Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2006. / På titelsidan felaktigt: immunotherpay. Härtill 7 uppsatser.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009. / Made available in DSpace on 2012-10-24T15:09:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 274094.pdf: 2621155 bytes, checksum: ed1393da62ea71d2d47ccd38ff064440 (MD5) / Os vírus entéricos humanos são importantes causas de enfermidades veiculadas através da água. Atualmente, em termos de legislação brasileira, apenas a contagem do número de coliformes é utilizada para determinar a segurança microbiológica de águas tratadas e não tratadas. Os vírus presentes no meio ambiente são, na sua maioria, não adaptados ao cultivo in vitro, tornando-se necessário o desenvolvimento e implementação de métodos que possibilitem a adoção de medidas preventivas para controle de contaminação viral. Assim sendo, os objetivos do presente trabalho foram (I) padronizar e estabelecer metodologias de concentração, detecção, quantificação e viabilidade viral no ambiente aquático; (II) realizar a pesquisa de adenovírus humanos (HAdV), norovírus (NoV) genogrupos GI e GII, rotavírus humanos genogrupo A (RV-A) e vírus da hepatite A (HAV) em águas ambientais e ostras de cultivo durante o período de um ano e (III) avaliar por ensaio de placa de lise a sobrevivência de HAdV infecciosos sorotipos 2 e 41 em águas de superfície e subterrâneas. No estudo de padronização dos métodos foram utilizados como modelos os HAdV e HAV inoculados em águas: destilada, de esgoto tratado, do mar e da lagoa. A melhor eficiência de recuperação viral (100%) foi obtida quando as matrizes de água destilada e de esgoto tratado foram utilizadas. A menor eficiência (10%) foi encontrada para a água do mar. No estudo de campo, águas foram coletadas de 8 locais de Florianópolis, Santa Catarina e ostras (Crassostrea gigas) de duas fazendas de cultivo (norte e sul da Ilha) foram também avaliadas no mesmo período. Os resultados de detecção de genomas virais foram HAdV: 75% (esgoto tratado); 64,2% (águas ambientais); 87,5% (ostras); RV-A: 41,6% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); 8,3% (ostras); HAV: 25% (esgoto tratado); 8,3% (águas ambientais); ausência nas ostras; NoV: 50% (esgoto tratado); 19% (águas ambientais); ausência nas ostras. No estudo de viabilidade viral por PCR integrado a cultura celular (ICC-PCR), confirmou-se positividade de HAdV em: 66,6% (esgoto tratado); 83,8% (águas ambientais); de RV-A: ausência em esgoto tratado e 12,5% (águas ambientais); de HAV: 66,6% (esgoto tratado) e ausência nas águas ambientais. Por PCR quantitativo o número de genomas (gc) de NoV nas águas foram médias de 1,8 x 102 (GI) e 1,0 x 103 gc/L (GII) em esgoto tratado e de 1,1 x 102 (GI) e 8,1 x 103 gc/L (GII) nas águas ambientais. Para HAdV obteve-se médias de: 9,8 x 104 (esgoto tratado); 9,8 x 106 gc/L (águas ambientais) e de 9,1 x 104 (ostras sul da ilha) e 1,5 x 105 gc/g (ostras norte da ilha). Os resultados obtidos indicam uma maior prevalência de HAdV no ambiente aquático, seguido de NoV, RV-A e HAV. No estudo de decaimento de infectividade de HAdV em amostras de água houve uma significativa inativação viral somente ao final das 23 semanas a 19°C para os dois sorotipos de adenovírus testados. Estes resultados demonstram a longa taxa de sobrevivência destes vírus em águas ambientais. / Enteric viruses are important cause of gastroenteritis outbreaks transmitted through contaminated water sources. Nowadays, the Brazilian legislation only requires the coliforms counting to determine the microbiologic safety in treated and non treated water. Most viruses present in the aquatic environment are not adaptable to in vitro cultures, becoming necessary to develop and implement methods that could be used in the monitoring and prevention of viral contamination. Therefore, the objectives of this thesis were (I) to standardize and establish methodologies of concentration, detection, quantification and viral viability in the aquatic environment; (II) to access the contamination of human adenovirus (HAdV), norovirus (NoV) genogrups GI e GII, human rotavirus genogrup A (RV-A) and Hepatitis Virus A (HAV) in environmental waters and oysters during one year; (III) to study the survival of infectious HAdV type 2 and 41 in surface and ground waters measured by plaque assay. In the standardization study, HAdV and HAV were used as models and were inoculated in distilled water, treated wastewater, seawater and lagoon water, showing better virus recovery (100%) in distilled water and treated wastewater, and lower recovery (10%) in seawater. In the field study, water samples were collected from 8 sites in Florianopolis, Santa Catarina and oyster samples (Crassostrea gigas) from two oysters' farms (north and south of the Island) were also collected in the same period. The detection results of virus genomes were HAdV: 75% (treated wastewater); 64.2% (environmental waters); 87.5% (oysters); RV-A: 41.6% (treated wastewater); 19% (environmental waters); 8.3% (oysters); HAV: 25% (treated wastewater); 8.3% (environmental waters); absence in oysters; NoV: 50% (treated wastewater); 19% (environmental waters); absence in oysters. In the viability study by integrated cell culture PCR (ICC-PCR), the results confirmed viable HAdV: 66.6% (treated wastewater); 83.3% (environmental waters); RV-A: absence in treated wastewater and 12.5% (environmental waters); HAV: 66.6% (treated wastewater) and absence in environmental waters. By quantitative PCR assays the number of genomes (g.c.) for NoV in waters were averages of 1.8 x 102 (GI) and 1.0 x 103 gc/L (GII) in treated wastewater and 1.1 x 102 (GI) and 8.1 x 103 gc/L (GII) in environmental waters. For HAdV the averages were: 9.8 x 104 (treated wastewater); 9.8 x 106 gc/L (environmental waters) and 9.1 x 104 (oyster farm South) e 1.5 x 105 gc/g (oyster farm North). The surveillance results have shown a higher prevalence of HAdV in the aquatic environment, followed by NoV, RV-A and HAV. In the study of HAdV infectivity decay in water under different temperatures, results showed a significant inactivation only after 23 weeks at 19°C for both HAdV tested. These results have shown a long-term survival of adenoviruses in environmental waters.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química. / Made available in DSpace on 2012-10-23T18:50:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 250664.pdf: 11349748 bytes, checksum: 3dedf8277e403e722de3fd41c0b049a8 (MD5) / Durante os últimos anos a pesquisa de novos fármacos antivirais passou por grandes avanços, com a descoberta de novos alvos moleculares e com o desenvolvimento da síntese orgânica, o que tem resultado em substâncias bioativas mais eficazes e/ou menos tóxicas, que podem ser utilizadas como modelos de novos fármacos. Este trabalho teve como objetivo sintetizar sulfonamidas derivadas da 4-metoxichalcona e sulfonamidas derivadas da quinolina; avaliar a potencial atividade antiviral desses compostos e de outros 150 compostos; e elucidar o mecanismo da ação antiviral do composto mais ativo. Assim, os efeitos inibitórios dos compostos sobre a replicação do Herpes Simplex Virus tipo 1 (HSV-1) e do rotavírus (RV-SA11) foram avaliados através do ensaio do MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-difeniltetrazólio]; e os efeitos dos compostos sobre a replicação do Herpes Simplex Virus tipo 2 (HSV-2) e do vírus sincicial respiratório (RSV) foram avaliados através do método de inibição da formação de placas de lise. Com base nos resultados destas triagens, os compostos mais ativos foram selecionados para uma avaliação detalhada do seu mecanismo de ação, através de várias estratégias metodológicas, tais como: avaliação da ação virucida; avaliação da interferência na dispersão dos vírus célula a célula, na expressão de proteínas virais, na síntese do DNA viral e na ligação dos vírus às glicosaminoglicanas das superfícies celulares; e a preparação e avaliação da sensibilidade de variantes do HSV resistentes. As sulfonamidas derivadas da 4-metoxichalcona e as sulfonamidas derivadas da quinolina apresentaram fraca inibição da replicação dos vírus testados e baixos índices de seletividade e não foram selecionados para a continuidade dos estudos. Os resultados dos processos de triagem mostraram que o composto 98 (2,2-dimetil-5-[(1,3,4-tiadiazol-2-amino)metileno]-1,3-dioxane-4,6-dione) apresentou resultados promissores na inibição da replicação do HSV-1 (cepa 29R/resistente ao aciclovir), uma baixa atividade anti-RSV, e somente 37% de inibição da replicação do vírus HSV-2. Seu mecanismo de ação anti-HSV-1 parece ser mediado, ao menos em parte, pela inibição da dispersão do HSV-1 (cepa 29R) célula a célula e pela interferência em eventos imediatos da replicação deste vírus, através do bloqueio da síntese da proteína ICP27. Além disso, ele não inibiu a síntese do DNA viral, nem apresentou ação virucida. Adicionalmente, outros dois compostos foram escolhidos: uma celohexaose sulfatada (167), e um oligossacarídeo formado por duas unidades de lactose sulfatadas ligadas por um espaçador hidrofóbico específico do tipo C6H4 (183). Eles apresentaram promissoras atividades anti-RSV e anti-HSV e ausência de ação virucida. O mecanismo da ação antiviral destes oligossacarídeos sulfatados parece ser mediada pela inibição da dispersão célula a célula do HSV e, em alguma extensão, do RSV e pela interferência na ligação de ambos os vírus às glicosaminoglicanas das superfícies celulares. Os resultados indicaram, ainda, que outro(s) componente(s) viral(is), exceto a glicoproteína gC, poderia(m) estar também envolvidos(s) na atividade anti-HSV-1 detectada.

Made available in DSpace on 2015-11-18T13:20:35Z (GMT). No. of bitstreams: 2 yasmin_farias_ioc_mest_2013.pdf: 2570192 bytes, checksum: 08f3d8b50b732ac0d3d33ed27c715211 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-04-14 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os rotavírus da espécie A (RVA) são os principais responsáveis pela gastroenterite aguda (GA) em diversas espécies animais. Em humanos, as crianças \2264 5 anos de idade são as mais afetadas. Cerca de 453.000 mortes infantis são causadas pela infecção por RVA, anualmente. Devido a este impacto na saúde pública algumas medidas de controle e prevenção foram estabelecidas: no Brasil, em março de 2006 foi introduzida uma vacina monovalente (G1P[8]) atenuada contra RVA, denominada Rotarix®. Segundo a Organização Mundial da Saúde, é necessário uma extensa e contínua monitorização dos genótipos circulantes de RVA, além de estudos de vigilância para que se possa avaliar os impactos da vacina, sua eficácia e o surgimento de novas variantes virais que possivelmente possam escapar do processo de imunização. Para uma melhor caracterização e entedimento da diversidade genética dos RVA, foi proposto um novo sistema de classificação baseada na análise dos 11 segmentos gênicos, no qual os genótipos de cada um dos segmentos devem ser caracterizados. Esta abordagem está fornecendo dados para apoiar a existência de três genogrupos dominantes entre humanos: Wa-like(I1-R1-C1-M1-A1-N1-T1-E1-H1), DS1-like (G2-P[4]- I2-R2-C2-M2-A2-N2-T2-E2-H2) e AU1-like ((G3-P[9]-I3-R3-C3-M3-A3-N3-T3-E3-H3), sendo este último menor e compartilhado por estirpes de origem felina/canina. No Brasil, trabalhos envolvendo a caracterização de todos os segmentos gênicos são escassos. No presente estudo foram selecionadas 40 espécimes fecais entre 1994-2012 de crianças hospitalizadas devido a GA causada por RVA G1, G2, G3, G4, G9 e G12, na região Norte do Brasil A principal finalidade do estudo foi avaliar a diversidade genética dos RVA circulantes antes e depois da introdução da vacina Rotarix®. Para tal, os genes de RVA foram amplificados, sequenciados e analisados por reconstrução filogenética. Através desta análise foi possível identificar pelo menos três alelos subgênicos distintos para cada gene, permitindo evidenciar constelações genotípicas diferentes, porém conservadas relacionadas aos três principais genogrupos: Wa-like, DS1-like e AU-like, sendo que neste último,uma amostra (PID084) se relacionou com estirpes de origem felina. Foram evidenciados mecanismos de variabilidade genética viral, como: reassortment inter-genogrupos ocorrendo em amostras de origem humana e entre humana-animal; reassortment intra-genogrupos ocorrendo em cepas G1P[8], G2P[4], G4P[8] e G9P[8] e com genes de origem animal; e ainda mutações pontuais ocorrendo na sequência de todos os genes das estirpes analisadas. O maior grau de variabilidade genética foi encontrado em cepas circulantes antes da introdução da vacina. Com relação aos genes que codificam para proteínas externas, foi possível identificar mudanças em resíduos localizados em regiões antigências de estirpes circulantes nos dois períodos, podendo refletir em modificações estruturais importantes na proteína. Os dados do presente estudo contribuem para uma melhor compreensão acerca da diversidade genética dos RVA e de seus mecanismos evolutivos, sendo um dos poucos trabalhos sobre a caracterização dos 11 segmentos gênicos de estirpes circulantes na Região Norte, contribuindo para esclarecer caracterísiticas que podem representar um desafio para o Programa Nacional de Imunização no Brasil / Specie A Rotaviruses (RVA) are responsible for acute gastroenteritis (GA) in many animal species. In humans, children under five years old are the most affected. Each year, a bout 453,000 infant deaths are caused by RV infections . Due to this public health impact, prevention and control measures were established: in March 2006, the Brazilian Health Ministry made available an monovalent att enuated vaccine, called Rotarix®. According to World Health Organization, extensive and continuous monitoring of RVA strains and surveillance studies are necessary to evaluate the impact and efficacy vaccine and to investigate appearance of new viral varia nts that could possibly escape the immunization procedure. For a better characterization and understanding of the RVA genetic diversity, proposed a new classification system encompassing all 11 RVA gene segments. This approach has facilitated the exponenti al growth of complete RVA genome data during recent years. On the basis of complete RVA genome sequence comparisons, two major genotype constellations (genogroups): I1 - R1 - C1 - M1 - A1 - N1 - T1 - E1 - H1 (Wa - like) and I2 - R2 - C2 - M2 - A2 - N2 - T2 - E2 - H2 (DS1 - like), have been shown to circulate worldwide among humans. A third (minor) human genotype constellation, referred to as AU1 - like (I3 - R3 - C3 - M3 - A3 - N3 - T3 - E3 - H3).In Brazil, studies involving the characterization of all genes segments are rare . In the current study, a total of 40 fecal specimens were selected between 1994 and 2011 from children hospitalized due to acute diarrhea caused by RVA G1, G2, G3, G4, G9 and G12 in Northern Brazil region, aiming to evaluate the RVA genetic diversity in the pre - vaccine period and post - va ccine.For this, the RVA genes were amplified, the amplicons were sequenced and analyzed for phylogenetic reconstruction. Based this analysis were identified three subgenotype alleles for each gene, allowing evidence con served genotypic constellations, thou gh related to three distinct genogroups: Wa - like, DS1 - like e AU - like. AU1 - like strain (PID084) revealed close relationship with genes feline origin. The results also show evidence some genetic variability mechanisms: inergenogroup reassortments events occ ourring between human - human and human - animal genes ; intragenogroup reassortment events in G1P[8], G2P[4], G3P[8], G4P[6], G4P[8] RVA strains between human - human and human - animal gene, newly; and still occurring point mutations in the sequences of all gene s of strains analyzed. A large degree of variability has been found in circulating strains before vaccine introduction.Regarding genes encoding foreign proteins, it was possible to identify changes in residues located in antigenic regions and may reflect s ignificant changes in structural proteins.In conclusion, the current work help to increase the knowledge on the genomic diversity of RVA, aiming detect new variants and possible antigenic changes, whose potential effect on vaccine effectiveness should be s tudied. Additionally, our findings identified close relationships between human and animal RVA, contribute to clarify characteristics that can pose a challenge for the Brazilian National Immunization Program

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:01:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 ana_teixeira_ioc_dout_2014.pdf: 2210367 bytes, checksum: 5beb9168ee6e8a292a1d6f9e977c6f99 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Os fômites desempenham um papel importante na disseminação de diferentes patógenos, em ambientes hospitalares. Atualmente, o Programa Nacional de Controle de Infecção Hospitalar (PCIH) dispõe sobre a obrigatoriedade dos hospitais manterem uma Comissão de Controle de Infecções Hospitalares (CCIH) para execução do controle das infecções adquiridas durante as hospitalizações. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel de vírus gastroentéricos, não incluído nestas normas, como potenciais marcadores biológicos de contaminação hospitalar. Com este propósito foram realizados estudos para demonstrar a disseminação e a infecciosidade de rotavírus da espécie A (RVA) e adenovírus humanos (HAdV) em superfícies e fômites de unidades de tratamentos intensivos (UTI) adulto e neonatal e enfermaria pediátrica da rede privada e pública. O primeiro estudo realizado em uma UTI de adultos detectou HAdV em 44,7% (63/141) dos fômites investigados com carga viral variando entre 2,48 x 101 e 2,1 x 103 cópias genômicas por mililitro (gc/mL), incluindo uma contaminação mista com HAdV e RVA. Pode-se observar uma diminuição significativa no percentual de detecção de HAdV (p <0,05) a partir de intervenções realizadas no processo de limpeza e desinfecção da UTI de adultos da rede privada. Embora a detecção de HAdV tenha sido significativamente maior (p <0,05) que RVA nos primeiros dois meses do estudo, os RVA apresentaram uma maior carga viral Tanto os HAdV quanto os RVA coletados dos fômites hospitalares puderam ser isolados em cultura celular, indicando que os vírus permanecem infecciosos nessas superfícies, apesar dos processos de desinfecção utilizados. Os dados referentes às unidades hospitalares infantis da rede pública revelaram uma maior taxa de detecção de HAdV [26,6% (128/480)] quando comparada com RVA [3,4% (16/480)] (p <0,001). Na unidade de terapia intensiva neonatal, 4,5% (7/156) das amostras foram positivas. Na enfermaria pediátrica, 42,3% foram positivas (137/324), sendo 4,3% (14/324) RVA positivas e 38% (123/324) HAdV positivas. Realizou-se uma avaliação da metodologia utilizada, determinando a recuperação de vírus a partir de superfícies porosas (fórmica porosa e emborrachado) e não porosas (fórmica lisa). A metodologia de amostragem por swab utilizada para coleta das amostras a partir dos fômites foi avaliada e a análise por PCR quantitativa (qPCR) revelou uma eficiência de recuperação variável, entre 0,6 e 77% de acordo com os vírus e as superfícies testadas. PP7 e MNV-1 foram recuperados em 100% das superfícies (P e NP) contaminadas artificialmente e indicou o MNV-1 como potencial controle interno para o monitoramento de todas as etapas da metodologia utilizada Concluindo, os resultados apontam os HAdV como potenciais marcadores de contaminação hospitalar, uma vez que: i) as superfícies analisadas apresentaram uma maior contaminação por estes vírus; ii) foi comprovada a infecciosidade destas amostras; iii) esses vírus podem ser isolados mais facilmente em culturas celulares. O monitoramento de fômites hospitalares mostra-se fundamental para demonstrar a dispersão dos vírus no ambiente hospitalar, podendo contribuir de forma mais eficaz na avaliação da qualidade microbiológica dos ambientes hospitalares, na elucidação de surtos hospitalares e, principalmente, na tomada de medidas eficazes para a prevenção e tratamento de doentes / Hospital fomites can play an important role in the spread of pathogens such as gastroenteric virus. Currently, the National Program of Hospital Infection Control requires hospitals to maintain a Committee of Nosocomial Infection Control for preventing infections acquired during hospitalization. In this context, the aim of this study was to evaluate the role of gastroenteric viruses as potential biomarkers of hospital contamination. For this purpose studies were performed to demonstrate the spread and infectivity of rotavirus species A (RVA) and human adenoviruses (HAdV) on surfaces and fomites of two hospitals: one private and one public, including adult, neonatal-Intensive care units (ICU) and pediatric ward. The first study conducted in an adult ICU, detected HAdV in 44.7% (63/141) of investigated fomites, with the viral load ranging from 2.48 x 101 to 2.1 x 103 genomic copies per milliliter (gc/mL), including a mixed contamination with HAdV and RVA. Furthermore, it can be observed a significant decrease in the percentage of detection of HAdV (p <0.05) from the cleaning and disinfection interventions of the adult ICU, similar to that previously observed for RVA. Although the detection of HAdV was significantly higher (p <0.05) than the RVA at the first two months of the study, the RVA showed a higher viral load. Both the RVA as HAdV collected from hospital fomites could be isolated in cell culture, indicating that those viruses remain infectious at this surfaces despite the disinfection processes used. Data regarding pediatric's public hospitals revealed a higher detection rate of HAdV [26.6% (128/480)] compared to RVA [3.4% (16/480)] (p <0.001). Only 4.5% (7/156) of the samples were positive in the neonatal intensive care unit. In the pediatric ward, 42.3% were positive (137/324), 4.3% (14/324) RVA positive samples and 38% (123/324) HAdV positive samples. Additionally, it was performed an evaluation of the methodology used in this study, determining the recovery of virus from porous surfaces (porous formica and rubber) and nonporous (nonporous formica) using murine norovirus 1 (MNV-1) and bacteriophage PP7 as internal process controls. The swab sampling methodology used for collecting samples from fomites was evaluated, quantitative PCR (qPCR) showed variable recovery efficiency, between 0.6 and 77% according to viruses and surfaces tested. PP7 and MNV-1 were recovered in 100% of the artificially contaminated surfaces (P and NP), and the MNV-1 was indicated as a potential internal control to monitor all stages of the methodology. In conclusion, the results indicate the HAdV as potential markers of nosocomial infection, since: i) the studied surfaces showed greater HAdV contamination; ii) the infectivity of these samples was proven; iii) these viruses can be more easily isolated in cell cultures. Therefore, the monitoring of hospital fomites proven to be crucial and helps to enhance the dispersion of the virus in the hospital environment, and could contribute more effectively in the evaluation of the microbiological quality of the hospital environment, at the elucidation of hospital outbreaks, and especially in the measured of prevention and treatment of patients.

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-23. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:29Z : No. of bitstreams: 1 000836886_20170327.pdf: 64217 bytes, checksum: 393504d20ec7ab99c209ce9343eb843a (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-31T12:19:17Z: 000836886_20170327.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-31T12:20:20Z : No. of bitstreams: 1 000836886.pdf: 1309134 bytes, checksum: c44c8eb5c08f968e0157c6ac0f5dcec8 (MD5) / Os rotavírus são os principais agentes causadores de diarreias em várias espécies animais e nos seres humanos, causando grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. Uma característica marcante desse vírus é a grande diversidade genotípica das estirpes circulantes. Informações sobre genotipagem são imprescindíveis para estabelecer mecanismos de vigilância epidemiológica da infecção por rotavírus. O presente trabalho teve como objetivo discutir a epidemiologia de rotavírus na espécie bovina por meio de estudos desenvolvidos entre os anos 2006 e 2010, no Laboratório de Rotavirose da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (FCAV/Unesp). Foram obtidas 803 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária de 1 a 90 dias, com e sem diarreia, de 48 rebanhos de gado bovino leiteiro e de corte localizados no Estado de São Paulo. As amostras foram caracterizadas com base nos testes de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). O teste de PAGE indicou animais positivos em 33,3% (16/48) dos rebanhos e 6,1% (49/803) das amostras analisadas. Nos rebanhos leiteiros foram detectados animais infectados por rotavírus nas diferentes faixas etárias de até 90 dias de idade, enquanto nos rebanhos de corte alta frequência (22,8%) de amostras positivas foi verificada em bezerros entre 1 e 15 dias (P<0,05). A análise do perfil do genoma no PAGE identificou sete eletroferótipos, característicos de rotavírus do grupo A, indicando grande diversidade genômica do rotavírus nos rebanhos estudados. A caracterização molecular dos genótipos G (VP7) e P (VP4) pela RT-PCR identificou o genótipo G6P[5] como o mais comum. Foram construídos mapas que analisaram a distribuição espacial dos rotavírus detectados. O trabalho de identificação do rotavírus é de grande valia, uma vez que... / Rotavirus is the major causative agent of diarrhea in several animal species and humans, causing large economic and public health damage. A striking feature of this virus is the great genotypic diversity of circulating strains. Genotyping information is essential to establish surveillance mechanisms of rotavirus infection. This study aimed to discuss the epidemiology of rotavirus in cattle through studies conducted between 2006 and 2010, the Rotavirus Disease Laboratory of the Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences of the Universidade Estadual Paulista Julio de Mesquita Filho (FCAV / UNESP), 803 samples of feces of calves were obtained, ranging in age from 1 to 90 days, with and without diarrhea, 48 herds of dairy and beef cattle in the State of São Paulo. The samples were characterized on the basis of electrophoresis tests on polyacrylamide gel (PAGE) and then reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The PAGE test indicated positive animals in 33.3% (16/48) of the herds and 6.1% (49/803) of the samples. In dairy herds infected animals were detected rotavirus in different age groups (P> 0.05), while in the high frequency cut herds (22.8%) of positive samples was observed in calves between 1 to 15 days (P <0,05). The genome profile analysis in PAGE identified seven eletropherotypes characteristic of rotavirus group A, indicating a high genomic diversity of rotavirus in the herds. The molecular characterization of genotype G (VP7) and P (VP4) by RT-PCR identified the genotype G6P [5] as the most common. Maps were constructed to analyze the spatial distribution of detected rotavirus. Rotavirus identification work is of great value, since it is evident that different genotypes agent is spread in São Paulo presenting different forms of production

Orientador: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: Este estudo teve como objetivo avaliar a imunidade ativa e passiva contra rotavirose bovina induzida por vacina comercial em vacas e seus respectivos bezerros, oriundos de propriedade no município de Cravinhos, Estado de São Paulo. Foram realizadas análises dos níveis séricos das imunoglobulinas IgG, IgG1, IgG2, IgM e IgA anti-rotavírus das vacas antes da vacinação (aproximadamente 60 dias antes do parto), antes da revacinação (aproximadamente 30 dias antes do parto) e no momento do parto, pela técnica de ELISA indireto. Os níveis colostrais das imunoglobulinas IgG, IgG1, IgG2 IgM e IgA no dia do parto foram avaliados pela mesma técnica. Os níveis de imunoglobulinas dos bezerros, nascidos das vacas vacinadas e não vacinadas alimentados com seus respectivos colostros, foram avaliados no dia do nascimento (D0) antes da mamada do colostro e 1, 7, 14, 21 e 28 dias após o nascimento. A excreção de rotavírus nas fezes dos bezerros foi avaliada por SDS-PAGE. Neste estudo os níveis séricos de IgM e IgA foram significativamente maiores nas vacas que não foram vacinadas, o que refletiu no aumento da IgM no primeiro dia de vida dos bezerros nascidos destas vacas. O grupo das vacas vacinadas tiveram níveis séricos de IgG1 e níveis colostrais de IgG2 aumentados em relação às vacas do grupo controle, mas não houve diferenças significativas nos níveis de imunoglobulinas dos bezerros nascidos de vacas vacinadas ou não vacinadas. Em ambos os grupos houve excreção de rotavírus nas fezes, e, apesar de baixa ocorrência, um bezerro nascido de vaca vacinada excretou rotavírus posteriormente (aos 21 dias) aos dois bezerros nascidos de vacas não vacinadas (7 e 14 dias). Os resultados deste estudo demonstraram que a vacinação materna no terço final de gestação com vacina inativada retardou, mas não evitou a ocorrência da rotavirose / Abstract: The aim of this study was evaluated the active and passive immunity against rotavirus induced by vaccination with an inactive commercial vaccine in cows and their respective calves from a farm of Cravinhos, state of São Paulo. The analysis of IgG, IgG1, IgG2 , IgM and IgA were done in serum 60 days before calving (before vaccination); 30 days before calving (before revaccination) and in the day of calving, with indirect ELISA. The levels of IgG, IgG1, IgG2, IgM and IgA in colostrum were evaluated in the day of calving, with the same technique. The levels of calves' immunoglobulin were evaluated in the day of born and 1, 7, 21 and 28 days of age. The secretion of rotavirus was evaluated in fecal samples of calves by SDS-PAGE. In this study, levels of IgM and IgA were increased in cows that were not vaccinated, and their calves, fed their colostrums, have levels of IgM increased one day after born. Vaccinated cows have serum IgG1 and colostral IgG2 higher than non vaccinated cows but statistics differences in levels of immunoglobulin were not found in calves. In both groups, was detected rotavirus in feces of calves, and besides the low occurrence in this study, one calf of vaccinated cow excreted rotavirus in day 21, while two calves born of non vaccinated cows excreted rotavirus with 7 and 14 days. In conclusion, the vaccination of cows with a commercial inactivated vaccine did not prevent the rotaviruses in calves / Mestre

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

Os rotavírus são os responsáveis pela ocorrência de diarreias em humanos e outras diversas espécies animais. Estão amplamente disseminados na suinocultura, inclusive no Brasil. As proteínas não estruturais 2 e 5 (NSP2 e NSP5) dos rotavírus estão envolvidas nas etapas de replicação viral, sendo essenciais para a formação do viroplasma, uma estrutura citoplasmática no interior da qual ocorre a morfogênese das novas partículas virais. Entretanto, são escassos os estudos sobre a diversidade genética destas proteínas em rotavírus circulantes nas criações brasileiras. Até o presente momento, a NSP2 pode ser classificada em nove genotipos (N1 ao N9) e a NSP5, 11 (H1 ao H11), sendo que em humanos foram descritos os genotipos N1, N2, N3 e H1, H2 e H3, e em suínos N1 e H1. Este estudo teve o objetivo de caracterizar as amostras circulantes de rotavírus em termos da diversidade da NSP2 e NSP5. Para isso, um total de 63 amostras fecais provenientes de criações de suínos localizadas em seis diferentes municípios do Estado de São Paulo, Brasil, foram previamente triadas mediante a técnica de nested-PCR. Destas, nove tiveram os respectivos segmentos genômicos amplificados pela reação de RT-PCR, sendo que em sete foi possível o sequenciamento nucleotídico parcial para NSP2 e, em seis, o sequenciamento total para NSP5. Todas foram caracterizadas como genotipo N1 e H1. Considerando o gene NSP2, nas amostras aqui definidas, a identidade nucleotídica variou de 100% a 86,4%, e em termos de aminoácidos, de 100% a 91,5%, enquanto que para NSP5 foi de 100% a 95,1%, e de 100% a 97,4% respectivamente para nucleotídeos e aminoácidos. Conclui-se que os genotipos das amostras circulantes na região de estudo estão em concordância com aqueles descritos na literatura para a espécie suína, e que há a hipótese de interação entre rotavirus de origem humana e animal. Estes dados são úteis para uma vigilância mais abrangente dos rotavírus circulantes e contribuem para uma melhor compreensão da patogenia, epidemiologia e prevenção da doença, inclusive no que diz respeito ao seu caráter zoonótico. / Rotaviruses are responsible for the occurrence of diarrhea in humans and several other animal species. They are widespread in pig farms, including in Brazil. The non-structural proteins 2 and 5 (NSP2 and NSP5) of rotavirus are involved in viral replication and they are essential for the formation of viroplasm, a cytoplasmic structure within which occurs morphogenesis of new viral particles. However, there are very few studies on the genetic diversity of those proteins in circulating rotavirus in Brazilian swine raisings. So far, nine NSP2 genotypes have been identified (N1 to N9) and eleven for NSP5 (H1 to H11). In humans, genotypes N1, N2, N3 and H1, H2, H3 have been described, whereas in pigs, H1 and N1 have been described. This study is aimed at characterizing circulating samples of rotavirus in terms of diversity of NSP2 and NSP5. For this purpose, a total of 63 fecal samples from pig farms located in six different cities in the state of São Paulo, Brazil, were previously screened by nested-PCR technique. Of those, nine had their genomic segments amplified by RT-PCR, and in seven it was possible to obtain the partial nucleotide sequencing for NSP2, whereas in six, the total sequencing for NSP5. All were characterized as genotype H1 and N1. Considering the gene NSP2, the strains nucleotide identity, defined herein, ranged from 100% to 86.4% and in terms of amino acids, from 100% to 91.5%. Whereas for NSP5, it was from 100% to 95.1 %, and 100% to 97.4% for nucleotides and amino acids, respectively. It is concluded that the genotypes of the strains circulating in the region of study are in agreement with those reported in literature for swine, and that there is the possibility of interaction between human and animal rotaviruses. These data are useful for a broader surveillance of circulating rotaviruses and contribute to a better understanding of the pathogenesis, epidemiology and disease prevention, especially in regard to its zoonotic aspect.

Os rotavírus e coronavírus são importantes agentes virais associados às enteropatias em suínos, tendo implicações em Saúde Animal, Saúde Pública e no Agronegócio. Apesar disso, são escassos os trabalhos em nosso meio que visaram detectá-los e caracterizá-los com maior amplitude, especialmente os coronavírus. Nesse sentido, determinou-se a ocorrência das amostras circulantes destes vírus a partir de materiais clínicos oriundos de diversas granjas produtoras de suínos de 12 diferentes municípios do Estado de São Paulo, mediante o emprego de três reações, previamente descritas, em paralelo: uma multiplex nested RT-PCR para detecção simultânea de dois coronavírus suínos que podem ser encontrados nas fezes desses animais, o Vírus da Gastroenterite Transmissível (TGEV) e o Vírus da Diarreia Epidêmica dos Suínos (PEDV), e rotavírus do grupo A; uma nested RT-PCR para investigar a existência de algum pancoronavírus nos animais pesquisados; e uma RT-PCR para verificar a ocorrência do TGEV e do Coronavírus Respiratório Suíno (PRCoV), o qual também pode ser observado em materiais fecais de porcos. Para a primeira reação, foram utilizados dois pares de primers dirigidos ao gene S do TGEV (951pb e 793pb), dois ao gene M de PEDV (425pb e 291pb), e dois ao gene NSP5 do rotavírus (317pb e 208pb); para a segunda, foram empregados quatro primers direcionados ao gene RdRp dos coronavírus (251pb e 136pb); e para a terceira, foi usado um par de primers tendo como alvo o gene S (886pb para TGEV e 205 a 214pb para PRCoV). Os dados obtidos demonstraram que há uma elevada frequência de ocorrência de rotavírus nas criações comerciais, acometendo 40,37% do total de amostras testadas (88/218) e 91,6% dos municípios amostrados (11/12 municípios). Os coronavírus não foram detectados nas criações. Os fragmentos de rotavírus amplificados provenientes da multiplex nested RT-PCR foram purificados e caracterizados através da determinação das sequências de nucleotídeos, referentes aos genes VP4 e VP7. Foi possível o sequenciamento nucleotídico total do gene VP7 de uma amostra, e o sequenciamento parcial de 34 (aproximadamente 24,74% a 35,57% da região codificadora) e 23 (aproximadamente 63,19% a 98,77% da região codificadora) amostras para o gene VP4 e VP7, respectivamente. Quanto aos genotipos, foram detectados o G3, G5 e G9 em combinação com P[6], P[13] (e/ou P[22]) e P[23]. Formulações vacinais disponíveis comercialmente contemplam apenas os genotipos G4 e G5 dos rotavírus, o que demonstra uma desvantagem em termos de proteção de animais suscetíveis, visto que somente um deles (G5) foi encontrado nos animais analisados no presente estudo. O conhecimento deste víru permite estudos quanto à transmissão zoonótica e interespécies deste micro-organismo e o fortalecimento do controle e de medidas profiláticas direcionadas ao agente. / The rotavirus and coronavirus are important viral agents associated with enteropathies in pigs, with implications for Animal Health, Public Health and Agribusiness. Nevertheless, there is little data about the detection and characterization of these viruses, especially the coronavirus. This study determined the occurrence of them on farrow-to-finish pig farms from 12 different cities in the São Paulo State, Brazil. For this purpose, three reactions, previously described, were performed: multiplex nested RT-PCR for simultaneous detection of two porcine coronavirus that can be found in the feces of these animals, the Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and the Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), and group A rotavirus; a nested RT-PCR to investigate the occurrence of any member of the genus Coronavirus; and a RT-PCR for detection of the TGEV and Porcine Respiratory Coronavirus (PRCoV), which can also be observed in fecal samples of swine. For the first reaction, we used two pairs of primers targeting the S gene of TGEV (951bp and 793bp), two primers targeting to the M gene of PEDV (425bp and 291bp), and two primers targeting the NSP5 gene of group A rotavirus (317bp and 208bp). For the second reaction, four primers were used targeting to the RdRp gene of coronaviruses (251bp and 136bp). In the third reaction, a pair of primers was used targeting the S gene (886bp to TGEV and 205-214bp to PRCoV). This data showed that 40.37% of the total samples tested (88/218) and 91.6% of the cities (11/12 cities) were positive for rotavirus. Coronaviruses were not detected on farms examined in this study. The rotavirus positive stools were characterized based on PCR and nucleotide sequence analyses for the VP4 and VP7 genes. The VP7 complete nucleotide sequencing was obtained for one sample, and partial nucleotide sequencing for 34 (about 24.74% to 35.57% of coding region) and 23 (about 63.19% to 98.77% of coding region) samples for the VP4 and VP7 gene, respectively. The genotypes G3, G5 and G9 in combination with P[6], P[13] (and / or P[22]) and P[23] was found. Commercially available vaccine formulations include only the G4 and G5 rotavirus genotypes, which demonstrates a disadvantage in terms of protection of susceptible animals, whereas only one (G5) was detected in the animals analyzed in this study. The knowledge of this virus allows studies of the zoonotic and interspecies transmission of this microorganism and the strengthening of control and prophylactic measures directed to the agent.