A esquistossomose mansônica é a segunda maior endemia parasitária do mundo em termos de extensão das áreas endêmicas e do número de pessoas infectadas com 200 milhões de pessoas acometidas. Esta doença é causada pelo parasito trematódeo Schistosoma mansoni, o qual apresenta adequados mecanismos de resposta ao estresse envolvendo a regulação da expressão gênica e proteica, reparo ou substituição de moléculas danificadas, recuperação do balanço redox, controle do ciclo celular e apoptose. O sistema ubiquitina- proteassoma é importante para manter a homeostase proteica durante o estresse celular. Inibidores do proteassoma podem interferir em processos como crescimento, progressão do ciclo celular e replicação, e os seus efeitos vem sendo caracterizados em muitos parasitos. Nosso laboratório demonstrou que MG132 reduz o número de esquistossômulos, a carga parasitária e a ovoposição em camundongos infectados com S. mansoni. Neste trabalho, são descritos os efeitos in vitro do estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico em vermes adultos de S. mansoni. Observou-se alteração no perfil de expressão proteica durante estresse oxidativo e térmico, sendo identificadas dezoito proteínas upreguladas nestas condições. Estas proteínas estão envolvidas em muitas vias intracelulares como dobramento de proteínas, proteólise, ligação a íons cálcio, regulação de proteínas e resposta a estresse. Além disso, o estresse oxidativo gerou mudanças em vermes adultos de S. mansoni em processos como produção de ovos, motilidade, morfologia do tegumento, viabilidade e pareamento dos vermes. O estresse químico induzido com Curcumina, IBMX e MG132 aumentou a produção de ROS intracelular e alterou o perfil de expressão de enzimas antioxidantes em S. mansoni. As enzimas SmGPx1 e SmPGx2 tiveram a expressão aumentada no estresse com Curcumina e IBMX, enquanto que SmSOD e SmTGR foram induzidas no estresse com Curcumina. As enzimas do proteassoma SmHul5 e SmUbp6 tiveram a expressão modulada durante o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico. Em adição, a análise de expressão no ciclo de vida de S. mansoni revelou que estes genes apresentam um nível alto de expressão em esporocistos, esquistossômulos e miracídios. Estes resultados sugerem que estas proteínas acessórias do proteassoma participam da resposta ao estresse e desenvolvimento do parasito. O nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6 foi cerca 9 e 16 vezes menor em relação ao controle no estresse químico induzido com IBMX, respectivamente, sugerindo a desmontagem do proteassoma. Por outro lado, Curcumina, MG132, estresse oxidativo e choque térmico aumentaram o nível de expressão de SmHul5 e SmUbp6. Além disso, o nível de expressão da proteína de maturação do proteassoma (SmPOMP) aumentou no estresse com Curcumina, MG132 e estresse oxidativo, sugerindo a síntese de novas populações de proteassoma. Em relação ao estresse oxidativo, nós demonstramos o aumento no nível proteico de proteassoma 20S e da subunidade alfa-3 do proteassoma sugerindo que em S. mansoni as proteínas oxidadas são degradadas pelo proteassoma 20S. Além do mais, nós observamos que vermes adultos de S. mansoni parecem utilizar mecanismos de resposta similares para diferentes estresses. Nossos resultados demonstraram que o estresse oxidativo, choque térmico e estresse químico modificam o perfil de expressão de genes relacionados ao sistema ubiquitina-proteassoma e sugerem que o proteassoma é importante para as respostas celulares ao estresse neste parasito. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease caused by blood flukes (genus Schistosoma) and affecting 200 million people worldwide. This disease continues to rank, following malaria, at the second position of the world\'s parasitic diseases in terms of the extent of endemic areas and the number of infected people. There are different types of stress and the organisms have many mechanisms to respond to these stressor agents. The responses involve the regulation of gene and protein expression and consist in events such as repair or substitution of damaged molecules, recovery of redox balance, cell cycle control and apoptosis. The proteasomal system is important to support the protein homeostasis during the cellular stress. Effect of proteasome inhibitors has been described in many protozoans, either inhibiting growth or cell cycle progression, or blocking replication. Our laboratory\'s results have shown that MG132 reduces the number of lung stage schistosomula, the worm burden and consequently decreases oviposition in S. mansoni-infected mice. Here, we describe the in vitro effects of oxidative stress, heat shock and chemical stress in S. mansoni adult worms. We report that the oxidative stress and heat shock cause drastic changes in the protein profile of S. mansoni adult worms, and we identified a total of eighteen upregulated proteins in these conditions. These proteins are involved with many intracellular pathways as protein folding, proteolysis, calcium ion binding, regulator proteins and stress response. In addition, oxidative stress induced with H2O2 generated significative changes in the adult worms concerning process such as egg production, motor activity, tegument morphology, viability and pairing of worms. Chemical stress induced with Curcumin, IBMX and MG132 increases ROS production and changes the gene expression profile of antioxidant enzymes of S. mansoni adult worms. The enzymes SmGPx1 and SmGPx2 were upregulated in Curcumin and IBMXinduced chemical stress, and both SmSOD and SmTGR were upregulated- Curcumin. The proteasomal enzymes SmHul5 and SmUbp6 had their gene expression modified during oxidative stress, heat shock and chemical stress. Besides of, expression analyses in the S. mansoni life cycle indicate that genes are different express in sporocyst, schistosomula and miracidia. These results suggest these accessory proteins proteasome participates of stress response and parasite development. The expression level of SmHul5 and SmUbp6 were 16 and 9 times less than the control in chemical stress induced by IBMX, and we suggest that these results are due to the proteasome disassembling. On the other hand, Curcumin, MG132, oxidative stress e heat shock increases the expression of SmHul5 and SmUbp6. Furthermore, the expression level of maturation proteasome protein (SmPOMP) increases in stress induced by Curcumin, MG132 and oxidative stress suggesting new proteasome synthesis. In addition, we demonstrate increase the both 20S level and alpha-3 subunit proteasome in the oxidative stress, suggesting that in S. mansoni oxidized protein formed due to oxidative damage are degrade by proteasome 20S. We observed that S. mansoni adult worms utilize similar mechanisms to respond different stresses. Ours results demonstrate that oxidative stress, heat shock and chemical stress modified the expression profile of genes related with the ubiquitinproteasome system and suggest that the proteasome is important to responses the cellular stresses in the parasite.

As doenças parasitárias são uma das maiores causas de morte em países em desenvolvimento, e recebem pouca ou nenhuma atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de terapias. Causada pelo parasita Schistosoma mansoni a esquistossomose mansônica afeta aproximadamente 259 milhões de pessoas no mundo sendo aproximadamente 6 milhões somente no Brasil. O S. mansoni não possui a via \"de novo\" para a biossíntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação para o suprimento dessas bases, portanto, essa via é um alvo em potencial. Agentes capazes de bloquear a atividade das enzimas participantes desta via atuam de forma inespecífica e são quase sempre tóxicos ao homem e por isso o estudo minucioso das pequenas diferenças encontradas entre as enzimas do hospedeiro e do parasita são de extrema importância. Uma diferença marcante entre a via de salvação de purinas do parasita e do hospedeiro humano é a presença de atividade para adenosina fosforilase, que no parasita é exercida por duas entidades distintas: pela enzima Metiltioadenosina fosforilase de S. mansoni (SmMTAP) e por uma enzima até então desconhecida. A enzima SmMTAP naturalmente converte 5\'-deoxi-5\'-metiltioadenosina (MTA) em adenina livre, mas ao contrário do que é visto no hospedeiro, no parasita essa enzima atua preferencialmente na conversão de adenosina. Substituições encontradas no sítio ativo dessa enzima, podem explicar tamanha preferência pelo substrato alternativo, revelando mecanismos distintos da enzima humana. A enzima Purina nucleosídeo fosforilase de S. mansoni (SmPNP) converte inosina e guanosina à hipoxantina e guanina, respectivamente, mas não possui atividade catalítica para adenosina. No entanto, no genoma de S. mansoni é descrita uma isoforma para a SmPNP (SmPNP2), cuja atividade catalítica é desconhecida e, portanto, essa enzima pode também atuar na conversão de adenosina juntamente com a SmMTAP. Assim, os objetivos deste trabalho foram realizar estudos bioquímicos da ação da enzima SmMTAP e realizar a caracterização estrutural e funcional da enzima SmPNP2. Para isso, foram realizadas mutações no sítio ativo da SmMTAP (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L), as mutantes da SmMTAP juntamente com a enzima SmPNP2 foram clonadas, expressas de forma heteróloga e purificadas. Foram realizados ensaios de cristalização e cinéticos por espectrofotometria utilizando um sistema acoplado. A atividade da SmPNP2 foi ainda avaliada por calorimetria e HPLC. Foram determinadas as constantes catalíticas da forma nativa e para os cinco mutantes da SmMTAP para cinco diferentes substratos. Foi determinada atividade catalítica da SmPNP2 por 3 diferentes substratos: adenosina, inosina e citidina, as constantes catalíticas foram determinadas para os três substratos. Foram obtidos cristais para os mutantes da SmMTAP e da SmPNP2, que foram submetidos à difração de raios X nas linhas I04-1 e I02 do laboratório de radiação síncrotron Diamond Light Source (DLS). Foram resolvidas 9 estruturas dos mutantes da SmMTAP e 4 da proteína SmPNP2. Os dados cinéticos, juntamente com os dados estruturais, permitiram compreender mecanismos catalíticos e de interação das proteínas estudadas, complementando o conhecimento do metabolismo do parasita Schistosoma mansoni e revelando alvos em potencial para o desenvolvimento de fármacos específicos. / The parasitic illness are the leading cause of deaths in developing countries, and receives little or no attention from drug companies to develop therapies. The schistosomiasis is caused by Schistosoma mansoni parasite and affects approximately 259 million people worldwide with 6 million only in Brazil. The Schistosoma mansoni parasite does not possess the \"de novo\" pathway for purine bases biosynthesis and depends entirely on salvage pathway for its purine requirement, therefore this pathway is a potential target. Compounds able to block the enzymes from this pathway, are not specific and are often toxic to humans, thus the thorough study about the particularity found between enzymes from host and parasite are extremely important. A notable difference between human and parasite metabolism, is the activity existence to Adenosine phosphorylase that in parasite is carried out by two distinct entities: by Methylthioadenosine phosphorylase (SmMTAP) and by a hitherto unknown enzyme. The SmMTAP enzyme, naturally converts 5\'-deoxy-5\'-methylthioadenosine (MTA) to free adenine and in opposition to host, in the parasite this enzyme acts manly in adenosine conversion. Substitutions found in the active site from SmMTAP, can explain the huge preference by alternative substrate and to expose a distinct mechanisms from human enzyme. The Purine nucleoside Phosphorylase from S. mansoni (SmPNP) converts inosine and guanosine to hypoxanthine and guanine, respectively, but it not possess catalytic activity to adenosine conversion. However in the S. mansoni genome there is a isoform to SmPNP, whose activity is unknown, thus is possible that SmPNP2 enzyme also can to convert adenosine. This study aimed to perform biochemical studies to investigate the SmMTAP enzyme action and perform the structural and functional characterization of SmPNP2. For this propose was made site-directed mutagenesis (S12T, N87T, Q289L, S12T/N87T e S12T/N87T/Q289L). The SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme were cloned, expressed by heterolog process and purified. Were perform kinetic assays by spectrophotometric method in a coupled system. The SmPNP2 activity was also available by calorimetry and HPLC methods. Were determined the catalytic constants to wild and mutants SmMTAP to five different substrate. Was determinated to SmPNP2 catalictical activity and kinetics parameters to three substrate: adenosine, inosine e cytidine. Were obtained crystals from SmMTAP mutants and SmPNP2 enzyme, those crystals were submitted to X-rays diffractions in the I04-1 and I02 beamlines from Diamond Light Source (DLS). Nine structures were obtained from SmMTAP mutants and four from SmPNP2 enzyme. The kinetics and structural data allowed understanding the catalytic and interaction mechanisms about the protein studied, supplementing the knowledge around Schistosoma mansoni metabolism and reporting potential targets for the specific drugs development.

Anteriormente, foi identificada a atividade esquistossomicida da piplartina, um alcalóide-amida isolado em nossos estudos de bioprospecção em plantas da família Piperaceae. Neste trabalho, foi analisada a estrutura e as propriedades de uma série de análogos da piplartina para avaliar a relação estrutura-atividade. A atividade de análogos sintéticos da piplartina foi avaliada in vitro em vermes adultos de S. mansoni. Primeiro, os análogos foram testados a 50 e 100 μg/mL. Os compostos ativos foram selecionados para a determinação dos valores de IC50. Ao todo, 36 análogos com modificações em três regiões da piplartina foram avaliados. Todas as modificações tiveram uma influência negativa na atividade biológica; no entanto, uma seletividade específica entre os gêneros foi observada. Seis análogos tiveram os valores de IC50 determinados, variando entre 72,33 a 216,86 μM. As diferenças na atividade esquistossomicida entre a piplartina e seus análogos podem ser atribuídas a alterações na forma, equilíbrio hidrofílico-lipofílico e distribuição de carga eletrostática. / Previously, the schistosomicidal activity of piplartine, an alkaloid-amide isolated in our bioprospection studies with plants from Piperaceae species, was identified. In this work, we analyzed the structure and properties of a series of piplartine derivatives to propose a structure-activity relationship model. In vitro activity was evaluated in S. mansoni adult worms exposed in vitro to piplartine synthetic analogs. First, analogs were screened at 50 and 100 μg/mL. Active compounds were selected to the determination of IC50 values. A total of 36 synthetic piplartine analogs with modifications in three regions of the piplartine molecule were evaluated. All the modifications had a negative influence in the biological activity; nevertheless, a gender specific selectivity was observed. Of all the analogs, 6 had the IC50 values determined, ranging from 72.33 a 216.86 μM. Differences in the schistosomicidal activity between piplartine and its analogs could be attributed to changes in shape, hydrophilic-lipophilic equilibrium and electrostatic charge distribution.

Esquistossomose é uma das doenças parasitárias com maior incidência mundial. Schistosoma mansoni, a única espécie encontrada no Brasil, tem um ciclo de vida complexo que inclui seis estágios de desenvolvimento distintos e dois hospedeiros, sendo um deles o homem. Nosso grupo identificou um gene que codifica um receptor que possui homologia com o receptor de TNF-&#945; humano em S. mansoni (SmTNFR) e descrevemos o efeito in vitro da citocina humana TNF-&#945; sobre a expressão gênica em larga escala no parasita. A via de sinalização através da qual o TNF-&#945; atua sobre o parasita permanece desconhecida. Em humanos, o TNF-&#945;, ao se ligar à isoforma do receptor que é mais semelhante ao SmTNFR, inicia uma cascata de fosforilação que conduz à ativação de diversas proteínas quinases que levam à ativação de fatores de transcrição. A nossa hipótese é a de que esta citocina humana atuaria no parasita de forma semelhante, resultando na alteração da expressão gênica do parasita observada em nosso trabalho anterior. No presente trabalho tivemos como objetivo verificar se há aumento de proteínas fosforiladas após o tratamento in vitro de vermes com o TNF-&#945; humano, e identificá-las, elucidando a via de sinalização induzida por esta citocina em S. mansoni. A fim de identificar as proteínas que são significativamente diferencialmente fosforiladas após exposição de S. mansoni à citocina humana, vermes machos adultos foram incubados em cultura por 15 min com TNF-&#945; (20 ng / ml), ou somente com o veículo, em controles, seguido da extração de proteínas totais. Utilizamos a abordagem fosfoproteômica por meio da realização de eletroforese bidimensional, seguida de coloração com corante específico para fosfoproteínas Pro-Q Diamond (Invitrogen). Para identificar quais proteínas tiveram fosforilação alterada pelo tratamento, fizemos uma análise quantitativa dos spots (volume dos spots) nas imagens dos géis corados com Pro-Q, utilizando o software 2D Platinum (GE). Em seguida a coloração de proteína total dos géis foi realizada utilizando Coomassie Blue Coloidal, para localização de todos os spots de proteínas de cada gel. Cortamos dos géis os spots de proteínas que apresentaram mudanças estatisticamente significativas na fosforilação (n = 3 réplicas; p <0,05, teste-t), com base na comparação de seus volumes relativos nas imagens dos géis das amostras tratadas comparadas com as controles, e em seguida as proteínas das amostras foram identificadas por espectrometria de massa. Analisamos três réplicas biológicas e observamos 45 spots que tiveram fosforilação significativamente alterada, sendo que 42 deles apresentaram fosforilação aumentada e 3 apresentaram fosforilação diminuída após o tratamento com a citocina. Entre os spots identificados por espectrometria de massa, verificou-se que proteínas relacionadas a processos metabólicos, sinalização celular, citoesqueleto e contração muscular estavam entre as que sofreram aumentos de fosforilação com o tratamento com TNF-&#945; humano. Embora a abordagem experimental adotada para este estudo não tenha sido sensível o suficiente para concluir qual via canônica de transdução de sinal é ativada por TNF-&#945; humano em S. mansoni, este estudo confirmou o aumento da fosforilação de proteínas-alvo induzido por TNF-&#945; humano, abrindo novos caminhos para uma investigação mais aprofundada que caracterize o papel das proteínas identificadas como alteradas por essa via de sinalização, e permita entender melhor a importância do TNF-&#945; humano na biologia do S. mansoni e na interação parasita-hospedeiro. / Schistosomiasis remains one of the parasitic diseases with the highest incidence worldwide. Schistosoma mansoni, the only species found in Brazil, has a complex life cycle which includes six life stages and two hosts, one of them being humans. Our group has identified a gene that encodes a TNF-alpha receptor-like in S. mansoni (SmTNFR) and described the in vitro effect of human TNF-alpha cytokine on large-scale gene expression of the parasite. The signaling pathways by which TNF-alpha acts upon the parasite remain unknown. In humans, when TNF-alpha binds to the receptor isoform that is most similar to SmTNFR it initiates a phosphorylation cascade that activates a signaling pathway leading to the activation of transcription factors. Our hypothesis is that this cytokine could act in the parasite through a phosphorylation cascade that activates transcription factors resulting in the change of gene expression observed in our previous work. The aim of this work was to verify if there were proteins that showed increased phosphorylation upon the in vitro treatment of worms with human TNF-alpha, identifying them, to try and elucidate the signaling pathway by which the cytokine acts in S. mansoni. In order to identify which proteins are significantly differentially phosphorylated upon exposure of S. mansoni to the human cytokine, we incubated male adult worms for 15 min in culture with human TNF-alpha (20 ng / ml), or with vehicle only, in controls, and we extracted total proteins from the parasites. We used the phosphoproteomics approach of bidimensional gel electrophoresis followed by phospho-specific staining of gels using Pro-Q Diamond dye (Invitrogen). To identify which proteins were phosphorylated or had their phosphorylation changed due to the treatment, we quantified the spots (determined the spots volumes) from Pro-Q stained gels using Image Master 2D Platinum software (GE). A total protein staining of the gels was performed using Coomassie Brilliant Blue (CBB) in order to localize all protein spots in the gel. We excised from CBB stained gels the protein spots that showed statistically significant changes in phosphorylation (n= 3 replicates; p-value<0.05, t-test), based on the relative volumes of their spot images with respect to the total volume of spots in the gel, with samples from treated compared to control parasites, and subsequently the proteins in these samples were identified by mass spectrometry. We have analyzed three biological replicates and observed 45 spots that were differentially phosphorylated; 42 of them had their phosphorylation increased and 3 had their phosphorylation decreased upon a 15-min-treatment of male adult worms with the cytokine. Among the spots identified by mass spectrometry, we found proteins related to metabolic process, cell signaling, and cytoskeleton and muscle contraction. Although the experimental approach adopted for this study was not sensitive enough to conclude which canonical signal transduction pathway is activated by human TNF-alpha in S. mansoni, this kind of study confirmed the increase in phosphorylation of target proteins induced by human TNF-alpha, opening new paths for further investigation in order to characterize the role of the proteins identified as altered by this specific signaling, which will lead to a better understanding of the importance of this cytokine in the biology of S. mansoni and in host-parasite interaction.

Neste estudo avaliou-se o efeito in vitro de 4 compostos isolados de espécies vegetais, as amidas piplartina e piperina, a lignana grandisina e o alcaloide epiisopiloturina; 1 composto isolado da pele de anfíbio, o peptídeo antimicrobiano dermaseptina 01; e de 6 extratos etanólicos obtidos de vegetais, Piper tuberculatum, P. crassinervium, P. diospyrifolium, P. fuligineum, P. gaudichaudianum e Pothomorphe umbellata em adultos (machos e fêmeas com 49 dias) e esquistossômulos (recém-transformados, 1, 3, 5 e 7 dias) de Schistosoma mansoni linhagem BH. O estudo avaliou: 1) a viabilidade de vermes adultos; 2) a capacidade reprodutiva, avaliada pelo acasalamento e oviposição; 3) o efeito no tegumento em parasitas adultos; 4) a viabilidade e o efeito no tegumento em esquistossômulos; 5) a citotoxicidade de compostos e extratos em células de mamífero (célula Vero). Além disso, com microscopia confocal, neste estudo é proposto um novo modelo experimental que avalia, quantitativamente, o efeito de esquistossomicidas no tegumento dos esquistossomos. / In this study, the in vitro effect of 4 compounds isolated from plant species, amides piplartine and piperine, the lignin grandisin and alkaloid epiisopiloturine; 1 compound isolated from amphibian skin, the antimicrobial peptide dermaseptin 01; and 6 ethanolic extracts of plants, Piper tuberculatum, P. crassinervium, P. diospyrifolium, P. fuligineum, P. gaudichaudianum and Pothomorphe umbellata was evaluated in adults worm pairs (49-day-old) and schistosomula (newly-transformed, 1-, 3-, 5-, and 7-day-old) of Schistosoma mansoni BH strain. The effect of compounds and extracts against schistosomes was examined regarding: 1) adult worms survival, 2) the reproductive fitness as assessed by mating and oviposition; 3) alterations on adult worms tegumental surface; 4) viability and morphological alterations on schistosomula; 5) the cytotoxicity of compounds and extracts in mammalian cells (Vero cells) In addition, this study shows a new experimental model to evaluate quantitatively the effect of schistosomicidal drugs on the tegument of the schistosomes.

A classe de proteínas das MEGs (codificadas por genes de micro-éxon) presente em Schistosoma mansoni, ganhou evidência após a publicação do genoma deste parasita, principalmente por ser majoritariamente secretada, estando em contato direito com moléculas do hospedeiro, e possuir alta taxa de variação, o que poderia ter relação com um possível um mecanismo de evasão do sistema imune. Assim, foram escolhidas proteínas da classe das MEGs, todas com predição de hélice anfipática em sua estrutura, para investigação neste trabalho. Hélices anfipáticas são amplamente descritas na literatura como tendo alta propensão à interação com membranas celulares e interessantes funções fisiológicas. O objetivo deste projeto foi estudar a dinâmica de interação com membranas e estabelecer possíveis indícios de função biológica das proteínas MEG-24 e MEG-27 a partir de técnicas biofísicas. Optou-se por trabalhar com essas proteínas produzidas a partir da síntese química. Utilizando as técnicas de CD, Fluorescência e DLS, observou-se que a presença de miméticos de membrana induzem o enovelamento e o aumento da estabilidade térmica de MEG-27, e interferem no seu estado oligomérico. Para MEG-24, também foi observado aumento da estabilidade térmica e influência no estado oligomérico na presença de sistemas miméticos de membrana. Utilizando OCD, inferiu-se que MEG-27 possivelmente interage com a superfície da membrana, a passo que MEG-24 se insere na bicamada. Adicionalmente, ambas foram capazes de interferir na dinâmica de vesículas, conforme observado pelo ensaio de vazamento de calceína e DSC. Utilizando células de eritrócito e um modelo de membrana a partir dessas células (ghosts) foram realizados ensaios biológicos, DSC e EPR. A capacidade de MEG-24 e MEG-27 realizarem hemólise e hemoaglutinação, respectivamente, reitera o potencial de interação destas proteínas com membranas biológicas. Os resultados de DSC apontaram que ambas interferem nas transições das proteínas de membrana embebidas na bicamada de ghosts de eritrócitos. Por EPR, notou-se que MEG-27 tem maior efeito na dinâmica de lipídios em detrimento a MEG-24, possivelmente devido a um mecanismo de acomodação envolvendo domínios raft e a diferença de orientação de interação entre ambas as proteínas. A expressão de MEG-27 exclusivamente na região da glândula do esôfago em vermes adultos verificada por WISH, sugere que a mesma deva entrar em contato com células recém ingeridas pelo parasita. Não foi observada atividade antimicrobiana para ambas e não foram encontrados parceiros de interação proteínas pela técnica de Duplo-híbrido para MEG-27. Concluiu-se que os peptídeos estudados interagem com membranas biológicas, podendo ter papéis importantes na interface de interação parasito-hospedeiro. / The class of MEGs proteins (coded by micro-exon genes) present in Schistosoma mansoni, drawn attention after the parasite genome publication. This proteins are mostly secreted, being in direct contact with host molecules and with a high rate of variation, which could be a mechanism of Imune system evasion. Thus, proteins of the MEGs class, all with amphipathic prediction in their structure, were chosen for investigation in this work. Amphipathic helices are widely described in the literature with high propensity to interact with membranes and, consequently, probability of related biological function. The objective of this project was to study the interaction dynamics with membranes and to establish possible indications of biological function of MEG-24 and MEG-27 proteins from biophysical techniques. We chose to work with these proteins produced by chemical synthesis. Using CD, Fluorescence and DLS techniques, it was observed that the presence of membrane mimetics induced the folding and increased thermal stability of MEG-27, and interfered with its oligomeric state. For MEG-24, an increase in thermal stability and influence on the oligomeric state was also observed when in the presence of membrane mimetic systems. The results of OCD suggest that MEG-27 possibly interacts with the membrane surface, whereas MEG-24 is inserted into the bilayer. Both were able to interfere with vesicle dynamics, as observed by the Leakage and DSC tests. Using a more realistic membrane model from erythrocyte cells, biological assays, DSC and EPR were performed. The ability of MEG-24 and MEG-27 to perform hemolysis and hemagglutination, respectively, provides evidence of the potential for interaction of these proteins with biological membranes. The DSC results indicated that both interfere with the transitions of the membrane proteins embedded in the bilayer of erythrocyte ghosts. By EPR, it was noted that MEG-27 has a greater effect on lipid dynamics than MEG-24, possibly due to an accommodation mechanism involving raft domains and the difference in orientation of interaction between both proteins. The expression of MEG-27 exclusively in the region of the esophagus gland in adult worms verified by WISH suggests that it should come into contact with cells just ingested by the parasite. No antimicrobial activity was observed for both and no protein interaction partners were found by the MEG-27 double-hybrid technique. It was concluded that the studied peptides interact with biological membranes and may have important roles in the parasite-host interaction interface.

A doença granulomatosa inflamatória envolve interações coordenadas entre linfócitos, monócitos/macrófagos, células epitelióides, eosinófilos, neutrófilos e fibroblastos. A comunicação intercelular mediada por junções gap, constituídas por conexinas, é responsável pela homeostase tecidual. A Cx43 está presente em células linfóides, células mielóides, fibroblastos e outras. Assim, para compreendermos o possível envolvimento das conexinas no granuloma, nós analisamos o efeito da deleção heterozigótica de uma Gja1 (gene Cx43) na formação e desenvolvimento dos granulomas hepáticos, induzidos por ovos de Schistosoma mansoni. Para tanto, camundongos heterozigotos (Cx43+/-) e selvagens (Cx43+/+) foram infectados com cercárias de Schistosoma mansoni e avaliados nos tempos: 6, 8 e 12 semanas após a infecção. As células dos granulomas apresentaram expressão de conexina 43, notadamente após 12 semanas de infecção. As lesões dos camundongos Cx43+/- apresentaram índice de proliferação reduzido e aumento na deposição de colágeno em fases tardias da doença. Apesar desses achados, não se encontrou redução no tamanho e celularidade das lesões em comparação aos camundongos selvagens. Também não obtivemos diferenças em relação ao hemograma ou população de linfócitos esplênicos CD4, CD8 e CD19. As células peritoneais dos animais de ambos genótipos apresentaram produção de NO e H<SUB2O<SUB2 similares. Contudo, os neutrófilos e monócitos sanguíneos dos animais Cx43+/-, estimulados por PMA, apresentaram aumento significante do burst oxidativo. Concluindo, nossos resultados indicam que a deleção de um alelo do gene da Cx43 modifica claramente a evolução da doença granulomatosa, mostrando um papel desta conexina no desenvolvimento do granuloma. / Inflammatory granulomatous disease involves coordinated interactions among lymphocytes, monocytes/macrophages, epithelioid cells, eosinophils, neutrophils and fibroblasts. Intercellular communication mediated by gap junctions constituted of connexins, is responsible for tissue homeostasis. Cx43 is present in lymphoid cells, myelogenous cells, fibroblasts and others. In order to understand the possible involvement of connexins in granuloma, we analyzed the effect of the heterologous deletion of a Gja1 (Cx43 gene) on the formation and development of hepatic granulomas induced by Schistosoma mansoni eggs. Heterozigous (Cx43+/-) and wild-type (Cx43+/+) mice were infected with S. mansoni cercarie and evaluated after 6, 8 and 12 weeks. Granuloma cells express Cx43, with considerable reduction in Cx43+/- mice. Moreover, granuloma cells from Cx43v+/- mice displayed reduced proliferation and increased collagen deposition at late phases of the disease. Despite these findings, no reduction of size or cellularity of the lesions was found in comparison to wild-type mice. We didn?t find differences in relation to blood count and splenic lymphocyte population CD4, CD8 and CD19. Peritoneal cells from animals of both genotypes presented similar production of NO and H2O2. However, blood neutrophils and monocytes from Cx43+/- mice, stimulated by PMA, displayed significantly increased oxidative burst. In conclusion, our results indicate that the deletion of one allele of the Cx43 gene clearly modifies the evolution of a granulomatous disease, supporting a role for this connexin on granuloma development.

A esquistossomose é um grave problema de saúde pública, com alta mortalidade e morbidade em países endêmicos, causada pelo verme trematódeo do gênero Schistosoma. O praziquantel é a única droga disponível para tratamento da doença, é usada em larga escala para tratamento de populações de áreas endêmicas, porém não previne a reinfecção e tem efeito somente em vermes adultos. Drogas estudadas em câncer como inibidores de histona deacetilases (iHDACs) modificam o padrão epigenético da célula desencadeando a morte celular, e em Schistosoma mansoni já foi mostrado que a inibição de HDACs além de aumentar a acetilação de histonas alterou o fenótipo de miracídios e provocou morte em esquistossômulos e vermes adultos. O presente estudo investigou o efeito do iHDAC Trichostatin A (TSA) na regulação da transcrição gênica em esquistossômulos, detectando por meio de ensaios de microarray centenas de genes diferencialmente expressos, relacionados a replicação de DNA, metabolismo e complexos modificadores de histonas. A inibição de HDAC em vermes adultos levou a um aumento da acetilação nas marcas de histonas H3K9ac, H3K14ac e H4K5ac relacionadas à indução de transcrição. Com imunoprecipitação de cromatina seguida de PCR (ChIP-qPCR) detectou-se o aumento de deposição de H3K9ac e H3K14ac na região promotora de genes com expressão aumentada ou diminuída, porém a marca de repressão H3K27me3 não sofreu alteração na região promotora de nenhum gene analisado. Análises adicionais indicaram um conjunto de genes diferencialmente expressos que codificam proteínas histone readers, que fazem parte de complexos modificadores de histonas, como EED capaz de identificar a marca de repressão H3K27me3 e regular a atividade de EZH2, apontando um novo alvo terapêutico. O efeito sinérgico entre iHDAC e um iEZH2 foi testado e detectou-se o aumento da mortalidade de esquistossômulos. A estrutura de SmEZH2 foi modelada por homologia e usada para análises computacionais que sugeriram uma alta afinidade de ligação de SmEZH2 com o iEZH2, abrindo uma perspectiva de desenvolvimento de novas drogas específicas para tratamento da esquistossomose. / Schistosomiasis is a serious public health problem, with high mortality and morbidity in endemic countries, caused by trematode worms of the genus Schistosoma. Praziquantel is the only available drug for treatment of the disease; it is used extensively to treat populations in endemic areas, but does not prevent reinfection and is effective only in adult worms. Drugs studied in cancer as histone deacetylase inhibitors (iHDACs) modify the epigenetic status of the cell, triggering cell death, and it has been shown in Schistosoma mansoni that inhibition of HDACs increase histone acetylation, alter the phenotype of miracidia and cause death in schistosomules and adult worms. The present study investigated the effect of iHDAC Trichostatin A (TSA) on the regulation of gene transcription in schistosomules, detecting by means of microarray assays hundreds of differentially expressed genes related to DNA replication, metabolism and histone remodeling complexes. Inhibition of HDAC in adult worms led to an increase in histone acetylation marks H3K9ac, and H3K14ac H4K5ac related to transcriptional induction. With chromatin immunoprecipitation followed PCR (ChIP-qPCR) we detected an increased deposition of H3K9ac and H3K14ac at the promoter region of genes with increased or decreased expression, but the repressive mark H3K27me3 was not changed at all analyzed gene promoter regions. Additional analysis indicated a set of differentially expressed genes that encode histone reader proteins that are part of histone modifier complexes such as EED, which is able to identify the repression mark H3K27me3 and to regulate EZH2 activity, pointing to a new therapeutic target. The synergistic effect between iHDAC and one iEZH2 has been tested and found to cause an increase in schistosomules mortality. The SmEZH2 structure was modeled by homology and used for computational analyses, which suggested a high affinity binding of SmEZH2 with iEZH2, opening the opportunity for development of new specific drugs for treatment of schistosomiasis.

Septinas são proteínas pertencentes à família das GTPases que estão envolvidas em uma variedade de funções celulares. Verificamos através de análises bioinformáticas que Schistosoma mansoni, um dos principais agentes etiológicos da esquistossomose, possui quatro genes que codificam septinas (SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2). O objetivo deste trabalho foi a produção heteróloga das proteínas codificadas por estes genes, visando estudos estruturais e funcionais das mesmas. As septinas SmSEPT5 e SmSEPT10 foram expressas em sistema recombinante e foi possível a obtenção de formas solúveis destas proteínas. Experimentos de gel filtração e cross-linking mostraram que elas são diméricas em solução e estáveis em ampla faixa de pH, embora agregados proteicos tenham sido observados com o aumento da temperatura. Ambas as proteínas foram capazes de ligar GTP e GDP, embora apenas SmSEPT5 tenha apresentado atividade GTPásica. Mg2+ se mostrou essencial para a ligação de GTP a ambas as proteínas, enquanto a ligação do GDP foi independente da presença deste cofator. Ensaios de cristalização com o domínio GTPase de SmSEPT10 resultaram em cristais de ótima qualidade cuja difração resultou na obtenção da estrutura com melhor resolução alcançada até o momento para septinas: 1.9 &Aring; para a forma ligada a GDP e 2.1 &Aring; para a forma ligada a GTP. A análise da sobreposição das estruturas obtidas resultou na observação do deslizamento de uma fita &beta; em relação às demais, que acreditamos estar envolvido com o mecanismo de associação destas proteínas à membranas. Um sistema de coexpressão foi construído em que SmSEPT5, SmSEPT10 e SmSEPT7.2 foram coexpressas e copurificadas, resultando na verificação da formação de hetero-oligômeros e filamentos por estas proteínas. Tratamento de diversas fases do ciclo de vida do parasito com um composto (FCF) que afeta a dinâmica de filamentos de septina, resultou em um fenótipo reversível de paralisia no parasito. Estudos de imunolocalização revelaram a colocalização de septinas e actina em fibras musculares do parasito, sugerindo que a interação entre filamentos de septina e actina pode ter um papel importante nas funções motoras do parasita. A imunolocalização revelou ainda a presença de septinas em placas epiteliais ciliadas de miracídios, células germinativas de miracídios e esporocistos e protonefrídios de cercárias. Os resultados apresentados aqui constituem a primeira descrição de septinas em platelmintos e nos possibilitam o estabelecimento de correlações estruturais e funcionais entre septinas de S. mansoni e complexos análogos de septinas de outros organismos, contribuindo para a elucidação da função desta família de proteínas. / Septins belong to the GTPase family of proteins and are involved in a variety of cellular processes. We have identified four genes encoding septins in Schistosoma mansoni, one of the main causative agents of schistosomiasis, these genes were named SmSept5, SmSept10, SmSept7.1 e SmSept7.2. The aim of this study was to clone the cDNA of these genes in order to subject the resulting proteins to a set of biophysical and functional studies. Biophysical characterizations were undertaken with SmSEPT5 and SmSEPT10 because of the higher solubility of these proteins, which were dimeric in solution and stable over a wide range of pH, although increasing temperatures promoted the aggregation of these proteins. The nucleotide binding assays revealed that both were capable of binding GTP and GDP, although only SmSEPT5 presented GTPase activity. Mg2+ has shown to be essential for GTP binding in both proteins while GDP binding was independent of this cofactor. Crystallization assays with the GTPase domain of SmSEPT10 have resulted in crystals of high quality and consequently high resolution structures were obtained: 1.9 &Aring; to the GDP bound form and 2.1 &Aring; to the GTP bound form, the best resolution achieved to date for any septin member. The sobreposition of the structures obtained enabled us to observe a strand slippage in &beta;3 strand suggesting that it might be part of an activation mechanism involved in the association of these proteins to membranes. A coexpression system was produced, in which SmSEPT5, SmSEPT10 and SmSEPT7.2 were coexpressed and copurified. These proteins were able to assemble into heterocomplexes that further polymerize into filaments. Functional studies performed with a drug (FCF) that affects the dynamics of septin filaments have resulted in a reversible paralysis phenotype in the parasite. Immunolocalization experiments revealed the colocalization of septins and actin in muscular structures of the parasite, suggesting that the interaction of septin and actin filaments might have an important role in the motor activity of the parasite. The immunolocalization also revealed the presence of septins in the ephitelial plates of miracidia, germ cells of miracidia and sporocysts and protonephridia of cercariae. The results presented here constitute the first description of septins in phatyhelmintes and enabled us the establishment of structural and functional relaltionships among septins from S. mansoni and analogous septin complexes in other organisms, contributing to elucidate the function of this family of proteins.

Neste trabalho caracterizou-se a família das nucleotídeo pirofosfatases/ fosfodiesterases do parasita S. mansoni visando avaliá-los como antígenos vacinais. O parasita possui quatro proteínas desta família (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c e SmNPP-6), sendo que duas delas possuem maior expressão gênica nos estágios que infectam o homem. Dos anticorpos produzidos, apenas o anti-SmNPP-5a apresentou especificidade para a proteína nativa e utilizando-os demonstrou-se que a SmNPP-5a é uma glicoproteína associada às membranas do tegumento dos vermes adultos. Também se verificou que esses anticorpos inibiram parcialmente a atividade da enzima em parasitas vivos. Assim avaliamos a SmNPP-5a recombinante como antígeno vacinal juntamente com uma apirase (SmATPDase) e com a fosfatase alcalina (SmAP), outras duas nucleotidases presentes no tegumento de parasitas adultos. A SmNPP-5 e a SmNTDPase apresentaram menor imunogenicidade que a SmAP. Porém só verificamos a redução da carga parasitária em animais imunizados com a SmAP e tratados com doses subcurativas de praziquantel. / In this work the family of nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (NPP) from S. mansoni was characterized in order to evaluate them as vaccine antigens. The parasite has four proteins of this family (SmNPP-5a, SmNPP-5b, SmNPP-5c and SmNPP-6), whereas two of them present higher gene expression in stages that infect humans. Only anti-SmNPP-5a anitbodies showed specificity for the native protein. We use them to characterize SmNPP-5a as a glycoprotein associated with tegument membranes from adult worms. It was also found that these antibodies were able to partially inhibit the activity of the enzyme in live parasites. Thus we evaluated SmNPP-5a as recombinant vaccine antigen together with an apyrase (SmATPDase) and alkaline phosphatase (SmAP), two other nucleotidases involved in nucleotide metabolism and present in the tegument of adult parasites. SmNTDPase and SmNPP-5 were less immunogenic than SmAP. However, we only verified the reduction of parasite burden in mice immunized with SmAP, when the animals also received a subcurative treatment with praziquantel.