Le complexe cohésine maintient associées les chromatides sœurs depuis la réplication jusqu’à leur ségrégation en mitose. Une question majeure est de comprendre comment la cohésion est établie lors de la phase S. Chez les mammifères et S. pombe, les cohésines sont associées de manière labile aux chromosomes pré-réplicatifs et l’établissement de la cohésion en phase S s’accompagne de la stabilisation de l’association des cohésines aux chromosomes. L’objectif de ce travail est de comprendre comment la dynamique des cohésines est régulée et comment son inhibition créée la cohésion.En G1 les cohésines associées aux chromosomes s’échangent avec le pool soluble et leur dissociation dépend de Pds5 et Wapl. La première partie de ce travail présente les résultats d’un crible génétique visant à identifier de nouveaux régulateurs de la dynamique des cohésines.L’établissement de la cohésion nécessite l’acétyltransférase Eso1 mais pas en contexte Δwpl1, indiquant que la seule mais essentielle fonction d’Eso1 est de s’opposer à celle de Wapl. L’acétylation de Smc3 par Eso1 contribue mais n’est pas suffisante pour contrecarrer Wapl, suggérant l’existence d’un autre événement dépendant d’Eso1. En G1, Pds5 agit avec Wapl pour dissocier les cohésines des chromosomes mais après la phase S, Pds5 est requise pour leur maintien sur les chromosomes et pour la cohésion à long terme. Pds5 co-localise avec la fraction stable de cohésines mais pas Wapl. Nous suggérons un modèle dans lequel la cohésion est créée par deux événements d’acétylation couplés à la progression de la fourche de réplication conduisant à l’éviction de Wapl des cohésines destinées à produire la cohésion. / Following DNA replication, sister chromatids are connected by cohesin to ensure their correct segregation during mitosis. How cohesion is created is still enigmatic. The cohesin subunit Smc3 becomes acetylated by ECO1, a conserved acetyl-transferase, and this change is required for cohesion. As in mammals, fission yeast cohesin is not stably bound to G1 chromosomes but a fraction becomes stable when cohesion is made. The aim of this work was to understand how cohesin dynamics is regulated and how the change in cohesin dynamics creates cohesion.In G1 chromatin bound cohesin exchange with the soluble pool and the unloading reaction relies in part on Wapl. The first part of this study reports on the identification of G1/S factors as new candidate regulators of cohesin dynamics.Following S phase a stable cohesin fraction is made. The acetyl-transferase Eso1 is not required for this reaction when the wpl1 gene is deleted. Yet, it is in wild-type cells, showing that the sole but essential Eso1 function is counteracting Wapl. Eso1 acetylates the cohesin sub-unit Smc3. This renders cohesin less sensitive to Wapl but does not confer the stable binding mode, suggesting the existence of a second Eso1-dependent event. The cohesin sub-unit Pds5 act together with Wapl to promote cohesin removal from G1 chromosomes but after S phase Pds5 is essential for cohesin retention on chromosomes and long term cohesion. Pds5 co-localizes with the stable cohesin fraction whereas Wapl does not. We suggest a model in which cohesion establishment is made by two acetylation events coupled to fork progression leading to Wapl eviction while keeping Pds5 on cohesin complexes intended to make cohesion.

Au cours de mon travail de doctorat, je me suis intéressé aux mécanismes qui contrôlent la séparation équitable du génome lors de la méiose dans l’ovocyte de souris.Le point de contrôle du fuseau contrôle la ségrégation des chromosomes en méiose : en cas d'attachement incorrect des chromosomes au fuseau, l'anaphase est retardée ce qui permet d'éviter les aneuploïdies. En métaphase, l’attachement des chromosomes homologues aux deux pôles opposés du fuseau, génère une force de tension au niveau des kinétochores. Mon travail de thèse a consisté à déterminer si la tension exercée sur les chromosomes est un signal qui permet de satisfaire le point du contrôle du fuseau en méiose I dans l'ovocyte de souris. Lorsque la tension exercée sur les chromosomes homologues par les microtubules est diminuée par un traitement pharmacologique, la dégradation de la sécurine, qui marque l’entrée en anaphase, est retardée. Si le point de contrôle du fuseau est inhibé en absence de tension, l’anaphase n’est pas retardée, ce qui indique que le point de contrôle du fuseau est sensible à la tension.Nous avons aussi montré que la kinase Aurora B/C n’est pas requise pour la réponse du point de contrôle du fuseau aux chromosomes non attachés, mais qu’elle est essentielle à la réponse du point de contrôle du fuseau à la baisse de tensionDans un contexte où les erreurs de ségrégation en méiose sont très fréquentes chez la femme et augmentent drastiquement avec l'âge, nos travaux pourraient permettre d'identifier si ces mécanismes de contrôle sont diminués et moins efficaces avec l'âge chez la femme. / At each cell division, chromosomes must be faithfully segregated so that exactly one set of chromosomes is passed on to the next generation. The spindle assembly checkpoint (SAC) ensures faithful chromosome segregation in meiosis: upon uncorrect attachment of the chromosome to the spindle, anaphase onset is delayed in order to avoid chromosome missegregation and aneuploidies. For my PhD thesis, I wanted to determine whether tension applied by the spindle microtubules on the chromosomes is itself a signal that satisfies the SAC in mouse oocyte meiosis I. When tension is decreased by small molecule inhibitors, securin degradation, which is a readout of anaphase onset, is delayed. If the SAC is inhibited, then tension defects cannot delay anaphase onset. This indicates that the SAC is able to delay anaphase onset upon tension defects.Furthermore, we showed that Aurora B/C kinase is not required for the SAC response to unattached chromosomes but that Aurora B/C is required for the SAC response to tension defects.Chromosome segregation errors are very common in women and increase with age. In that context, our work could help to identify whether these key control mechanisms are less efficient in the mammalian oocyte with age.

La présence de cassures double-brin de l'ADN en mitose est problématique pour les cellules, car cette situation produit des fragments de chromosome ne possédant pas de centromères. En l'absence d'un mécanisme permettant leur prise en charge, ces fragments acentriques n'étant pas attachés au fuseau mitotique, pourraient être ségrégés aléatoirement dans les cellules filles, causant de l'instabilité génomique. Nous avons découvert un mécanisme permettant la transmission correcte des fragments acentriques dans les cellules filles via une structure faisant le lien entre les deux fragments cassés. Plusieurs protéines sont recrutées sur les cassures, comme les kinases mitotiques BubR1 et Polo, et favorisent la ségrégation correcte de ces chromosomes cassés. Cependant, les mécanismes permettant le recrutement de BubR1 et Polo sur les cassures d'ADN en mitose sont inconnus. De plus, les mécanismes moléculaires par lesquels BubR1 et Polo favorisent la ségrégation correcte des fragments acentriques restent à être identifiés. La première partie de mon projet a été d'étudier le rôle et la régulation de BubR1 sur les cassures d'ADN pendant la mitose. Nous avons montré que BubR1 requiert Bub3 pour se localiser sur les chromosomes cassés afin de favoriser leur ségrégation correcte. Nous avons également détecté l'accumulation de FizzyCDC20, un cofacteur de l'E3 ubiquitine ligase APC/C (Anaphase-Promoting- Complex/Cyclosome), sur les cassures d'ADN, et son recrutement dépend de son interaction avec la KEN Box de BubR1. De plus, l'utilisation d'un substrat synthétique de l'APC/C nous a permis de démontrer que la dégradation par l'APC/C est inhibée localement autour du chromosome cassé, de manière dépendante de BubR1. Ces résultats suggèrent fortement que le complexe BubR1/Bub3 recrut é sur les cassures d'ADN inhibe localement l'APC/C en séquestrant FizzyCDC20 et empêche ainsi la dégradation de substrats clefs impliqués dans la ségrégation correcte des chromosomes cassés. La seconde partie de mon projet a été d'étudier les relations d'interdépendance entre Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. Nous avons utilisé un laser UV pulsé pour induire des cassures dans un chromosome à un instant précis pendant la mitose, puis nous avons suivi le recrutement de protéines tagguées GFP sur les cassures de chromosome. Cette étude révèle que Polo est rapidement recrutée sur les cassures d'ADN et précède BubR1, Bub3 et Fizzy. De plus, la disparition de BubR1, Bub3 et Fizzy des cassures d'ADN coïncide avec la télophase alors que Polo disparait des cassures pendant l'interphase. Nous avons également montré que le recrutement de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN est retardé dans les mutants polo, indiquant que Polo est requis pour un recrutement efficace de BubR1, Bub3 et Fizzy sur les cassures d'ADN. Pour finir, nous avons montré que l'accumulation de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN dépend de deux composants de la réponse aux dommages à l'ADN, le complexe MRN (Mre11-Rad50-Nbs1) et ATM (ataxia-telangiectasia mutated). Ce travail a permis d'avoir une meilleure compréhension sur la dynamique de recrutement de Polo et BubR1/Bub3/Fizzy sur les cassures d'ADN en mitose. De plus, le mécanisme moléculaire par lequel le complexe BubR1/Bub3 agit pour faciliter la ségrégation des chromosomes cassés a pu être en partie élucidé. / The presence of DNA double strand breaks (DSB) during mitosis is challenging for the cell, as it produces fragments of chromosome lacking a centromere. If not processed, this situation can cause genomic instability resulting in improper segregation of the broken fragments into daughter cells. We uncovered a mechanism by which broken chromosomes are faithfully transmitted to daughter cells via the tethering of the two broken chromosome ends. Several proteins including the mitotic kinase BubR1 and Polo are recruited to the breaks and mediate the proper segregation of the broken fragments. However, the mechanism underlying Polo and BubR1 recruitment to DNA breaks is unknown. Moreover, the molecular mechanisms by which Polo and BubR1 mediate the proper segregation of the broken fragments remain to be elucidated. We first investigated the role and regulation of BubR1 on DNA breaks during mitosis. We show that BubR1 requires Bub3 to localize on the broken chromosome fragment and to mediate its proper segregation. We also find that FizzyCdc20, a co--‐factor of the E3 ubiquitin ligase Anaphase--‐Promoting--‐Complex/Cyclosome (APC/C), accumulates on DNA breaks in a BubR1 KEN box--‐dependent manner. A biosensor for APC/C activity demonstrates a BubR1--‐dependent local inhibition of APC/C around the segregating broken chromosome. These results are consistent with a model where Bub3/BubR1 complex on DNA breaks functions to inhibit the APC/C locally via the sequestration of FizzyCdc20, thus preserving key substrates from degradation, which promotes proper transmission of broken chromosomes. In a second study, we investigated the dependency relationship between Polo and BubR1/Bub3/Fizzy on DNA breaks in mitosis. We used a pulsed UV laser to break one chromosome at a define time during mitosis. We immediately follow the recruitment of GFP--‐tagged proteins to laser--‐induced DNA breaks. My study reveals that Polo is promptly recruited to DNA breaks and precedes BubR1, Bub3 and Fizzy. In addition, while BubR1, Bub3 and Fizzy dissociation from the breaks coincide with telophase and the nuclear envelope reformation, Polo remains on the breaks well into interphase. We further show that the appearance of BubR1, Bub3 and Fizzy on DNA breaks is delayed in polo mutant, indicating that Polo is required for the robust and efficient recruitment of BubR1, Bub3 and Fizzy to DNA breaks. Finally, the timely accumulation of Polo, BubR1 and Bub3 to DNA breaks depends on two components of the DNA Damage Response, the MRN complex (Mre11--‐Rad50--‐Nbs1) and ATM (ataxia--‐telangiectasia mutated). This work gives us a better understanding on how Polo and BubR1, Bub3 and FizzyCdc20 are recruited to DNA breaks in mitosis and how they promote broken chromosomes segregation.

La mitose assure la répartition égale du génome. La kinase mitotique Aurora B y joue un rôle majeur en contrôlant la fidélité de la ségrégation des chromosomes de par sa localisation aux centromères et aux microtubules, qui nécessite son ubiquitination par CUL3. Cependant, le mécanisme conduisant la forme ubiquitinée d’Aurora B sur ces structures mitotiques reste à déterminer. Dans ce contexte, j’ai pu identifier la protéine UBASH3B, qui contient un domaine de liaison à l’ubiquitine (UBD) comme un régulateur essentiel de la ségrégation chromosomique, agissant comme un récepteur de l’ubiquitine pour Aurora B. UBASH3B interagit directement avec Aurora B et cette interaction est dépendante de la modification d’Aurora B par l’ubiquitine ainsi que de CUL3. UBASH3B ne régule pas le niveau d’expression d’Aurora B. En revanche, UBASH3B se localise aux fuseaux mitotiques et est à la fois nécessaire et suffisant pour transférer Aurora B aux microtubules. De plus, la redistribution d’Aurora B des centromères vers les microtubules contrôle le déroulement et la fidélité de la ségrégation des chromosomes et donc le contenu correct du matériel génétique des cellules. Ainsi, mes résultats expliquent comment la modification par l’ubiquitine régule la localisation et la fonction d’Aurora B, reliant une voie de signalisation impliquant un récepteur à l’ubiquitine à la mitose. / Mitosis ensures equal segregation of the genome. The major mitotic kinase Aurora B controls fidelity of chromosome segregation by its localization to centromeres and microtubules, which requires CUL3-mediated ubiquitylation. However, it remains unknown how ubiquitylated Aurora B is targeted to mitotic structures. Here, I identify ubiquitin-binding domain (UBD) protein UBASH3B that critically regulates chromosome segregation, acting as ubiquitin receptor for Aurora B. UBASH3B directly binds Aurora B, and this interaction is dependent on CUL3 and on ubiquitin recognition. UBASH3B does not regulate protein levels of Aurora B. Instead, UBASH3B localizes to the mitotic spindle and is both required and sufficient to transfer Aurora B to microtubules. Moreover, redistribution of Aurora B from centromeres to microtubules controls timing and fidelity of chromosome segregation and thereby euploidy of cells. Thus, my findings explain how ubiquitin attachment regulates localization and function of Aurora B, linking receptor-mediated ubiquitin signaling to mitosis.

Escherichia coli, comme la majorité des bactéries, possède un unique chromosome circulaire. Au moins une copie du chromosome doit être transmise à chacune des cellules filles avant la division cellulaire afin d'assurer une prolifération cellulaire correcte. Une couplage spatio-temporel précis de la ségrégation avec la division cellulaire est donc nécessaire pour assurer la bonne répartition des deux chromosomes après réplication. La région terminale du chromosome (ter) est la dernière à être répliquée et ségrégée, et migre du pôle vers le centre de la cellule au moment de la mise en place du septum de division, à la fin du cycle cellulaire. Les loci de la région ter présentent une période de cohésion post-réplicative étendue. Cette cohésion étendue est contrôlée par la protéine MatP, qui se fixe spécifiquement au niveau des sites matS, présents uniquement dans ter. MatP se fixe à l'ADN sous forme de dimère, via son domaine N-terminal, et tétramérise via son domaine C-terminal. La tétramérisation est stimulée par la liaison à l'ADN et permet le pontage de deux sites matS distants. MatP interagit aussi avec ZapB, un composant du divisome, la machinerie protéique participant à la formation du septum. Alors que la tétramérisation de MatP semble importante pour la compaction de la région ter, son interaction avec ZapB, qui est localisée au septum via ZapA et FtsZ, participe au positionnement et à la cohésion étendue de cette région. Le couplage de la région ter avec le divisome est essentiel pour le bon déroulement de nombreux évènements tardifs du cycle cellulaire : (i) la ségrégation active, ordonnée et progressive de la région ter par FtsK, un composant du divisome, (ii) la résolution des dimères de chromosomes via la recombinaison spécifique de site XerCD/dif, activée par FtsK, (iii) la résolution des liens d'intercaténation par la TopoIV et (iv) la régulation positive de l'assemblage du divisome en absence des régulateurs négatifs MinCDE et SlmA. Pendant ma thèse, je me suis tout d'abord intéressée au rôle de MatP dans la structuration globale du chromosome. En utilisant un système permettant de visualiser deux loci marqués avec un site parSp1 et un site parSpMT1, reconnu par ParBp1 et ParBpMT1 spécifiquement, nous avons analysé le positionnement et l'orientation du chromosome dans la cellule. Nous avons montré que MatP est nécessaire au positionnement et à l'orientation de tout le chromosome à la fin du cycle cellulaire. La localisation de SlmA dans des souches wt et DeltamatP prouve que l'inactivation de MatP, induisant une mauvais positionnement du chromosome, s'accompagne d'une défaut de localisation de SlmA, et induit donc une inhibition de la division. Ces résultats pris ensemble montre que MatP, SlmA et leur communication à travers la structuration globale du chromosome sont importants pour le management du chromosome et le contrôle de la division cellulaire. En collaboration avec l'équipe d'Olivier Espeli, nous avons utilisé des méthodes de génomiques et de biologie moléculaire pour caractériser la régulation de la TopoIV au cours du cycle cellulaire d'E. coli. Nous avons montré qu'au site dif, les activités de fixation et de clivage de la TopoIV sont améliorées par la présence des recombinases XerCD et de MatP. L'amélioration de l'activité de la TopoIV favorise la décaténation des chromosomes nouvellement répliqués et assure, en lien avec d'autres processus, la séparation précise des chromosomes frères. Ces résultats permettent de mieux comprendre le réseau d'interactions dédiées au management du chromosome à la fin du cycle cellulaire, et l'influence du management du chromosome sur le contrôle de la division cellulaire. / Escherichia coli, as the majority of bacteria, has a unique circular chromosome. Faithfull cell proliferation requires that a least one copy of the chromosome is transmitted to sister cells prior to cell division. A strict temporal and spatial coupling of chromosome segregation with cell division is thus required to ensure the accurate separation of the two fully replicated chromosomes. The terminal region of the chromosome (ter) is the last one to be replicated and segregated, and moves from the pole to the middle of the cell where the division septum is formed, at the end of the cell cycle. Loci of the ter region display an extended cohesion period. This extended cohesion is controlled by the MatP protein, which binds specific matS sites restricted to the ter region. MatP binds DNA as a dimer and forms tetramers via its N-terminal and C-terminal domains respectively. Tetramerisation is stimulated by binding to DNA and pairs remote matS sites. MatP also interacts with ZapB, a component of the divisome, the protein machinery that contributes to septum formation. While tetramerisation of MatP appears important for compacting the ter region, its interaction with ZapB, which is localized at the septum via ZapA and FtsZ, is involved in the positioning and the extended cohesion of this region. The linkage of the ter region with the divisome is required for the success of many later events of the cell cycle : (i) the active, ordered and progressive segregation of the ter region by FtsK, a component of the divisome, (ii) resolution of chromosome dimers via the site-specifique recombination XerCD/dif, activated by FtsK, (iii) the resolution of intercatenation links by TopoIV and (iv) the positive regulation of divisome assembly in the absence of the negative regulators MinCDE and SlmA. During my thesis, I first studied the role of MatP in the chromosome management. By using pairs of loci tagged with parSp1 and parSpMT1 sites recognized by cognate ParB-XFP proteins, we directly analysed chromosome positioning and orientation in the cell. We show that MatP is required for normal positioning and orientation of the whole chromosome at the end of the cell cycle. The localisation of SlmA in wt and Delta matP strains proves that inactivation of MatP leads to inaccuracy of nucleoid positioning accompanied by defects in SlmA localisation, and thus induces division inhibition. Take together, these results show that MatP, SlmA and their interplay are important for chromosome management and control of cell division in E. coli. In collaboration with O. Espeli's team, we have used genomic and molecular biology methods to characterize TopoIV regulation during the E. coli cell cycle. We show that at the dif site, TopoIV binging and cleavage are enhanced by the presence of the XerCD recombinases and MatP. This enhancement of TopoIV activity at dif promotes decatenation of fully replicated chromosomes and ensure, through interaction with other processes, accurate separation of sister chromosomes. These results provide insight into the protein network dedicated to the final step of chromosome management during the cell cycle, and how the chromosome management is linked to cell division.

La mitose est précisément contrôlée par la signalisation via l'ubiquitine et est essentielle au maintien de l'intégrité du génome. Dans ce travail, j'ai étudié la fonction de l'enzyme de dé-ubiquitination, UCHL3 et de la ligase E3-ubiquitine, TRIM15. J'ai observé que TRIM15 régule l'adhésion et la mobilité des cellules. UCHL3 a été identifié par un criblage à haut contenu, en tant que facteur critique contrôlant l'alignement et la ségrégation des chromosomes. Fait intéressant, il a déjà été rapporté que les niveaux d’expression d’UCHL3 sont altérés dans divers types de cancer. En utilisant une approche protéomique, nous avons identifié la kinase Aurora B comme un médiateur potentiel de ces phénotypes. Comme l'aneuploïdie est la marque de nombreux cancers et que l'adhésion cellulaire joue un rôle important dans l'invasion des tumeurs et les métastases, mes résultats suggèrent que ces deux protéines pourraient jouer un rôle dans la carcinogenèse. / Mitosis is tightly controlled by ubiquitin signaling and is crucial to maintain genome integrity. In this work, I investigated the function of the deubiquitinating enzyme UCHL3 and the E3 ubiquitin ligase TRIM15. I observed that TRIM15 regulates cell adhesion and motility. UCHL3 was identified in a high-content screen, as a critical factor controlling the chromosome alignment and segregation. Interestingly, it has been previously reported that UCHL3 levels are altered in various cancer types. Using a proteomic approach, we identified Aurora B kinase as a potential mediator of these phenotypes. Since aneuploidy is a hallmark of many cancers, and cell adhesion plays an important role in tumor invasion and metastasis, my results suggest that both proteins could play a role in carcinogenesis.

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI. / E. coli possesses two type IA topoisomerases (topos), namely topo I (topA) and topo III (topB). The major function of topo I is the relaxation of excess negative supercoiling. Much less is known about the function of topo III. Cells lacking both type IA topos suffer from severe chromosome segregation and growth defects. We show that these defects are mostly related to the presence of gyrase mutations that prevent excess negative supercoiling in topA null mutants. Indeed, increasing gyrase activity by spontaneous mutations, by substituting a gyrB(Ts) allele for a wild-type one or by exposing cells carrying the gyrB(Ts) allele to permissive temperatures, significantly corrected the growth and segregation defects of cells lacking type IA topo activity. We also found that topB mutants are hypersensitive to novobiocin due to gyrase inhibition. Our data also suggest that unregulated replication occurring in the absence of topA and rnhA (RNase HI) exacerbates the need for topo III activity. Moreover, when topA and rnhA were absent, we found that topo III overproduction reduced the extensive DNA degradation that took place in the absence of recA (RecA). All together, our results lead us to propose a role for topo III in chromosome segregation when gyrase activity is suboptimal, thus reducing replication forks collapse, especially when replication is unregulated due to the absence of topo I and RNase HI.

Les modifications post-traductionelles des histones contribuent à l’expression génique et à la stabilité du génome. La méthylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me), une marque associée aux promoteurs de gènes transcrits, est déposé par les methyltransferases hautement conservées de la famille SET1, dans le contexte du complexe COMPASS. SET-2, l’homologue de SET1 chez Caenorhabditis elegans, est responsable de la déposition de H3K4me dans la lignée germinale, et son inactivation provoque une perte progressive de la fertilité. Le but de mon travail de thèse a été d’étudier comment SET-2 et la méthylation de H3K4 contribuent au maintien de la lignée germinale. J’ai montré que l’absence de SET-2 provoque une sensibilité accrue aux dommages à l’ADN. Cependant, les voies de signalisation et de réparation de ces dommages sont fonctionnelles dans le mutant set-2. Par séquençage de l’ADN, j’ai par ailleurs montré que la stérilité progressive observée en l’absence de set-2 n’est pas due à une capacité de réparation réduite. L’ensemble de mes résultats suggère que H3K4me pourrait agir en aval de la signalisation de dommages à l’ADN, en influençant l’organisation de la chromatine aux sites des cassures double brin. J’ai d’autre part mis en évidence une nouvelle fonction pour la méthylation de H3K4 dans l’organisation de la chromatine en montrant que set-2 interagit génétiquement avec le complexe Condensine II et la Topoisomérase II, facteurs clefs de l’organisation mitotique des chromosomes. Des expériences de microscopie par FLIM-FRET ont d’ailleurs validé une fonction de H3K4 méthylée dans l’organisation de la chromatine dans la lignée germinale. Enfin, j’ai montré par analyses transcriptomiques que la protéine CFP-1 du complexe COMPASS est impliquée dans la régulation du programme transcriptionnel de la lignée germinale et que cette fonction est indépendante de SET-2. L’ensemble de mes résultats montre comment la régulation chromatinienne impacte le maintien d’une lignée germinale fonctionnelle à plusieurs niveaux. / Post-translational modifications of histones contribute to gene expression and genome stability. Methylation of lysine 4 of histone H3 (H3K4me), a mark associated with actively transcribed genes, is deposited by the highly conserved SET1 family methyltransferases acting in COMPASS related complexes. SET-2, the SET1 homologue in Caenorhabditis elegans, is responsible for the deposition of H3K4me in the germ line, and its inactivation causes progressive loss of fertility. The purpose of my PhD work was to study how SET-2 and the methylation of H3K4 contribute to the maintenance of the germ line. I have shown that the absence of SET-2 causes increased sensitivity to DNA damage. However, the DNA damage-induced signaling and repair pathways are functional in the set-2 mutant. By DNA sequencing, I have also shown that the progressive sterility observed in the absence of set-2 is not due to a reduced repair capacity. Together, my results suggest that H3K4 methylation may act downstream of DNA damage signaling, potentially by influencing the organization of chromatin at the sites of double-strand breaks. I have also described a new function for H3K4 methylation in the organization of chromatin by showing that set-2 genetically interacts with the Condensitin II complex and Topoisomerase II, key factors in mitotic chromosome organization. Moreover, FLIM-FRET microscopy experiments have validated a role for H3K4 methylation in germline chromatin organization. Finally, using transcriptomic analyses, I have described a function for CFP-1, a component of the COMPASS complex, in the regulation of the germline transcriptional program independent of SET-2. Altogether, my results show how chromatin regulation affects the maintenance of a functional germline through multiple mechanisms.

Dans une première partie nous avons utilisé des techniques de<br />micromanipulations de molécules d'ADN uniques avec des pinces magnétiques<br />pour étudier la cinétique et thermodynamique de formation de boucles<br />sur l'ADN par le répresseur GalR. Nous avons également étudié les propriétés<br />de la translocase à ADN FtsK impliquée dans la ségrégation des chromosomes<br />chez E. coli. Dans une seconde partie nous avons mis en place différentes<br />expériences utilisant l'excitation biphotonique. Tout d'abord nous<br />avons construit un dispositif pour mesurer les sections efficaces d'absorption<br />à deux photons de molécules synthétisées au laboratoire.Nous avons ensuite<br />mis en place la technique de corrélation de fluctuations de fluorescence pour<br />mesurer des coefficients de diffusion et des constantes cinétiques.

Les topoisomérases I (topA) et III (topB) sont les deux topoisomérases (topos) de type IA d’Escherichia coli. La fonction principale de la topo I est la relaxation de l’excès de surenroulement négatif, tandis que peu d’information est disponible sur le rôle de la topo III. Les cellules pour lesquelles les deux topoisomérases de type IA sont manquantes souffrent d’une croissance difficile ainsi que de défauts de ségrégation sévères. Nous démontrons que ces problèmes sont majoritairement attribuables à des mutations dans la gyrase qui empêchent l’accumulation d’excès de surenroulement négatif chez les mutants sans topA. L’augmentation de l’activité de la gyrase réalisée par le remplacement de l’allèle gyrB(Ts) par le gène de type sauvage ou par l’exposition des souches gyrB(Ts) à une température permissive, permet la correction significative de la croissance et de la ségrégation des cellules topos de type IA. Nous démontrons également que les mutants topB sont hypersensibles à l’inhibition de la gyrase par la novobiocine. La réplication non-régulée en l’absence de topA et de rnhA (RNase HI) augmente la nécessité de l’activité de la topoisomérase III. De plus, en l’absence de topA et de rnhA, la surproduction de la topoisomérase III permet de réduire la dégradation importante d’ADN qui est observée en l’absence de recA (RecA). Nous proposons un rôle pour la topoisomérase III dans la ségrégation des chromosomes lorsque l’activité de la gyrase n’est pas optimale, par la réduction des collisions fourches de réplication s’observant particulièrement en l’absence de la topo I et de la RNase HI. / E. coli possesses two type IA topoisomerases (topos), namely topo I (topA) and topo III (topB). The major function of topo I is the relaxation of excess negative supercoiling. Much less is known about the function of topo III. Cells lacking both type IA topos suffer from severe chromosome segregation and growth defects. We show that these defects are mostly related to the presence of gyrase mutations that prevent excess negative supercoiling in topA null mutants. Indeed, increasing gyrase activity by spontaneous mutations, by substituting a gyrB(Ts) allele for a wild-type one or by exposing cells carrying the gyrB(Ts) allele to permissive temperatures, significantly corrected the growth and segregation defects of cells lacking type IA topo activity. We also found that topB mutants are hypersensitive to novobiocin due to gyrase inhibition. Our data also suggest that unregulated replication occurring in the absence of topA and rnhA (RNase HI) exacerbates the need for topo III activity. Moreover, when topA and rnhA were absent, we found that topo III overproduction reduced the extensive DNA degradation that took place in the absence of recA (RecA). All together, our results lead us to propose a role for topo III in chromosome segregation when gyrase activity is suboptimal, thus reducing replication forks collapse, especially when replication is unregulated due to the absence of topo I and RNase HI.