Orientador: José Antônio Dell'aqua Junior / Resumo: A refrigeração de sêmen é importante ferramenta para disseminação de material genético de garanhões. Essa técnica é possível pela correta diluição do sêmen em meios específicos e pelo uso de caixas próprias para refrigeração passiva a 5 ou 15ºC. A maior parte dos diluentes para refrigeração de sêmen equino utilizados no mundo são a base de leite. Entretanto, um dos entraves da utilização deste produto biológico é o grande número de substâncias contidas, levando a não padronização entre partidas. Visando solucionar esta problemática, o desenvolvimento de meios diluentes quimicamente definidos que proporcionem proteção aos espermatozoides durante o arrefecimento, mantendo a fertilidade após a refrigeração deve ser considerado. O uso de frações do leite pode otimizar seu potencial benéfico, tendo em vista que é possível aumentar a concentração dos componentes que favorecem a proteção espermática. A caseína é a fração do leite descrita como a mais eficaz para manutenção da viabilidade espermática e com capacidade de proteger a membrana plasmática. Considerando essas informações, este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos de meios diluentes para sêmen equino a base de caseina (CS), caseina com pentoxifilina (CSP), caseina com colesterol (CSC) e seus equivalentes a base de leite desnatado (LD), leite desnatado com pentoxifilina (LDP) e leite desnatada com colesterol (LDC) sobre os parâmetros espermáticos in vitro e fertilidade do sêmen submetido a refrigeração passiva a 5ºC p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O plasma seminal é uma fração do ejaculado masculino, produzido por contribuição de várias glândulas acessórias masculinas. Deveria ser reconhecido, como ocorre em outras espécies, como agente necessário ao “condicionamento” do endométrio, favorecendo o processo de implantação do embrião. A composição e conseqüente atividade imunossupressora do plasma seminal parece estar relacionados com o favorecimento da viabilidade da gravidez. Nessa tese, em estudo em que foram comparadas amostras de plasma seminal de pacientes considerados férteis frente a amostras de homens considerados inférteis (com oligozoospermia ou astenozoospermia) não foi encontrada diferença estatística entre níveis de diversas citocinas envolvidas no processo implantação. Amostras de plasma seminal dos dois grupos estudados demonstraram ter o mesmo potencial em diminuir a secreção de fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e estimular a secreção de interleucina (IL)-6 e IL-8 por células mononucleares periféricas (PBMC), comprovando a atividade imunomoduladora do plasma seminal. A habilidade do sistema imune materno em manter tolerância frente ao feto pode ser reflexo do ambiente criado nos tecidos envolvidos e não somente de citocinas liberadas exclusivamente por células do sistema imune. Em outro estudo aqui apresentado, demonstrou-se que o perfil de expressão gênica de células endometriais epiteliais cultivadas in vitro pode ser modulado pela ação de plasma seminal em cultura. Análises de ontologia gênica apontam a regulação negativa de genes envolvidos com a resposta imune e estimulação de agentes envolvidos com a quimiotaxia, podendo estar relacionados com a expansão de linfócitos T reguladores observados durante gestações bem sucedidas. Regulação positiva de 133 genes e resolução negativa de 12 genes endometriais epiteliais foram descritas pela primeira vez nesse trabalho de tese e podem contribuir para a compreensão do processo envolvido na simbiose materno-fetal. Em ensaio clínico apresentado nessa tese envolvendo pacientes submetidas à Fertilização in vitro (FIV) ou Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) voluntárias a participar do estudo piloto duplo-cego, observou-se que pacientes que recebiam plasma seminal intracervical e intravaginal no dia da coleta dos oócitos exibiam maior taxa de gravidez do que a do grupo controle (salina). Ainda permanece pouco esclarecido o exato mecanismo pelo qual o plasma seminal é capaz de levar a aumento relativo de 45% na taxa de gravidez em mulheres que receberam plasma seminal, por vias intracervical e intravaginal, no dia da coleta dos oócitos. / Seminal plasma (SP) is a fraction of the masculine ejaculate, produced by contribution of some masculine accessory glands. Seminal plasma must be recognized, as it occurs in other species, as a necessary agent for “conditioning” of the endometrium, favoring the embryo implantation process. The SP imunossupressor activity seems to be responsible for the viability of the pregnancy. In this thesis, we compared SP from fertile patients with samples from infertile (oligozoospermia or astenozoospermia) patients. There were no significant differences between levels of several cytokines in the different groups. SP samples of both groups had similar effects in inhibiting TNF-alpha secretion and stimulating the secretion of IL-6 and IL-8 from peripheral mononuclear cells (PBMC), indicating that SP displays imunomoduladory activity. The ability of the maternal immune system in keeping tolerance to the embryo, can be related to the environment created in surrounding tissues and not only to cytokines produced by immune cells. We also show the profile genomic change of epithelial endometrial cells cultivated in vitro, under SP stimulation. Gene ontology analysis pointed genes related to negative regulation of genes enrolled in the immune response. SP stimulatory effect, on gene expression in endometrial epithelial cells, notably of chemokines, could be related with the expansion of T reg cells observed during successful gestations. Up-regulation of 133 genes and down-regulation of 12 epithelial endometrial genes might contribute to a better understanding of the process involved in the maternal-fetal symbiosis. In a clinical trial involving patients submitted to the FIV/ICSI and volunteers to participate of a double-blind pilot study. We observed that patients receiving SP by intracervical and intravaginal routes at the time of oocyte retrieval, showed greater pregnancy rates when compared to the control group (saline). The molecular mechanisms underlying the conditioning effect of SP, which could explain the 45% relative increase in pregnancy rate in patients receiving local seminal plasma treatment, remain to be established.

CAVALCANTE, Marcelo Borges. Criopreservação de sêmen humano : comparação entre métodos de congelação e tipos de envase. 2004. 101 f. Dissertação (Mestrado em Tocoginecologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2004. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-12-24T12:10:10Z No. of bitstreams: 1 2004_dis_mbcavalcante.pdf: 637772 bytes, checksum: ace79c400c029e261085272b9318a825 (MD5) / Approved for entry into archive by denise santos(denise.santos@ufc.br) on 2013-12-24T12:11:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2004_dis_mbcavalcante.pdf: 637772 bytes, checksum: ace79c400c029e261085272b9318a825 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-12-24T12:11:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2004_dis_mbcavalcante.pdf: 637772 bytes, checksum: ace79c400c029e261085272b9318a825 (MD5) Previous issue date: 2004 / This research has as objective determines the best freezing method and storage of human semen, when compared the fast method with the slow method and the storage in 0,25ml straws with cryotubes of 2ml, using as variables the morphology and motility of the spermatozoa before and after the cryopreservation. It is an experimental study, laboratorial technique validation. It was developed in the Assisted Reproduction Center of Ceará. Eighteen semen samples from eighteen men were analyzed. The samples were submitted to the analysis of the morphology and motility previous the cryopreservation. It was still determined a spermatozoa motility curve in the first three hours. TEST-YOLK was used as cryoprotective media. After having added the TEST-YOLK media, the semen was divided in same parts and storage in cryotubes and straws. Half of the cryotubes and of the straws was cryopreserved by the fast method (RT and RP, respectively) and the other half by the slow method (LT and LP, respectively). The samples were thawed and analyzed the morphologies, as well as the motilities soon after the thawed and every hour for three hours. Statistical analysis was done by the SPSS program - Windows version 11.0.0. Motility of spermatozoa decrease after the cryopreservation, initial motility was 58,1% and motilities in the different treatments were 30,3% (LT), 21,1% (LP), 27% (RT) and 19,2% (RP). There was a significant decrease of the normal morphology after the cryopreservation, in relation to the initial morphology, but difference was not observed among the methods (RP=12,8%, RT=12,6%, LP=12,6% e LT=12,4%). The motility of LT method was closer than that obtained in the fresh semen. The method LT showed the best recovery of motile cells after freezing and thawing. There was not difference among the methods when appraised the morphology. Key-Word: Cryopreservation; Semen preservation; Spermatozoa; Reproduction. / O presente trabalho tem como objetivo determinar o melhor método de congelação e envase de sêmen humano, quando comparado o método rápido com o lento e o envase em palhetas de 0,25ml com criotubos de 2ml, utilizando como variáveis a morfologia e motilidade dos espermatozóides antes e após a criopreservação. Trata-se de um estudo experimental, de validação de técnica laboratorial. Foi desenvolvido no Centro de Reprodução Assistida do Ceará. Foram analisadas dezoito amostras de sêmen de dezoito voluntários. As amostras foram submetidas à análise da morfologia e motilidade espermática prévia à criopreservação. Foi determinada ainda uma curva de motilidade espermática nas primeiras três horas. O meio TEST-YOLK foi utilizado como crioprotetor. Depois de adicionado o crioprotetor, o sêmen foi dividido em partes iguais e envasado em criotubos e palhetas. Metade dos criotubos e das palhetas foi submetida a criopreservação pelo método rápido (RT e RP, respectivamente) e a outra metade pelo método lento (LT e LP, respectivamente). Em seguida, as amostras foram descongeladas e determinadas as morfologias, bem como as motilidades logo após a descongelação e a cada hora durante três horas. Análise estatística foi realizada pelo programa de SPSS for Windows versão 11.0.0. Houve uma queda, estatisticamente significante, da motilidade após a criopreservação, motilidade inicial de 58,1% e motilidades nos diferentes tratamentos de 30,3% (LT), 21,1% (LP), 27% (RT) e 19,2% (RP). Também houve uma diminuição significante da morfologia normal após a criopreservação, em relação à morfologia inicial (14,2%), mas não foi observada diferença entre os métodos (12,8%, 12,6%, 12,6% e 12,4%; RP, RT, LP e LT, respectivamente). O método LT foi o que obteve uma curva de motilidade espermática mais próxima da observada no sêmen in natura. Conclui-se que o método LT foi o que menos afetou a motilidade espermática e que, apesar de ter sido observada uma piora significativa da morfologia espermática após a criopreservação, não houve diferença entre os métodos. Palavras-chaves: Criopreservação; Preservação do Sêmen; Espermatozóide; Reprodução

LINARD, M. A. B. Perfil mineral e proteico do plasma seminal de coelhos. 2013. 76 f. Dissertação (Mestrado em Zootecnia) - Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2013. / Submitted by Daniel Eduardo Alencar da Silva (dealencar.silva@gmail.com) on 2015-01-14T20:44:40Z No. of bitstreams: 1 2013_dis_mablinard.pdf: 1573487 bytes, checksum: 46d876fa9e23bbe4e9d4ec820b07d007 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-11-25T13:54:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_dis_mablinard.pdf: 1573487 bytes, checksum: 46d876fa9e23bbe4e9d4ec820b07d007 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-25T13:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_dis_mablinard.pdf: 1573487 bytes, checksum: 46d876fa9e23bbe4e9d4ec820b07d007 (MD5) Previous issue date: 2013 / Seminal plasma is the fluid portion of semen and its presence positively affects the survival and parameters of sperm motility in rabbits. This study aimed (i) to verify the seminal concentrations of sodium, chloride and citric acid as a function of collection month, the color and aspect of the ejaculate, and to find the frequency of ejaculations with the presence of gel fraction, color and aspect of the semen of rabbits on tropical climate, (ii) to meet monthly protein spots and their possible correlation with seminal and biochemical parameters in rabbits. 20 rabbits of New Zealand White, raised in the flat-deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a week, and then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm concentration. After the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal plasma, which was stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly seminal plasma pool of each animal was made to evaluate the concentrations of sodium, chloride, citric acid and proteins. Significant monthly variations were found (p <0.05) in the concentrations of sodium, chloride and citric acid in the seminal plasma of rabbits. All mineral constituents analyzed suffered significant influence (p <0.05) by the color of the ejaculate, and the highest concentrations were found in the white-yellowish ejaculates. Correlation studies found a high and significant association between concentrations of sodium and vigor (r = 0.80, p <0.001), and between sperm concentration and citric acid (r = -0.64, p <0.02). Most of the ejaculates of rabbits showed no gel fraction. The results also showed that the white and milky ejaculate are the most common for the species. It was also observed an average concentration of 2.73 ± 0.31 mg / dl total protein in samples of seminal plasma. From the quantification of total protein were prepared two-dimensional electrophoresis gels stained SDS-PAGE with silver nitrate, with a pH gradient between 3 – 10, mesh 15% and a concentration of 100 mg of protein per sample for each month. Gels were analyzed with the Image Master 2D Platinum 6.0. ® software. The gel containing the most spots (555 spots) was the gel of the month of May, and the gel with fewer spots (71 spots) was observed in January, but no effect of month on the amount of spots was detected. The majority of spots present in seminal plasma of rabbits have pI below 8, and these spots, about 40% have pI acid, the distribution of the spots as a function of pI was homogeneous throughout the year. The distribution of spots depending on the molecular weight widely varied between the months. Except of a few months, most of the protein had a molecular weight above 100 kDa. The number of protein spot positively and moderately correlated with total protein (r = 0.57, p <0.05) and citric acid (r = 0.59, p <0.05). In silico analysis of 1411 protein spots found compatible proteins with the Swiss-Prote database and TrEMBL (UniProtKB). It is concluded that the composition of the seminal plasma of rabbits showed a broad monthly variation and ejaculated with high concentrations of citric acid are undesirable. In addition, the protein profile of rabbits has great affinity of the proteins to acidic and high molecular weight, no influence of the months of the year on the amount of protein spots identified were found and bioinformatics analysis tool does not provide consistent results with those obtained gel electrophoresis, but it allows an estimate of the probable proteins that can be found. / O plasma seminal representa a porção fluida do sêmen e sua presença afeta positivamente a sobrevivência e os parâmetros de motilidade espermática em coelhos. Este trabalho teve como objetivos (i) verificar as concentrações seminais de sódio, cloretos e ácido cítrico em função do mês de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado, e encontrar a frequência de ejaculados com presença de fração gel, cor e aspecto do sêmen de coelhos criados em clima tropical; (ii) conhecer os spots proteicos mensais e suas possíveis correlações com parâmetros seminais e bioquímicos de coelhos. Foram utilizados 20 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, criados em sistema flat-deck, alimentados com ração comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e concentração espermática. Após as avaliações os ejaculados foram centrifugados para obtenção do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Um pool mensal de PS de cada animal foi feito para avaliação das concentrações de sódio, cloretos, ácido cítrico e proteínas totais. Foram constatadas variações mensais significativas (p<0,05) nas concentrações de sódio, cloretos e ácido cítrico no plasma seminal de coelhos. Todos os constituintes minerais analisados sofreram influencia significativa (p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentrações mais elevadas foram constatadas nos ejaculados de cor branco-amarelada. O estudo de correlações encontrou associação alta e significativa entre as concentrações de sódio e vigor (r=0,80; p<0,001), bem como entre a concentração espermática e o ácido cítrico (r=-0,64; p<0,02). A maior parte dos ejaculados de coelhos não apresentaram a fração gel. Os resultados também mostraram que o ejaculado de cor branca e de aspecto leitoso são os mais comuns nessa espécie. Também foi verificado uma concentração média de 2,73 ±0,31 μg/dl de proteínas totais nas amostras de plasma seminal. A partir da quantificação das proteínas totais foram confeccionados dois géis de eletroforese bidimensional SDS-PAGE corados com nitrato de prata, com gradiente de pH entre 3 – 10, malha de 15% e uma concentração de 100 μg de proteínas por amostra, para cada mês. Os géis foram analisados no software Image Master 2D Platinum 6.0. ®. O gel que continha o maior número de spots (555 spots) foi o do mês de maio, e o gel com menor número spots (71 spots) foi verificado em janeiro, mas não houve efeito do mês sobre a quantidade de spots detectados. A maioria dos spots presentes no plasma seminal de coelhos tem pI abaixo de 8 e, destes spots, cerca de 40% tem pI ácido, a distribuição dos spots em função do pI foi homogênea ao longo do ano. A distribuição dos spots em função do peso molecular variou amplamente entre os meses. Com exceção de alguns os meses, a maioria das proteínas apresentaram peso molecular acima de 100 kDa. O número de spot proteicos correlacionaram-se moderada e positivamente com as proteínas totais (r=0,57; p<0,05) e com o ácido cítrico (r=0,59; p<0,05). A análise in silico dos spots encontrou 1.411 proteínas compatíveis com os bancos de dados Swiss-Prote e TrEMBL (UniProtKB). Concluiu-se que a composição do plasma seminal de coelhos apresentou ampla variação mensal e que ejaculados com alta concentração de ácido cítrico são indesejáveis. Além disso, o perfil proteico de coelhos apresenta grande parte das proteínas com afinidade a meio ácido e com alto peso molecular, não houve influencia de meses do ano sobre a quantidade de spots proteicos detectados, e devido à ausência de dados sobre coelhos, a ferramenta de análise bioinformática não ofereceu resultados coerentes, mas permite uma estimativa das prováveis proteínas que podem ser encontradas.

O primeiro experimento, teve o objetivo de comparar os efeitos da indução hormonal na qualidade espermática de Brycon insignis. Foram utilizados 12 reprodutores que tiveram uma alíquota do sêmen coletado e avaliado antes da indução hormonal (Ctrl) e em seguida foram divididos em tratamentos de acordo com o hormônio e dosagem recebida, Extrato de Hipófise de Carpa – EHC (T1 – 2,5 mg/kg-1 de peso vivo), análogos de GnRH sendo aplicado em duas dosagens diferentes (T2 – 0,7 mg/kg-1 de peso vivo e T3 – 1,4 mg/kg-1 de peso vivo). Dentre as análises utilizadas para comparar o efeito da indução e dos hormônios utilizados foram; taxa de motilidade – Ctrl (95%), T1 (100%), T2 (100%) e T3 (98%), onde foi observado um ligeiro aumento e concentração espermática – Ctrl (11,52 x109), T1 (4,37 x109), T2 (4,34 x109) e T3 (4,01 x109), que pode ser observado uma redução na concentração após a indução hormonal. No entanto a utilização de indutores hormonais não altera negativamente as características seminais de piabanha. No segundo experimento, o objetivo foi de avaliar a qualidade do sêmen diluído com três diluidores e resfriado a temperatura de 6 °C durante um período de 120 horas. Foram utilizados 32 machos, o liquido seminal era dividido em quatro tratamentos; sem diluição, diluído com BTS®, HBSS e ACP®, na proporção de 1:4 (sêmen:diluidor), as avaliações eram realizadas para; motilidade espermática, tempo de motilidade, morfologia espermática e vigor, no momento da diluição (tempo 0) e nos tempos seguintes de 24, 48, 72, 96 e 120 horas após a diluição. A taxa de fertilização e eclosão foi coletada apenas no momento da diluição do sêmen. Os resultados apontam que a diluição é eficaz para conservação do sêmen de C. macropomum, porém ainda por um curto período de tempo. A recomendação é que esse procedimento seja realiado com o diluidor BTS® por até 72 horas. No terceiro experimento, o objetivo foi classificar por meio de análise de clusters os reprodutores C. macropomum após a criopreservação seminal como sendo de baixo ou alto potencial de congelabilidade e correlacionar com as características do sêmen fresco e fenotípicas. Foram utilizados 25 machos, o sêmen de cada animal foi submetido ao mesmo protoloco de criopreservação que era composto de BTS®+DMF (90:10), e o sêmen diluído na proposção de 1:4. Os resultados demonstram que mesmo sobre as mesmas condições o liquido seminal apresenta diferentes variações, e através da análise de clusters foi possível diferenciar a formação de três grupos de reprodutores (G1, G2, G3). O G1 foi classificado como sendo de alta qualidade espermática após a criopreservação, porém as correlações demonstram que os animais com menor tamanho de cabeça apresentam FR melhores após a criopreservação, e possivelmente a MT pode ser utilizada como pré indicador de congelabilidade para reprodutores C. macropomum. / The first experiment aimed to compare the effects of hormonal induction on the spermatic quality of Brycon insignis. 12 broodstocks that had an aliquot of the semen collected and evaluated before to hormonal induction (Ctrl) were used and then divided into treatments according to the hormone and dosage received, Carpal Hypophysis Extract - EHC (T1 - 2.5 mg/Kg-1 live weight), GnRH analogs being administered in two different dosages (T2 - 0.7 mg/kg-1 live weight and T3 - 1.4 mg/kg-1 live weight). Among the analyzes used to compare the effect of induction and hormones used were: motility rate, that showed a slight increase, Ctrl (95%), T1 (100%), T2 (100%) and T3 (98%) and sperm concentraction wich may be observed a reduction, Ctrl (11.52 x109), T1 (4.37 x109), T2 (4.34 x109) and T3 (4.01 x109). However, the use of hormone inducers does not negatively affect the seminal characteristics of piabanha. In the second experiment, the objective was to evaluate the quality of semen of the Colossoma macropomum diluted with three extenders and cooled to 6 °C for a period of 120 hours. 32 males were used, the seminal fluid was divided into four treatments; Without dilution, diluted with BTSTM, HBSS and ACPTM, at the ratio of 1:4 (semen:extender), evaluations were performed for; Sperm motility, sperm motility and vigor, at the time of dilution (time 0) and at the following times of 24, 48, 72, 96 and 120 hours after dilution. The rate of fertilization and hatching was collected only at the time of the semen dilution. The results indicate that the dilution is effective for the conservation of semen of C. macropomum, but still for a short period of time. The recommendation is that this procedure be performed with the BTSTM thinner for up to 72 hours. In the third experiment, the objective was to classify by means of clusters analysis the C. macropomum broodstock after seminal cryopreservation as being of low or high freeze potential and to correlate with the characteristics phenotypic and fresh semen. 25 males were used, the semen from each animal was submitted to the same cryopreservation protocol that was composed of BTSTM+DMF (90:10), and the semen diluted in the 1:4 ratio. The results show that even on the same conditions, the seminal fluid presents different variations, and through the analysis of clusters it was possible to differentiate the formation of three broodstock groups (G1, G2, G3). G1 was classified as being of high spermatic quality after cryopreservation, but correlations show that animals with smaller head sizes have better fertilization rate after cryopreservation, and possibly motility time can be used as a pre-freeze indicator for C. macropomum.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003-12-18Bitstream added on 2014-06-13T21:07:28Z : No. of bitstreams: 1 cavalcante_tv_dr_jabo.pdf: 513638 bytes, checksum: 073a21ec173f620f19ec2cbbe21ac512 (MD5) / Avaliou-se a influência das estações reprodutiva e não reprodutiva in vivo sobre a fertilidade e in vitro pedizer a qualidade do sêmen de caprinos das raças Boer e Alpina em duas etapas. A primeira foi conduzida na FMVZ - Botucatu e FCAV Jaboticabal. Selecionou-se nove caprinos das raças Boer e Alpina mantidos em criação intensiva e sob luminosidade natural. Estudou-se as características seminais, congelabilidade do sêmen, e testes para predição da fertilidade como: integridade do DNA, análises computadorizadas da motilidade e morfometria espermática, avaliação da peça intermediária e a integridade de membrana de 71 ejaculados no outono e 64 na primavera. Amostras de sangue foram colhidas nas duas estações, para mensuração da testosterona plasmática. Na segunda etapa, 164 cabras SRD foram inseminadas com o sêmen colhido na primeira etapa. Aplicou-se ANOVA seguida do teste de comparação múltipla de Tukey-Kramer para cada uma das variáveis, teste T de Student e qui-quadrado. Nas características seminais, observaram-se diferenças estatísticas (P<0,01) para o volume e concentração espermática. A morfologia espermática apresentou-se dentro da normalidade. As taxas de fertilidade para as fêmeas inseminadas foram 26,74, 19,77 e 34,62 e 29,49, com sêmen colhido no outono e primavera, para as raças Boer e Alpina, respectivamente. Não houve diferença de fertilidade dos machos Os testes de fertilidade mostraram que a integridade da cromatina apresentou menos de 10% de espermatozóides danificados. A motilidade espermática, os índices de atividade citoquímica e a integridade de membrana plasmática diferiram estatisticamente (P<0,01) nas amostras pós-colheita e pós-descongelação, entretanto, sem diferença entre as estações. A morfometria da cabeça e a quantificação de testosterona não apresentaram diferenças estatísticas (P<0,01) entre as amostras... / The season breeding and non-breeding influence on in vivo and in vitro fertility of Boer and Alpine Bucks was evaluated two steps. The first was conducted at FMVZ - Botucatu and FCAV - Jaboticabal. Nine bucks of Boer and Alpine breed were selected and kept under intensive production regimen and natural luminosity. The seminal characteristics, freezing and fertility prediction tests was evaluated using: DNA integrity, sperm motility computer analysis, head morphometric, middle piece evaluation and membrane integrity of 71 ejaculates on autumn and 64 on spring. Blood samples were collected in both for seasons to measurement of plasmatic testosterone (PT). In second step, 164 female goats, without defined breed, were insemination with the semen collected in the first step. ANOVA was applied followed by the Tukey-Kramer multiple comparison tests for each of the characteristics. T-Student and Chi-square tests were performed and for PT and fertility rate (FR). For seminal characteristics evaluation, statistical differences (P<0.01) were observed for volume and concentration. The spermatic morphological analysis showed normal patterns. The FR for pregnancy were 26.74, 19.77, 34.62 and 29.49, for semen that was collected in Autumn and Spring, to Boer and Alpine breeds respectively. There was no difference in males' fertility. Prediction fertility tests showed less than 10% of damaged spermatozoon on chromatin integrity evaluation. Spermatic motility parameters, citochemistry activity rates and integrity membrane plasmatic were statistically different (P<0.01) in samples after-collection and after-thawing, however, between seasons differences were not seen. The head morphometry and the testosterone quantification did not show statistical differences (P>0.01) between the samples. It was concluded that Boer and Alpine breeds did not differ in fertility, when used for artificial insemination, in Autumn and Spring.

O plasma seminal é uma fração do ejaculado masculino, produzido por contribuição de várias glândulas acessórias masculinas. Deveria ser reconhecido, como ocorre em outras espécies, como agente necessário ao “condicionamento” do endométrio, favorecendo o processo de implantação do embrião. A composição e conseqüente atividade imunossupressora do plasma seminal parece estar relacionados com o favorecimento da viabilidade da gravidez. Nessa tese, em estudo em que foram comparadas amostras de plasma seminal de pacientes considerados férteis frente a amostras de homens considerados inférteis (com oligozoospermia ou astenozoospermia) não foi encontrada diferença estatística entre níveis de diversas citocinas envolvidas no processo implantação. Amostras de plasma seminal dos dois grupos estudados demonstraram ter o mesmo potencial em diminuir a secreção de fator de necrose tumoral (TNF)-alfa e estimular a secreção de interleucina (IL)-6 e IL-8 por células mononucleares periféricas (PBMC), comprovando a atividade imunomoduladora do plasma seminal. A habilidade do sistema imune materno em manter tolerância frente ao feto pode ser reflexo do ambiente criado nos tecidos envolvidos e não somente de citocinas liberadas exclusivamente por células do sistema imune. Em outro estudo aqui apresentado, demonstrou-se que o perfil de expressão gênica de células endometriais epiteliais cultivadas in vitro pode ser modulado pela ação de plasma seminal em cultura. Análises de ontologia gênica apontam a regulação negativa de genes envolvidos com a resposta imune e estimulação de agentes envolvidos com a quimiotaxia, podendo estar relacionados com a expansão de linfócitos T reguladores observados durante gestações bem sucedidas. Regulação positiva de 133 genes e resolução negativa de 12 genes endometriais epiteliais foram descritas pela primeira vez nesse trabalho de tese e podem contribuir para a compreensão do processo envolvido na simbiose materno-fetal. Em ensaio clínico apresentado nessa tese envolvendo pacientes submetidas à Fertilização in vitro (FIV) ou Injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI) voluntárias a participar do estudo piloto duplo-cego, observou-se que pacientes que recebiam plasma seminal intracervical e intravaginal no dia da coleta dos oócitos exibiam maior taxa de gravidez do que a do grupo controle (salina). Ainda permanece pouco esclarecido o exato mecanismo pelo qual o plasma seminal é capaz de levar a aumento relativo de 45% na taxa de gravidez em mulheres que receberam plasma seminal, por vias intracervical e intravaginal, no dia da coleta dos oócitos. / Seminal plasma (SP) is a fraction of the masculine ejaculate, produced by contribution of some masculine accessory glands. Seminal plasma must be recognized, as it occurs in other species, as a necessary agent for “conditioning” of the endometrium, favoring the embryo implantation process. The SP imunossupressor activity seems to be responsible for the viability of the pregnancy. In this thesis, we compared SP from fertile patients with samples from infertile (oligozoospermia or astenozoospermia) patients. There were no significant differences between levels of several cytokines in the different groups. SP samples of both groups had similar effects in inhibiting TNF-alpha secretion and stimulating the secretion of IL-6 and IL-8 from peripheral mononuclear cells (PBMC), indicating that SP displays imunomoduladory activity. The ability of the maternal immune system in keeping tolerance to the embryo, can be related to the environment created in surrounding tissues and not only to cytokines produced by immune cells. We also show the profile genomic change of epithelial endometrial cells cultivated in vitro, under SP stimulation. Gene ontology analysis pointed genes related to negative regulation of genes enrolled in the immune response. SP stimulatory effect, on gene expression in endometrial epithelial cells, notably of chemokines, could be related with the expansion of T reg cells observed during successful gestations. Up-regulation of 133 genes and down-regulation of 12 epithelial endometrial genes might contribute to a better understanding of the process involved in the maternal-fetal symbiosis. In a clinical trial involving patients submitted to the FIV/ICSI and volunteers to participate of a double-blind pilot study. We observed that patients receiving SP by intracervical and intravaginal routes at the time of oocyte retrieval, showed greater pregnancy rates when compared to the control group (saline). The molecular mechanisms underlying the conditioning effect of SP, which could explain the 45% relative increase in pregnancy rate in patients receiving local seminal plasma treatment, remain to be established.

A criopreservação de sêmen humano é de grande importância para a medicina reprodutiva, porém esse processo pode causar danos ao espermatozóide devido, entre outros aspectos, à produção de espécies reativas de oxigênio, as quais podem lesar as biomoléculas. Tanto o resveratrol quanto o ácido ascórbico são compostos com reconhecida capacidade antioxidante, porém ainda pouco estudados em relação à prevenção de criodanos em espermatozóides humanos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi analisar marcadores de danos oxidativos e parâmetros seminais antes e após a criopreservação de sêmen humano em presença e ausência de resveratrol e ácido ascórbico. Foram analisadas amostras de sêmen de 20 homens inférteis e 10 doadores com fertilidade comprovada. Indivíduos com azoospermia(ausência de espermatozoides), leucocitospermia (aumento da contagem de leucócitos seminais) ou sob uso de suplementação antioxidante foram excluídos do estudo. Os marcadores de estresse oxidativo incluíram a avaliação dos produtos reativos ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a atividade das enzimas superóxido dismutase (Sod) e catalase (Cat). Os danos ao DNA foram quantificados pelo ensaio Cometa. Após a análise seminal padrão as amostras foram divididas em alíquotas, quais sejam: sem a adição de antioxidantes (controle), com 0,1 mM, 1,0 mM, e 10,0 mM de resveratrol e 10,0 mM de ácido ascórbico. Após uma hora de incubação as alíquotas foram criopreservadas em nitrogênio líquido a - 196°C, empregando-se o TEST-Yolk buffer como agente crioprotetor. Paralelamente, foram avaliados, ainda, os parâmetros séricos para TBARS, Sod, Cat e níveis de ácido úrico em homens inférteis e férteis. Os resultados mostraram que o uso de ácido ascórbico e resveratrol não causou nenhuma alteração na concentração e morfologia dos espermatozóides, porém nenhum dos antioxidantes foi capaz de prevenir a diminuição da motilidade induzida pelo processo de criopreservação. A criopreservação induziu uma diminuição na atividade da Sod em indivíduos inférteis e um aumento nos níveis de TBARS nas amostras de homens férteis e inférteis. Observou-se uma correlação negativa entre motilidade espermática e os valores de TBARS em homens inférteis, tanto em amostras pré-congelamento (-0,868, p<0,05) quanto em amostras pós-congelamento (-0,897, p<0,05). A adição de resveratrol às amostras, previamente ao processo de criopreservação, preveniu a diminuição da atividade da Sod em indivíduos inférteis e diminuiu os níveis de TBARS tanto em homens férteis como em inférteis. O ácido ascórbico foi capaz de minimizar os danos oxidativos a lipídios causados pela criopreservação, porém somente em sêmen de homens inférteis. Observou-se ainda que a criopreservação induziu um significativo aumento de danos ao DNA (principalmente dos tipos 2, 3 e 4) em homens férteis e inférteis. A adição de ácido ascórbico ao espermatozóide reduziu os danos ao DNA em homens inférteis, mas não em homens férteis. Por outro lado, o resveratrol foi capaz de reduzir os danos ao DNA tanto em homens férteis como em inférteis. Salienta-se, ainda, que o uso de 10,0mM de resveratrol foi capaz de evitar todos os danos ao DNA induzidos pela criopreservação em homens inférteis. Observou-se, também, que os indivíduos inférteis apresentaram níveis séricos mais elevados de TBARS, ácido úrico e atividade de Sod. Embora outros estudos sejam necessários, os dados apresentados neste trabalho indicam a possibilidade da utilização do resveratrol e ácido ascórbico em procedimentos de criopreservação de sêmen humano, principalmente naqueles onde a motilidade não seja essencial para ocorrer a fecundação como, por exemplo, a ICSI (injeção intracitoplasmática de espermatozóide). / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-06-17T12:17:41Z No. of bitstreams: 1 Tese Márcia Esteves Silva Garcez.pdf: 2973862 bytes, checksum: e8fd732e0138084fef17eacaadbb9e22 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-06-17T12:17:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Márcia Esteves Silva Garcez.pdf: 2973862 bytes, checksum: e8fd732e0138084fef17eacaadbb9e22 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Cryopreservation of human semen is very important in reproductive medicine, but it may cause damages to the spermatozoa, probably due to the production of reactive oxygen species (ROS), which may cause structural damage to the biomolecules. Resveratrol and ascorbic acid are important antioxidants, however, until now, there are only few studies about its use in cryopreservation process. Therefore, the aim of this study was to analyze the oxidative stress markers and seminal standard parameters before and after the cryopreservation of human semen with and without these antioxidants. Ejaculated semen from 20 infertile men and 10 fertile donors, with proven fertility, were examined. Individuals with azoospermia, leukocytospermia or under antioxidant supplementation were excluded from the study. Oxidative stress markers including the determination of the levels of thiobarbituric acid reactive species (TBARS) and the activity of the antioxidant enzymes superoxide dismutase (Sod) and catalase (Cat). DNA damages were quantified by comet assay. After the evaluation of standard seminal assays, semen samples were divided into 5 aliquots, which were treated as follows: (a) without antioxidants; (b) with 0.1 mM of resveratrol; (c) with 1.0 mM of resveratrol; (d) with 10.0 mM of resveratrol and (e) with 10.0 mM of ascorbic acid. Samples were incubated for 1 hour and, then, they were cryopreserved in liquid nitrogen at -196°C. The TEST-Yolk buffer was used as cryoprotector agent in all the samples. Besides, it was evaluated, also, the seric values of TBARS, Sod, Cat and uric acid both in infertile and fertile men. The results showed that the use of ascorbic acid or resveratrol did not change the concentration and morphology of the spermatozoids. However, none of the antioxidants were able to prevent the decrease in the mobility induced by the cryopreservation process. Cryopreservation causes a decrease in Sod activity in infertile men and an increase of TBARS levels, both in infertile and fertile men. It was observed a negative correlation between spermatozoa motility and TBARS levels in infertile men, both before (-0, 868, p<0,05) and after (-0, 897, p<0,05) the cryopreservation process. Resveratrol was able to avoid the decrease in Sod activity in infertile men and the increase in TBARS levels both in infertile and fertile men samples. Ascorbic acid was able to reduce the oxidative lipid damages induced by cryopreservation only in infertile men. It was also observed that the cryopreservation process induced a significant increase of DNA damages (mainly types 2, 3 and 4) in infertile and fertile men. The addition of ascorbic acid reduces DNA damages only in infertile men. On the other hand, resveratrol was capable to reduce DNA damages both in infertile and fertile men. In fact, the use of 10.0mM of resveratrol was able to avoid all the DNA damages induced by the cryopreservation in infertile men. Infertile men showed high seric levels of TBARS, uric acid and Sod activity than the fertile men. Although other studies are necessary, the data presented in this work suggests the possibility to use resveratrol and ascorbic acid in human cryopreservation procedures, both for fertile and infertile men, at least, for ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection), as it does not need motile sperm for achieving pregnancy.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2003Bitstream added on 2014-06-13T19:17:44Z : No. of bitstreams: 1 souza_ff_dr_botfmvz.pdf: 2099202 bytes, checksum: f4b636446831c1c7dd26bf9e83e952f8 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste estudo foram utilizados 20 cães, sem raça definida, de fertilidade desconhecida, com pesos variando entre 15 e 20 Kg, sorologicamente negativos para leptospirose e brucelose canina. Após um período de condicionamento, foram colhidos seis ejaculados de cada cão, por manipulação digital do pênis, sendo três antes da deferentectomia e três após. O sêmen foi imediatamente analisado após a colheita, considerando os seguintes parâmetros: volume, cor, motilidade progressiva, vigor espermático, porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais, pH, integridade de membrana (teste hiposmótico e coloração com sondas fluorescentes). Foram determinadas as concentrações de proteínas totais, cloretos totais, cálcio, potássio e sódio. A SDS-PAGE foi realizada utilizando-se duas concentrações de poliacrilamida, 13% e 22%, no gel de separação. Os géis foram corados com coomassie azul brilhante R-250, suas imagens digitalizadas e avaliadas num programa analisador de imagens, onde foram estimados os pesos moleculares e a densidade óptica integrada de cada banda, para cada amostra. Uma correlação negativa foi verificada entre o potássio e a motilidade progressiva, vigor espermático, resultados do teste hiposmótico e porcentagem de espermatozóides com integridade de membrana na coloração com sondas fluorescentes. Apenas o cálcio mostrou-se significativamente mais elevado após a deferentectomia. Foi verificado um total de 37 bandas antes da deferentectomia e 35 após. Antes da deferentectomia, encontrou-se uma correlação positiva e significativa entre duas bandas protéicas, B4 (67 kDa) e a B5 (58,6 kDa) e a motilidade progressiva, vigor espermático, porcentagem de espermatozóides morfologicamente normais, resultados do teste hiposmótico e porcentagem de espermatozóides com integridade de membrana na coloração com sondas fluorescentes... . / In this study 20 mixed breed dogs (15 to 20 Kg of body weight) of unknown fertility were used. The dogs were negative in leptospyrosis and brucelosis tests. After a conditioning time, were collected six ejaculated of each dog by digital manipulation of penis, being three before and three after deferentectomy. Immediately, the semen was analyzed considering the following parameters: volume, color, spermatic motility, vigor, morphological forms of the spermatozoa, pH and membrane integrity (hypoosmotic test and fluorescent stain). The concentrations of total proteins, total chlorides, calcium, potassium and sodium were determined. The SDS-PAGE of each seminal plasma sample was carried out using two polyacrylamide concentrations, 13% and 22%, in the separation gel. The gels were stained with coomassie blue brilliant R-250, the images were digitalized and evaluated in a analyzer software, where the molecular weights were estimated, in accordance with a standard applied in each gel. The integrated optic density of each band for each sample was determined. A negative correlation was verified between the potassium and the spermatic motility, vigor, results of the hypoosmotic test and percentage of spermatozoa with integrity of membrane in the fluorescent stain. The calcium concentrations after of deferentectomy were significantly higher than before. A total of 37 bands before deferentectomy and 35 after were observed. Before the deferentectomy, a positive correlation was verified between two bands, B4 (67 kDa) and the B5 (58,6 kDa), and the spermatic motility, vigor, percentage of normal spermatozoa, results of the hypoosmotic test and percentage of spermatozoa with integrity of membrane in the stain fluorescent. Three bands were significantly different before and after the deferentectomy (B3, of 73,5 kDa, B29, of 7,8 kDa and B27, 3,6 kDa). Keywords: Dog; Seminal Plasma; Proteins; Electrophoresis, Electrolites.

Orientador: José Gonçalves Franco Jr. / Coorientador: Mario Cavagna / Banca: João Batista Alcantara Oliveira / Banca: Claudia Guilhermino Petersen / Resumo: Poucos estudos avaliando o efeito da idade paterna nos resultados de RA tem sido descritos na literatura. A idade avançada do homem parece influenciar na função reprodutiva masculina em menor grau quando comparada com a idade da mulher, pelo simples fato da ocorrência de nascimentos de crianças de pais com idade entre 70 e 94 anos. O efeito da idade paterna na qualidade do sêmen tem sido discutido na literatura porém os resultados são contraditórios. Frente a tais contradições, este artigo de revisão tem como objetivo descrever e discutir os dados da literatura no que diz respeito a influência da idade paterna nos parâmetros seminais (volume, concentração, motilidade e morfologia) , nos danos do DNA espermático , nos resultados de rerpodução assistida (fertilização, desenvolvimento embrionário, implantação, gravidez, aborto e nascimentos) e em doenças genéticas / Abstract: Few studies evaluating the effect of paternal age on the results of ART has been described in the literature. Advanced paternal age seems to influence the male reproductive function to a lesser degree than the female's, as evidenced by the fact that babies have been fathered by aged 70 to 94 years. The effect of paternal age on semen quality has been discussed in the literature but the results are not consistent. Front these contradictions this review article aims to describe and discuss the literature data on the influence of paternal age on the semen parameters (volume, concentration, motility and morphology), sperm DNA damage, outcomes of ART (fertilization, embryo development, implantation, pregnancy, abortion and birth) and genetic disease / Mestre