A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente. / Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.

Regulation of gene expression is an essential process for all living organisms. Transcriptional regulation, associated with chromatin, is governed by: (1) DNA sequence, which creates regulatory sites (promoters, enhancers and silencers), where sequence motifs and features (e. g. CpG) can attract transcription factors (TFs) and influence chromatin structure or RNA polymerase II (Pol II) binding, initiation and elongation; (2) non-sequence, epigenetic factors - histone modifications, TF binding, chromatin remodelling (histone placement, eviction and reconstitution), and non-coding RNA regulation. These factors interact with each other, creating a complex network of interactions. In this thesis I describe computational studies of heterochromatin factors in regulation of gene and repeat expression, an analysis of active regulatory elements, and global analyses of big datasets in C. elegans. I first show that a team of heterochromatin factors - HPL-2/HP1, LIN-13, LIN-61, LET-418/Mi-2, and H3K9me2 histone methyltransferase MET-2/SETDB1 - collaborates with piRNA and nuclear RNAi pathways to silence repetitive elements and protect the germline. I also found that the TACBGTA motif is particularly enriched on repeats and heterochromatin factors binding sites, and that repeat elements are derepressed in the soma during normal C. elegans ageing. I then describe the work on active regulatory regions. I show that CFP-1/CXXC1 binds CpG dense, nucleosome depleted promoters and, along SET-2, is required for H3K4me3 deposition at these loci. Using expression profiling I determined that the majority of CFP-1 binding targets are not significantly mis-regulated in cfp-1 mutants, but are weakly upregulated in bulk analyses. I also show that CFP-1 functionally interacts with the Sin3S/HDAC complex. In cfp-1 mutant I observed both loss and gain of SIN-3 binding, depending on chromatin context. Finally, I performed a data driven study on a large collection of ChIP-seq profiles using non-parametric sparse factor analyses (NSFA) and compared it to other, unsupervised machine learning algorithms. This study uncovered interactions and structure in genomic datasets. In addition, I present a collection of computational tools and methods I developed to facilitate processing, storage, retrieval, annotation, and analyses of large datasets in genomics.

Vibrio splendidus est une bacterie Gram négative du genre Vibrio. Les Vibrios sont des bactéries motiles, en forme de virgule, vivant essentiellement dans les ecosystèmes marins. Depuis une quinzaine d'années, Vibrio splendidus a été associé a des épisodes estivaux de mortalité de naissains d'huitres en France, jusqu'à compromettre l'économie ostréicole. Cependant on sait encore peu de choses sur l’évolution de cette espèce, sa capacité d'adaptation, et ses mécanismes de virulence. De nombreux travaux au cours de ces dernières années ont souligné l'importance des petits ARN non codants (sRNA) dans la régulation des gènes bactériens, en particulier en réponse à l'environnement ainsi qu'au cours de la pathogenèse. Nous avons réalisé une étude de transcriptomique par séquençage à haut débit afin d'établir un répertoire des sRNA chez V. splendidus. Cette analyse transcriptomique nous a permis d'identifier des centaines de sRNAs putatifs, dont la majorité sont spécifiques de cette espèce, une minorité résultant de transferts horizontaux avec d'autres bactéries marines, comme les Shewanellaceae. Les données transcriptomiques ont montré la présence chez V. splendidus de 4 copies du petit ARN CsrB, contrairement aux autres Vibrios qui en ont trois ou deux. Nous avons pu montrer que ces CsrBs jouent un role important dans la physiologie cellulaire en contrôlant la production et/ou la sécrétion de deux proteases jouant un role dans la virulence. De plus, nous avons montré que le réseau de régulation impliquant ces CsrBs est significativement différent des autres Vibrios, indiquant que la présence d'une copie supplémentaire a sans doute entraine un remodelage de ce réseau de régulation. / Vibrio splendidus is a Gram negative bacterium of the genus Vibrio. The Vibrios are motile, comma-shaped bacteria, living mainly in marine ecosystems. Over the past fifteenyears, Vibrio splendidus has been associated with oyster summer mortality episodes inFrance, generating heavy economic losses. However, still little is known about the evolutionof this species, its adaptive capacity, and the mechanisms of virulence. Many works in recentyears have stressed the importance of small noncoding RNAs (sRNAs) in bacterial generegulation, particularly in response to the environment as well as during pathogenesis. Wedid a transcriptomic study by high-throughput sequencing in order to explore the sRNArepertoire in V. splendidus. This transcriptomic analysis allowed us to identify hundreds ofputative sRNAs, the majority of which being specific of this species, a minority resulting fromhorizontal transfers with other marine bacteria, such as the Shewanellaceae. Transcriptomicdata showed the presence of 4 copies of the small RNA CsrB in V. splendidus, unlike otherVibrios which have two or three. We have shown that these CsrBs play an important role incell physiology by controlling the production and/or secretion of two proteases playing a rolein virulence. In addition, we have shown that the regulatory network involving these CsrBs issignificantly different from other Vibrios, indicating that the presence of an extra copy hasindeed resulted in a reshaping of the regulatory network.

A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

A ferrugem alaranjada é uma doença foliar que afeta a cana-de-açúcar, tendo ganho destaque como uma das principais doenças da cultura. Causada pelo fitopatógeno biotrófico Puccinia kuehnii, foi relatada em diversos países da América do Sul, incluindo o Brasil. Entender o comportamento desta doença é importante na compreensão de seus mecanismos de infecção. Para isso, o propósito deste trabalho é avaliar o transcriptoma, por sequenciamento de RNA, da resposta da cana-de-açúcar à infecção por P. kuehnii durante o estabelecimento da doença. O material biológico utilizado correspondeu a folhas de cana-de-açúcar do cultivar suscetível SP89-1115, amostrados no momento da inoculação dos esporos (0 h), 12 horas após a inoculação (hai), 24 hai, 48 hai, 5 dias e 12 dias após a inoculação da ferrugem alaranjada. Após o pré-processamento das leituras, foi realizado o mapeamento de aproximadamente 800 milhões de leituras, utilizando como referência um transcriptoma de cana-de-açúcar obtido a partir do sequenciamento de seis genótipos distintos. Posteriormente, foi realizada a análise de expressão diferencial: i) em um teste do tipo Análise de Variância, ii) entre a comparação de cada tempo após a infecção contra 0 h e iii) pela comparação de tempos adjacentes. Por essa última estratégia, a maioria dos transcritos diferencialmente expressos ocorreu em 12 hai, 48 hai e 12 dai. Através do enriquecimento funcional foram evidenciados processos relacionados principalmente à fotossíntese e oxirredução, importantes na manutenção do metabolismo e sinalização celular sob perturbação. Os perfis de expressão gênica temporal dos transcritos anotados de acordo com termos da base Gene Ontology, por sua vez, mostraram ondas invertidas de repressão e estímulo entre as comparações 12 hai vs 0 h e 48 hai vs 24 hai. Através da segunda análise de expressão diferencial houve indícios de que os níveis de expressão dos transcritos eram similares entre 0 h e 48 hai. Portanto, P. kuehnii pode ter agido no sentido de repressão das vias de resposta de defesa nas primeiras horas seguidas da inoculação, desfavorecendo mecanismos de acúmulo de fitormônios e deposição de lignina na parede celular. O cultivar de cana-de-açúcar pode ter sido prejudicado pela ausência de sistemas de reconhecimento e/ou no combate às proteínas efetoras do patógeno, de modo a ter sido modulado para o estabelecimento fúngico, havendo evidências do restabelecimento parcial da homeostase celular em 48 hai. / Orange rust is a foliar disease that affects sugarcane, gaining importance among the main diseases of this crop. Caused by the biotrophic phytopathogen Puccinia kuehnii, it has been reported in several countries in South America, including Brazil. Understanding the behavior of this disease is very important in comprehending its mechanisms of infection. The purpose of this work is to evaluate the transcriptome, by RNA sequencing, of the sugarcane response to infection by P. kuehnii during the establishment of the disease. The biological material used corresponds to sugarcane leaves from susceptible cultivar SP89-1115, sampled at the time of spore inoculation (0 h), 12 hours post inoculation (hpi), 24 hpi, 48 hpi, 5 days and 12 days post inoculation of orange rust. After pre-processing the reads, we mapped approximately 800 million reads to a reference sugarcane transcriptome obtained from sequencing six different genotypes. Subsequently, we performed differential expression analysis: i) in an Analysis of Variance type test; ii) comparing each time after inoculation against 0 h and iii) by comparing adjacent times. By the latter strategy, most of the differentially expressed transcripts occurred at 12 hpi, 48 hpi and 12 dpi. Through functional enrichment analysis, processes related mainly to photosynthesis and oxidation were evidenced, which are important in metabolic maintenance and cellular signaling under perturbation. The temporal gene expression profiles of Gene Ontology-annotated transcripts, in turn, showed reverse repression and stimulus waves between the comparisons 12 hpi vs 0 h and 48 hpi vs 24 hpi. Through the second differential expression analysis we found evidence that the expression levels of the transcripts were similar between 0 h and 48 hpi. Therefore, P. kuehnni may have acted in the sense of repressing defense response pathways in the first hours following inoculation, disfavoring mechanisms of phytohormones signaling and lignin deposition in the cell wall. This sugarcane cultivar may have been harmed by the absence of recognition systems and/or in the control of pathogen effector proteins in order to have been modulated for fungal establishment, with evidence of partial reestablishment of cellular homeostasis at 48 hpi.

O corpo lúteo (CL) canino apresenta períodos regulares de formação, atividade e regressão, marcados por intensa remodelação tecidual, o que depende diretamente de aporte energético, em alguns casos mediado pela insulina. Além de seu papel metabólico, a insulina, através de diferentes genes, pode desempenhar um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções do CL de cadelas cíclicas. Nosso objetivo na primeira parte experimental foi mapear os genes diferencialmente expressos no CL, em diferentes estágios do diestro, diretamente relacionados à sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica. A via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica foi abordada. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Na segunda parte experimental, através de cultivo celular, quantificamos a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese após estímulo insulínico, e realizamos o bloqueio das vias phosphoinositide 3-kinase (PI3K), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e mitogen-activated protein kinase 1(MAP2K1) para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: insulin receptor substrate (IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), e dois genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) e hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A via secundária de captação de glicose mostrou que adenylyl cyclase-associated protein (CAP1), CRK proto-oncogene, adaptor protein (CRKII) apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de progesterona (P4), diferente de member of RAS oncogene family (RAP) e ras homolog family member Q (RHOQ) que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de estradiol (E2) no diestro. Nos experimentos em cultivo celular, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20, diferentemente do dia 40, no qual houve aumento de expressão no grupo tratado com insulina. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de expressão no dia 20 e 40. A produção de P4 apresentou diminuição com o bloqueio de PI3K, MAPK14 e MAP2K1, enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K e MAPK14, e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAP2K1. Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluímos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro. / The canine corpus luteum (CL) has regular periods of formation, activity and regression marked by intense tissue remodeling, which depends directly on energy supply in some cases mediated by insulin. In addition to its metabolic role, insulin, through different genes, may play a key role in the regulation of steroidogenesis, and consequently in the CL functions of cyclic bitches. Our objective in the first experimental part was to map the differentially expressed genes in CL, at different stages of the diestrus, directly related to insulin signaling and steroidogenesis in canine CL, characterizing their gene and protein expression. The secondary pathway of glucose uptake also resulting from insulin signaling was addressed. Non-pregnant dogs were submitted to ovariosalpingohisterectomy every 10 days between days 10 and 60 (n=5/group) post- ovulation. The collected CL was used for RNA sequencing (RNA-Seq), validation by real-time PCR and protein for Western blotting and immunofluorescence. In the second experimental part, through cell culture we identified different responses of luteal cells after insulin stimulation under the expression of differentially expressed steroidogenesis genes. We also performed phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and mitogen-activated protein kina 1 (MAP2K1) pathway blockade to measure steroids production (n = 4/group). Seven differentially expressed genes related to insulin signaling were identified: insulin receptor substrate IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), in addition to two genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) and hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identified as being involved with steroidogenesis. The secondary glucose uptake pathway showed that adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP1) and CRK Proto-Oncogene, Adaptor Protein (CRKII) increased expression in the period of increased production of progesterone (P4). different than member Of RAS Oncogene Family (RAP) and ras homolog family member Q (RHOQ) showed less gene expression on days 40 p.o., coinciding with the increase of estradiol (E2). In the cell culture experiments under insulin stimulation, the expression of CYP19A1 did not present difference when the cells were coming from day 20, unlike day 40, in which there was increased expression in the group treated with insulin.. HSD3B expression increased on days 20 and 40. The production of P4 presented a decrease with PI3K, MAPK14 and MAP2K1, while that production of E2 decreased with PI3K and MAPK14 blockade, and did not alter with MAP2K1 blockade. Together, these data suggest that MAPK and PI3K can modulate steroidogenesis in the canine CL, probably via HSD3B and CYP19A1 expression. The activation of the CAP-CrKII-RHOQ-RAP pathway is not involved in this process. We conclude that insulin is able modulate steroidogenesis in canine CL and that hormonal response to insulin stimulus depends on the day of the diestrus.

A glândula de veneno da serpente Bothrops jararaca é uma glândula exócrina relacionada a glândula salivar dos mamíferos. Diferentemente de outras glândulas exócrinas, esta possui um lúmen central no qual o veneno produzido fica estocado. Os mecanismos envolvidos na regulação da síntese e secreção de toxinas pela glândula de veneno são pouco conhecidos. Sabe-se que a inervação noradrenérgica possui um papel essencial no ciclo de produção de veneno, pois serpentes Bothrops jararaca tratadas com reserpina, um potente bloqueador da atividade simpática, não acumulam veneno no lúmen. Porém a ativação direta dos adrenoceptores α e β, através da ação de agonistas, tem a capacidade de reverter a ação da reserpina. No presente trabalho utilizamos métodos combinados de análise de expressão gênica em larga escala a fim de identificar os processos celulares sob controle do sistema simpático durante o ciclo de produção de veneno da glândula de veneno de Bothrops jararaca. Foi construído um array de cDNA em membrana da náilon contendo 4608 clones provenientes da biblioteca de cDNA construída a partir das glândulas de veneno de um macho e uma fêmea, adultos, de Bothrops jararaca. Para a análise temporal da expressão gênica foram utilizados machos adultos de B. jararaca. As glândulas de veneno foram extraídas em diferentes dias do ciclo de produção de veneno (0, 1, 2, 4 e 15 dias). Através da análise do perfil de expressão gênica identificamos que os transcritos de toxinas e de não toxinas (celulares) possuem perfil semelhante de expressão ao longo do ciclo, sendo que no 2° dia do ciclo ocorre o pico de expressão desses transcritos. Para identificar os processos celulares sob controle da inervação noradrenérgica machos adultos de B. jararaca foram submetidos a tratamento farmacológico com reserpina (glândula 4dR) e com reserpina e agonistas dos adrenoceptores α e β (glândula 4dA). Na análise da expressão gênica utilizando macroarranjos, entre os clones com expressão aumentada na glândula 4dR, aproximadamente 51% eram de toxinas, indicando que a inibição da atividade simpática não interfere na transcrição das toxinas. A análise dos transcritos celulares confirmou que os processos de transcrição e tradução não são afetados pelo tratamento com reserpina. A análise da expressão por PCR quantitativo em tempo real, confirmou que as toxinas são expressas normalmente na glândula 4dR. Além disso, a análise da expressão de genes envolvidos nos processos de enovelamento protéico e secreção revelou que genes responsivos a estresse de retículo endoplasmático apresentam aumento na expressão na glândula 4dR. Também realizamos a análise transcriptômica por sequenciamento em larga escala (RNA-seq) da glândula 4d e da glândula 4dR. Entre os contigs identificados como toxinas não houve diferenças quantitativas nem qualitativas significativas entre as glândulas 4d e 4dR, confirmando que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β. A análise de enriquecimento de termos do gene ontology revelou predominância de processos biológicos relacionados a resposta a estresse de retículo endoplasmático entre os transcritos mais expressos na glândula 4dR e de processos envolvendo a formação de vesículas de transporte entre os transcritos menos expressos na glândula 4dR. Na análise dos transcritos exclusivos da glândula 4d e exclusivos da glândula 4dR identificamos diversas isoformas de small GTPases da família Ras (Rab) que possuem papel fundamental na regulação da formação de vesículas. Assim, nesse trabalho mostramos que o processo de transcrição de toxinas ocorre independentemente da ativação dos adrenoceptores α e β e que a ativação dos adrenoceptores parece ser necessária para que ocorra a formação de vesículas secretoras. Já a inibição do processo pela ação da reserpina possivelmente provoca a ativação da resposta UPR (unfolded protein response), o que pode estar associado com o acúmulo de proteínas no lúmen do retículo endoplasmático. / The venom gland of the Brazilian venomous snake Bothrops jararaca (Crotalinae, Viperidae) is an exocrine tissue related to the salivary gland. The venom gland has a central lumen where the venom is stored. When the venom is released, the production of new venom is triggered by the activation of noradrenaline on both α1- and β-adrenoceptors. But the genes involved and the regulation of venom production cycle are poorly known. When the Bothrops jararaca is treated with reserpine, a depletor of catecholamine, the venom production is inhibited. At present work we used combined methods of high throughput analysis of gene expression to identify cellular process controlled by the sympathetic system during the cycle of venom production in the venom glands of Bothrops jararaca. Was constructed a cDNA array with 4608 clones from a cDNA library of the venom glands of one male and one female of B.jararaca. In order to get a time series analysis adult males of B.jararaca were used. The venom gland was extracted at different time points of the venom production cycle (0, 1, 2, 4 and 15 days). The resulting profile of the gene expression of toxins and non-toxins during the cycle was shown to be similar, and the higher level of gene expression was found at the 2nd day of the venom production cycle. A differential gene expression analysis was performed also with venom glands of B.jararaca treated with reserpine. Although previous results reported that venom glands under effect of reserpine are not able to produce venom, we found that 51% of upregulated clones of the venom gland treated with reserpine (4dR) are toxins. Moreover, most of the non-toxins clones were involved with transcription and translation processes, showing that these processes are not affected by the inhibition of the sympathetic system. The analysis of gene expression by quantitative real-time PCR confirmed that in the venom gland treated with reserpine (4dR) the toxins are normally produced, and the genes responsive for unfolded protein response (UPR) are upregulated. We also performed the next generation sequencing to produce a transcriptomic profile (RNA-seq) of normal venom gland (4d) and venom gland treated with reserpine (4dR). The comparison between the transcripts of toxins found at 4d and 4dR transcriptomes revealed no qualitative or quantitative differences, confirming that the toxins transcription are independent of the activation of α1- and β-adrenoceptors. The enrichment analysis of Gene Ontology terms revealed that the unfolded protein response are activated at 4dR venom gland and the membrane trafficking are possibly inhibited. We also identify many isoforms of Ras family small GTPases (Rab proteins) that has a key role ate regulation of membrane trafficking. At present work we showed that the transcriptional control of the toxins in the venom gland are independent of the activation by α1- and β-adrenoceptors, however, the adrenoceptors seems to be necessary to activate the secretory pathway. The inhibition of the activation of α1- and β-adrenoceptor by reserpine seems to be recruiting an unfolded protein response, probably due to the accumulation of proteins at the lumen of the endoplasmic reticulum.

O corpo lúteo (CL) canino apresenta períodos regulares de formação, atividade e regressão, marcados por intensa remodelação tecidual, o que depende diretamente de aporte energético, em alguns casos mediado pela insulina. Além de seu papel metabólico, a insulina, através de diferentes genes, pode desempenhar um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções do CL de cadelas cíclicas. Nosso objetivo na primeira parte experimental foi mapear os genes diferencialmente expressos no CL, em diferentes estágios do diestro, diretamente relacionados à sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica. A via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica foi abordada. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Na segunda parte experimental, através de cultivo celular, quantificamos a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese após estímulo insulínico, e realizamos o bloqueio das vias phosphoinositide 3-kinase (PI3K), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e mitogen-activated protein kinase 1(MAP2K1) para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: insulin receptor substrate (IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) e suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), e dois genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) e hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A via secundária de captação de glicose mostrou que adenylyl cyclase-associated protein (CAP1), CRK proto-oncogene, adaptor protein (CRKII) apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de progesterona (P4), diferente de member of RAS oncogene family (RAP) e ras homolog family member Q (RHOQ) que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de estradiol (E2) no diestro. Nos experimentos em cultivo celular, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20, diferentemente do dia 40, no qual houve aumento de expressão no grupo tratado com insulina. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de expressão no dia 20 e 40. A produção de P4 apresentou diminuição com o bloqueio de PI3K, MAPK14 e MAP2K1, enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K e MAPK14, e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAP2K1. Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluímos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro. / The canine corpus luteum (CL) has regular periods of formation, activity and regression marked by intense tissue remodeling, which depends directly on energy supply in some cases mediated by insulin. In addition to its metabolic role, insulin, through different genes, may play a key role in the regulation of steroidogenesis, and consequently in the CL functions of cyclic bitches. Our objective in the first experimental part was to map the differentially expressed genes in CL, at different stages of the diestrus, directly related to insulin signaling and steroidogenesis in canine CL, characterizing their gene and protein expression. The secondary pathway of glucose uptake also resulting from insulin signaling was addressed. Non-pregnant dogs were submitted to ovariosalpingohisterectomy every 10 days between days 10 and 60 (n=5/group) post- ovulation. The collected CL was used for RNA sequencing (RNA-Seq), validation by real-time PCR and protein for Western blotting and immunofluorescence. In the second experimental part, through cell culture we identified different responses of luteal cells after insulin stimulation under the expression of differentially expressed steroidogenesis genes. We also performed phosphoinositide 3-kinase (PI3K), Mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and mitogen-activated protein kina 1 (MAP2K1) pathway blockade to measure steroids production (n = 4/group). Seven differentially expressed genes related to insulin signaling were identified: insulin receptor substrate IRS1), phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 3 (PI3KR3), phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit gamma (PI3KCG), mitogen-activated protein kinase 9 (MAPK9), mitogen-activated protein kinase 13 (MAPK13), mitogen-activated protein kinase 14 (MAPK14) and suppressor of cytokine signaling 1 (SOCS1), in addition to two genes, cytochrome P450 family 19 subfamily A member 1 (CYP19A1) and hydroxy-delta-5-steroid dehydrogenase, 3 beta (HSD3B), identified as being involved with steroidogenesis. The secondary glucose uptake pathway showed that adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP1) and CRK Proto-Oncogene, Adaptor Protein (CRKII) increased expression in the period of increased production of progesterone (P4). different than member Of RAS Oncogene Family (RAP) and ras homolog family member Q (RHOQ) showed less gene expression on days 40 p.o., coinciding with the increase of estradiol (E2). In the cell culture experiments under insulin stimulation, the expression of CYP19A1 did not present difference when the cells were coming from day 20, unlike day 40, in which there was increased expression in the group treated with insulin.. HSD3B expression increased on days 20 and 40. The production of P4 presented a decrease with PI3K, MAPK14 and MAP2K1, while that production of E2 decreased with PI3K and MAPK14 blockade, and did not alter with MAP2K1 blockade. Together, these data suggest that MAPK and PI3K can modulate steroidogenesis in the canine CL, probably via HSD3B and CYP19A1 expression. The activation of the CAP-CrKII-RHOQ-RAP pathway is not involved in this process. We conclude that insulin is able modulate steroidogenesis in canine CL and that hormonal response to insulin stimulus depends on the day of the diestrus.

Les anomalies du tractus rénal et les troubles du spectre autistique caractérisent le syndrome 19q12 causé par la délétion hétérozygote du gène TSHZ3. Pour identifier des programmes développementaux TSHZ3-dépendants, nous avons comparé le transcriptome (RNA-seq) d’uretères et de reins mutants Tshz3 (KO) et sauvage (WT) d’embryons de souris au stade E12,5. Nous avons identifié des gènes exprimés de façon différentielle connus pour être impliqués dans le développement de l'uretère et/ou des reins, dont 38 ont des orthologues humains associés à des maladies rénales. Corrélativement, les reins E12,5 KO présentent une arborisation anormale de l’uretère.Dans les reins adultes, TSHZ3 est exprimé dans les cellules endothéliales glomérulaires. L'analyse morphologique de reins Tshz3+/lacZ (HET) révèle une diminution de la densité des glomérules et de l'épaisseur de la membrane basale glomérulaire ainsi qu'un phénotype d'effacement des pieds des podocytes. L’analyse du sang et de l'urine de souris adultes HET a permis d’établir des profils spécifiquement associés au génotype HET. En particulier, le protéome urinaire a identifié 33 biomarqueurs qui pourraient constituer la signature d'un processus pathologique. Par ailleurs, l'analyse du transcriptome des reins HET adultes montre un enrichissement pour des voies liées à l'inflammation.Ces résultats confirment le rôle précoce de Tshz3 dans l'uretère ainsi qu'une fonction de Tshz3 dans les reins embryonnaires. La présence de défauts structurels et fonctionnels dans les reins hétérozygotes adultes Tshz3 renforce l'idée que les souris HET modélisent le syndrome TSHZ3 humain. / Renal tract defects and autism spectrum disorder represent the phenotypic core of the 19q12 syndrome caused by heterozygote deletion of the TSHZ3 gene. To identify TSHZ3-dependent developmental programs, we performed a transcriptome analysis (RNA-seq) on E12.5 Tshz3 mutants (KO) and wild type (WT) control mouse ureters and kidneys. This analysis identified differentially expressed genes known to be involved in ureter and/or kidney development, among which 38 have human orthologues associated to renal tract diseases. Correlatively, we found that E12.5 Tshz3 KO kidneys display an abnormal ureteric branching morphogenesis.In adult kidneys, we showed that TSHZ3 is expressed in glomerular endothelial cells. Histological and transmission electron microscopy analysis showed a decreased glomerular density and thickness of the glomerular basement membrane as well as a foot process effacement phenotype in Tshz3+/lacZ (HET) kidneys. To evaluate renal function, we analysed blood and urine samples from HET and WT adult mice. Both analyses generated profiles that specifically associated with HET genotype. In particular, the urine proteome identified 33 biomarkers that might constitute a signature for a pathological process in HET kidneys. Note that transcriptome analysis of adult HET kidneys showed enrichment for inflammation-related pathways.These results support an early role for Tshz3 in the ureter as well as an unanticipated function for Tshz3 in E12.5 embryonic kidneys. The presence of structural and functional defects in Tshz3 heterozygous adult kidneys reinforces the idea that HET mice model the human TSHZ3 disorder.

Com o desenvolvimento do sequenciamento em larga escala, novas tecnologias surgiram para auxiliar o estudo de sequências de ácidos nucleicos (DNA e cDNA); como consequência, o desenvolvimento de novas ferramentas para analisar o grande volume de dados gerados fez-se necessário. Entre essas novas tecnologias, uma, em particular, chamada Imunoprecipitação de Cromatina seguida de sequenciamento de DNA em larga escala ou CHIP-Seq, tem recebido muita atenção nos últimos anos. Esta tecnologia tornou-se um método usado amplamente para mapear sítios de ligação de proteínas de interesse no genoma. A análise de dados resultantes de experimentos de ChIP-Seq é desaadora porque o mapeamento das sequências no genoma apresenta diferentes formas de viés. Os métodos existentes usados para encontrar picos em dados de ChIP-Seq apresentam limitações relacionadas ao número de amostras de controle e tratamento usadas, e em relação à forma como essas amostras são combinadas. Nessa tese, mostramos que métodos baseados em testes estatísticos de hipótese tendem a encontrar um número muito maior de picos à medida que aumentamos o tamanho da amostra, o que os torna pouco conáveis para análise de um grande volume de dados. O presente estudo descreve um método estatístico Bayesiano, que utiliza meta-análise para encontrar sítios de ligação de proteínas de interesse no genoma resultante de experimentos de ChIPSeq. Esse métodos foi chamado Meta-Analysis Bayesian Approach ou MABayApp. Nós mostramos que o nosso método é robusto e pode ser utilizado com diferentes números de amostras de controle e tratamentos, assim como quando comparando amostras provenientes de diferentes tratamentos. / With the development of high-throughput sequencing, new technologies emerged for the study of nucleic acid sequences (DNA and cDNA) and as a consequence, the necessity for tools to analyse a great volume of data was made necessary. Among these new technologies, one in special Chromatin Immunoprecipitation followed by massive parallel DNA Sequencing, or ChIP-Seq, has been evidenced during the last years. This technology has become a widely used method to map locations of binding sites for a given protein in the genome. The analysis of data resulting from ChIP-Seq experiments is challenging since it can have dierent sources of bias during the sequencing and mapping of reads to the genome. Current methods used to nd peaks in this ChIP-Seq have limitations regarding the number of treatment and control samples used and on how these samples should be used together. In this thesis we show that since most of these methods are based on traditional statistical hypothesis tests, by increasing the sample size the number of peaks considered signicant changes considerably. This study describes a Bayesian statistical method using meta-analysis to discover binding sites of a protein of interest based on peaks of reads found in ChIP-Seq data. We call it Meta- Analysis Bayesian Approach or MABayApp. We show that our method is robust and can be used for dierent number of control and treatment samples, as well as when comparing samples under dierent treatments.