O presente trabalho estuda a variação do diâmetro inicial e diâmetro final de um furo puncionado feito em uma chapa de aço ASTM A-36 com 12,7 mm de espessura. São propostas três geometrias diferentes de punção fabricados em aço AISI D2 e AISI S1 com diâmetro inicial 20 mm e final 22 mm. Os punções foram fabricados para realizarem o processo de puncionamento e brochamento com penetrações de avanço (asf) de 0,2 mm, 0,5 mm e 1 mm. O objetivo principal é reduzir a conicidade dos furos puncionados atualmente através do método convencional. As folgas entre punção e matriz (w) utilizadas foram de 3,1%, 7,8% e 15,7% da espessura da chapa de testes respectivamente. Para avaliação do desempenho de cada ferramenta, todos os furos puncionados foram medidos e tabelados. Entre os resultados encontrados, constatou-se que os punções com brochamento apresentam melhores valores que os convencionais em todos parâmetros analisados. As regiões de cisalhamento (Zc) e região de ruptura abrupta (Zr) também sofreram influência direta em função da geometria utilizada. / The present work studies the variation of the initial diameter and final diameter of a punched hole made in an ASTM A-36 steel sheet with 12.7 mm of thickness. Three different punches geometries are proposed and manufactured from AISI D2 and AISI S1 steel with initial diameter 20 mm and final diameter 22 mm. The punches were manufactured to carry out the punching and broaching process with feed penetrations (asf) of 0.2 mm, 0.5 mm and 1 mm. The main objective is to reduce the conicity of the punched holes currently through the conventional method. The clearance between punch and die (w) used were 3.1%, 7.8% and 15.7% of the thickness of the test plate respectively. To evaluate the performance of each tool, all punched holes were measured and tabulated. Among the results, it was observed that the punches with a broaching showed better values than the conventional ones in all analyzed parameters. The regions of shear (Zc) and region of abrupt rupture (Zr) also had a direct influence in function of the geometry used.

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: José Moacir Marin / Banca: Camillo Del Cistia Andrade / Resumo: A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa - Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / Abstract: The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector - Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis. / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:22Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-26Bitstream added on 2014-06-13T20:16:38Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_mcm_me_jabo.pdf: 755871 bytes, checksum: 00a7ca290b99eaeb7742fdd22cdc3c6c (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A glicoproteína S1 do vírus da broquite infecciosa (VBI) além de ser altamente variável é responsável pela adsorção com os receptores das células hospedeiras e pela indução de anticorpos vírus-neutralizantes e inibidores da hemaglutinação em galinhas. A disponibilidade desse tipo de proteína pode contribuir com o imunodiagnóstico e com a imunoprofilaxia da bronquite infecciosa aviária. O presente estudo foi conduzido com a finalidade de fazer a clonagem e a expressão do gene da glicoproteína S1 derivada da estirpe M41 do VBI no sistema constituído pelo vetor pFLDa – Picchia pastoris. O cDNA completo do gene S1 foi preparado a partir do RNA extraído do líquido alantóide infectado com a estirpe M41 do VBI e o amplicon obtido pela PCR foi clonado no vetor de expressão pFLDa. O plasmídeo foi linearizado e usado na transformação da linhagem GS115 de Picchia pastoris por eletroporação. Foi avaliada a influência da composição do meio de cultura sobre a produção de biomassa e a expressão da proteína recombinante S1 durante a fase de indução. A produção da proteína S1 recombinante foi detectada somente no compartimento intracelular, embora o vetor pFLDa seja capaz de direcionar a síntese de uma proteína heteróloga para a via secretora. A proteína recombinante foi caracterizada imunoquimicamente como uma banda de aproximadamente 90 kDa e com reatividade específica para os anticorpos monoclonais anti-polihistidina. Concluindo, o sistema hospedeiro de células da levedura P. pastoris com o vetor pFLDa usado nesse estudo comprovou ser um método eficaz para a produção no compartimento intracelular da proteína recombinante S1 da estirpe M41 do VBI, com potencial para futura utilização em técnicas de imuno-diagnóstico da bronquite infecciosa aviária. / The glycoprotein (S1) of infectious bronchitis virus (IBV) has been shown to be highly variable and responsible for attachment to the receptor in host cellular membrane, induction of neutralizing and haemagglutination-inhibiting antibodies in chickens. Thus, the availability of such protein can contribute to the immuno-diagnosis and immunoprofilaxis of avian infectious bronchitis. The present study was carried out aiming to clone and to express the gene of S1 glycoprotein from M41 strain fo IBV in the system constituted by pFLDa vector – Picchia pastoris. Full length cDNA of IBV S1 glycoprotein was prepared from RNA extracted from infected allantoic fluid and the amplicon generated by PCR was cloned into yeast expression vector pFLDa to construct the plasmid of pFLDa - S1 - IBV. This plasmid was linearized and then transformed in Picchia pastoris GS115 by electroporation. The recombinant yeast clones were cultivated and selected. The influence of media composition on biomass and in the production of recombinant S1 during induction phase was studied. The production of recombinant S1 protein was detected only in the intra-cellular compartment, though the pFLDa vector would direct the synthesis for the secretor pathway. The recombinant protein was characterized by SDS-PAGE and Western-Blotting as a band of a molecular weight of approximately 90 kDa with specific reactivity against anti-Histidina monoclonal antibodies. The use of complex media promotes an increase in biomass, but no soluble S1 recombinant protein was produced. Concluding, the yeast system composed by pFLDa - P. pastoris was efficient to express intra-cellularly the recombinant S1 protein of M41 strain of IBV which has a potential to be used in the immuno-diagnosis of avian infectious bronchitis.

Orientador: Hélio José Montassier / Banca: Ana Maria Iba Kanashiro / Banca: José Moacir Marin / Resumo: A glicoproteína de superfície (8) do vírus da bronquite infecciosa (VBI) em aves; é um alvo antigênico importante para a indução de imunidade e como antígeno utilizado no imunodiagnóstico da infecção causada por este vírus. Nesse estudo, a forma recombinante da subunidade 81 da glicoproteína 8 da estirpe M41 do VBI foi clonada e expressa como proteína de fusão contendo uma cauda de poli-histidina e o epítopo V-5 em células da levedura Saccharomyces cerevisiae. O gene codificador dessa proteína foi amplificado a partir do RNA genômico da estirpe M41 do VBI, por meio das técnicas da reação de transcrição reversa (RT) e da reação da polimerase em cadeia (PCR). Foi amplificada toda a seqüência codificadora de interesse e fossem geradas extremidades compatíveis com a inserção no vetor pYE82.1N5-His-TOPO. Este vetor foi usado na transformação de leveduras, tendo sido obtidos os clones transformantes específicos portadores do inserto gênico. A expressão da proteína de fusão foi então induzida, em células de S. cerevisiae, sendo produzida a proteína recombinante 81 de fusão com peso molecular 95 kDa. Essa proteína apresentou com uma elevada reatividade cruzada para a proteína 8 do próprio vírus, tal como demonstraram os resultados das análises pelo Western blotting e ELl8A. Essa proteína de fusão foi, devido à presença da cauda de poli¬histidina, prontamente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel ¬agarose e, posteriormente utilizada com sucesso no desenvolvimento de um método indireto de ELl8A para a detecção de anticorpos específicos de galinhas infectadas com o VBI. / Abstract: The surface glycoprotein of infectious bronchitis virus (IBV) is a important antigenic target for the induction of immunity and as antigen in the immunodiagnosis of infection caused by this virus. In this study, the gene of 51 glycoprotein of M41 strain of the IBV was cloned and expressed as a fusion protein containing a poly-histidine and epitope V-5 tags in the yeast cells of Saccharomyces cerevisiae. The 51 gene was amplified from genomic RNA of the M41 strain of VBI, by reverse transcription (RT) and polymerase chain reaction (PCR). The entire coding sequence of 51 gene was amplified and inserted in the vector pYE52.1N5-His-TOPO. This construct was used for transforming yeast cells, and to obtain specific clones carrying the inserted gene. The expression of the fusion protein was induced in transformed cells of S. cerevisiae, and a recombinant 51 protein was produced with a molecular weight of 95 kDa. A high cross¬reactivity with the original 51 protein from the virus was detected by Western blotting and ELl5A. The presence of the poly-histidine tail in the fusion recombinant protein favored their prompt purification by affinity chromatography in a column of nickel¬sepharose. This recombinant 51 protein was successfully used in the development of an indirect method of ELl5A for the detection of specific anti-IBV antibodies in chickens experimentally infected or vaccinated with this virus. / Mestre

O presente trabalho estuda a variação do diâmetro inicial e diâmetro final de um furo puncionado feito em uma chapa de aço ASTM A-36 com 12,7 mm de espessura. São propostas três geometrias diferentes de punção fabricados em aço AISI D2 e AISI S1 com diâmetro inicial 20 mm e final 22 mm. Os punções foram fabricados para realizarem o processo de puncionamento e brochamento com penetrações de avanço (asf) de 0,2 mm, 0,5 mm e 1 mm. O objetivo principal é reduzir a conicidade dos furos puncionados atualmente através do método convencional. As folgas entre punção e matriz (w) utilizadas foram de 3,1%, 7,8% e 15,7% da espessura da chapa de testes respectivamente. Para avaliação do desempenho de cada ferramenta, todos os furos puncionados foram medidos e tabelados. Entre os resultados encontrados, constatou-se que os punções com brochamento apresentam melhores valores que os convencionais em todos parâmetros analisados. As regiões de cisalhamento (Zc) e região de ruptura abrupta (Zr) também sofreram influência direta em função da geometria utilizada. / The present work studies the variation of the initial diameter and final diameter of a punched hole made in an ASTM A-36 steel sheet with 12.7 mm of thickness. Three different punches geometries are proposed and manufactured from AISI D2 and AISI S1 steel with initial diameter 20 mm and final diameter 22 mm. The punches were manufactured to carry out the punching and broaching process with feed penetrations (asf) of 0.2 mm, 0.5 mm and 1 mm. The main objective is to reduce the conicity of the punched holes currently through the conventional method. The clearance between punch and die (w) used were 3.1%, 7.8% and 15.7% of the thickness of the test plate respectively. To evaluate the performance of each tool, all punched holes were measured and tabulated. Among the results, it was observed that the punches with a broaching showed better values than the conventional ones in all analyzed parameters. The regions of shear (Zc) and region of abrupt rupture (Zr) also had a direct influence in function of the geometry used.

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Infectious bronchitis virus (IBV) is a member of family Coronaviridae and is classified into group 3 of the Coronaviruses. The virus is a single-stranded positive-sense RNA virus with a genome of 27kbp. IBV is a highly infectious disease of chickens that results in high morbidity with moderate to severe mortality depending on the strain involved, age of the birds, and immune status of the chickens. Multiple worldwide investigations indicate that differentiation within the S1 glycoprotein gene can lead to serotype variation within the IBV species. In this study 46 isolates collected over two years from broiler and broiler breeder flocks and eight historical isolates were analyzed. Forty one isolates originated from the KwaZulu-Natal region whilst the remaining thirteen were isolated from 4 other poultry-dense provinces. The S1 gene was sequenced and compared to determine variation between South African isolates, as well as global sequences submitted to Genbank. The results indicate the division of isolates analyzed into 2 different clades of IBV within the province. The most prevalent genotype was similar to IBV Mass strain detected in 79% of the full S1 sequences. Variation up to 22.3% was detected within local strains, supporting the hypothesis that multiple IBV serotypes may co-circulate in the same region simultaneously. Additionally, more conservation was observed among Mass serotypes versus QX-like serotypes, implying that vaccine use can influence the variability within the IBV population. Higher variability was found in the first half of the S1 gene in comparison to the last half of the S1 gene. This is in agreement with previous findings that the hypervariable regions of the S1 gene are located within the first 450 base pairs. This study offers the first published consolidation of IBV isolates from South Africa and identifies variation within the IBV population of the SA broiler flock. Previous publications list four or five IBV isolates whilst this study describes variation found in 54 isolates spanning 32 years. In addition this study provides the insight into the prevalence of IBV variation in poultry flocks due to the large number of isolates. The comparative use of geno- and serotyping for South African IBV isolates is also described for the first time in this study. / Dissertation (MSc)--University of Pretoria, 2013. / gm2014 / Veterinary Tropical Diseases / unrestricted

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Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_paula_finger.pdf: 729110 bytes, checksum: fe15bb22f0abb92bf1b2938fd6dcdfc9 (MD5) Previous issue date: 2011-12-19 / The chickens infectious bronchitis (IB) is a highly contagious viral disease which causes predominantly respiratory lesions manifested clinically and invariably by sneezing and tracheo-bronchial rales, which may lead to more severe signs, with a decrease in fertility and reduction of eggs production. The infectious bronchitis virus (IBV) encodes four major structural proteins: N (nucleocapsid protein), S (spike protein), E (envelope protein) and M (membrane protein) being the S protein is cleaved into S1 and S2. The 1 subunit (S1) is found exposed in the viral envelope, which makes it an important or main inducer of neutralizing antibodies against the IBV, the main target for the host s immune system. The variations in two regions of the envelope s S1 subunit, called hypervariables regions, may originate to new serotypes. The IBV s mutation and recombination capacity and the selection pressure exerted by the prolonged use of live vaccines contribute to the appearance of a wide variety of serotypes and subtypes of IBV. The objective of this study was to express, in Pichia pastoris, the gene that encodes the surface protein S1 of IBV strain M41 and, in Escherichia coli, to express the S1 of the synthetic gene designed from consensus sequences of national and international field samples, as an interesting alternative for the production of antigen that can be used for monitoring vaccination of birds and also an antigen that is suitable for the use in serological diagnostic. The cloning and expression of glycoprotein S1 in both heterologous expression systems was successfully performed. The process of expression using E. coli was simple and quick when compared to the use of P. pastoris. The P. pastoris was able to express the entire S1; however, it showed difficulty in secreting the glycoprotein. The results will be evaluated for use in immunodiagnostic kit for monitoring the disease in poultry, being more affordable than the ones existing currently. / A bronquite infecciosa das galinhas (IB) é uma enfermidade viral altamente contagiosa que causa predominantemente lesões respiratórias que se manifestam clinicamente e invariavelmente por espirros e estertores tráqueo-bronquiolares, podendo levar a sinais mais severos, com diminuição na fertilidade e redução da produção de ovos. O vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV) codifica quatro proteínas estruturais importantes: N (proteína do nucleocapsídeo), S (proteína de superfície), E (proteína do envelope) e M (proteína da membrana), sendo a proteína S subdividida em S1 e S2. A subunidade 1 (S1) encontra-se exposta no envelope viral, o que torna-a um importante, ou principal, indutor da produção de anticorpos neutralizantes frente ao IBV, sendo o principal alvo para o sistema imune do hospedeiro. As variações em duas regiões da subunidade S1 do envelope, chamadas regiões hipervariáveis, podem dar origem a novos sorotipos. A capacidade de mutação e recombinação de IBV e a pressão de seleção exercida pelo uso prolongado de vacinas vivas contribuem para o aparecimento de uma grande variedade de sorotipos e subtipos de IBV. O objetivo deste trabalho foi expressar em Pichia pastoris o gene que codifica a proteína de superfície S1 da estirpe M41 do IBV e, em Escherichia coli, expressar a S1 de um gene sintético elaborado a partir de sequências consenso de amostras de campo nacionais e internacionais, como uma alternativa interessante para a produção de antígeno que possa ser utilizado para monitoramento vacinal das aves e também um antígeno que seja adequado para utilização em diagnóstico sorológico. A clonagem e a expressão da glicoproteína S1 em ambos os sistemas heterólogos de expressão foi realizada com sucesso. O processo de expressão usando E. coli foi rápido e simples quando comparado ao uso da P. pastoris. A P. pastoris foi capaz de expressar a S1 inteira, porém, apresentou dificuldade em secretar a glicoproteína. Os resultados obtidos deverão ser avaliados para uso em Kit de imunodiagnóstico para monitoramento da enfermidade na avicultura, sendo de custo mais acessível do que os existentes no mercado.