacionada com um aumento da capacidade de produzir componentes de matriz extracelular, cuja deposição exagerada configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas, ao qual são atribuídos inúmeros efeitos benéficos devido a sua capacidade antioxidante, antiproliferativa e pró-apoptótica.Recentemente, tem se discutido um possível efeito pró-oxidante desta molécula em alguns sistemas celulares. O presente estudo mostra que a dose de 50 μM de RSV induziu uma diminuição da viabilidade e da proliferação celular nas células GRX devido a um efeito pró-oxidante observado nas primeiras 24 horas de tratamento. Essas alterações foram atenuadas ao longo de 120 horas de exposição. Observamos um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e uma diminuição da atividade da catalase (CAT) no grupo que recebeu 50 μM de RSV em 120 horas de tratamento, que resulta em um desequilíbrio na atividade de ambas enzimas e possivelmente gera uma produção alta de H2O2. As células que receberam 50 μM de RSV apresentaram dano mediado por lipoperoxidação, tanto em 24 horas quanto em 120 horas de exposição, embora este parâmetro tenha sido menor no modelo crônico. De maneira complementar, avaliamos os efeitos do RSV sobre os parâmetros de migração das células GRX. Observamos um aumento na capacidade de migração destas células já nas primeiras 8 horas de exposição às doses de 1, 10 e 50 μM de RSV. Estes resultados mostraram que o RSV induz um aumento de migração e uma adaptação das células GRX que sobrevivem ao choque tóxico das primeiras 24 horas. / Fibrosis and hepatic cirrosis are chronic diseases of the liver, standing for one of the highest causes of human mortality. GRX cell line is representative of hepatic stellate cells (HSC) that are associated to fibrosis development which, at its last stage, turns into cirrosis. In a healthy liver, such cells present a quiescent or lipocytic phenotype, characterized by its capacity to store lipid droplets. Continuous injuries to the liver generate autocrine and paracrine stimuli mediated by cytokines and reactive oxygen species (ROS). This may cause modulation to the activated or myofibroblastic phenotype, related to an increase of cells capacity to produce matrix components which excessive deposition is responsible for the pathologic condition of fibrosis. Resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic capacity. Recently, a possible pro-oxidant effect of this molecule in some cell systems has been put into discussion. The present study shows that 50 μM of RSV induced a decreased cell viability and proliferation of GRX cells due a pro-oxidant effect during the first 24 hours of treatment. These alterations were attenuated during 120 hours of exposure. We observed an increased SOD activity as well as a decreased CAT activity, in the 50 μM RSV-treated group at 120 hours of treatment, leading to an imbalance in the ratio of both enzymes activities, and possibly resulting in an over-production of H2O2. The cells that received 50 μM RSV presented oxidative damage, mediated by lipoperoxidation, at 24 hours as well as at 120 hours, although some of these parameters were smaller in the chronic model. Additionally, we evaluated RSV effects on the GRX cell migration. We observed an increase in the migration capacity of these cells during the first 8 hours of exposition to the 1, 10 and 50 μM RSV. Such results demonstrate that RSV induces migration increase as well as an adaptation of GRX cells which survive the first 24-hour toxic shock.

Glioblastoma multiforme (GBM) é o mais comum e mais maligno tumor cerebral. O péssimo prognóstico é parcialmente devido à baixa biodisponibilidade dos quimioterápicos no tecido tumoral, recorrência originada por células precursoras resistentes ao tratamento e um sistema imune comprometido. De fato, linfócitos regulatórios modulam o sistema imune para uma resposta pró-tumoral, tornando ainda mais difícil o tratamento. Nesse contexto, nanocápsulas lipídicas (LNCs) têm sido amplamente estudadas a fim de aumentar especificidade dos fármacos ao tecido tumoral. Metotrexato (MTX) e trans-resveratrol (RSV) possuem ação antitumoral já descrita, mas necessitam doses relativamente altas para ação anti-glioblastoma in vivo. O MTX também possui ação imunossupressora através do aumento de adenosina no meio extracelular. A Adenosina, por sua vez, pode modular tanto células efetoras quanto células regulatórias no microambiente tumoral. Dessa forma, a hipótese apresentada nessa tese é que o RSV e o MTX possam ser mais eficazes quando carreados por nanocápsulas em modelos de GBM. Além disso, buscamos avaliar se o MTX poderia interferir com enzimas do sistema purinérgico. Por fim, pesquisamos como a adenosina poderia modular linfócitos B e T através das enzimas CD39 e ecto-5’-NT/CD73. O RSV em nanocápsulas e o MTX em nanocápsulas (RSV-LNCs e MTX-LNCs) aumentaram a atividade anti-tumoral em relação aos compostos em solução, induzindo parada no ciclo celular e apoptose em células de GBM. O MTX diminuiu a expressão da proteína antiapoptótica BCL-2 e aumentou a caspase-3 ativa, levando as células de GBM à apoptose. Além disso, o MTX aumentou a expressão da enzima ecto-5’-NT/CD73 tanto em células de glioma quanto em linfócitos T presentes no microambiente dos gliomas. Esse aumento da expressão foi acompanhado da diminuição em linfócitos T efetores e T regulatórios. Também, demonstramos que linfócitos B que possuem alta expressão da enzima CD39, tem capacidade supressiva sobre linfócitos efetores. Em conjunto, os resultados apresentados nessa Tese apresentaram possíveis novas alternativas de tratamento e contribuíram para melhor compreender esse maligno câncer cerebral. / Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common and most malignant brain tumor. The awful prognosis is in part due to the low bioavailability of chemotherapy agents in the tumoral tissue, recurrence originated from treatment-resistant progenitor cells and an impaired immune system. Indeed, regulatory lymphocytes modulate the immune system toward a pro-tumoral response, turning the treatment even more difficult. In this sense, lipid-core nanocapsules (LNCs) have been widely studied to raise the drug specificity to the tumor. Methotrexate (MTX) and trans-resveratrol (RSV) have antitumoral activity, but need relatively high doses to the anti-glioblastoma outcome in vivo. MTX has immunosuppressive capability mediated by the increase of adenosine in the extracellular milieu. Adenosine in turn may modulate both effector and regulatory immune cells in the tumoral microenvironment. Thereby, the hypothesis presented is that RSV and MTX may have an antitumor improvement when loaded into LNCs in GBM models. Moreover, we sought to evaluate whether MTX could interfere with purinergic enzymes. Lastly, we evaluated how adenosine could modulate B- and T-lymphocytes through CD39 and ecto-5’NT enzymes. RSV- and MTX-loaded lipid-core nanocapsules (RSV-LNCs or MTX-LNCs) increased their antitumoral outcome in relation to the solution compounds, inducing both cell cycle arrest and apoptosis in GBM cells. MTX decreased the expression of the antiapoptotic protein BCL-2 and increased the active caspase-3, triggering glioblastoma cells to apoptosis. Furthermore, MTX increased the expression of ecto-5’-NT/CD73 in glioma cells and T lymphocytes of the glioma microenvironment. This up-regulation was followed by decreasing in T effector and T regulatory lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Also, we further demonstrated that B lymphocytes with high expression of CD39 enzyme can suppress T efector lymphocytes. Taken together, the results presented herein indicate newfound treatment approaches and new knowledge regarding to this deadliest brain tumor.

Introduction: Inflammation and oxidative stress are risk factors related to cardiovascular disease mortality in patients with chronic kidney disease (CKD). Resveratrol is a promising molecule in the treatment of CKD due to antioxidant and anti-inflammatory effects. Objective: To evaluate the effect of resveratrol on markers of oxidative stress and inflammation in renal hemodialysis patients. Methods: Clinical, randomized, double-blind, placebo-controlled trial of hemodialysis patients. Patients were randomized into two groups: resveratrol and placebo. One group (n = 21) received sublingual tablets containing 50 mg resveratrol two times a day for 30 days and another (n = 21), placebo tablets. Sociodemographic, clinical and anthropometric data were collected at the initial moment of the study. The KDQOL-SFTM quality of life evaluation questionnaire and the determination of oxidative stress markers (lipoperoxidation, GSH, carbonylated protein and myeloperoxidase) and inflammation (PCR, TNF-α, IL-1β, IL-10 and IL -6) before and after intervention. Results: 21 patients (placebo) and 19 (resveratrol) were included in the analyses. In the placebo group 62% were male and in resveratrol, 53%; mean age was 57.48 ± 10.72 and 59.74 ± 12.96 years in the placebo and resveratrol groups, respectively. The primary cause of CKD in the placebo group was polycystic kidney disease and in resveratrol, hypertension. The mean hemodialysis time was 51.24 ± 42.38 and 56.68 ± 44.61 months in the placebo and resveratrol groups, respectively. Baseline anthropometric data did not differ between groups. No statistical difference was observed in terms of quality of life, markers of oxidative and inflammatory stress, when the groups were compared. The approximate mean range of the markers was: 7-9 nmol/mg (TBARS); ~ 2 μmol/mg (GSH), 0.3-0.4 mmol/mg (carbonylated protein) and 5-7 U/mg (MPO). The proportion of patients with detectable levels was <31% (CRP), 5-9% (TNF-α), <5% (IL-1β), 5 -11% (IL-10) and <11% (IL-6). Conclusion: Sublingual resveratrol supplementation was not effective in the dosage tested. For future studies it is suggested to consider: initiating supplementation at earlier stages of CKD, evaluating increased supplementation time and exploring different routes of administration. / Submitted by Daniele da Silva Hermes (daniele.hermes@unisul.br) on 2018-11-16T00:34:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Daniele Hermes_PPGCS_versão final.pdf: 2708091 bytes, checksum: 79c7e2b18e2b89cc18e5f17ce552046a (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Correa da Cruz (caroline.cruz@unisul.br) on 2018-11-16T10:23:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Daniele Hermes_PPGCS_versão final.pdf: 2708091 bytes, checksum: 79c7e2b18e2b89cc18e5f17ce552046a (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-16T10:23:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) Dissertação Daniele Hermes_PPGCS_versão final.pdf: 2708091 bytes, checksum: 79c7e2b18e2b89cc18e5f17ce552046a (MD5) Previous issue date: 2018 / Introdução: Inflamação e estresse oxidativo são fatores de risco relacionados à mortalidade por doenças cardiovasculares em pacientes com doença renal crônica (DRC). O resveratrol é uma molécula promissora no tratamento da DRC devido aos efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios. Objetivo: Avaliar o efeito do resveratrol sobre marcadores de estresse oxidativo e inflamação em pacientes renais hemodialisados. Métodos: Ensaio clínico, randomizado, duplo-cego, controlado por placebo, realizado com pacientes hemodialisados. Os pacientes foram randomizados em dois grupos: resveratrol e placebo. Um grupo (n=21) recebeu pastilhas sublinguais com 50 mg de resveratrol duas vezes ao dia por 30 dias e outro (n=21), pastilhas de placebo. Dados sociodemográficos, clínicos e antropométricos foram coletados no momento inicial do estudo. Foi aplicado o questionário de avaliação da qualidade de vida para renais crônicos (KDQOL-SFTM) e realizada dosagem de marcadores de estresse oxidativo (lipoperoxidação, GSH, proteína carbonilada e MPO) e de inflamação (PCR, TNF-α, IL-1β, IL-10 e IL-6) antes e após a intervenção. Resultados: Foram incluídos nas análises: 21 pacientes (placebo) e 19 (resveratrol). No grupo placebo 62% eram do sexo masculino e no resveratrol, 53%, a média de idade foi de 57,48 ± 10,72 e 59,74 ± 12,96 anos no grupo placebo e resveratrol, respectivamente. A principal causa da DRC no grupo placebo foi doença renal policística e no resveratrol, hipertensão arterial. O tempo médio de hemodiálise foi 51,24 ± 42,38 e 56,68 ± 44,61 meses no grupo placebo e resveratrol, respectivamente. Dados antropométricos basais não diferiram entre grupos. Não foi observada diferença estatística em termos de qualidade de vida, marcadores de estresse oxidativo e inflamatórios, quando comparados os grupos. A faixa média aproximada dos marcadores foi: 7 - 9 nmol/mg (TBARS); ~2 µmol/mg (GSH), 0,3 - 0,4 mmol/mg (proteína carbonilada) e 5 – 7 U/mg (MPO). A proporção de pacientes com níveis detectáveis foi de < 31% (PCR), 5 – 9% (TNF-α), < 5% (IL-1β), 5 -11% (IL-10) e < 11% (IL-6). Conclusão: A suplementação de resveratrol por via sublingual não apresentou eficácia na posologia testada. Para os estudos futuros sugere-se considerar: iniciar a suplementação em estágios mais precoces da DRC, avaliar aumento do tempo de suplementação e explorar vias diferentes de administração.

A amônia é uma neurotoxina implicada em desordens metabólicas cerebrais associadas com hiperamonemia. A neurotoxicidade aguda da amônia pode ser mediada por mecanismos excitotóxicos envolvendo o sistema glutamatérgico, incluindo a ativação do receptor NMDA e o subsequente aumento na concentração de Ca2+. O estresse oxidativo está relacionado à neurotoxicidade da amônia e o óxido nítrico parece estar envolvido nesta condição. Os astrócitos desempenham um papel essencial na proteção dos neurônios contra excitotoxicidade por captar o excesso de amônia e glutamato e convertê-los em glutamina, usando a enzima glutamina sintetase, e também protegendo contra o estresse oxidativo. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como parâmetro de ativação ou comprometimento em várias situações de dano cerebral, incluindo hiperamonemia. Antioxidantes, como o resveratrol, apresentam muitos efeitos biológicos, incluindo a modulação de parâmetros gliais como a captação de glutamato, a atividade da glutamina sintetase e a secreção de S100B. Neste estudo, foi investigado o efeito de antioxidantes sobre a secreção de S100B induzida pela amônia em células astrogliais. O resveratrol foi capaz de prevenir o aiumento da secreção de S100B, após 24 h de exposição à amônia, provavelmente via inibição de óxido nítrico e proteína cinase A (PKA). Então, o resveratrol pode ser um possível agente protetor contra a neurotoxicidade induzida pela amônia. / Ammonia is a neurotoxin implicated in brain metabolic disorders associated with hyperammonemia. Acute ammonia neurotoxicity can be mediated by excitotoxic mechanism involving glutamatergic system, including NMDA receptor activation and subsequent increase in intracellular Ca2+ concentration. Oxidative stress is related to ammonia neurotoxicity and nitric oxide can be involved in this condition. Astrocytes play an essential role in protecting neurons against excitotoxicity uptake excess ammonia and glutamate and converting it into glutamine, using enzyme glutamine synthetase and also protected against oxidative stress. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury, including hyperammonemia. Antioxidants, such as resveratrol, showed many biological effects, including modulation of glial parameters as glutamate uptake, glutamine synthetase activity and S100B secretion. In this study, we investigated the effect of antioxidants on S100B secretion induced by ammonia in astroglial cells. Resveratrol was able to prevent the increase of S100B secretion, after 24 h ammonia exposure, probably via nitric oxide and protein kinase A (PKA) inhibition. Then, resveratrol may be a possible protective agent against neurotoxicity induced by ammonia.

A doença de Alzheimer (DA) é uma devastadora desordem neurológica que afeta mais de 37 milhões de pessoas ao redor do mundo, caracterizada pelo progressivo dano cognitivo e pela perda da memória. Estas alterações clínicas são acompanhadas por alterações histológicas cerebrais características da doença, as quais incluem atrofia cerebral, perda de neurônios e disfunção sináptica secundárias à deposição extracelular do peptídeo beta-amilóide (Aβ) e à deposição intracelular de emaranhados neurofibrilares constituídos da proteína tau. Fármacos disponíveis para a terapia da DA apresentam efeito limitado e tratamentos utilizando um único medicamento ou a combinação de terapias que possam efetivamente parar ou modificar o curso da doença ainda não se encontram disponíveis. O resveratrol, um polifenol de origem vegetal, tem atraído considerável interesse devido aos seus potenciais benefícios à saúde humana. Diversos estudos têm demonstrado que o resveratrol possui propriedades anti-amiloidogênicas; entretanto, os efeitos biológicos in vivo do resveratrol são fortemente limitados devido a sua baixa biodisponibilidade, a qual representa uma barreira no desenvolvimento de aplicações terapêuticas do resveratrol. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi desenvolver uma nova formulação capaz de superar a baixa solubilidade, a limitada estabilidade, a elevada metabolização e a baixa biodisponibilidade do resveratrol e avaliar o seu efeito frente à toxicidade induzida pelo Aβ em modelos in vitro e in vivo. Inicialmente, o isômero trans do resveratrol foi incorporado em nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (RSV-LNC) e a distribuição destas nanocápsulas nos tecidos cerebral, hepático e renal foi avaliada após a administração intraperitoneal (i.p.) ou por gavagem em ratos saudáveis. As nanocápsulas apresentaram elevada capacidade de encapsulamento do resveratrol e animais tratados com RSV-LNC exibiram maior concentração do resveratrol no cérebro, no fígado e no rim quando comparados aos animais tratados com resveratrol livre (RSV) após administrações diárias pelas vias i.p. ou gavagem. Na sequência, nós comparamos o efeito do tratamento com RSV e RSV-LNC frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da exposição de culturas organotípicas de hipocampo ao Aβ1-42 por 48 h. Tanto o tratamento prévio quanto o simultâneo das culturas com RSV ou RSV-LNC reduziram significativamente a morte celular induzida pelo Aβ, com o RSV-LNC apresentando efeito mais pronunciado. O pré-tratamento com ambos, RSV ou RSV-LNC, preveniu a produção de espécies reativas de oxigênio; entretanto, o tratamento simultâneo com RSV não protegeu as culturas do dano oxidativo. Ambos os tratamentos, prévio e simultâneo, com RSV-LNC bloquearam a neuroinflamação desencadeada pelo Aβ de maneira sustentada. Além disso, apenas os tratamentos com RSV-LNC foram capazes de aumentar a liberação da IL-10 mesmo na presença do Aβ e prevenir/reduzir a ativação glial e a fosforilação da JNK. Finalmente, nós avaliamos o efeito do resveratrol frente à toxicidade induzida pelo Aβ através da injeção intracerebroventricular do Aβ1-42 em ratos. Nós observamos que os animais que foram injetados com o Aβ1-42 exibiram um significativo défcit na memória, o qual foi acompanhado pela significativa redução nos níveis da sinaptofisina no hipocampo. É importante ressaltar que através do uso das nanocápsulas o resveratrol foi capaz de reduzir estes efeitos deletérios do Aβ1-42 enquanto o tratamento com RSV não foi capaz de proteger da toxicidade induzida pelo Aβ, o que pode ser explicado pelo robusto aumento na biodisponibilidade cerebral do resveratrol atingida pelo uso das nanocápsulas. Adicionalmente, a ativação astrocitária e microglial, bem como fosforilação da JNK desencadeada pelo Aβ foram reduzidas somente após o tratamento com RSV-LNC, enquanto ambos os tratamentos com RSV e RSV-LNC foram capazes de reestabelecer os distúrbios na sinalização mediada pela GSK-3β e a desestabilização da β-catenina desencadeadas pelo Aβ. Juntos, nossos resultados não somente confirmam o potencial do resveratrol no tratamento dos processos neurodegenerativos como também oferecem uma via efetiva para melhorar o efeito neuroprotetor do resveratrol através de um sistema nanocarreador. Estes resultados fornecem suporte para futuros estudos objetivando o entendimento dos mecanismos envolvidos no efeito neuroprotetor do resveratrol. Além disso, a combinação do resveratrol com o sistema de entrega mediado por nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico abrem novas possibilidades para o tratamento da doença de Alzheimer. / Alzheimer's disease (AD) is a devastating neurological disorder that affects more than 37 million people worldwide, characterized clinically by progressive impairments in cognition and memory. These clinical features are accompanied by characteristic histological changes in the brain, which include brain atrophy, loss of neurons and loss of synaptic function secondary to extracellular deposition of amyloid-beta peptide (Aβ) and intracellular deposition of neurofibrillary tangle composed of the microtubule-associated protein tau. Available drugs for AD therapy have small effect sizes and we still not have a single treatment or combination therapy that can effectively stop or reverse the relentless progression of AD. Resveratrol, a naturally occurring polyphenol, has attracted considerable interest for its beneficial potentials for human health. Several studies have been shown that resveratrol is associated with anti-amyloidogenic properties; however, the in vivo biological effects of resveratrol appear strongly limited by its low bioavailability, which is a barrier to the development of therapeutic applications. In this context, the present study was designed to develop a novel resveratrol formulation to overcome its poor solubility, limited stability, high metabolization and weak bioavailability, and to evaluate the effects of resveratrol against in vitro and in vivo Aβ-induced toxicity. Initially, trans-resveratrol was loaded into lipid-core nanocapsules (RSV-LNC) and the nanocapsule distribution in brain, liver and kidney tissues was evaluated by intraperitoneal (i.p.) and gavage routes in healthy rats. Lipid-core nanocapsules showed high entrapment of resveratrol and animals treated with RSV-LNC displayed a higher resveratrol concentration in the brain, the liver and the kidney than those treated with free resveratrol (RSV) after daily i.p. or gavage administration. Next, we compared the effects of RSV and RSV-LNC treatment against Aβ-induced toxicity by expositing organotypic hippocampal cultures to Aβ1-42 by 48 h. Pre- and co-treatment of cultures with both, RSV and RSV-LNC, significantly attenuated Aβ-induced cell death, with RSV-LNC showing somewhat higher potency. Reactive oxygen species formation was prevented by pretreatment with both RSV or RSV-LNC; however, co-treatment with RSV failed to protect cultures from oxidative damage. Pre- and co-treatment with RSV-LNC was able to block the neuroinflammation triggered by Aβ in a sustained pattern. Furthermore, only RSV-LNC treatments were able to increase IL-10 release even in the presence of Aβ, and prevent/decrease glial activation and JNK phosphorylation. Finally, we evaluated the effects of resveratrol against Aβ-induced toxicity by using an intracerebroventricular injection of Aβ1-42 model in rats. We found that Aβ1-42-injected animals showed a significant impairment on learning-memory ability, which was paralleled by a significant decrease in hippocampal synaptophysin levels. Noteworthy, by using lipid-core nanocapsules, resveratrol was able to rescue these deleterious effects of Aβ1-42 while treatment with RSV failed to protect against Aβ-induced toxicity, which can be explained by robust increase of brain bioavailability of resveratrol achieved by lipid-core nanocapsules. Additionally, activated astrocytes and microglial cells, as well as JNK phosphorylation triggered by Aβ was reduced only after RSV-LNC treatment, while both RSV and RSV-LNC treatments were able to restore the disturbance in GSK-3β signaling and destabilization of β-catenin triggered by Aβ. Taken together, our results not only confirm the potential of resveratrol in treating neurodegenerative processes but also offer an effective way to improve the neuroprotective efficiency of resveratrol by nanocarrier delivery system. These findings provide further support for future studies aiming at precisely understanding of mechanisms involved in the neuroprotective effects of resveratrol. Furthermore, the combination of resveratrol and lipidcore nanocapsules-based delivery system may open new avenues for the treatment of Alzheimer’s disease.

Phenolic antioxidants reduce the effect of oxidative stress within cells. They are found in a various fruits, vegetables and as food additives to reduce spoilage. Consumption of antioxidants by humans has been linked with increased lifespan and reduced incidence of cancer and cardiovascular disorders (Cabrera et al. 2006; Kuriyama 2008). In cultured mammalian cells however, some of these phenolic antioxidants have been reported to generate reactive oxygen species (ROS), leading to chromosomal breakage (Long et al. 2007; Long & Halliwell 2001). It is clear then, that amongst this group of compounds, in vitro toxicological study is not a reliable prediction of human hazard. It is for this reason that the work described in this thesis was undertaken: the principal aim was to gain a better understanding of the reasons underlying this contradiction. It has been suggested that excessive ROS generated in vitro might be a result of the higher levels of oxygen (~20%) compared to (1-7%) in vivo: (Yusa et al. 1984; Turrens et al. 1982). With clearer understanding, new experimental approaches might be taken to highlight or reduce positive in vitro genotoxicity test results that might be considered misleading. A diverse set of test compounds was first chosen. It included polyphenolic (PPA), monophenolic (MPA) and non-phenolic antioxidants (NPA), in addition to mechanistically characterised oxidants, genotoxins and cytotoxic, non-genotoxins as controls. Genotoxicity was assessed in vitro using the GADD45a, GFP reporter assay and in silico using Derek Nexus™. Amongst the 19 antioxidants assessed, the 11 of 12 of PPAs, 0 of 4 MPAs and 1 of 3 NPAs (ethoxyquin) produced positive results in vitro and 8 of 12 PPAs generated alerts of at least plausible genotoxicity in silico. To discover whether these results were the result of cellular hyperoxia-promoted generation of physiologically irrelevant ROS in cells, genotoxicity was reassessed in the presence of 1 and 5% oxygen. This reduced oxygen exposure had no effect upon the qualitative result for any of the assessed compounds and a negligible effect upon the dose at which any positive result was produced. An assessment of the ability of antioxidants to generate potentially genotoxic ROS within cells was carried out using the intracellular fluorescent dye, dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). 10 of 12 PPAs, 0 of 4 MPAs and 1 of 3 NPAs (ethoxyquin) were shown to increase the level of ROS within TK6 human lymphoblastoid cells within 4 hours of compound exposure. Within this same timeframe, the mitochondrial membranes in cells treated with 10 of 12 PPAs, 2 of 4 MPAs and 1 of 3 NPAs (ethoxyquin) were shown to become depolarised using JC-1 dye. It was unclear however, whether mitochondrial membrane depolarisation was a cause or a consequence of ROS generation within the cells. In order to assess whether the increase in intracellular ROS led to an increase in oxidised DNA within treated cells, 8-oxoguanine (8-OG) was quantified using a FITC conjugated anti8-OG antibody. This assessment revealed that levels of the oxidised base were only increased in cells exposed to two of the 12 PPAs (quercetin and resorcinol). The level of 8OG detected was lower than the vehicle control for cells treated with 10 of the 15 antioxidants. One interpretation of this is that these agents induce the repair pathway for oxidative damage, which leads to a lower level of oxidised DNA bases in the genome. The results showed that while a large proportion of PPAs produce genotoxic results in vitro and lead to increased levels of ROS, the amount of oxidised DNA is not higher in treated cells. This would suggest the presence of a different mechanism for the observed genotoxicity.

A fibrose e a cirrose hepática são doenças crônicas do fígado que representam uma das maiores causas de mortalidade humana. A GRX é uma linhagem representativa das células estreladas hepáticas (HSC), que estão associadas ao desenvolvimento da fibrose que, em último estágio, acarreta em cirrose. No fígado saudável, estas células apresentam um fenótipo quiescente ou lipocítico, caracterizado pela sua capacidade de armazenar gotas lipídicas. Danos contínuos ao fígado desencadeiam uma resposta que gera estímulos autócrinos e parácrinos mediados por citocinas e espécies reativas de oxigênio. Este quadro leva a uma modulação destas células ao fenótipo ativado ou miofibroblástico, relacionada com um aumento da capacidade de produzir componentes de matriz extracelular, cuja deposição exagerada configura o estado patológico da fibrose. O resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-estilbeno) é uma fitoalexina produzida por algumas espécies de plantas, ao qual são atribuídos inúmeros efeitos benéficos devido a sua capacidade antioxidante, antiproliferativa e pró-apoptótica.Recentemente, tem se discutido um possível efeito pró-oxidante desta molécula em alguns sistemas celulares. O presente estudo mostra que a dose de 50 μM de RSV induziu uma diminuição da viabilidade e da proliferação celular nas células GRX devido a um efeito pró-oxidante observado nas primeiras 24 horas de tratamento. Essas alterações foram atenuadas ao longo de 120 horas de exposição. Observamos um aumento da atividade da superóxido dismutase (SOD) e uma diminuição da atividade da catalase (CAT) no grupo que recebeu 50 μM de RSV em 120 horas de tratamento, que resulta em um desequilíbrio na atividade de ambas enzimas e possivelmente gera uma produção alta de H2O2. As células que receberam 50 μM de RSV apresentaram dano mediado por lipoperoxidação, tanto em 24 horas quanto em 120 horas de exposição, embora este parâmetro tenha sido menor no modelo crônico. De maneira complementar, avaliamos os efeitos do RSV sobre os parâmetros de migração das células GRX. Observamos um aumento na capacidade de migração destas células já nas primeiras 8 horas de exposição às doses de 1, 10 e 50 μM de RSV. Estes resultados mostraram que o RSV induz um aumento de migração e uma adaptação das células GRX que sobrevivem ao choque tóxico das primeiras 24 horas. / Fibrosis and hepatic cirrosis are chronic diseases of the liver, standing for one of the highest causes of human mortality. GRX cell line is representative of hepatic stellate cells (HSC) that are associated to fibrosis development which, at its last stage, turns into cirrosis. In a healthy liver, such cells present a quiescent or lipocytic phenotype, characterized by its capacity to store lipid droplets. Continuous injuries to the liver generate autocrine and paracrine stimuli mediated by cytokines and reactive oxygen species (ROS). This may cause modulation to the activated or myofibroblastic phenotype, related to an increase of cells capacity to produce matrix components which excessive deposition is responsible for the pathologic condition of fibrosis. Resveratrol (RSV - 3,4',5-tri-hidroxi-trans-stilbeno) is a phytoalexin produced by some species of plants. Several beneficial effects are attributed to this molecule due to its antioxidant, antiproliferative and pro-apoptotic capacity. Recently, a possible pro-oxidant effect of this molecule in some cell systems has been put into discussion. The present study shows that 50 μM of RSV induced a decreased cell viability and proliferation of GRX cells due a pro-oxidant effect during the first 24 hours of treatment. These alterations were attenuated during 120 hours of exposure. We observed an increased SOD activity as well as a decreased CAT activity, in the 50 μM RSV-treated group at 120 hours of treatment, leading to an imbalance in the ratio of both enzymes activities, and possibly resulting in an over-production of H2O2. The cells that received 50 μM RSV presented oxidative damage, mediated by lipoperoxidation, at 24 hours as well as at 120 hours, although some of these parameters were smaller in the chronic model. Additionally, we evaluated RSV effects on the GRX cell migration. We observed an increase in the migration capacity of these cells during the first 8 hours of exposition to the 1, 10 and 50 μM RSV. Such results demonstrate that RSV induces migration increase as well as an adaptation of GRX cells which survive the first 24-hour toxic shock.

Os gangliosídios são glicoesfingolipídios caracterizados pela presença de ácido siálico em sua estrutura química e por suas altas concentrações nas membranas das células do sistema nervoso, além de desempenharem importantes funções celulares, como diferenciação, comunicação, maturação, plasticidade neuronal, entre outras. A isquemia cerebral está entre as principais causas de mortalidade e morbidade em todo o mundo, o que torna essa patologia alvo de muitos estudos para o entendimento dos mecanismos desencadeados que levam à morte neuronal, e ao mesmo tempo, com o objetivo de descobrir novos tratamentos farmacológicos. Neste estudo investigamos a ação neuroprotetora dos polifenóis resveratrol e daidzeína associando-a ao efeito destas substâncias sobre o perfil cromatográfico dos gangliosídios. Para isso, foi utilizado um modelo in vitro de privação de oxigênio-glicose (POG) em culturas organotípicas de hipocampo de rato. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com ambos polifenóis diminuiu significativamente a morte celular induzida pela POG. Através da análise do perfil cromatográfico dos gangliosídios, podemos observar uma diminuição de expressão para o gangliosídio GM1 no grupo POG, o que não aconteceu nos grupos POG tratados com os polifenóis. Além disso, os resultados de imuno-histoquímica analisados por microscopia confocal, permitiram visualizar uma maior fluorescência de GM1 localizada na região dos neurônios hipocampais, marcados pela proteína NeuN. Portanto, esses resultados sugerem que a ação neuroprotetora dos polifenóis possa ocorrer através da expressão do gangliosídio GM1 em neurônios hipocampais, prevenindo desta forma, a morte celular. / The gangliosides are glycosphingolipids characterized by the presence of sialic acid in their chemical structure and by their high concentrations in the nervous system cell membranes. Besides this, they have important cellular functions such as differentiation, communication, maturation, neuronal plasticity among others. Cerebral ischemia is one of the main causes of morbidity and mortality worldwide, making this disease the subject of many studies to understand the mechanisms that trigger the neuronal death. At the same time, the discovery of drugs that target these mechamisms could lead to new pharmacological treatments. We investigated the neuroprotective action of the polyphenols resveratrol and daidzein associating it to their effect on the chromatographic profile of gangliosides. For this, we used an in vitro model of oxygen-glucose deprivation (OGD) in organotypic cultures of rat hippocampus. Our results demonstrated that treatment with both polyphenols significantly decreased cell death induced by OGD. Through analysis of the chromatographic gangliosides profile, a decrease of GM1 ganglioside expression in OGD group was observed, which did not happen in the OGD groups treated with polyphenols. Furthermore, immunohistochemistry analysis by confocal microscopy, showed a greater GM1 fluorescence located in the region of hippocampal neurons, marked by NeuN protein. These results suggest that the polyphenols neuroprotective action may occur at the level of GM1 ganglioside expression in hippocampal neurons and may prevent cellular death.

Estudos com resveratrol (RSV) tiveram um crescimento exponencial nos últimos anos, especialmente focando seu efeito benéfico na saúde humana. Recentemente, foram publicados trabalhos mostrando um forte efeito neuroprotetor, não somente reduzindo lesões cerebrais, mas também promovendo a recuperação funcional após a isquemia cerebral. Entretanto, as bases moleculares para a neuroproteção ainda são desconhecidas. Neste trabalho, avaliamos diversos mecanismos que são modulados pelo resveratrol em modelos experimentais de isquemia cerebral. Inicialmente, demonstramos que o tratamento com RSV, administrado durante 7 dias antes da indução da lesão isquêmica, diminuiu a morte neuronal em hipocampo e córtex cerebral de ratos submetidos a isquemia cerebral global. Em paralelo, reduziu a geração de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio. Este efeito foi associado com o aumento de antioxidantes endógenos, além da prevenção do aumento da peroxidação lipídica e da diminuição da atividade da Na+K+-ATPase induzidos pela isquemia cerebral global. Tendo em vista que o insulto isquêmico aumentou rapidamente os níveis de espécies reativas de oxigênio, investigamos o efeito do resveratrol sobre o perfil lipídico, e demonstramos que ele foi capaz de prevenir a diminuição de gangliosídeos, fosfolipídios e colesterol observada em hipocampo e córtex de ratos isquêmicos. A análise de vias de sinalização possivelmente envolvidas, mostrou que o efeito neuroprotetor do resveratrol envolve a modulação da via de sobrevivência PI3- K/Akt através da ativação de seus substratos GSK-3β e CREB. Adicionalmente, vias que controlam a neuroinflamação foram moduladas por resveratrol, o qual diminuiu a ativação glial, reduziu a fosforilação da JNK, diminuiu a translocação nuclear de NF- κB, reduzindo sua ativação e seus possíveis substratos iNOS e COX-2. A seguir avaliamos o efeito do resveratrol em promover a angiogênese em células endoteliais cerebrais e demonstramos que ele foi capaz de promover a proliferação, migração e indução da formação de tubo vascular in vitro. Além da função da célula, o RSV mostrou mudar o aspecto morfológico de células endoteliais do cérebro associadas com o rearranjo do citoesqueleto e relocalização de β-catenina e VE-caderina. A avaliação de vias de sinalização associadas com a angiogênese promovida pelo resveratrol, mostrou o envolvimento das vias PI3-K/Akt e MAPK/ERK, que regularam eNOS modulando os níveis de VEGF e metaloproteinases. Considerando que angiogênese e neurogênese são processos acoplados, investigamos o efeito do RSV no aumento de fatores tróficos e na plasticidade neuronal. Demonstramos que o RSV promoveu a recuperação funcional e está intimamente relacionada com o aumento da angiogênese e neurogênese após a isquemia cerebral focal. Em conjunto, nossos resultados abrem a perspectiva para o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica para o tratamento da isquemia cerebral. / Recent studies with resveratrol (RSV) have been growing exponentially throughout the years, especially focusing on its beneficial effect on human health. Recently published studies, showing strong neuroprotective effects of RSV, not only reduce brain damage, but also promotes functional recovery after stroke. However, the molecular basis for neuroprotection is still unknown. In this study, we evaluated various mechanisms that are modulated by RSV in experimental models of cerebral ischemia. Initially, we demonstrated that by administering RSV, for 7 days prior to global cerebral ischemia, decreased neuronal cell death in the cerebral cortex and hippocampus of rats as well as reducing the generation of oxygen and nitrogen reactive species. The observed neuroprotection was associated with increased endogenous antioxidants, a decrease of Na+ K+ ATPase, and the prevention of lipid peroxidation. With an ischemic insult, levels of ROS rapidly increase which may lead to a decrease in lipids. However, we investigated the effects of RSV on lipid profiles and it showed that it was able to prevent a decrease in the amount of gangliosides, phospholipids, and cholesterol observed in the hippocampus and cortex of ischemic rats. There are several possible signaling pathways of RSV. Analysis of these pathways reveals that the neuroprotective effects of RSV involve the modulation of PI3-K/Akt survival pathway by activating its substrates GSK-3β and CREB. Furthermore, RSV modulates pathways involved in neuroinflammation, decreasing glial activation, phosphorylation of JNK, nuclear translocation and activation of NF- κB and its possible substrates of iNOS and COX-2. Additionally, we also investigated the effects of RSV on angiogenesis in brain endothelial cells. Results showed that RSV was able to promote proliferation, migration and vascular tube formation in vitro. Signaling pathways associated with angiogenesis by RSV, involves PI3-K/Akt and MAPK/ERK pathways which both regulate eNOS in the modulation of VEGF and metalloproteinase levels. Furthermore, RSV showed that the morphological change of brain endothelial cells was associated with cytoskeletal rearrangement and relocation of β-catenin and VE-cadherin. Considering that angiogenesis and neurogenesis are coupled processes, we investigated the effects of RSV on the increase of trophic factors and neuronal plasticity. We demonstrate that RSV increased functional recovery as well as intimately related to the increase of angiogenesis and neurogenesis after focal cerebral ischemia. Therefore, our results open the perspective for the development of a new therapeutics for the treatment of stroke.