Sabe-se que o sistema canabinóide endógeno está envolvido com os processos de formação e evocação da memória. Agonistas dos receptores CB1 exibem diferentes efeitos conforme a via de infusão, seja ela sistêmica, seja local, atingindo estruturas específicas do encéfalo. Neste estudo pretendemos estabelecer o perfil farmacológico-comportamental e eletrofisiológico do agonista CP55,940 quando administrado no hipocampo dorsal de ratos, estrutura em que há poucos estudos prévios com este fármaco: diferente de outros agonistas como a WIN55,212 e mesmo a pouco seletiva anandamida, o CP55,940 restringe-se a receptores canabinóides e chega a ser mais potente que o Δ9-THC, embora não discrimine entre os receptores CB1 (central) e CB2 (periférico). Os fármacos foram infundidos bilateralmente, em diferentes concentrações, na área CA1 do hipocampo, imediatamente após o treino ou antes do teste na tarefa de Condicionamento Aversivo ao Contexto (CAC), visando estudar seus efeitos, respectivamente, na consolidação e na evocação da memória. A CP55,940 pós-treino foi amnéstica apenas na concentração de 5 μg/μl, e esse efeito foi revertido pelo antagonista AM251, seletivo para CB1, em concentração sem efeito próprio, comprovando tal efeito dever-se à ação sobre os receptores CB1. O mesmo efeito foi observado 24h após o treino, na infusão pré-teste, se bem que agora a CP55,940 foi efetiva também em concentrações mais baixas, sugerindo que os receptores desse sistema endógeno tenham ficado mais sensíveis a seus ligantes em função do aprendizado; a seletividade por CB1 neste caso, porém, não ficou claramente atestada pois o efeito de 5 μg/μl de CP55,940 só foi revertido com uma concentração maior de AM251. Na eletrofisiologia, uma concentração de CP55,940 comparável à efetiva sobre a CAC (10μM), não foi capaz de inibir a indução da LTP, já que a potenciação só se sustentou por cerca de 30min – não passou de uma LTP. Esses resultados reforçam e diversificam estudos anteriores, inclusive de nosso grupo, que comprovam a participação dos receptores CB1 na formação e/ou evocação de novas memórias aversivas, bem como possíveis alterações plásticas na densidade desses receptores em função da experiência cognitiva, embora não necessariamente mediadas por eventos sinápticos plásticos como a LTP. / The endogenous cannabiboid system is known to be involved memory formation and retrieval processes. CB1 agonists may cause different effects according to the administration pathway, be it systemic or local/intrastructure. Here we try to establish the behavioral-pharmacologic and electrophysiologic profile of the agonist CP55,940 infused into the rat dorsal hippocampus, a structure less studied with this drug: different from other agonists such as WIN55,212 or even the poorly selective anandamida, CP55,940 sticks only to cannabinoid receptors and is more potent than Δ9-THC, but does not distinguish between central CB1 and peripherical CB2 receptors. The drug was infused bilaterally in different concentrations into the CA1 area of the hippocampus, right after training or pre-test in the Context Fear Conditioning (CFC) task, in order to study its effects upon memory consolidation and retrieval, respectively. Post-training CP55,940 was amnestic only at 5 μg/μl, and the CB1-selective antagonist AM251 reverted this effect in a concentration without action per se, which proves that the original effect is mediated by CB1 receptors. The same amnestic effect was observed 24h after training, in the pretest infusion, only that now CP55,940 was affective also with lower concentrations, suggesting that these receptors are now more sensitive to its endogenous ligands due to learning; CB1-selectivity, however, is not clearly proven here since 5 μg/μl of CP55,940 was reverted only by a higher concentration of AM251. In electrophysiology, a concentration of CP55,940 compatible with that found effective upon CFC (10μM), was not able to block LTP induction, since the potentiation was not sustained for more than 30min – it was only a STP. These results teinforce and diversify previous findings, including some from our own lab, that prove the involvement of CB1 receptors in memory consolidation and/or recall, as well as possible plastic changes in receptor density due to the cognitive experience, despite not necessarily mediated by plastic synaptic events such as LTP.

A linhagem de glioma de rato C6 tem sido amplamente utilizada para investigar vários aspectos da biologia celular. Esta linhagem apresenta variações morfológicas, bioquímicas e fisiológicas de acordo com o número de passagens em cultivo. Segundo a literatura, culturas de passagens recentes apresentam características similares a glioblastomas, enquanto que culturas de passagens tardias assemelham-se à astroglia madura. Devido a isso, muitos estudos têm utilizado a linhagem C6 como modelo celular de glioblastoma e de astrócitos para investigar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico, como por exemplo, captação de glutamato. Entretanto, até o presente momento a caracterização e comparação desses parâmetros entre as culturas da linhagem C6 de passagens recentes e tardias ainda não foram avaliadas. O objetivo desta dissertação foi investigar e comparar alguns parâmetros do sistema glutamatérgico entre as culturas de C6 com passagens recentes e tardias. As passagens recentes apresentaram um conteúdo intracelular de [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu 55% maior quando comparadas às passagens tardias e ambas as culturas atingiram o platô a partir dos 120min de incubação. Além disso, ambas as culturas apresentaram, após incubação com glutamato, os mesmos níveis de incorporação de iodeto de propídeo. Este resultado indica que o menor nível intracelular de [3H] observado nas culturas de passagens tardias não se deve a uma alteração na permeabilidade ou integridade de membrana dessas células. Ambas as culturas expressam somente o transportador Na+ dependente de alta afinidade EAAC1 (carreador de aminoácido excitatórios 1), sendo que sua expressão total foi similar tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias. Para verificar se a captação de L-[3H]-Glu estava ocorrendo através de outro sistema de transporte, as culturas foram incubadas na presença ou ausência de PDC (L-trans-2,4--trans-Pyrrolidine-2,4-dicarboxylic acid ) ou TBOA (DL-threo-β-Benzyloxyaspartic acid). O tratamento com os inibidores reduziu de forma similar a captação de L-[3H]-Glu tanto nas culturas de passagens recentes quanto nas tardias, indicando que este aminoácido é captado principalmente através do transportador de alta afinidade EAAC1. Com relação à liberação de glutamato, observou-se que 50% da radioatividade incorporada na forma de L-[3H]-Glu foi liberada para o meio extracelular tanto nas passagens recentes quanto nas tardias após 2h de incubação. Este resultado pode estar relacionado com o estabelecimento do platô do conteúdo intracelular de [3H] observado após 120 min de captação de L-[3H]-Glu. Para investigar se a liberação de L-[3H]-Glu ocorreu via transporte reverso dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade, ambas as culturas foram incubadas na presença do inibidor não transportável TBOA. Não foi observada alteração no perfil de liberação de radioatividade intracelular nas culturas após incubação com TBOA. Para verificar se a metabolização do L-[3H]-Glu estaria relacionado com a diferença nos níveis intracelulares de [3H], ambas as culturas foram incubadas com o análogo não-metabolizável D-[3H]-Asp. Tanto as passagens recentes como as tardias apresentaram um aumento tempo-dependente do conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp, não atingindo o platô. Além disso, o bloqueio dos transportadores Na+ dependentes de alta afinidade por PDC ou TBOA reduziu a captação de D-[3H]-Asp em ambas as culturas, indicando que sua captação ocorreu principalmente através deste tipo de transporte. Além disso, diferentemente do observado com L-[3H]-Glu, apenas 10% do D-[3H]-Asp captado é liberado após 2h de incubação em ambas as culturas. Este resultado, juntamente com a não inibição por TBOA da liberação da radioatividade captada na forma de L-[3H]-Glu, indica que possivelmente o que está sendo liberado para o meio extracelular é um metabólito marcado com [3H] e não o próprio L-[3H]-Glu. Além disso, nas passagens tardias, o conteúdo de [3H] derivado da captação de D-[3H]-Asp foi menor quando comparado com as passagens recentes aos 60 e 120 min de incubação, sugerindo que as passagens recentes possuem intrinsecamente uma maior capacidade de transporte tanto de L-[3H]-Glu quanto de D-[3H]-Asp quando comparadas às passagens tardias. Os resultados dessa dissertação demonstram que as passagens recentes e tardias da linhagem de glioma C6 diferem na sua capacidade de acumular o [3H] derivado da captação de L-[3H]-Glu. A maior capacidade das passagens recentes da linhagem C6 em acumular a radioatividade não está relacionada a uma maior expressão dos transportadores de glutamato e nem a uma reduzida liberação de L-[3H]-Glu para o meio extracelular. Como conclusão, os resultados obtidos nesta dissertação indicam que o número de passagens deve ser considerado em futuros estudos que pretendam avaliar parâmetros relacionados ao sistema glutamatérgico utilizando a linhagem C6 como modelo celular. / Rat C6 lineage has been widely used to investigate several aspects of cell biology. This lineage presents morphological, biochemical and physiological variations according to number of passages in culture. Early passage cells exhibit characteristics similar to glioblastomas, whereas later passage cells resemble mature astroglia. Thus, many studies have been using C6 lineage as astroglial and glioma model to investigate several parameters related to glutamatergic system, such as glutamate uptake. However, the characterization and comparison of these parameters between C6 cultures at early and late passages have not been evaluated. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare some glutamatergic system parameters between early and late passage C6 cells in cultures. Early passages have an L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H] 55% higher when compared to later passages and both cultures reached plateau at 120 min. In addition, after incubation with glutamate, both cultures showed the same levels of propidium iodide incorporation. This result indicates that lower levels of intracellular [3H] in later passages are not due to an alteration of cellular membrane permeability. Both cultures expressed only the higher affinity Na+ dependent transporter EAAC1, and its total expression was similar in early and later passage cultures. To verify if L-[3H]-Glu uptake occurred through another kind of glutamate transport system, the cultures were incubated in the presence or absence of PDC or TBOA. Treatment with this inhibitors reduced the L-[3H]-Glu uptake in both cultures at same levels, indicating that glutamate is taken up mainly by the higher affinity transporter system. Regarding the release of glutamate, it was observed that 50% of the radioactivity incorporated as L-[3H]-Glu was released to extracellular medium in both early and late passages after 2 h of incubation. This result could be related to the establishment of the plateau observed after 120 min for intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake. To investigate if the release of L-[3H]-Glu occurred trough reverse transport, both cultures were incubated in the presence of non-transportable inhibitor TBOA. There was no alteration of intracellular radioactivity release in cultures after incubation with TBOA. In order to verify if the metabolism of L-[3H]-Glu could be related to the differences in intracellular levels of [3H], both cultures were incubated with the non-metabolizable analogue D-[3H]-Asp. Early and late passage C6 cells showed a time-dependent increase in intracellular content of [3H] derived from D-[3H]-Asp uptake, without reaching the plateau. Moreover, blockade of Na+ dependent transporters of high affinity by PDC or TBOA reduced D-[3H]-Asp uptake in both cultures, indicating that uptake occurred mainly through EAAC1. Moreover, differently from L-[3H]-Glu, only 10% of D-[3H]-Asp captured is released after 2 h of incubation in both cultures. This result, taken together with the fact that TBOA did not inhibit the release of radioactivity captured as L-[3H]-Glu, indicates that a [3H]-metabolite is being released to extracellular medium and not L-[3H]-Glu itself. Moreover, in later passages, D-[3H]-Asp-derived intracellular content of [3H] was lower when compared to early passages at 60 and 120 min of incubation, suggesting that early passage C6 cells intrinsically have a greater capacity to transport both L-[3H]-Glu and D-[3H]-Asp when compared to later passages. This study demonstrates that early and late passage C6 cells differ in their ability to accumulate L-[3H]-Glu-derived intracellular content of [3H]. From 60 min of incubation, early passages have an intracellular content of [3H] derived from L-[3H]-Glu uptake 55% higher in relation to later passages. This increased capacity is not related to a higher expression of glutamate transporters nether nor by reduced release of L-[3H]-Glu to extracellular medium. In conclusion, our results indicate that the number of passages should be considered in future studies that intent to evaluate parameters relating to glutamatergic system using Rat C6 lineage as cell model.

Resumo não disponível

Fora o papel de micronutriente essencial à manutenção da fisiologia celular de mamíferos, a vitamina A é utilizada como fármaco no tratamento de patologias que vão desde distúrbios dermatológicos até certas formas de câncer. Embora a utilização de vitamina A na clínica venha sendo considerada segura, trabalhos mostram que a toxicidade exercida pela vitamina A atinge praticamente qualquer tecido, com conseqüências que podem comprometer a qualidade de vida do paciente. Além disso, o consumo inadvertido de vitamina A na forma de ésteres de retinol (palmitato de retinol, acetato de retinol) adicionados a alimentos colabora para a aquisição de mais vitamina A além daquilo recomendado para a vida saudável. Alguns estudos mostram que, a nível cognitivo, a ingestão excessiva de vitamina A pode levar à irritabilidade, distúrbios do sono, distúrbios alimentares, ansiedade, déficits de aprendizado e de memória, depressão e tentativa de suicídio. No entanto, embora estes efeitos sejam alarmantes e, mais preocupante, possam atingir indivíduos que não têm histórico de doença mental na família, não se tem uma clara visão acerca dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento destes males. Então, decidimos investigar, neste trabalho, as conseqüências de uma suplementação com vitamina A na forma de palmitato de retinol nas doses de 1000, 2500, 4500 e 9000 UI/kg.dia-1 por 28 dias sobre os estados redox e bioenergético de regiões cerebrais envolvidas em disfunções neuropsiquiátricas como ansiedade e depressão (substantia nigra, estriado, hipocampo, hipotálamo, córtex frontal, córtex cerebral total e cerebelo) em ratos Wistar machos adultos (3 meses). Ainda, analisamos o imunoconteúdo de α- e β- sinucleínas, bem como o do receptor para produtos terminais de glicação avançada (RAGE) e do receptor dopaminérgico D2. Também avaliamos o efeito da vitamina A sobre a quantidade de fator de necrose tumoral-α (TNF-α) e o destino celular via ativação das enzimas pró-apoptóticas caspase-3 (via intrínseca) e caspase-8 (via extrínseca). Além destes parâmetros, observamos o comportamento dos animais em campo aberto e em três tarefas diferentes de abordagem de depressão. Encontramos disfunção mitocondrial considerando a cadeia transportadora de elétrons, aumento na quantidade de α-sinucleína e de RAGE, diminuição no nível de receptor D2 e aumento na atividade de caspase-3. A nível comportamental, a suplementação com vitamina A induziu ansiedade, mas não depressão neste modelo experimental. Assim, tais alterações, algumas vezes globais no sistema nervoso central (SNC) dos animais, podem ter um importante papel no desenvolvimento de distúrbio cognitivo, como ansiedade e, provavelmente, possa causar uma facilitação para o estabelecimento de futura neurodegeneração e declínio cognitivo. / In addition to the role of essential micronutrient to the maintenance of mammalian cells physiology, vitamin A has been utilized as an alternative drug during therapy of diseases that vary from dermatological disturbances to some types of cancer. Even thought the clinical utilization of vitamin A has been take as safe, some works demonstrate that the toxicity elicited by vitamin A affects virtually any tissue, leading to decreased life quality. Furthermore, inadvertent intake of vitamin A through vitamin A esters added to food facilitates the acquisition of excessive vitamin A. Some studies have shown that excessive vitamin A intake may induce cognitive decline, including irritability, sleep disturbances, metabolic impairments, anxiety, decreased capacities to learn and memory, depression, and suicide ideation. Nevertheless, even thought the alarming effects seen here and, more concerning, may affect subjects without prior clinical history to mental illness, the mechanisms around the development of such effects are not completely understood. Then, we decided to investigate here the consequences of vitamin A supplementation as retinol palmitate at 1000, 2500, 4500, or 9000 IU/kg.day-1 for 28 days on redox and bioenergetics states in cerebral regions that may be affected during neuropsychiatric dysfunctions, for instance anxiety and depression (substantia nigra, striatum, hippocampus, hypothalamus, frontal cortex, total cerebral cortex, and cerebellum), in adult male Wistar rats (90 days old). Moreover, we analyzed the amount of α- e β-synucleins, as well as that of receptor for advanced glycation end products (RAGE) and dopaminergic receptor D2. We also investigated the effect of vitamin A supplementation on tumor necrosis factor-α (TNF-α) levels and, regarding cell fate, we quantified caspase-3 (intrinsic pathway) and caspase-8 (extrinsic pathway) enzyme activity, which are pro-apoptotic enzymes. In addition to these molecular parameters, we have observed rat behavior in an open field apparatus and during three different tasks related to the study of depression. Overall, we found mitochondrial dysfunction regarding the mitochondrial transfer chain, increased amounts of α-synuclein and RAGE, decreased D2 levels, and increased caspase-3 enzyme activity. Regarding rat behavior, vitamin A supplementation induced anxiety-like behavior, but not depressionrelated behavior in this experimental model. Concluding, the effects elicited by vitamin A supplementation, which were observed to affect virtually any rat brain region investigated here, may take an important role during cognitive impairment, as for example anxiety, and it is plausible that this vitamin may induce a facilitation to future neurodegeneration and cognitive decline.

Animais tolerantes à anoxia são essenciais para o estudo dos mecanismos capazes de proteger tecidos sensíveis, como o coração e o sistema nervoso, de períodos de reduzida disponibilidade de oxigênio. Por ser um animal terrestre tolerante às reduções ambientais na tensão de oxigênio, o caracol Megalobulimus abbreviatus representa um excelente modelo para a análise da tolerância do sistema nervoso à anoxia. No presente estudo foram avaliados diferentes parâmetros do metabolismo do sistema nervoso central (SNC) de caracóis submetidos aos períodos de 3 h ou 12 h de anoxia e ao período de 15 h de reoxigenação após 3 h de anoxia. Além disso, foi analisada a possível existência de ritmicidade circadiana na atividade da forma ativa da enzima glicogênio fosforilase (GFa) e na concentração de glicose hemolinfática. Os resultados destes estudos demonstraram que a maior atividade GFa nos gânglios cerebrais de M. abbreviatus, assim como os níveis mais elevados de glicose hemolinfática do caracol ocorrem no início da escotofase, período de maior atividade comportamental do caracol. A partir desses resultados, foi necessária a utilização de um grupo controle para cada um dos períodos experimentais de anoxia analisados, evitando erros relativos ao período do dia em que os grupos anoxia ou recuperação foram dissecados. A anoxia não causou mudanças na captação de glicose nem na capacidade de síntese de glicogênio do SNC do caracol. Porém, a ausência de oxigênio causou uma redução na atividade das enzimas glicogênio sintase (GS) e glicogênio fosforilase (GF), o que pode sugerir a ativação de um mecanismo de depressão metabólica. Em relação ao metabolismo oxidativo, enquanto a oxidação dos substratos glicose e piruvato manteve-se constante durante a anaerobiose, a atividade da enzima citocromo oxidase (COx) apresentou uma regionalização. Enquanto a região neuropilar central dos gânglios cerebrais apresentou uma redução da atividade COx, as regiões do lobo pedal e do neuropilo lateral mantiveram a atividade enzimática basal, mesmo após 12 h de ausência de oxigênio. Esses resultados, juntamente com a falta de redução na oxidação de glicose e piruvato, sugerem a existência de alguma forma de estoque de oxigênio em M. abbreviatus, capaz de manter o metabolismo oxidativo tecidual mesmo durante a anoxia. O SNC do caracol apresentou uma alta atividade das enzimas antioxidantes catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD), e isto pode ser importante para evitar a geração de qualquer estresse oxidativo durante os constantes ciclos de anoxia/reoxigenação aos quais o animal está submetido no ambiente. Apesar de um pequeno aumento na imunorreatividade ao GABA, verificado nos corpos neuronais às 3 h de anoxia, não ocorreram alterações relativas ao neurotransmissor nas regiões neuropilares dos gânglios cerebrais. Esses resultados não apóiam a hipótese de que o GABA possa estar envolvido nos mecanismos de controle do processo de depressão metabólica em moluscos. De qualquer forma, o caracol M. abbreviatus está bem adaptado às situações de anoxia e reoxigenação, desde que não foi verificada qualquer mortalidade no presente estudo. Sem dúvida, a adaptação às condições anóxicas e de reoxigenação deve depender de um equilíbrio entre a estabilização de algumas variáveis metabólicas e a modificação de outras, como foi observado no presente estudo, mantendo a homeostase do SNC do caracol durante estes períodos. / Anoxia-tolerant animal models are crucial to understand the protective mechanisms available in the tissues sensitive to anoxia, like brain and heart. The snail Megalobulimus abbreviatus is an anoxia-tolerant land snail that has been used as an experimental model to study the effects of anaerobiosis on the nervous system. In the present study, different parameters of the nervous system metabolism were analyzed in animals submitted to anoxia for 3 h or 12 h and animals exposed to a 15 h aerobic recovery period. Moreover, it was analyzed the possible existence of circadian rhythms in the activity of glycogen phosphorylase and in hemolymph glucose levels. The results showed higher phosphorylase activity and hemolymph glucose levels during the scotophase, a period of behavioral activity of these nocturnal snails. Thus, in order to avoid circadian metabolic variations during anoxia experiments, it was used a control group specific to each anoxia experimental period. The anoxia treatment did not alter the glucose uptake and glycogen synthesis in the central nervous system of the snail. However, that condition induces a reduction of the glycogen phosphorylase and glycogen synthase activities, which suggest a possible metabolic arrest. The rates of glucose and piruvate oxidation remain constant during anoxia, but the cytochrome oxidase (COx) activity was variable in the different cerebral regions analyzed. There was a decrease in COx activity in the central neuropil. However, the somata and lateral neuropil of the pedal lobe maintained the COx activity ever after 12 h of anaerobiosis. These results suggest the existence of an oxygen store that supplies the aerobic metabolism even in anoxia. The CNS of the snail showed a high activity of the catalase and superoxide dismutase. These antioxidant enzyme levels could be important to avoid the oxidative stress during the anoxia/reoxygenation cycles. The GABAimmunoreactivity increases in the neuronal somata at 3 h of anoxia. However, in the neuropilar regions no changes were observed in the GABA immunoreactivity. A role for the GABAergic system in the metabolic depression in this snail deserves further investigation. Anyway, Megalobulimus abbreviatus is adapted to anoxic and reoxygenation conditions because no mortality was verified. Undoubtedly, this adaptation depends on balance between stabilization and changes of some variables. This pattern of response maintains the CNS homeostasis during the anaerobiosis and reoxygenation.

O principal objetivo dos experimentos apresentados nesta tese foi investigar o envolvimento dos receptores do peptídeo liberador de gastrina (GRPRs) hipocampais nos processos de extinção e reconsolidação da memória e em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. No Capítulo I foram avaliados os efeitos do bloqueio do GRPR na extinção da memória aversiva. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de esquiva inibitória e retornaram repetidamente ao contexto da sessão de treino sem choque durante três dias seguidos. A infusão no hipocampo dorsal de um antagonista dos GRPRs ou anisomicina, inibidor da síntese protéica, imediatamente após a primeira sessão de teste inibiram a extinção da memória. Estas drogas não tiveram o mesmo desempenho nas sessões subseqüentes quando a primeira sessão da extinção (primeiro dia após o treinamento) foi omitida. Os resultados indicam que os GRPRs estão envolvidos na extinção da memória motivada por medo no hipocampo.No Capítulo II foi avaliado o possível papel do GRPR e do receptor de glutamato do tipo N-metil-D-aspartato (NMDAR) em processos associados à reconsolidação da memória. Os resultados mostraram que a inativação de GRPR pelo antagonista RC-3095 ou de NMDARs hipocampais pelo antagonista ácido aminofosfonopentanoico (AP5), após a reativação da memória, prejudica temporariamente a retenção. Entretanto, o prejuízo da memória induzido por RC-3095 ou AP5 pós-reativação foi transitório e voltou aos níveis dos ratos-controle em um teste subseqüente 3 dias após o treino. O efeito das drogas se deu apenas após a reativação da memória, e não na ausência da mesma. Estes resultados fornecem a primeira evidência que a inativação de GRPR após areativação pode prejudicar a memória. No Capítulo III nós investigamos o efeito da ativação dos GRPRs em um modelo de amnésia associado à doença de Alzheimer. Os ratos receberam infusão bilateral de bombesina, agonista GRPR, ou salina 10 min antes do treino na tarefa de esquiva inibitória, e peptídeo β-amilóide (25-35) ou água destilada imediatamente após o treino. A infusão intrahipocampal pós-treino do peptídeo β-amilóide (25-35) induziu um prejuízo significativo na retenção da memória na tarefa de esquiva inibitória. A infusão pré-treino de bombesina previniu o prejuízo da retenção da memória induzido pelo peptídeo β-amilóide (25-35). O resultado indica que os agonistas de GRPR podem previnir os prejuízos da memória causados pelo peptídeo β-amilóide (25-35) no hipocampo. / The main purpose of the research presented in this thesis was to evaluate the involvement of hippocampal gastrin-releasing peptide receptors (GRPRs) in extinction and reconsolidation of fear memory, as well as the effects of GRPR activation in a rat model of memory dysfunction associated with Alzheimer’s disease (AD). In Chapter 1, we evaluated the possible involvement of the GRPR in extinction of memory for aversive training. Male Wistar rats were trained in inhibitory avoidance (IA) conditioning and then returned repeatedly to the training context without shock on a daily basis for 3 days. Infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the protein synthesis inhibitor anisomycin into the CA1 area of the dorsal hippocampus immediately after the first extinction session blocked extinction. These drugs did not affect performance in subsequent sessions when the first extinction session (1 day after training) was omitted.The results provide the first evidence that hippocampal GRPRs are involved in memory extinction. In Chapter 2, we evaluated the possible role of hippocampal GRPRs and glutamate N-methyl-D-aspartate receptors (NMDARs) in reconsolidation-like processes. We show that inactivation of hippocampal GRPRs or NMDARs after memory reactivation temporarily disrupts retention of IA memory.Post-retrieval intrahippocampal infusion of the GRPR antagonist RC-3095 or the NMDAR antagonist aminophosphonopentanoic acid (AP5) produced an impairment of IA performance tested 2 days after training in rats. However, the memory impairment induced by postretrieval RC-3095 or AP5 was transient and recovered to levels of control rats in a subsequent test 3 days after training. The drug effects were only present after memory reactivation and not in the absence of reactivation. The findings provide the firstevidence that GRPR inactivation after memory retrieval can impair memory. In Chapter 3, we verified whether GRPR activation would affect IA memory retention in a rat model of memory dysfunction associated with AD. Rats were given bilateral infusions of the GRPR agonist bombesin or saline 10 min before IA training, and β-amyloid peptide (25- 35) or distilled water immediately after training. Posttraining intrahippocampal infusion of β-amyloid peptide (25-35) induced a significant impairment of IA retention. Pretraining infusion of an otherwise ineffective dose of bombesin prevented the β-amyloid peptide (25-35)-induced retention impairment. The result indicates that GRPR agonists can prevent memory impairments elicited by β-amyloid peptide (25-35) in the hippocampus.

O aminoácido glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do SNC de mamíferos e participa de funções importantes como cognição, memória, aprendizagem e plasticidade neuronal. Porém, excessiva estimulação dos receptores glutamatérgicos pode resultar em morte celular, processo este denominado excitotoxicidade e que está associado à processos neurodegenerativos. A remoção do glutamato da fenda sináptica, que ocorre através de transportadores dependentes de sódio de alta afinidade, localizados principalmente nos astrócitos, é o principal mecanismo modulatório das ações glutamatérgicas e responsável pela manutenção de concentrações extracelulares abaixo dos níveis neurotóxicos. O Ácido quinolínico (AQ), um agonista NMDA, é uma potente neurotoxina endógena, cujo acúmulo no cérebro parece estar envolvido na etiopatologia das convulsões. Entretanto, apesar do seu envolvimento em muitas doenças, os mecanismos moleculares e danos cerebrais ainda não são perfeitamente elucidados. Os derivados da guanina com funções extracelulares, sejam os nucleotídeos GTP, GDP ou GMP, e o nucleosídeo guanosina mostraram exercer ações tróficas em células neurais, bem como modular o sistema glutamatérgico. Os resultados demonstram que vários sistemas de transporte de glutamato são afetados pela ação do ácido quinolínico, e que os nucleotídeos da guanina podem exercer ação modulatória destas respostas. Nos estudos in vitro, o AQ estimulou a liberação de glutamato em sinaptossomas e inibiu a captação de glutamato por astrócitos. Observou-se ainda que o AQ inibiu a captação vesicular de glutamato, porém os nucleotídeos da guanina foram capazes de prevenir esta inibição, indicando uma possível modulação neste tranportador. Nos estudos in vivo, usando um modelo experimental de indução de convulsão por AQ, observou-se que a liberação sinaptossomal glutamatérgica também está estimulada, porém este efeito foi completamente abolido pela guanosina, quando este nucleosídeo foi capaz de prevenir a convulsão. AQ também estimula a captação vesicular de glutamato e inibe a captação vesicular de GABA; da mesma forma, os nucleotídeos da guanina exercem seus efeitos modulatórios, já que tanto a inibição quanto o aumento de captação retornaram aos níveis do controle quando houve prevenção da convulsão. Adicionalmente, estas alterações na captação vesicular de glutamato parecem ser relacionadas ao AQ, já que em outros modelos (picrotoxina, cainato, cafeína, PTZ ou eletrochoque transcorneal) não foram observadas alterações. Nossos resultados sugerem que os nucleotídeos da guanina exercem importante função como neuromoduladores e ainda neuroprotetores. / Glutamate is the main excitatory neurotransmitter in mammalian CNS, involved in processes such as plasticity, learning and memory, and neural development. However, an excessive glutamate receptors activation can induce intracellular events which lead to the neural death through excitotoxic events, wich are associated to the etiology of neuodegeneratives disorders. The removal of glutamate from the synaptic cleft, which occurs by high affinity of sodium-dependent transporters, located mainly in astrocyte membranes, is the major mechanism for modulating of glutamate actions, responsible for maintaining its extracellular concentrations below neurotoxic levels. Quinolinic acid (QA), an NMDA agonist, is a potent endogenous neurotoxin. Accumulation of QA in the brain seems to be involved in the ethiopatogeny of convulsions. However, in spite of its involvement in many diseases, the molecular mechanisms linking QA and brain damage are far from understood. Extracellular guanine-based purines (GBPs), namely the nucleotides GTP, GDP, GMP and the nucleoside guanosine have been shown to exert trophic effects on neural cells, as well as to modulate of the glutamatergic system. The results demonstrate that various systems of glutamate transport are affected by action of QA, and guanine nucleotides exert modulatory effect. In in vitro studies, QA stimulates glutamate release in synaptosomes and inhibits the glutamato uptake by astrocytes. We observed that QA inhibits glutamate vesicular uptake, however guanine nucleotides prevent this inhibition, indicating a possible modulation of this transporter. In in vivo studies, using a experimental model of QA-induced seizures, we observed that synaptosomal glutamate release is stimulated, and this effect was completely abolished by guanosina. QA stimulates the glutamate uptake and inhibits the GABA uptake, and guanine nucleotides exert modulatory effect, because both effects are abolished when animals not displaying seizures. Additionally, this alterations in vesicular glutamate uptake appears are related with QA, because in other models of seizure (picrotoxin, kainate, caffeine, PTZ or maximal transcorneal electroshock) we do not observed any alterations. Our results suggest that guanine nucleotides exert an important role as neuromodulators and neuroprotectors.

Diversos trabalhos têm relacionado a fisiopatogenia da acidemia glutárica tipo I (GA I) com a excitotoxicidade glutamatérgica. Ainda que sob intenso debate, a maioria desses trabalhos se baseia na semelhança estrutural existente entre o glutamato e os principais ácidos orgânicos acumulados na GA I, os ácidos glutárico (GA) e 3-hidroxiglutárico (3-OHGA). Tendo em vista a janela de vulnerabilidade cerebral dos pacientes afetados pela GA I durante os primeiros anos de vida e o distinto padrão de expressão e propriedades de receptores e transportadores glutamatérgicos ao longo do desenvolvimento, o presente trabalho teve por objetivo investigar os efeitos dos ácidos GA e 3-OHGA sobre a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática e sobre a captação de glutamato por fatias e preparações sinaptossomais de córtex cerebral e estriado de ratos de 7 a 60 dias de vida. Nossos resultados demonstraram que o 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana em córtex cerebral de ratos de 30 dias de vida. Observamos ainda que esse ácido parece interagir com receptores do tipo NMDA, agindo como um fraco agonista desses receptores por aumentar a ligação de MK-801 em receptores de membrana e o influxo de Ca2+ em fatias de córtex cerebral de ratos. Através do estudo ontogenético da ligação de glutamato a seus receptores e transportadores de membrana plasmática de ratos na presença de GA e 3-OHGA, verificamos que o GA inibe a ligação de glutamato a seus receptores de membrana em córtex cerebral e estriado de ratos de 7 e 15 dias de vida. A utilização de antagonistas glutamatérgicos juntamente com a inibição da ligação de cainato a seus receptores na presença de GA indicaram que os efeitos desse ácido sobre a ligação de glutamato a seus receptores parecem envolver receptores do tipo não- NMDA, possivelmente do tipo cainato. O ácido 3-OHGA inibiu a ligação de glutamato somente a transportadores de membrana de estriado de ratos de 7 dias de vida. Os estudos de captação de glutamato mostraram que o GA inibe o transporte desse neurotransmissor apenas em fatias de córtex cerebral de ratos de 7 dias de vida. Esse efeito não foi devido à morte celular e foi prevenido por pré-administração de N-acetilcisteína sugerindo o envolvimento de dano oxidativo na presença do GA. Além disso, o efeito do GA parece envolver os transportadores glutamatérgicos do tipo GLAST, expressos nos estágios iniciais de desenvolvimento cerebral. Em contraste, o ácido 3-OHGA não afetou a captação de glutamato por fatias de córtex cerebral e estriado de ratos. Observamos também que os ácidos GA e 3-OHGA não afetaram a captação de glutamato por preparações sinaptossomais de cérebro de ratos. Os efeitos detectados no presente estudo pelos ácidos GA e 3-OHGA em períodos específicos do desenvolvimento e também nas distintas estruturas cerebrais estudadas podem estar relacionados com a expressão diferenciada de receptores e transportadores glutamatérgicos no cérebro de ratos. Apesar de não explicarem a janela de vulnerabilidade estriatal, tais resultados podem auxiliar na elucidação dos mecanismos fisiopatogênicos envolvidos no dano neurológico ocorrido durante os primeiros anos de vida dos pacientes com GA I. / The role of excitotoxicity in the cerebral damage of glutaric acidemia type I (GA I) is under intense debate. Several studies relate the excitotoxic actions of the major metabolites accumulating in GA I, glutaric (GA) and 3-hydroxyglutaric acids (3-OHGA), based on the chemical structural similarity between these organic acids and glutamate. Considering that GA I patients present a window of cerebral vulnerability during the first years of life and the variable ontogenetic pattern of glutamate receptors and transporters expression and properties, the objective of the present work was to investigate the effects of GA and 3-OHGA on glutamate binding to receptors and transporters from synaptic plasma membranes and on glutamate uptake by slices and synaptosomal preparations from cerebral cortex and striatum during rat brain development. Our results demonstrated that 3-OHGA inhibited glutamate binding to receptors and transporters from plasma membranes of cerebral cortex of 30-day-old rats. Moreover, its effect on glutamate receptors seems to be directed towards NMDA receptors and suggests that 3-OHGA acts as a weak agonist of these receptors by increasing the MK-801 binding to membrane receptors and Ca2+ influx into cerebral cortex slices of rats. The ontogenetic study of glutamate binding to receptors and transporters in the presence of GA and 3- OHGA revealed that GA decreased the glutamate binding to receptors from plasma membranes of cerebral cortex and striatum of 7- and 15-day-old rats. In addition, by using glutamate antagonists and kainate binding assay, we verified that this effect involved non-NMDA receptors, probably kainate receptors. On the other hand, 3-OHGA inhibited glutamate binding to transporters from plasma membranes of striatum of 7-day-old rats. The glutamate uptake studies showed that GA decreased glutamate transport only in cerebral cortex slices of 7-day-old rats. Furthermore, this effect was not due to cellular death and was prevented by N-acetylcysteine preadministration suggesting the involvement of oxidative damage. Moreover, immunoblot analysis and glutamate uptake assays in the presence of GA and dihydrokainate (DHK) revealed that GA effect seems to involve GLAST transporters, which are expressed in early stages of rat brain development. In contrast, 3-OHGA did not affect glutamate uptake by brain slices. We also observed that both GA and 3-OHGA did not affect glutamate uptake by synaptosomal preparations from rat brain. Concluding, the effects provoked by GA and 3-OHGA at specific ages of development and also in distinct cerebral structures may possibly be explained by the differential ontogenetic and regional specific expression of the glutamate receptors and transporters in rat brain. Although these results can not explain the window of striatal vulnerability, they may contribute to elucidate the mechanisms of the neurological damage occurred during the first years of life in GA I patients.

O estudo de metodologias que possibilitem o acesso de moléculas terapêuticas ao cérebro evitando a barreira hematoencefálica (blood-brain barrier, BBB), é extremamente importante para o tratamento das doenças que afetam o sistema nervoso central. Os estudos se concentram na busca por vias seguras e pouco invasivas. Recentemente a via nasal tem mostrado resultados positivos na administração de fármacos ao sistema nervoso central de maneira segura, sugerindo a utilização desta via para a terapia gênica. Neste trabalho, foi estudada a administração intranasal de um vetor não viral, que codifica o gene da proteína verde fluorescente otimizada (enhanced green fluorescent proten, EGFP), diluído em água ou em solução de sulfato de zinco em camundongos adultos da linhagem BALB/c. Os resultados de RT-PCR mostraram que o vetor atingiu o cérebro em ambos tratamentos, e sua expressão foi mantida até 8 semanas após o tratamento. A expressão da EGPF em diferentes regiões cerebrais foi analisada 1, 2, 4 e 8 semanas após o tratamento, através de imunohistoquímica. Nossos resultados mostraram que um número muito pequeno de células foi transfectado em ambos tratamentos e que a freqüência destas células nas regiões cerebrais estudadas varia muito mesmo entre animais do mesmo grupo. O tratamento com sulfato de zinco não aumentou a eficiência do vetor. Os maiores números de células transfectadas encontradas foram no bulbo olfatório e hipocampos uma semana após o tratamento. Nossos resultados mostram pela primeira vez a expressão prolongada de um gene administrados pela via nasal no cérebro. / The investigation of methods that allow the access of therapeutic molecules to the brain, overcoming the blood-brain barrier (BBB), is of great importance for the treatment of diseases reaching the central nervous system. Studies concentrate mainly on the search for safer and less aggressive routes. Recent studies have suggested that pharmaceutical agents can reach the brain by the nasal route, that may thus be also appropriate for gene therapy. Here, we investigated brain targeting by intranasal administration of a plasmid vector (pREGFP) with the reporter gene EGFP, diluted in water or in a zinc sulfate/water solution, to adult BALB/c mice. Brain regions were examined by RT-PCR or immunohistochemistry 1, 2, 4 or 8 weeks after the treatment. RT-PCR results showed that the plasmid DNA reached the brain similarly with the two types of treatment. Expression of egfp was observed in all groups, and maintained even 8 weeks after treatment. Brain sections submitted to immunohistochemistry (IHC) were analyzed for the detection of EGFP-positive cells, that could be observed in brain samples from mice treated by intranasal administration of pREGFP. The frequency of EGFP-positive cells was very low, and presented great variation even among mice from the same experimental group. The supplementation of the transfection medium with zinc sulfate did not induce higher numbers of EGFP-positive cells. A higher frequency of these cells was observed in the olfactory bulb one week after treatment, and in the hippocampus as compared to other brain regions. Our results show for the first time the long-term expression of a gene carried by a nonviral vector to the central nervous system.

A terapia celular utilizando células tronco mesenquimais (MSC) derivadas da medula óssea surge como uma alternativa para o tratamento das doenças neurodegenerativas. Apesar dos resultados positivos com o uso dessas células nos ensaios pré-clínicos e clínicos após a isquemia cerebral, seus efeitos colaterais e seu mecanismo de ação permanecem desconhecidos. Os benefícios alcançados após a terapia celular para o tratamento da isquemia não são atribuídos à diferenciação dessas células em novos neurônios, mas sim aos fatores que elas podem secretar. Na tentativa de compreender como os fatores secretados pelas MSC podem influenciar o tecido hipocampal que sofreu ou não privação de oxigênio e glicose (POG) e como os fatores liberados pelo tecido lesionado podem atuar sobre as MSC, nós utilizamos culturas organotípicas de hipocampo expostas ao meio condicionado pelas MSC e MSC expostas ao meio condicionado pelas culturas organotípicas de hipocampo expostas à POG. Os resultados obtidos nesse trabalho mostram que o meio condicionado pelas MSC é tóxico para as culturas organotípicas de hipocampo, induzindo morte celular especificamente nas regiões do Corno de Ammon (CA) e agravando a lesão causada pela POG. Essa toxicidade parece ser específica das MSC, uma vez que o meio condicionado por outros tipos celulares não tem o mesmo efeito. As MSC isoladas tanto de rato como de camundongo e tanto de medula óssea como de pulmão induzem a morte celular de uma maneira semelhante, sugerindo que o efeito não é espécie ou órgão específico. Ainda, nós observamos que os fatores secretados pelas MSC ativam a microglia e os astrócitos, induzindo a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), o aumento da iNOS e um aumento de IL-6 e TNFα nas culturas organotípicas. O efeito tóxico do meio condicionado pelas MSC pode ser atenuado por antioxidantes, anti-inflamatórios, antagonistas NMDA e AMPA, bloqueadores de canal de cálcio dependentes de voltagem e por agonista GABA. Quando as MSC foram analisadas após a sua exposição ao meio condicionado pelo tecido hipocampal lesionado, nós não observamos morte celular ou mudanças morfológicas aparentes nessas células após 24 h de exposição ao meio. Surpreendentemente, as MSC aumentaram a proliferação quando expostas ao meio condicionado pelo hipocampo lesionado, não apresentando nenhum marcador neural após 72 h em contato com esse meio condicionado. Em conjunto, nossos resultados mostram um possível efeito adverso de fatores secretados pelas MSC, introduzindo uma nota de cautela na utilização dessas células. / Cell therapy using bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC) seems to be a new alternative for the treatment of neurodegenerative diseases. In spite of several good and promising results with the use of these cells in preclinical and clinical studies after stroke, their side effects and their mechanism of action are still unknown. The benefits reached after cell therapy to treat stroke are not attributed to the differentiation of the cells in new neurons, but to the factors that these cells can secrete. In an attempt to understand how MSC secreted factors can influence the hippocampal tissue that suffer or not from oxygen and glucose deprivation (OGD) and how the factors secreted from the injured hippocampus can influence MSC behavior, we used organotypic hippocampal slice cultures exposed to MSC conditioned medium and MSC exposed to organotypic hippocampal cultures conditioned medium. The results obtained in this work show that MSC conditioned medium is toxic to organotypic hippocampal slice cultures, inducing cell death specifically in the CA (Cornus Ammonis) region of hippocampus and aggravating the lesion induced by OGD. This toxicity seems to be specific to MSC, once the medium conditioned by other cell types do not induce cell death. Also, MSC isolated from rat or mice and from bone marrow and lungs induce cell death in a similar manner, suggesting that the effect is not organ- or specie- specific. In addition, we have observed that MSC secreted factors activate microglia and astrocytes, inducing reative oxygem species (ROS) generation and iNOS, TNFα and IL-6 increase in organotypic cultures. The MSC conditioned medium-induced toxic effect can be attenuated by antioxidants, antiinflammatory drugs, NMDA and AMPA antagonists, Ca2+ voltage-dependent channel blockers and GABA agonist. When MSC behavior was investigated after these cells were exposed to the conditioned medium from the lesioned hippocampus, we observed that these medium is not able to induce cell death or any apparent change in MSC morphology after a 24 h exposure period. Surprinsingly, MSC increase proliferation in response to the conditioned medium from the injured hippocampal tissue, do not presenting any neural marker after 72 h of contact with this medium. Taken together, our results show a possible side effect of MSC secreted factors, introducing a note of caution in the use of these cells.