Cheung, Siu Yuen. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2008. / Includes bibliographical references (leaves 178-200). / Abstracts in English and Chinese. / Abstract --- p.i / Chinese abstract --- p.iii / Acknowledgements --- p.v / Table of contents --- p.vii / Chapter Chapter One --- General Introduction --- p.1 / Chapter 1.1 --- S100 Proteins --- p.1 / Chapter 1.1.1 --- Structure of S100 proteins --- p.2 / Chapter 1.1.2 --- Possible functions of S100 proteins --- p.4 / Chapter 1.1.3 --- Genomic organization of S100 genes --- p.6 / Chapter 1.1.4 --- Clinical importance of S100 proteins --- p.7 / Chapter 1.2 --- S100A1 Protein --- p.8 / Chapter 1.2.1 --- Possible functions of the S100A1 protein --- p.10 / Chapter 1.2.1.1 --- Regulation of cardiac and skeletal muscle contractility --- p.10 / Chapter 1.2.1.2 --- Functional roles in the central nervous system (CNS) --- p.12 / Chapter 1.2.1.3 --- Other possible functions of the S100A1 protein --- p.13 / Chapter 1.2.2 --- S100A1 knockout mice --- p.14 / Chapter 1.2.3 --- Relationships between S100A1 and S100B proteins --- p.16 / Chapter 1.3 --- S100B Protein --- p.18 / Chapter 1.3.1 --- Possible functions of S100B protein --- p.19 / Chapter 1.3.2 --- S100B knockout mice --- p.20 / Chapter 1.4 --- RNA interference --- p.22 / Chapter 1.4.1 --- Mechanisms of RNA interference --- p.24 / Chapter 1.4.2 --- Efficacy and selectivity of siRNA --- p.25 / Chapter 1.4.3 --- siRNA delivery --- p.27 / Chapter 1.5 --- Objective --- p.31 / Figures and legends --- p.34 / Chapter Chapter Two --- S100A1 expression in normal mouse embryos and characterization of S100A1 knockout mouse embryos --- p.40 / Chapter 2.1 --- Introduction --- p.40 / Chapter 2.2 --- Materials and Methods --- p.44 / Chapter 2.2.1 --- Mouse strains --- p.44 / Chapter 2.2.2 --- RNA extraction --- p.46 / Chapter 2.2.3 --- Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) --- p.46 / Chapter 2.2.4 --- Protein extraction --- p.48 / Chapter 2.2.5 --- Western blotting --- p.49 / Chapter 2.2.6 --- Immunohistochemical staining --- p.50 / Chapter 2.3 --- Results --- p.53 / Chapter 2.3.1 --- S100A1 mRNA expression in normal mouse embryo --- p.53 / Chapter 2.3.2 --- S100A1 protein expression in normal mouse embryos --- p.55 / Chapter 2.3.2.1 --- Temporal expression of the S100A1 protein --- p.55 / Chapter 2.3.2.2 --- Spatial expression of the S100A1 protein --- p.57 / Chapter 2.3.3 --- Morphological and histological characterization of SI00A1 knockout mouse embryos --- p.60 / Chapter 2.3.4 --- S100B protein expression pattern in Wt and S100A1 KO mouse embryos --- p.62 / Chapter 2.4 --- Discussion --- p.64 / Tables --- p.73 / Figures and legends --- p.76 / Chapter Chapter Three --- Knockdown of S100A1 in S100B in knockout mouse embryos --- p.118 / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.118 / Chapter 3.2 --- Materials and Methods --- p.128 / Chapter 3.2.1 --- Mouse strains --- p.128 / Chapter 3.2.2 --- Short-interfering RNA (siRNA) --- p.129 / Chapter 3.2.3 --- In-uterus surgery --- p.130 / Chapter 3.2.4 --- RNA extraction and RT-PCR --- p.132 / Chapter 3.2.5 --- Immunohistochemical staining of S100A1 and S100B --- p.132 / Chapter 3.3 --- Results --- p.133 / Chapter 3.3.1 --- Characterization of S100B knockout mouse embryos --- p.133 / Chapter 3.3.2 --- S100A1 knockdown in S100B wild-type (Wt) mouse embryos --- p.133 / Chapter 3.3.3 --- S100A1 knockdown in S100B knockout (KO) mouse embryos --- p.139 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.146 / Tables --- p.153 / Figures and legends --- p.154 / Chapter Chapter Four --- General Discussion and Conclusions --- p.175 / Reference --- p.178

Convulsões prolongadas, status epilepticus (SE), durante o desenvolvimento cerebral podem afetar a estrutura e a função neuronal, levando a morte celular e alterações comportamentais na idade adulta. Nesta tese, investigamos os efeitos neuroquímicos e comportamentais, a curto e longo prazo, do SE induzido por LiCl-pilocarpina em animais jovens. O SE induzido por LiCl-pilocarpina reduz em 50% a atividade da Na+/K+ ATPase 1,5 h após a indução do insulto. Doze e vinte e quatro horas após a administração de pilocarpina, a atividade da Na+/K+ ATPase retornou aos níveis do controle. A diminuição da atividade da Na+/K+ ATPase foi acompanhada por uma diminuição significativa na captação de glutamato em concentrações fisiológicas (1 μM). No entanto, em concentrações elevadas (100 μM) não observou-se alteração da captação de glutamato. Nos animais tratados com LiCl-pilocarpina observou-se uma diminuição dos níveis de fosforilação das proteínas PKB e GKS-3β de 35,84% e 38,79%, respectivamente, 1,5 h após a indução do SE na região CA1 do hipocampo. No entanto, 24 h após a indução do SE, a fosforilação da PKB e GKS-3β retornaram aos níveis do controle. No giro denteado, observou-se uma redução de aproximadamente 30% nos níveis de fosforilação tanto da PKB e GKS-3β em 1,5 e 24 h após a indução do SE. Um elevado número de neurônios em degeneração foi observado 24 h após a indução do SE nas regiões CA1 e hilo do hipocampo. Na idade adulta, os animais tratados com LiCl-pilocapina apresentaram um severo déficit de memória-aprendizado na tarefa de esquiva inibitória, sendo que os animais que apresentaram menor latência para descida da plataforma apresentaram um maior escore para brotamento de fibras musgosas no hipocampo. No teste do claro-escuro, os animais submetidos ao SE retornaram menos e permaneceram menos tempo no compartimento claro quando comparados aos animais controles. Além disso, os animais tratados com LiCl-pilocarpina apresentaram elevados níveis da proteína S100B no líquor, bem como apresentaram uma correlação positiva entre o escore para brotamento de fibras musgosas e o imunoconteúdo de GFAP na região CA1. Portanto, nossos resultados mostraram que o SE induzido por LiCl-pilocarpina diminui a atividade da Na+/K+ ATPase, bem como a captação de glutamato em hipocampo 1,5 h após a indução do insulto. Estes efeitos foram acompanhados por uma diminuição da fosforilação das proteínas PKB e GKS-3β nas regiões CA1 e giro denteado, os quais podem estar relacionados com a morte neuronal observada 24 h após a indução do SE. Além disso, na idade adulta, o SE induzido aos 14 dias pós-natal induziu alterações no processo de memória-aprendizado e no comportamento emocional. As alterações comportamentais parecem estar relacionadas ao brotamento de fibras musgosas, visto que os animais que apresentaram déficit de memória na tarefa de esquiva inibitória e elevados níveis de ansiedade no teste claro-escuro apresentaram maior escore para brotamento de fibras musgosas no hipocampo. Além disso, os animais tratados com LiCl-pilocarpina apresentaram elevados níveis da proteína S100B no líquor bem como uma correlação positiva entre o imunoconteúdo de GFAP na região CA1 e o escore para brotamento de fibras musgosas, sugerindo uma resposta glial ao dano neuronal. Estes dados indicam que o status epilepticus induzido em períodos iniciais do desenvolvimento cerebral é danoso ao sistema nervoso central, alterando sua maturação e levando a alteração neuroquímicas, morfológicas e comportamentais na idade adulta. / Prolonged seizure activity, i.e. status epilepticus (SE), or repeated, brief seizures affect neuronal structure and function in the developing nervous system leading to neuronal death and behavioral impairment at adulthood. In this study, we investigated the short- and long-term effects of early-life LiCl-pilocarpine-induced SE on neurochemical and behavioral parameters. LiClpilocarpine- induced SE decreased Na+/K+ ATPase activity by 42% in hippocampal plasma membranes 1.5 h after SE induction when compared with control group. However, at 12 and 24 h after SE induction the activity of pump returned to control levels. At physiologic concentration of glutamate (1 μM), LiCl-pilocarpine treated animals showed decreased levels of glutamate uptake 1.5 h after SE induction. However, LiCl-pilocarpine-induced SE did not alter the glutamate uptake 12 and 24 h after SE induction. At higher concentration of extracellular glutamate (100 μM), no alterations were observed in glutamate uptake between control and LiCl-pilocarpine-induced SE groups in all times tested. LiCl-pilocarpine-induced SE decreased the phosphorylation of PKB by 35.84% and GSK-3β by 38.79% 1.5 h after SE induction in CA1 subfield. However, 24 h after LiCl-pilocarpine-induced SE the phosphorylation of PKB and GSK-3β returned to control levels. At dentate gyrus, the phosphorylation of PKB was reduced by 35.18% and 31.19% at 1.5 and 24 h after SE induction, respectively. GSK-3β phosphorylation was reduced by 38.05% and 33.12% at 1.5 and 24 h, respectively, after LiCl-pilocarpine administration. Twenty four h after SE, it was observed an increased number of degenerating neurons in the CA1 subfield and in the hilus. At adulthood, SE group presented an aversive memory deficit in an inhibitory avoidance task and the animals that presented lower latency to the step down showed a higher score for mossy fiber sprouting. In the light-dark exploration task, SE rats returned less and spent less time in the light compartment and present an increased number of risk assessment behavior (RA). There was a negative correlation between the time spent in the light compartment and the score for mossy fiber sprouting and a positive correlation between score for mossy fiber sprouting and number of RA. LiCl-pilocarpine-treated animals showed higher levels of S100B immunocontent in the CSF as well as a positive correlation between the score for sprouting and the GFAP immunocontent in the CA1 subfield, suggesting an astrocytic response to neuronal injury. Our results showed that early-life LiCl-pilocapine-induced SE reduce hippocampal Na+/K+ ATPase as well as glutamate uptake 1.5 h after SE induction. These effects were accompanied by a reduced phosphorylation of Akt and GSK- 3β at CA1 and dentate gyrus, which may be related to neuronal death observed 24 h after SE induction. Moreover, at adulthood the animals submitted to LiCl-pilocapine induced SE displayed memory impairment and increased anxiety-like behavior. The behavioral alterations appear to be associated with the mossy fiber sprouting, since the animals that presented impairment in the performance of inhibitory avoidance task and higher levels of anxiety in adulthood showed higher scores for mossy fiber sprouting in the hippocampus. Moreover, LiCl-pilocarpine-treated animals showed higher levels of S100B immunocontent in the CSF as well as a positive correlation between the score for mossy fiber sprouting and the GFAP immunocontent in the CA1 subfield, suggesting an astrocytic response to neuronal injury. These data indicate that LiCl-pilocarpine-induced SE early in life might harmfully affect brain maturation, leading to behavioral, morphological and neurochemical alterations in adulthood.

A doença de Alzheimer (DA) resulta de múltiplos eventos patogênicos, que incluem anormalidades no processamento protéico, inflamação e estresse oxidativo, levando à destruição seletiva de populações neuronais, especialmente de neurônios colinérgicos. Tal hipótese colinérgica justifica o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE) como a estratégia utilizada para tratamento de pacientes com DA. Huperzina A (HupA), um alcalóide Licopodium extraído de uma espécie vegetal (Huperzia serrata) de uso tradicional pela medicina chinesa, parece se apresentar como uma alternativa. A HupA atua como um inibidor potente, reversível e altamente específico da AChE. Sua potência como anticolinesterásico é similar ou superior à da fisostigmina, galantamina, donepezil e tacrina, anticolinesterásicos aprovados para o tratamento da DA Este alcalóide também demonstrou múltiplos efeitos neuroprotetores, incluindo modificação do processamento do peptídeo -amilóide, redução do estresse oxidativo, proteção neuronal contra apoptose e regulação da expressão e secreção de fatores tróficos, tais como fator de crescimento neuronal e em situações de injúria com comprometimento de funções glutamatérgicas. A S100B é uma proteína da família S100 de proteínas ligantes de cálcio, produzida e secretada por astrócitos no SNC. Quando em baixas concentrações no meio extracelular (nanomolar), ela é trófica; já em concentrações maiores (micromolar), é tóxica, podendo levar à apoptose. Sabe-se que a S100B está envolvida na patofisiologia de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na DA, no qual ocorre um aumento dos níveis dessa proteína no líquor em sua fase precoce. Neste trabalho investigamos o efeito da HupA, da tacrina (tetraaminoacridina ou THA) e da acetiltiocolina (ATCh) em astrócitos e em fatias hipocampais, quanto à secreção e conteúdo intracelular de S100B e proteína fibrilar glial ácida (GFAP), durante 1 e 24 h. A HupA (100 μM) aumentou a secreção em cultura de astrócitos em 1 h, mas diferentemente causou uma redução em fatias hipocampais, bem como ATCh (100 μM). Após 24 h de tratamento, foi possível observar em cultura de astrócitos um efeito da tacrina a 100 μM sobre a redução do conteúdo de S100B intracelular, mas não de HupA ou ATCh. O imunocontéudo de GFAP não foi alterado após os tratamentos. Uma análise geral desses resultados nos mostra que a HupA pode regular mecanismos de secreção da S100B. Além disto, a modulação de secreção desta proteína parece ser modulada por receptores colinérgicos. / Alzheimer´s Disease (AD) results in multiple pathogenic events, which include abnormalities of protein process, inflammation and oxidative stress, leading to a neuronal population destruction, especially of cholinergic neurons. This cholinergic hypothesis justifies the use of acetylcholinesterase inhibitors (IAChE) as the strategy for patients with AD. Huperzine A (HupA), a novel Lycopodium alkaloid isolated originally from a traditional Chinese medicine, seems to be an alternative. HupA is a reversible, potent and selective IAChE. Its potency and duration of AChE inhibition rival those of physostigmine, galanthamine, donepezil and tacrine, approved for treatment of DA. HupA also demonstrated multiple neuroprotector effects, including modifying the β-amyloid processing, decreasing oxidative stress, protecting neurons against apoptosis and also expressing and regulating secretion of trophic factors, such as neuronal growth factor (NGF) and also acts reducing glutamatergic excitotoxicity. S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS) and plays a regulatory role in the cytoskeleton and cell cycle. Moreover, extracellular S100B, a marker of glial activation in several conditions of brain injury, for example in AD, has a trophic or apoptotic effect on neurons, depending on its concentration. Here we investigated the effect of HupA, tacrina (tetraminoacridine or THA) and acetilthiocholine (ATCh), on S100B secretion, S100B and GFAP intracellular contend in cortical astrocytes cultures and hippocampal slices treated for 1 and 24 h. For 1 h, HupA and ATCh (100 μM) increased the secretion in astrocytes for 1 h, but caused a reduction on hippocampal slices (P < 0.05). After 24 h of treatment, tacrine (100 μM) reduced the S100B intracellular contend in astrocytes cultures, but it was not observed with HupA or ATCh. The GFAP immunocontent did not change after these treatments. Generally, our data show that HupA can regulate S100B secretion mechanisms and that this modulation could be activated by cholinergic receptors.

Na doença de Alzheimer, o grau de demência pode ser correlacionado com o dano dos neurônios colinérgicos, particularmente aqueles que inervam o hipocampo e neocórtex. Lesões no núcleo basal magnocelular (nbm) são extremamente utilizados para estudar déficits cognitivos e alterações comportamentais envolvendo a disfunção colinérgica. Neste modelo, astrogliose cortical é descrita, mas ainda não está claro se há ativação dos astrócitos hipocampais. Para tanto, este estudo buscou avaliar possíveis alterações astrogliais no hipocampo de ratos Wistar machos adultos após lesão do nbm através da infusão de ácido ibotênico. Foram investigados os conteúdos de GFAP (proteína glial fibrilar ácida), S100B (tecido e líquor), GSH (glutationa), atividade da GS (glutamina sintetase) e da AChE (acetilcolinesterase), além da captação de glutamato, secreção de S100B (com alta e baixa concentração de K+) e imunoistoquímica para GFAP após 7 e 28 dias de lesão. O déficit cognitivo foi confirmado através da tarefa de esquiva inibitória (parâmetro demência/não demência). Nossos resultados confirmam alterações astrogliais hipocampais, particularmente uma diminuição da defesa antioxidante (diminuição do conteúdo de GSH), diminuição da captação de glutamato, diminuição do conteúdo de GFAP e S100B (tecido) e diminuição da atividade da AChE após 28 dias de lesão no nbm. O conteúdo de S100B e GFAP após 7 dias de lesão não sofreu modificações significativas assim como o conteúdo de S100B no líquor. A atividade da GS também não alterou após 7 ou 28 dias de lesão com ácido ibotênico, bem como a secreção de S100B, que se manteve em níveis basais após 28 dias de lesão. Esses dados contribuem para o entendimento de lesão no nbm através da infusão de IBO, particularmente provocando uma disfunção colinérgica no hipocampo acompanhada de hipofunção glial; este procedimento pode ser considerado um modelo adequado para estudar alguns aspectos da demência, comumente associada à disfunção colinérgica. / In Alzheimer’s disease, the degree of dementia could be correlated with the damage of cholinergic neurons, particularly with those supply the hippocampus and neocortex. Lesions of the nucleus basalis magnocellularis (nbm) was extremely used to study cognitive deficits and behavior alterations involved cholinergic dysfunction. In this model cortical astrogliosis is described, but it is not clear if the activation of hippocampal neurons exist. Despite this, the present study evaluates the possible astroglial alterations in the hippocampus of Wistar male rats after lesion in the nbm with ibotenic acid infusion. Was investigate the GFAP, S100B, GSH content and AChE and GS activity, glutamate uptake, secretion of S100B (with high and low concentration of K+) and immunohistochemistry of GFAP after 7 and 28 days of lesion. The cognitive deficit was confirmed through the stepdown inhibitory avoidance task (dementia/no dementia). Our results confirm hippocampal astroglial alterations, particularly a decrease of antioxidant defense (decrease of GSH content), decrease of glutamate uptake, decrease of GFAP and S100B content and decrease of AChE activity after 28 days of lesion. The content of GFAP and S100B after 7 days of lesion was not modified as well as the S100B content in the CSF (cerebrospinal fluid). The GS activity was not altered after 7 or 28 days of lesion and the S100B secretion was maintained in basal levels after 28 days of insult. These data contribute to understand the nbm lesion with ibotenic acid, particularly a cholinergic dysfunction caused in the hippocampus together with glial hypofunction; this procedure could be considered a good model to study some aspects of dementia, commonly associated with cholinergic dysfunction.

A estimulação neonatal ocasiona alterações no desenvolvimento neuroendócrino, morfológico e comportamental de ratos. O procedimento de manipulação neonatal promove uma ruptura na relação mãe-filhote que pode perturbar o desenvolvimento do SNC. Uma das alterações morfológicas apresentadas em ratos machos e fêmeas manipulados no período neonatal é a diminuição do número de neurônios no locus coeruleus. A S100B é uma proteína ligante de cálcio secretada por astrócitos que pode apresentar ações extracelulares neurotróficos e neurotóxicas. Diversos estudos relacionam alterações dos níveis de S100B a eventos estressores. O estudo objetivou avaliar o efeito da estimulação neonatal, através da manipulação repetida, em ratos machos e fêmeas de 10 dias de idade sobre a concentração das proteínas S100B e GFAP no locus coeruleus, córtex frontal e bulbo olfatório, além da secreção de S100B no líquor. Os resultados revelaram um aumento da concentração de S100B no líquor apenas nas ratas fêmeas manipuladas, e uma diminuição da concentração de S100B no locus coeruleus em ratos machos e fêmeas manipulados. Ocorreu também, uma diminuição da concentração de S100B no córtex frontal em ratos machos manipulados. Em relação à proteína GFAP foi verificado um aumento no seu conteúdo no locus coeruleus em ratos machos e fêmeas manipulados. Foram encontrados diferenças entre os sexos, os machos não-manipulados têm um maior nível de S100B comparados com fêmeas nãomanipuladas no locus coeruleus. Os resultados sugerem que a manipulação neonatal pode interferir sobre o funcionamento das células gliais e através delas alterar o desenvolvimento das células nervosas. Além disso, os resultados mostram um efeito do sexo dos animais sobre as concentrações de S100B já no período neonatal.

O comportamento-doente e outros efeitos associados a intoxicação pelo lipopolissacarídeo (LPS) tem sido amplamente investigado por diversos campos da ciência contemporânea. Essa macromolécula bacteriana é capaz de ativar o sistema imunitário (SI) inato e gerar mecanismos adaptativos inflamatórios. Os mecanismos inflamatórios humorais e teciduais, tanto periféricos quanto centrais, estão envolvidos com diversas condições neuropsiquiátricas e representam uma importante condição para etiologia e patogênese destas desordens. O trabalho a seguir aborda alguns aspectos comportamentais e bioquímicos de ratos ou camundongos, quando injetados com LPS sistemicamente. Utilizou-se administrações agudas ou múltiplas e tarefas de avaliações comportamentais de memórias aversivas e espaciais, bem como sensibilização locomotora. Os resultados obtidos mostraram que o LPS induziu aumento das latências de teste da esquiva inibitória, que não foram observados nos grupos controle. Em outro experimento utilizando LPS e exercício físico forçado, no labirinto aquático de Morris os animais tratados somente com LPS apresentaram melhor desempenho após reativação de memória remota. Posteriormente não foi observado ansiedade ou déficit de memória. Foram observadas alterações significativas da S100B no líquido cefalorraquidiano de animais tratados com LPS. No soro essas diferenças foram sutis e não puderam discriminar os grupos. A corticosterona plasmática estava alterada nos animais com melhores desempenhos cognitivos. Noutro experimento, utilizando a sensibilização locomotora o LPS foi capaz de promover a expressão desse comportamento quando administrado com uma dose não sensibilizatória de cocaína. As conclusões apontam para o papel facilitador do LPS em tarefas de memória e sensibilização locomotora. Os possíveis mecanismos envolvidos devem estar relacionados com a ativação do eixo-HPA e outros mecanismos neuroimunológicos. Os paralelos traçados vão nas direções da comorbidade existente entre depressão e dependência química. E o autor busca discutir uma possível relação da bases neuroimunobiológicas com pensamentos cognitivistas. / Sickness behavior and other effects induced by lipopolysaccharide (LPS) have been widely used in contemporary neuroscience. This molecule triggers innate immune responses as inflammation, that has been reported to be involved with depression and others neuropsychiatric conditions. The main question of this thesis is about behavioral aspects of rats and mice treated with LPS, and possible relations between depression and addiction. In rats, a single LPS administration facilitated inhibitory avoidance (IA) memory retention but it did not changed serum or cerebrospinal fluid (CSF) S100B levels. The multiple LPS administration improved memory in the Morris water maze task (MWM) during the second testing, which occurred 24 hours after retraining. They also equally increased plasma corticosterone levels. CSF but not serum levels of S100B were increased by both LPS doses. In other experiment, LPS and cocaine were administered intraperitonealy in young-adult male C57bl/6 mice during a 5-day acquisition phase. After a 48-h withdrawal period all groups were challenged with cocaine to evaluate locomotor expression. During the acquisition phase, the LPS-treated groups displayed characteristic hypolocomotion related to sickness behavior. The low dose of cocaine did not increase the distance travelled, characterizing a nonsensitization dose. Groups that received both LPS and cocaine did not display hypolocomotion, indicating that cocaine might counteract hypolocomotion sickness behavior. Moreover, during challenge, only these animals expressed locomotor sensitization. Thus, LPS can induce memory retention and locomotor sensitization. The mechanisms involved in this data may be stress system and other neuroimmunological interactions.

Convulsões prolongadas, status epilepticus (SE), durante o desenvolvimento cerebral podem afetar a estrutura e a função neuronal, levando a morte celular e alterações comportamentais na idade adulta. Nesta tese, investigamos os efeitos neuroquímicos e comportamentais, a curto e longo prazo, do SE induzido por LiCl-pilocarpina em animais jovens. O SE induzido por LiCl-pilocarpina reduz em 50% a atividade da Na+/K+ ATPase 1,5 h após a indução do insulto. Doze e vinte e quatro horas após a administração de pilocarpina, a atividade da Na+/K+ ATPase retornou aos níveis do controle. A diminuição da atividade da Na+/K+ ATPase foi acompanhada por uma diminuição significativa na captação de glutamato em concentrações fisiológicas (1 μM). No entanto, em concentrações elevadas (100 μM) não observou-se alteração da captação de glutamato. Nos animais tratados com LiCl-pilocarpina observou-se uma diminuição dos níveis de fosforilação das proteínas PKB e GKS-3β de 35,84% e 38,79%, respectivamente, 1,5 h após a indução do SE na região CA1 do hipocampo. No entanto, 24 h após a indução do SE, a fosforilação da PKB e GKS-3β retornaram aos níveis do controle. No giro denteado, observou-se uma redução de aproximadamente 30% nos níveis de fosforilação tanto da PKB e GKS-3β em 1,5 e 24 h após a indução do SE. Um elevado número de neurônios em degeneração foi observado 24 h após a indução do SE nas regiões CA1 e hilo do hipocampo. Na idade adulta, os animais tratados com LiCl-pilocapina apresentaram um severo déficit de memória-aprendizado na tarefa de esquiva inibitória, sendo que os animais que apresentaram menor latência para descida da plataforma apresentaram um maior escore para brotamento de fibras musgosas no hipocampo. No teste do claro-escuro, os animais submetidos ao SE retornaram menos e permaneceram menos tempo no compartimento claro quando comparados aos animais controles. Além disso, os animais tratados com LiCl-pilocarpina apresentaram elevados níveis da proteína S100B no líquor, bem como apresentaram uma correlação positiva entre o escore para brotamento de fibras musgosas e o imunoconteúdo de GFAP na região CA1. Portanto, nossos resultados mostraram que o SE induzido por LiCl-pilocarpina diminui a atividade da Na+/K+ ATPase, bem como a captação de glutamato em hipocampo 1,5 h após a indução do insulto. Estes efeitos foram acompanhados por uma diminuição da fosforilação das proteínas PKB e GKS-3β nas regiões CA1 e giro denteado, os quais podem estar relacionados com a morte neuronal observada 24 h após a indução do SE. Além disso, na idade adulta, o SE induzido aos 14 dias pós-natal induziu alterações no processo de memória-aprendizado e no comportamento emocional. As alterações comportamentais parecem estar relacionadas ao brotamento de fibras musgosas, visto que os animais que apresentaram déficit de memória na tarefa de esquiva inibitória e elevados níveis de ansiedade no teste claro-escuro apresentaram maior escore para brotamento de fibras musgosas no hipocampo. Além disso, os animais tratados com LiCl-pilocarpina apresentaram elevados níveis da proteína S100B no líquor bem como uma correlação positiva entre o imunoconteúdo de GFAP na região CA1 e o escore para brotamento de fibras musgosas, sugerindo uma resposta glial ao dano neuronal. Estes dados indicam que o status epilepticus induzido em períodos iniciais do desenvolvimento cerebral é danoso ao sistema nervoso central, alterando sua maturação e levando a alteração neuroquímicas, morfológicas e comportamentais na idade adulta. / Prolonged seizure activity, i.e. status epilepticus (SE), or repeated, brief seizures affect neuronal structure and function in the developing nervous system leading to neuronal death and behavioral impairment at adulthood. In this study, we investigated the short- and long-term effects of early-life LiCl-pilocarpine-induced SE on neurochemical and behavioral parameters. LiClpilocarpine- induced SE decreased Na+/K+ ATPase activity by 42% in hippocampal plasma membranes 1.5 h after SE induction when compared with control group. However, at 12 and 24 h after SE induction the activity of pump returned to control levels. At physiologic concentration of glutamate (1 μM), LiCl-pilocarpine treated animals showed decreased levels of glutamate uptake 1.5 h after SE induction. However, LiCl-pilocarpine-induced SE did not alter the glutamate uptake 12 and 24 h after SE induction. At higher concentration of extracellular glutamate (100 μM), no alterations were observed in glutamate uptake between control and LiCl-pilocarpine-induced SE groups in all times tested. LiCl-pilocarpine-induced SE decreased the phosphorylation of PKB by 35.84% and GSK-3β by 38.79% 1.5 h after SE induction in CA1 subfield. However, 24 h after LiCl-pilocarpine-induced SE the phosphorylation of PKB and GSK-3β returned to control levels. At dentate gyrus, the phosphorylation of PKB was reduced by 35.18% and 31.19% at 1.5 and 24 h after SE induction, respectively. GSK-3β phosphorylation was reduced by 38.05% and 33.12% at 1.5 and 24 h, respectively, after LiCl-pilocarpine administration. Twenty four h after SE, it was observed an increased number of degenerating neurons in the CA1 subfield and in the hilus. At adulthood, SE group presented an aversive memory deficit in an inhibitory avoidance task and the animals that presented lower latency to the step down showed a higher score for mossy fiber sprouting. In the light-dark exploration task, SE rats returned less and spent less time in the light compartment and present an increased number of risk assessment behavior (RA). There was a negative correlation between the time spent in the light compartment and the score for mossy fiber sprouting and a positive correlation between score for mossy fiber sprouting and number of RA. LiCl-pilocarpine-treated animals showed higher levels of S100B immunocontent in the CSF as well as a positive correlation between the score for sprouting and the GFAP immunocontent in the CA1 subfield, suggesting an astrocytic response to neuronal injury. Our results showed that early-life LiCl-pilocapine-induced SE reduce hippocampal Na+/K+ ATPase as well as glutamate uptake 1.5 h after SE induction. These effects were accompanied by a reduced phosphorylation of Akt and GSK- 3β at CA1 and dentate gyrus, which may be related to neuronal death observed 24 h after SE induction. Moreover, at adulthood the animals submitted to LiCl-pilocapine induced SE displayed memory impairment and increased anxiety-like behavior. The behavioral alterations appear to be associated with the mossy fiber sprouting, since the animals that presented impairment in the performance of inhibitory avoidance task and higher levels of anxiety in adulthood showed higher scores for mossy fiber sprouting in the hippocampus. Moreover, LiCl-pilocarpine-treated animals showed higher levels of S100B immunocontent in the CSF as well as a positive correlation between the score for mossy fiber sprouting and the GFAP immunocontent in the CA1 subfield, suggesting an astrocytic response to neuronal injury. These data indicate that LiCl-pilocarpine-induced SE early in life might harmfully affect brain maturation, leading to behavioral, morphological and neurochemical alterations in adulthood.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:44:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Objetivo: Estudar as células ganglionares e as células intersticiais de Cajal (CIC) no intestino terminal de ratos portadores de anomalia anorretal (AAR) induzida pela etilenotiouréia (ETU). Métodos: Os animais foram distribuídos em três grupos: Grupo A - fetos normais, obtidos de ratas grávidas às quais não foi administrada ETU; Grupo S - fetos não portadores de AAR obtidos de ratas grávidas às quais foi administrada ETU e Grupo C - fetos portadores de AAR obtidos de ratas grávidas às quais foi administrada ETU. A ETU foi administrada no décimo primeiro dia de gestação na dose de 125 mg/Kg, por gavagem. As ratas foram submetidas à laparotomia e histerotomia para retirada dos fetos no vigésimo primeiro dia de gestação. O intestino terminal dos fetos foi retirado e analisado por imunohistoquímica para pesquisa das CIC e células ganglionares. Resultados: Foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos A, S e C quanto à densidade de CIC e de células ganglionares. O grupo A apresentou a maior densidade, seguida pelo grupo S, e a menor densidade, de ambas as células, foi encontrada no Grupo C. Não se observou diferença estatisticamente significante entre os três tipos de anomalia anorretal obtidos, quanto à densidade de ambas as células. Conclusão: Existe uma menor densidade de CIC e de células ganglionares no intestino terminal de ratos portadores de AAR. / Objective: to study the ganglion cells and the interstitial cells of Cajal (ICC) in the terminal bowel of rats with ethylenethiourea (ETU)-induced anorectal malformations (ARM). Methods: the animals were divided into three groups: Group A – normal fetuses from pregnant rats that were not administered ETU; Group B – fetuses without ARM born from pregnant rats that were administered ETU and Group C - fetuses with ARM born from pregnant rats that received ETU. ETU was administered on the 11 th day of pregnancy at the dose of 125 mg/kg body weight by gastric gavage. The rats had cesarean section on the 21 st day of gestation. The fetuses’ terminal bowel tissue was analyzed by immunohistochemistry to demonstrate ICC and ganglion cells. Results: statistically significant differences were found between groups A, B and C regarding ICC and ganglion cell densities. Group A had the highest cell density, followed by Group B and the lowest density of both cells was found in Group C. There were no statistically significant differences between the three types of ARM regarding the density of either cell. Conclusion: ICC and ganglion cell densities are decreased in the terminal bowel of rats with ARM / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Embora a inflamação seja um processo de defesa fisiológica, neuroinflamação desequilibrada tem sido associada com a fisiopatologia de doenças do SNC. Além disso, a exposição pré-natal à infecção bacteriana e/ou viral tem sido implicada em vários estudos como um importante fator ambiental capaz de afetar prejudicialmente o neurodesenvolvimento, aumentando assim o risco de esquizofrenia. Resposta imune materna, em vez de infecção direta do feto, poderia ser responsável pelo desenvolvimento da doença. Glia ativada libera uma variedade de citocinas pró-inflamatórias que contribuem para a disfunção neuronal. Além disso, as alterações de marcadores astrogliais parecem estar intimamente relacionadas à patologia da esquizofrenia, por exemplo, níveis elevados de S100B, uma proteína derivada da glia, foram observados no soro e LCR de pacientes com esquizofrenia. Nesta tese avaliou-se se a secreção de S100B (em células de glioma C6 e fatias de hipocampo de ratos Wistar) poderia ser diretamente modulada por citocinas inflamatórias alteradas na esquizofrenia, assim como o possível envolvimento da via da proteína cinase ativada por mítógeno (MAPK) nestas respostas. Os efeitos dos antipsicóticos típicos e atípicos na secreção de S100B induzida por citocinas foram analisadas. Nós também avaliamos se a administração de LPS em ratas prenhas no final da gestação afeta alguns aspectos comportamentais da prole em sua vida adulta, e investigamos os efeitos deste tratamento sobre parâmetros gliais usando preparação ex vivo dos descendentes, além de observar se o tratamento pré-natal afeta marcadores gliais (S100B e GFAP) da prole adulta. Usamos a prole aos 30 e 60 dias para avaliar as diferenças entre os ratos jovens e adultos e também investigar a existência de diferenças entre os descendentes do sexo masculino e feminino. Avaliamos também os parâmetros de estresse oxidativo NO e GSH. Nós observamos que secreção de S100B foi aumentada pelas citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF-, IL-6 e IL-8) em glioma C6 e em fatias hipocampais através da via MAPK, e estresse oxidativo pode ser um componente desta modulação. Além disso, IL-6 foi capaz de induzir um aumento no conteúdo de S100B e GFAP em glioma C6 e os antipsicóticos, haloperidol e risperidona, foram capazes de inibir a secreção de S100B estimulada por IL-6. Observamos também que o modelo de alteração imune maternal provocou alterações comportamentais na prole adulta, especialmente no comportamento social dos ratos afetados, além de modificar o padrão de secreção da proteína S100B e da captação de glutamato em fatias ex vivo da prole adulta. Constatamos que conteúdo de glutationa e NO são modificados de forma dependente de idade/gênero. Foi observada também uma pronunciada astrogliose particularmente hipocampal, com GFAP apresentando-se aumentada em ratos juvenis e adultos enquanto que conteúdo de S100B apresentou diminuição na prole juvenil e aumento em ratos adultos em resposta a exposição imune maternal. Aparentemente, infecção pré-natal parece levar a anormalidades comportamentais e neuroquímicas, incluindo modificação de marcadores gliais, na vida pós-natal, possivelmente via citocinas. / Although inflammation may be a physiological defense process, imbalanced neuroinflammation has been associated with the pathophysiology of brain disorders. Furthermore, prenatal exposure to bacterial and viral infection has been implicated by several studies indicating that such exposure is an important environmental factor out that may detrimentally affect neurodevelopment, increasing the risk of schizophrenia. Maternal immune response, rather than direct infection of the fetus, could be responsible for disease development. Activated glia releases a variety of pro-inflammatory cytokines that contribute to neuronal dysfunction. Moreover, changes in astrogliais markers seem to be closely related pathology of schizophrenia, for example, elevated levels of S100B, a glia derived protein, have been observed in the serum and CSF of schizophrenic patients. We evaluated whether S100B secretion (in C6 glioma cells and hippocampal slices in Wistar rats) could be directly modulated by the main inflammatory cytokines altered in schizophrenia, as well as the possible involvement of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in these responses. The effects of typical and atypical antipsychotic drugs on glial cytokine-induced S100B release were analyzing. We also evaluated whether administration of LPS to rats dams in late gestation affects some aspects of the offspring behavior in their adult life, and investigated the effects of this treatment on glial parameters using ex vivo preparation of offsprings, and whether it affects astroglial markers (S100B and GFAP) of the offspring in later life. We used the offspring at 30 and 60 days to evaluate the differences between juvenile and adult rats and also investigate the existence of differences between male and female offspring. We also investigated the oxidative stress parameters NO and GSH. We observed that S100B secretion was increased by the pro-inflammatory cytokines (IL-1 , TNF-, IL-6 and IL-8) in C6 glioma and in hippocampal slices via the MAPK, and oxidative stress may be a component this modulation. Furthermore, IL-6 was capable of inducing an increase in content GFAP and S100B in C6 glioma and antipsychotic, haloperidol and risperidone have been capable of inhibiting S100B secretion stimulated by IL-6. We also note that the model of maternal immune changes caused behavioral changes in the adult offspring, especially in the social behavior of rat affected and modified the pattern of secretion of S100B protein and glutamate uptake in ex vivo slices of adult offspring. We found that content of glutathione and NO are modified so age / gender dependent. There was also a pronounced hippocampal astrogliosis, with GFAP presenting increased in juvenile and adult rats while S100B content was reduced in juvenile and increased in adult offspring rats in response to exposure to maternal immune. Apparently, prenatal infection appears to lead to behavioral and neurochemical abnormalities, including modification of glial markers in the postnatal life, possibly via cytokines.

A amônia é uma neurotoxina implicada em desordens metabólicas cerebrais associadas com hiperamonemia. A neurotoxicidade aguda da amônia pode ser mediada por mecanismos excitotóxicos envolvendo o sistema glutamatérgico, incluindo a ativação do receptor NMDA e o subsequente aumento na concentração de Ca2+. O estresse oxidativo está relacionado à neurotoxicidade da amônia e o óxido nítrico parece estar envolvido nesta condição. Os astrócitos desempenham um papel essencial na proteção dos neurônios contra excitotoxicidade por captar o excesso de amônia e glutamato e convertê-los em glutamina, usando a enzima glutamina sintetase, e também protegendo contra o estresse oxidativo. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como parâmetro de ativação ou comprometimento em várias situações de dano cerebral, incluindo hiperamonemia. Antioxidantes, como o resveratrol, apresentam muitos efeitos biológicos, incluindo a modulação de parâmetros gliais como a captação de glutamato, a atividade da glutamina sintetase e a secreção de S100B. Neste estudo, foi investigado o efeito de antioxidantes sobre a secreção de S100B induzida pela amônia em células astrogliais. O resveratrol foi capaz de prevenir o aiumento da secreção de S100B, após 24 h de exposição à amônia, provavelmente via inibição de óxido nítrico e proteína cinase A (PKA). Então, o resveratrol pode ser um possível agente protetor contra a neurotoxicidade induzida pela amônia. / Ammonia is a neurotoxin implicated in brain metabolic disorders associated with hyperammonemia. Acute ammonia neurotoxicity can be mediated by excitotoxic mechanism involving glutamatergic system, including NMDA receptor activation and subsequent increase in intracellular Ca2+ concentration. Oxidative stress is related to ammonia neurotoxicity and nitric oxide can be involved in this condition. Astrocytes play an essential role in protecting neurons against excitotoxicity uptake excess ammonia and glutamate and converting it into glutamine, using enzyme glutamine synthetase and also protected against oxidative stress. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury, including hyperammonemia. Antioxidants, such as resveratrol, showed many biological effects, including modulation of glial parameters as glutamate uptake, glutamine synthetase activity and S100B secretion. In this study, we investigated the effect of antioxidants on S100B secretion induced by ammonia in astroglial cells. Resveratrol was able to prevent the increase of S100B secretion, after 24 h ammonia exposure, probably via nitric oxide and protein kinase A (PKA) inhibition. Then, resveratrol may be a possible protective agent against neurotoxicity induced by ammonia.