A tuberculose ainda é pontuada como uma doença de impacto mundial, sendo considerada desde 1993 um problema de saúde pública global. Uma das grandes preocupações é a contínua prevalência de cepas da Mycobacterium tuberculosis multidroga resistentes, especialmente o genótipo hipervirulento W-Beijing. Acredita-se que este genótipo apresenta alguma vantagem seletiva em relação a outros genótipos da M. tuberculosis, além de estar associado à falha terapêutica, tuberculose extrapulmonar, resistência à vacinação pela BCG e acentuada capacidade de disseminação. Estas cepas apresentam variável capacidade de sobrevivência dentro de macrófagos e do granuloma, modulando vias metabólicas específicas que culminam no escape do sistema imunológico e sucesso na infecção. Buscando entender esta vantagem seletiva e capacidade de persistência na infecção, este estudo teve como objetivo analisar e comparar o perfil transcriptômico de macrófagos infectados com as cepas da M. tuberculosis, W-Beijing 1471 e H37Rv. Os RNAs mensageiros dos macrófagos infectados foram sequenciados em plataforma HiScan Genome Analyzer Illumina. Foram gerados aproximadamente 30 milhões de sequências por amostra, em leituras single reads, com mais de 70% de sequências com valores de score Q de qualidade superior ou igual a 30. Foram mapeados e analisados 35.581 transcritos. Em média, 63% dos genes não apresentaram diferenças nos valores de expressões, 19% tiveram suas expressões reduzidas e 18% dos genes foram classificados como mais expressos, para todas as amostras de macrófagos sequenciadas. Após as análises terciárias e validação por PCR em tempo real, as amostras infectadas com a cepa W-Beijing 1471 apresentaram um aumento nas expressões de IFNs da classe I (p<0,001) e aumento exacerbado de TNF-alfa (p<0,001), comparativamente ao controle e as amostras infectadas com a cepa padrão H37Rv. Aditivamente foi observado um aumento nas expressões de duas quinases, RIPK1 e RIPK3 e de moléculas envolvidas na indução e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS), que em infecções por bactérias intracelulares, estão correlacionadas com a morte de macrófagos por necroptose. A cepa hipervirulenta da M. tuberculosis, W-Beijing 1471, apresentou reduzida persistência intramacrofágica e induziu morte precoce dos macrófagos ao quinto dia de infecção. A morte observada nos macrófagos foi associada a ativação de IFNs da classe I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 e ROS, indicando necroptose. Ainda, foi observado um aumento na expressão do receptor TLR3 nas amostras infectadas com a cepa W-Beijing, comparativamente as amostras controles e infectadas com a cepa H37Rv. É provável que a ativação inicial dos IFNs da classe I tenha ocorrido via TLR3 através do reconhecimento de dsRNAs da M. tuberculosis. / Since 1993 the tuberculosis is considered as a disease of worldwide impact and a problem of public health. A major concern is the continuing prevalence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains, especially the hypervirulent W - Beijing genotype. It is believed that this genotype has a selective advantage over other genotypes of M. tuberculosis and has being associated with treatment failure, extrapulmonary tuberculosis, resistance to BCG vaccination and marked ability to spread. These strains have varying ability to survive within macrophages and granuloma, modulating specific metabolic pathways that culminate in the escape of the immune system response. To understand this selective advantage and ability to persist in infection, this study aimed to analyze and compare the transcriptomic profile of macrophages infected with strains of M. tuberculosis W - Beijing 1471 and H37Rv. The mRNAs of infected macrophages were sequenced in HiScan Illumina Genome Analyzer platform. Were generated approximately 30 million sequences per sample, in single-reads readings. More than 70 % of sequences had values of Q score superior or equal to 30. Were mapped and analyzed 35,581 transcripts. On average, 63% of the genes showed no differences in the expressions, 19% were downregulated and 18% were upregulated, for all samples sequenced macrophages. After tertiary analysis and validation by real-time PCR, samples infected with the strain W -Beijing in 1471 showed an increase in expression of IFN class I (p <0.001) and exacerbated increase of TNF- alpha (p < 0.001) when compared to the control samples and those infected with standard strain H37Rv. Additively was observed an increase in expressions of the two kinases RIPK1 and RIPK3 and molecules involved in the induction and control of reactive oxygen species (ROS). In infections by intracellular bacteria, activation of RIPK1, RIPK3, ROS and TNF-&#945;, are correlated with death of macrophages by necroptosis. The hypervirulent M. tuberculosis W - Beijing 1471 strain showed reduced persistence inside macrophage and induced early death of macrophages in the fifth day of infection. The death observed in macrophages was associated with activation of IFNs class I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 and ROS, indicating necroptosis. Also was observed an increase in the expression of TLR3 receptor in infected samples with W-Beijing 1471 strain compared to controls and those infected with H37Rv strain. Probably the initial activation of IFNs class I occurred by TLR3 through the recognition of M. tuberculosis dsRNAs.

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico que infecta preferencialmente tecidos queratinizados, e é o agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de dermatofitoses humanas. Recentemente, este fungo tornou-se a causa de infecções profundas e generalizadas em pacientes imunocomprometidos. As estratégias terapêuticas para controlar esse tipo de infecção apresentam várias limitações, como o aparecimento de linhagens resistentes e o número restrito de alvos celulares disponíveis. Novas estratégias terapêuticas são necessárias, sendo o foco de muitas investigações. Acriflavina é uma droga citotóxica com atividade antifúngica envolvida na inibição da topoisomerase. Embora seja um composto intercalante de DNA, já foi relatada a super expressão de genes que codificam enzimas envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e no transporte de ferro em resposta a esta droga, sugerindo um amplo espectro de efeitos celulares. A fim de melhor compreender seus efeitos moleculares, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transcriptoma de T. rubrum em resposta a acriflavina. Os perfis transcricionais em resposta a esta droga foram analisados utilizando a metodologia de RNA-seq empregando o sequenciamento em larga escala SOLiD System. Foram comparadas quatro bibliotecas sendo uma o cultivo de T. rubrum em meio Sabouraud e três períodos de exposição à droga: 3 horas, 12 horas e 24 horas. Foram geradas aproximadamente 200 milhões de reads, as quais foram filtradas e alinhadas no genoma de T. rubrum disponível no Dermatophyte Comparative Database Broad Institute utilizando os algoritmos Bowtie e Tophat. As reads alinhadas foram processadas utilizando os algoritmos Cufflinks e Cuffdiff para estimar a abundancia dos transcritos e testar os genes diferencialmente expressos entre o controle e as condições de exposição à droga. Foram identificados 3.153 genes diferencialmente expressos. Após o estabelecimento de critérios mais estringentes, foram selecionados 490 genes diferencialmente expressos em resposta à droga. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares como reações de oxidação e redução, transporte transmembrana, transporte de íons e metais e a patogenicidade. Os genes envolvidos com patogenicidade foram reprimidos, sugerindo que a droga interfira com processos importantes para instalação e manutenção da infecção no hospedeiro. Outros fatores de virulência como genes envolvidos no ciclo do glioxilato, também foram reprimidos pela droga. Além disso, genes da via de biossíntese do ergosterol foram reprimidos pela droga, o que constitui um provável novo mecanismo de ação de acriflavina. Os resultados obtidos nesta análise em larga escala contribuem com a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na adaptação ao estresse em dermatófitos e podem auxiliar o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Além disso, estes resultados contribuem com a anotação do genoma e transcritoma de T. rubrum e outros dermatófitos. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that infects keratinized tissues and is the most common etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. Recently, it has become the cause of deep and widespread infections in immunocompromised patients. Therapeutic strategies to control these infections have several limitations, such as the appearence of resistant strains and the limited number of antifungal cellular targets. New therapeutic strategies are necessary, being the focus of many investigations. Acriflavine is a cytotoxic drug with antifungal activity involved in topoisomerase inhibition. Although it presents DNA intercalating properties, it has already been reported the over-expression of genes coding for enzymes involved in mitochondrial respiratory-electron transport and in iron transport in response to this drug, suggesting a broad spectra of cellular effects. In order to better understand its molecular effects we evaluated T. rubrum transcriptome in response to acriflavine in a time-course assay using the next generation sequencing technology SOLiD System. RNA-seq was performed comparing T. rubrum growth in Sabouraud medium as the control and the three periods of drug exposure, 3h, 12h, and 24h. RNA-seq generated approximately 200 million short reads that were mapped to the Broad Institutes Dermatophyte Comparative Database using Bowtie and TopHat algoritms. Differential gene expression analysis was performed using Cufflinks and Cuffdiff. It was identified 3,153 differentially expressed genes. A more stringent cut-off threshold was established and this analysis revealed a subset of 490 genes modulated in response to the stress caused by exposure of T. rubrum to acriflavine. These genes are involved in various cellular processes such as oxidation-reduction reactions, transmembrane transport, metal ion binding, and pathogenicity. The genes involved in pathogenicity were down-regulated, suggesting that this drug interferes with virulence factors that allow the development of infection and persistence of the dermatophyte in the host. Other virulence factors such as genes involved in the glyoxylate cycle were also repressed by the drug. Moreover, genes involved in ergosterol biosynthesis pathway were down-regulated by the drug and may constitute a new mechanism of action of acriflavine. The results obtained in this large scale analysis provide insights into the molecular mechanisms underlying the responses of T. rubrum to stress conditions and may aid the development of new antifungal drugs. Furthermore, these results contribute to improve gene annotation and open reading frame prediction for T. rubrum and other dermatophyte genomes and transcriptomes.

The Nelore breed represents the vast majority of Brazilian Zebuine cattle (Bos taurus indicus). The great adaptability of the Nelore breed to Brazilian tropical climate, however, is not associated with meat tenderness (MT). It is known that MT is influenced by several environmental factors, but also genetic composition. In the first chapter, we report a genome-wide analysis of copy number variation (CNV) inferred from Illumina® Bovine High Density SNP-chip data for a Nelore population of 723 males including 30 sires. We detected >2600 CNV regions (CNVRs) representing &asymp;6.5% of the Bos taurus genome. The CNVR size was 65 kb on average, ranging from 5 kb to 4.3 Mb. A total of 1155 CNVRs (43.6%) overlapped 2750 genes. They are enriched for important functions such as immune response, olfactory reception and processes involving guanosine triphosphate (GTP). The GTP processes have known influence in skeletal muscle physiology and morphology. Quantitative trait loci for MT, partly specific for Nelore, overlapped a substantial fraction of CNVRs and two CNVRs were found proximal to glutathione metabolism genes that are associated with MT as well. Comparing our results with previous studies revealed an overlap in &asymp;1400 CNVRs (>50%). We selected 9 CNVRs that overlapped regions associated with MT and we validated them in all 30 sires by qPCR. There was identified many genomic regions of structural variation in Nelore with important implications on the MT phenotype. In the second chapter, a total of 34 animals of the population were subjected to transcriptome analysis and meat tenderness (MT) phenotyping. We identified 170 CNV fragments (CNVFs) residing in 20 CNVRs, which occurred in different frequencies between animals with tougher and softer meat genetic potential. A considerable fraction of the identified CNVFs affected gene expression of the MT genes, which play important roles in glycogen metabolism, connective tissue turnover, membrane transporters and glutathione pathways. We also detected that several CNVRs substantially influenced the expression of overlapped and nearby genes, where the increase or decrease of copy number correlated well with the change in gene expression. Among them are two CNVRs at chromosomes 12 and 23, which are in the vicinity of previously described QTLs for MT in Nelore breed. Several CNVFs, which are more frequent in animals with genetic potential for softer or tougher MT, showed significant differences in gene expression. Those regions are linked to important biological functions with highly relevant influences on MT and skeletal muscle physiology. / A raça Nelore é predominante no rebanho zebuíno brasileiro (Bos taurus indicus). A grande adaptabilidade da raça Nelore ao clima tropical brasileiro, no entanto, não está associada à maciez de carne (MT). Sabe-se que MT é influenciada por vários fatores ambientais e pela composição genética. Foi realizada uma análise de todo o genoma para inferir Variação no Número de Cópias de Segmentos Genômicos (Copy Number Variation - CNV) a partir de dados oriundos de chip de SNP (Illumina® Bovine High Density), para uma população de 723 machos Nelore, incluindo 30 ancentrais da população. Foram detectadas >2600 regiões de CNV (CNVRs) representando &asymp;6.5% do genoma bovino. O tamanho médio do CNVR foi de 65 kb, variando de 5 kb até 43 Mb. Um total de 1155 CNVRs (43.6%) obtiveram sobreposição com 2750 genes. Estes genes foram enriquecidos para as funções importantes, tais como resposta imunológica, recepção olfativa e processos que envolvem o trifosfato de guanosina (GTP). As vias metabólicas do GTP conhecidamente influenciam a fisiologia e a morfologia do músculo esquelético. Loci de características quantitativas (QTLs) para MT, alguns específicos para Nelore, sobrepuseram uma fração substancial das CNVRs encontradas. Dois CNVRs foram encontrados em região proximal à genes do metabolismo da glutationa os quais também são associados com MT. Comparando os resultados com estudos anteriores &asymp;1400 CNVRs (>50%) foram sobrepostos. Nove CNVRs em regiões associadas com MT foram validados nos 30 ancentrais por qPCR. Em conclusão, foram identificadas regiões genômicas de variação estrutural no Nelore, com potenciais implicações sobre o fenótipo MT. No segundo capítulo, um total de 34 animais da população foi submetido à análise do transcriptoma e análise de potencial genético para MT. Foram identificados 170 fragmentos de CNV (CNVFs) mapeados em 20 CNVRs, os quais mostraram frequências significativamente diferentes entre animais com potencial genético para carne mais dura ou mais macia. Uma fração considerável dos CNVFs identificados afetaram a expressão gênica de genes MT (anteriormente descritos como associados à MT ou fisiologia do músculo esquelético), os quais desempenham um papel importante no metabolismo de glicogênio, volume do tecido conjuntivo, transportadores de membrana e vias metabólicas da glutationa. Um número considerável de CNVRs foram associados à expressão de genes sobrepostos e nas proximidades, onde o aumento ou diminuição do número de cópias foi associado com a mudança na expressão gênica. Dois CNVRs associados foram mapeados para os cromossomo 12 e 23, estando próximos a QTLs anteriormente descritos para MT na raça Nelore. Vários CNVFs, entre animais com potencial genético para carne mais macia ou dura, mostraram diferenças significativas na expressão gênica. Essas regiões estão ligadas a importantes funções biológicas com influências altamente relevantes para MT e para a fisiologia do músculo esquelético.

A soja é uma cultura de grande importância, movimentando aproximadamente 230 bilhões de dólares em todo o mundo, com produção anual estimada de 267,61 milhões de toneladas. Os percevejos sugadores de sementes são considerados uma das pragas de maior importância para a cultura da soja, sendo as espécies Euschistus heros (E.), Piezodorus guildinii (West.) e Nezara viridula (L.) as mais abundantes no Brasil. O ataque por percevejos causa diversos problemas como o atraso da maturação fisiológica, retenção foliar, perdas no rendimento e diminuição da qualidade e potencial germinativo das sementes. Esses insetos são responsáveis ainda pela transmissão de patógenos, e podem causar alterações na composição de óleos, proteínas e ácidos graxos das sementes. A obtenção de cultivares com resistência genética é indispensável, a fim de minimizar a necessidade de utilização de defensivos agrícolas. Dessa forma, este trabalho identificou genes possivelmente associados à resposta de resistência pela comparação da expressão gênica diferencial entre genótipos de soja resistente (IAC-100) e suscetível (CD-215), a partir da metodologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq). As vagens foram submetidas a dois tratamentos por 24 horas: infestação por percevejos Piezodorus guildinii (West.) e não infestação. Foi utilizado o alinhador STAR contra o genoma hardmasked do phytozome e o pacote cufflinks.Com os resultados das análises dos genes diferencialmente expressos e uma posterior filtragem foi possível identificar 128 genes candidatos, dentre estes: genes relacionados com defesa, metabolismo secundário de produção de terpenos e proteínas LRR de sinalização celular. / Soybeans are an important crop with a world-wide annual production of 267.61 tons, worth 230 billion dollars. Stink bugs are a major soybean pest. The most abundant species in Brazil are Euschistus heros (E.), Piezodorus guildinii (West.) and Nezara viridula (L.). Stink-bug attack causes several problems, including delayed physiological maturity, leaf retention, yield losses, decreased seed quality, and decreased germination potential. The bugs are responsible for transmitting pathogens, and they can cause changes in the oil, protein, and fatty acids composition in the seed. Producing genetically resistant cultivars is critical in order to minimize the need for agricultural pesticides. Our work aims to identify genes associated with the stink-bug resistance response in soybean by comparing differential gene expression between resistant (IAC-100) and susceptible (CD-215) genotypes by analyzing RNA sequencing (RNA-Seq) data. Data was from soybean pods that were subjected to two treatments for 24 hours: infestation by the stink bug Piezodorus guildinii (West.), and non-infestation. STAR aligner was used against the hard-masked genome sequence from Phytozome, followed by analysis using the Cufflinks package. Analysis of the results of the differentially expressed genes and a subsequent filtering identified 128 candidate defense-associated genes, among them, defense-related such as LRR-RLKs and production of secondary metabolites like terpenes.

Haemophilus influenzae (Hi) é uma bactéria Gram-negativa comensal da nasofaringe e um patógeno oportunista cujo único hospedeiro natural conhecido é o ser humano. As cepas de Hi que possuem cápsula de polissacarídeo estão associadas a doenças invasivas mais graves, sendo as de sorotipo b (Hib) as principais causadoras da meningite bacteriana em populações não vacinadas. Para produzir a vacina contra Hib, o polissacarídeo purificado desta bactéria é conjugado quimicamente ao toxóide tetânico. Industrialmente, a produção do polissacarídeo é realizada cultivando esse micro-organismo em biorreatores, entretanto o rendimento em polissacarídeo é baixo, mesmo com fornecimento de nutrientes, controle de pH e outros ajustes das condições no decorrer do cultivo. O estudo dos diferentes perfis fisiológicos da população bacteriana de Hib no decorrer do cultivo através da transcritômica traz a possibilidade de aprofundar o conhecimento sobre o metabolismo desse micro- organismo. As taxas de transcrição dos genes expressos em diferentes momentos considerados como pontos metabolicamente significativos do cultivo de Hib linhagem GB 3291 em batelada alimentada conduzido em Biorreator de 10 L, com aeração submersa e controles de pH (7,0) e temperatura (30° C) foram obtidas através de sequenciamento de RNA paralelo massivo (RNA-seq). A análise de co-expressão dos genes foi realizada com WGCNA, em que oito módulos de genes co-expressos foram identificados, quatro dos quais apresentaram correlação alta com dados fenotípicos dos cultivos, inclusive produtividade de acetato e de polissacarídeo. Análise de enriquecimento funcional identificou vias metabólicas associadas a ribossomo, síntese de parede celular, transportadores e consumo de carbono. A análise de expressão diferencial permitiu observar o comportamento desta bactéria durante o cultivo. Através da análise das taxas de transcrição dos genes foi possível identificar as principais vias de síntese de acetato e de polissacarídeo capsular, sendo esta última feita principalmente através da via de pentose fosfato, em detrimento da via de interconversão pentose-glucuronato. Nossos dados mostram que as diferentes etapas do cultivo de Hib leva à ação conjunta de vários grupos de genes, com destaque àqueles ligados às funções celulares básicas, como a síntese de proteínas e de parede celular, o transporte e a síntese de aminoácidos. Esses resultados contribuem para o entendimento dos processos bioquímicos e celulares que ocorrem durante o processo de cultivo de Hib, possibilitando que sejam feitas sugestões de modificações genéticas em Hib e alteração no processo de cultivo com propósito de diminuir produção de acetato e aumentar produção do polissacarídeo. / Haemophilus influenzae (Hi) is a nasopharynx commensal Gram-negative bacterium and an opportunistic pathogen whose only known natural host is human being. Hi strains with polysaccharide capsule are related to more severe invasive diseases, wherein type b capsule (Hib) strains are the main cause of bacterial meningitis in unvaccinated population. To produce Hib vaccine, purified polysaccharide of this bacterium is chemically conjugated to tetanus toxoid protein. Industrially, polysaccharide production is performed by cultivating this micro-organism in bioreactors; however, the yield of polysaccharide is low, even with supply of nutrients, pH control and further adjustments of the fermentation conditions during cultivation. The study of different physiological profiles of Hib bacterial population during cultivation by transcriptomics brings the possibility to deepen the knowledge about the metabolism of this micro-organism. Transcription of genes expressed at different times considered metabolically significant points of Hib strain GB 3291 grown in fed-batch conducted in a 10 L bioreactor with submerged aeration and pH (7.0) and temperature (30 ° C) control rates were obtained through massive parallel RNA sequencing (RNA-seq). Gene co-expression analysis was performed with WGCNA, in which eight modules of co-expressed genes were identified, four of which showed high correlation with cultivation data traits, including acetate and polysaccharide productivity. Enrichment analysis identified pathways related to ribosome, cell wall synthesis, transports and carbon consumption. Differential expression analysis allowed to observe this bacteria behaviour during cultivation. Through transcription rate analysis, it was possible to identify the main pathways for acetate and polysaccharide synthesis, which is through pentose phosphate pathway instead of glucoronate-pentose pathway. Our data show that different stages in Hib cultivation leads to joint action of several gene groups, highlighting genes related to basic cellular roles, like protein and cell wall synthesis, transport and aminoacid synthesis. These results contribute to the understanding of biochemical and cellular processes that ocurr during Hib cultivation process, allowing suggestions to be made to modify Hib gene circuitry and to change cultivation process in order to decrease acetate production and to decrease acetate production and increase polysaccharide production.

RNA helicases are found in all kingdoms of life, functioning in all aspects of RNA biology mainly through modulating structures of RNA and ribonucleoprotein (RNP) complex. RNA structures have fundamental impacts on steps in gene expression, including transcription, pre-mRNA processing, and translation. However, the precise roles and regulatory mechanisms of RNA structures in co- and post-transcriptional processes remain elusive. By probing genome-wide RNA structures in vivo, a recent study suggested that ATP-dependent factors, such as RNA helicases, maintain the actively unfolded state of RNAs. Among all RNA helicases, DEAD-box proteins form the largest family in eukaryotes, and have been shown to remodel RNA/RNP structures both in vitro and in vivo. Nevertheless, for the majority of these enzymes, it is largely unclear what RNAs are targeted and where they modulate RNA/RNP structures to regulate co-transcriptional processes. To fill the gap, my research focused on identification of the RNAs and structures targeted by the DEAD-box protein Dbp2 in S. cerevisiae to uncover the cellular processes that Dbp2 is involved in.<br><div><div>My studies revealed a role of Dbp2 in transcriptional termination. Dbp2 binds to ~34% of yeast mRNAs and all snoRNAs, and loss of DBP2 leads to a termination defect as evidenced by RNA polymerase II (RNAPII) accumulation at 3’ ends of these genes. In addition, the binding pattern of Dbp2 in mRNAs is highly similar to Nrd1 and Nab3 in the Nrd1-Nab3-Sen1 (NNS) termination complex, and deletion of DBP2 leads to reduced recruitment of Nrd1 to its target genomic loci. In Dbp2 and NNS targeted 3’ UTRs, RNA structural changes resulted from DBP2 deletion also overlap polyadenylation elements and correlate with inefficient termination, and loss of stable structure in the 3’ UTR bypasses the requirement for Dbp2. These findings lead to a model that Dbp2 promotes efficient termination of transcription through RNA structure remodeling.</div><div>Interestingly, my research also revealed the requirement of DBP2 for efficient splicing, as loss of DBP2 leads to accumulation of unspliced pre-mRNAs. Moreover, this function is dependent on the helicase activity of Dbp2. Further studies are needed to characterize the molecular mechanism of how Dbp2 facilitates splicing in cells. Overall, my research demonstrated that DEAD-box RNA helicases remodel mRNA structure in vivo and that structural alteration can be essential for proper gene expression.</div></div>

Em eucariotos, o DNA é organizado juntamente com histonas em um complexo nucleoproteico conhecido como cromatina, cuja unidade fundamental corresponde aos nucleossomos. A cromatina apresenta-se de duas maneiras: eucromatina, região estruturalmente menos condensada e, portanto, mais facilmente transcrita, e heterocromatina, região muito condensada e transcricionalmente silenciosa. Na forma de eucromatina, o acesso dos fatores de transcrição a regiões de DNA livres de nucleossomos é facilitado, enquanto que na forma de heterocromatina os fatores de transcrição não conseguem acessar o DNA para ativar ou reprimir a expressão gênica inferindo, assim, que o grau de compactação da cromatina interfere na regulação da expressão gênica e que o nucleossomo atua como silenciador gênico. Neste contexto, os objetivos foram identificar, mapear e caracterizar regiões em eucromatina na musculatura esquelética de bovinos da raça Nelore. As análises foram realizadas em relação ao músculo Longissimus dorsi pela técnica Assay for Transposase-Accessible Chromatin (ATAC-Seq), capaz de isolar regiões livres de nucleossomos a partir do mecanismo enzimático de transposição. A fim de otimizar o protocolo dessa metodologia para tecido muscular, foram testadas concentrações de 50 mil, 75 mil e 100 mil núcleos tratados com transposase. Destes, foram encontrados 6.811, 11.121 e 11.473 picos de eucromatina, respectivamente, e 6.212 regiões de cromatina aberta foram coincidentes nas três amostras. A associação entre regiões eucromáticas, expressão gênica e gordura intrasmuscular foi confirmada a partir da análise de sobreposição com transcriptional start sites (TSS), genes expressos em músculo esquelético, genes diferencialmente expressos (GDE) para gordura intramuscular e regiões de expression quantitative trait loci (eQTL) de tecido muscular reforçando, assim, o potencial regulatório das regiões de eucromatina. / In eukaryotes, DNA is organized along with histones in nucleoproteins complexes known as chromatin, which has nucleosomes as their fundamental unit. Chromatin exists in two forms: euchromatin, corresponding to a lightly condensed structure and an easily transcribed region, and heterochromatin, a highly condensed and transcriptionally silent region. In euchromatin form, transcription factors have free access to nucleosome-depleted DNA regions, while in heterochromatin the transcription factors can not access the DNA for activate or repress genic expression, which suggests that the chromatin compaction degree interferes with regulation of gene expression and that nucleosomes act as gene silencer. In this context, the aims of the present project were to identify, map and characterize euchromatin regions in the skeletal musculature of Nellore cattle. Analyzes were performed considering the muscle Longissimus dorsi using Assay for Transposase-Accessible Chromatin technique (ATAC-Seq), which isolates nucleosome-depleted regions throught transposition enzymatic mechanism. Differente transposase-treated nuclei concentrations were tested: 50 thousand, 75 thousand and 100 thousand. From these, 6.811, 11.121, and 11.473 euchromatin peaks were found, respectively, and 6.212 open chromatin regions were coincident among them. The association between euchromatic regions, gene expression and intrasmuscular fat was confirmed from the overlap analysis with transcriptional start sites (TSS), genes expressed in skeletal muscle, differentially expressed genes (GDE) for intramuscular fat and regions of expression quantitative trait loci (eQTL) of muscle tissue, reinforcing the regulatory potential of the euchromatin regions.

A proteobactéria Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista em humanos, sendo associado a queimaduras e infecções pulmonares crônicas em pacientes com fibrose cística. Essas infecções são difíceis de erradicar devido à resistência intrínseca de P. aeruginosa a antibióticos e à formação de biofilmes. Essa bactéria é altamente capaz de adaptar ao ambiente, tem um metabolismo versátil e pode direcionar a expressão de genes por vários fatores sigma alternativos. Estes são subunidades para transcrição de conjuntos específicos de genes em bactérias e interagem com o cerne da RNA polimerase, levando ao reconhecimento do promotor e início da transcrição. Os fatores sigma alternativos permitem que bactérias redirecionem a sua expressão genética. Um grupo de fatores sigma alternativos é o grupo dos fatores sigma de função extracitoplasmática (ECF) que são envolvidos principalmente em funções do envelope celular. Esse trabalho teve como objetivo caracterizar dois fatores sigma ECF de função desconhecida, PA14_21550 e PA14_46810. A linhagem mutante &#916;21550 foi analisada quanto a sua sobrevivência a diferentes estresses, observando-se que é mais resistente ao choque de 45°C que a linhagem selvagem. Esse fator sigma não é essencial para crescimento da bactéria em meio LB e meio mínimo M63 acrescido de glicose ou succinato. Além disso, observou-se que a superexpressão desse fator sigma aumenta a expressão da proteína hipotética PA14_30100, usando-se uma abordagem proteômica. O mutante de transposon para o fator sigma PA14_46810 apresenta melhor crescimento que a bactéria selvagem em meio M63 acrescido de glicose. Essa linhagem mostrou mesmo fenótipo para biofilme e formação de exopolissacarídeo que a bactéria selvagem. Ademais, foi realizada análise de transcritoma por RNA-Seq com a superexpressão do fator sigma PA14_46810 na linhagem selvagem. Na linhagem de superexpressão Observou-se que ocorre indução de genes envolvidos com a desnitrificação, transporte de moléculas e metabolismo de uma maneira geral, em relação à linhagem controle. Por outro lado, o excesso de PA14_46810 reprime principalmente genes envolvidos com a tradução de proteínas e síntese de espermidina. Este trabalho, portanto, trouxe novas informações sobre as funções de diferentes fatores sigma ECF de P. aeruginosa, contribuindo assim para um maior entendimento da fisiologia desta bactéria e sua adaptação a diferentes condições. / The proteobacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen in humans, and it is associated to chronic pulmonary infections in patients with cystic fibrosis and burn wounds. These infections are difficult to eradicate due to P. aeruginosa intrinsic resistance to antibiotics and formation of biofilms, which allow the bacteria to adhere to biotic and abiotic surfaces. This bacterium is highly adaptaptable to the environment has a versatile metabolism and can direct the expression of genes by several alternative sigma factors. The sigma factors bind to the RNA polymerase core, providing recognition to promoter and transcription initiation. Therefore, the alternative sigma factors can redirect bacterial genetic expression by recognizing specific promoters. One subfamily of alternative sigma factors is the extracytoplasmic function (ECF) sigma factors, involved mostly in cell envelope functions. The aim of this work was characterize two ECF sigma factors with unknown function in P. aeruginosa, PA14_21550 and PA14_46810. The strain &#916;21550 was analyzed for its survival in different stress conditions and it is more resistant in heat shock conditions at 45°C than the wild type strain. It was also observed that PA14_21550 sigma factor is not essential for bacterial growth in LB and M63 minimal medium added with glucose or succinate as the carbon source. Furthermore, overexpression of this sigma factor increases the expression of hypothetical protein PA14_30100, as verified by a proteomic approach. A strain insertionally inactivated in the PA14_46810 gene has better growth than the wild type strain in M63 added with glucose and the same phenotype regarding to biofilm formation and exopolysaccharide production as the wild type strain. Moreover, transcriptome analysis was carried out by RNA-Seq with overexpression of the PA14_46810 sigma factor in the wild type strain. Induction of genes involved in denitrification, transport of molecules and energetic metabolism in relation to the control strain was observed. On the other hand, excess of PA14_46810 represses genes involved in protein translation and spermidine synthesis. This work, therefore, brought new information about the functions of two ECF sigma of P. aeruginosa, thus contributing to a greater understanding of the physiology of this bacterium and its adaptation to different conditions.

As leishmanioses são um conjunto de doenças causadas pela infecção com protozoários do gênero Leishmania. No Brasil, o parasita L. infantum provoca a manifestação de uma doença sistêmica e crônica, conhecida como leishmaniose visceral (VL), que, quando não tratada, pode levar o indivíduo à óbito. A gravidade da leishmaniose visceral vem sendo associada ao aumento do nível sistêmico de IL- 6 em pacientes sintomáticos. Ainda não está claro como o aumento dessa citocina coordena a progressão da doença. Nós demonstramos durante a infecção por L. infantum experimental há produção dessa citocina nos órgãos alvos. Em decorrência dessa via, animais deficientes para IL-6 (IL-6-/-) são suscetíveis a infecção por apresentar maior número de parasitos nos órgãos alvo e por desenvolverem uma fraca resposta inflamatória em função da diminuição do infiltrado inflamatório. Como consequência, há o aumento de CXCL2 que medeia o recrutamento de neutrófilos no baço. Apesar de aumentada em animais IL-6-/- os neutrófilos apresentam um estado menos ativado. A produção dos principais mediadores de morte dos parasitos, como espécies reativas de oxigênio (ROS) e o óxido nítrico (NO), estão comprometidas e favorecem a disseminação do parasito em animais IL-6-/-. Por outro lado, a Il-6 não interfere na produção de citocinas pró-inflamatórias e na proliferação de linfócitos Th1, atuando somente em linfócitos Th17 no início da infecção, sugerindo que o controle da resposta inflamatória é dependente de mecanismos inatos. Em humanos, identificamos dois genes modulados pela via de sinalização da IL-6. Os genes Hsbp1 e AR estão up-regulados em pacientes com a doença ativa e são genes associados com a migração e a produção de neutrófilos na medula óssea, possivelmente envolvidos com a neutropenia em pacientes com LV. Juntos, os dados mostram que a via de sinalização da IL-6 tem papel importante na modulação da resposta imune de neutrófilos, e em promover proteção durante a LV. / Leishmaniasis is a group of diseases caused by infection with protozoa of the genus Leishmania. In Brazil, the parasite L. infantum causes the manifestation of a systemic and chronic disease, known as visceral leishmaniasis (VL), which, when left untreated, can lead to death. The severity of visceral leishmaniasis has been associated with an increase in the systemic level of IL-6 in symptomatic patients. It is not yet clear how the increase in this cytokine coordinates the progression of the disease. We demonstrated during the infection by experimental L. infantum there is production of this cytokine in the target organs. As a result of this pathway, IL-6 ( IL- 6-/-) deficient animals are susceptible to infection because they present a higher number of parasites in the target organs and they develop a poor inflammatory response due to the decrease of the inflammatory infiltrate. As a consequence, there is an increase in CXCL2 that mediates the recruitment of neutrophils in the spleen. Although increased in IL-6-/- animals the neutrophils have a less activated state. The production of the main mediators of parasite death, such as reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO), are compromised and favor the spread of the parasite in IL-6-/- animals. On the other hand, IL-6 does not interfere in the production of proInflammatory cytokines and Th1 lymphocyte proliferation, acting only on Th17 lymphocytes at the beginning of the infection, suggesting that the control of the inflammatory response is dependent on innate mechanisms. In humans, we identified two genes modulated by the IL-6 signaling pathway. The Hsbp1 and AR genes are up-regulated in patients with the active disease and are genes associated with the migration and production of neutrophils in the bone marrow, possibly involved with neutropenia in patients with VL. Together, the data show that the IL-6 signaling pathway plays an important role in modulating the neutrophil immune response, and in promoting protection during LV.

A melatonina é um antioxidante muito eficaz e protege as células contra o estresse oxidativo causado pelas espécies reativas, e indiretamente, modula a expressão de genes associados ao ciclo celular, metabolismo oxidativo e apoptose celular. Deste modo, a suplementação da melatonina ao meio de maturação in vitro, a torna uma alternativa para promover melhorias na viabilidade das células germinativas e embrionárias. O estudo 1 avaliou o efeito da adição de melatonina ao meio de maturação por meio da maturação nuclear (progressão meiótica) e citoplasmática (migração de grânulos corticais) e dos níveis de ROS em oócitos suínos maturados in vitro. A suplementação do meio de maturação com melatonina estimulou a progressão da meiose, a migração de grânulos corticais e reduziu os níveis intracelulares de ROS nos oócitos. O estudo 2 avaliou o efeito da melatonina na expressão de genes antioxidantes (Catalase, SOD1, SOD2 e GPX) envolvidos na proteção celular de oócitos e células do cumulus. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou positivamente a expressão dos genes antioxidantes nos oócitos e células do cumulus. O estudo 3 avaliou o efeito da melatonina nos processos biológicos por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, em células do cumulus oriundas de oócitos suínos maturados in vitro. A partir da análise de expressão diferencial foi possível identificar que a adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 80 genes associados a nove processos biológicos (ciclo celular; proteólise; organização de citoesqueleto; via energética; adesão e transporte celular; via de sinalização; fator de transcrição; metabolismo oxidativo e apoptose; e componente celular). A suplementação do meio de maturação com melatonina potencialmente influencia a viabilidade e o funcionamento celular, uma vez que modulou a expressão de genes associados à processos fisiológicos essenciais, tais como: divisão celular, metabolismo energético e oxidativo, vias de sinalização e apoptose. O estudo 4, avaliou o efeito da melatonina sobre os genes associados à viabilidade oocitária e o subsequente desenvolvimento embrionário por meio do perfil de trascriptomas, via RNA-Seq, de células do cumulus oriundas de oócitos suínos. A adição da melatonina ao meio de maturação influenciou 59 genes associados a nove funções biológicas (expansão do cumulus, comunicação em COCs, maturação nuclear, maturação citoplasmática, reparo e integridade do DNA, viabilidade oocitária, esteroidogênese, fertilização e embriogênese). Em conclusão, a suplementação do meio de maturação com melatonina influencia positivamente a maturação oócitária, reduz os níveis intracelulares de ROS, aumenta a expressão de genes antioxidantes, em adição, interfere no transcriptoma de um número expressivo de genes associados à aquisição da competência oócitária, da viabilidade embrionária e desenvolvimento subsequente. / Melatonin is a very effective antioxidant and protects cells against oxidative stress caused by reactive species, and indirectly modulates expression of genes associated with cell cycle, oxidative metabolism, and apoptosis. Thus, melatonin supplementation to in vitro maturation media becomes an alternative to improve the viability of germ and embryonic cells. The first study assessed the effects of adding melatonin to the maturation medium on nuclear (meiotic progression) and cytoplasmic (cortical granules migration) maturation and ROS levels in in vitro matured porcine cumulus-oocyte complexes (COCs). Melatonin supplementation stimulated meiosis progression and cortical granules migration, and reduced intracellular ROS levels in oocytes. The second study evaluated the effects of melatonin on the expression of antioxidant genes (Catalase, SOD1, SOD2, and GPX) involved in cellular protection in oocytes and cumulus cells. The addition of melatonin to the maturation medium positivity influence the expression of antioxidant genes in oocytes and cumulus cells. The third study evaluated the effect of melatonin on genes associated with biological processes through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs in vitro matured. Melatonin addition to maturation medium differentially affected expression of 80 genes associated with nine biological processes (cell cycle, proteolysis, cytoskeletal organization, energy pathaway, cell adhesion and transport, signalling pathway, transcription factor, oxidative metabolism and apoptosis, and cell components). The fourth study assessed the effect of melatonin on genes associated with oocyte viability and subsequent embryo development through transcriptomic profile via RNA-Seq in cumulus cells derived from porcine COCs. Melatonin in the maturation medium affected 59 genes associated with nine biological functions related with oocyte viability and embryo development (cumulus expansion, communication between cumulus cells and oocytes, nuclear maturation, cytoplasmic maturation, DNA repair and integrity, oocyte viability, steroidogenesis, fertilization and embryogenesis). In conclusion, supplementation of melatonin to maturation environment influences oocyte nuclear and cytoplasmic maturation, reduces intracellular ROS levels, positivity influence the expression of antioxidant and also interferes in the transcriptome of a significant number of genes associated with oocyte competence acquisition, embryo viability and subsequent development.