A Esquistossomose é uma das mais importantes doenças endêmicas do mundo, com mais de 200 milhões de pessoas infectadas em 76 países. É estimado que mais de 600 milhões de pessoas estejam em áreas endêmicas. Em 2003 dados do transcriptoma do Schistosoma mansoni foram disponibilizados. As informações de proteínas codificadas permitiram a análise de suas funções, e auxiliaram na procura de novos candidatos vacinais. A análise do transcriptoma permitiu a identificação de três famílias de proteínas homólogas à dineína de cadeia leve (DLC) de mamíferos. Uma delas é a família L8, com ao menos 18 membros, com proteínas em torno de 10 kDa. Essas proteínas são expressas em diferentes estágios do ciclo de vida do Schistosoma mansoni. Duas DLCs foram reconhecidas no tegumento de S. japonicum, sugerindo que elas são expostas ao sistema imune do hospedeiro. Salmonelas atenuadas como vacinas vivas têm sido descritas como bons veículos para apresentação de antígenos heterólogos. No nosso laboratório uma importante ferramenta tem sido desenvolvida para auxiliar o uso de salmonelas como vacinas vivas recombinantes, foi desenvolvido um vetor plasmididal baseado no regulon soxRS para controlar a expressão de genes heterólogos in vivo. Este sistema de expressão promove a expressão de proteínas recombinantes sob condições de estresse oxidativo, como aquele imposto ao microorganismo dentro do macrófago. Para investigar o potencial vacinal das DLCs, três genes foram selecionados para serem clonados e expressos em E. coli e em salmonelas atenuadas. A antigenicidade e imunogenicidade desses parálogos foram testadas em camundongos depois de serem imunizados com proteínas purificadas ou com salmonelas recombinantes. As DLCs mostraram ser bastante imunogênicas, aumentando os título de IgG. A proteína DLC1 também aumentou os níveis de IgE no soro dos animais, fato que poderia estar relacionado com reações alérgicas observadas em populações infetadas. Altos níveis de IgE também podem ser relacionados com uma marca de resistência existente em pessoas que vivem em áreas endêmicas. Depois de imunizados os animais foram desafiados com cercárias para investigar possível proteção. Foi observado que a imunização com proteínas purificadas resultou em aproximadamente 40% de diminuição da carga parasitária. A análise dos granulomas hepáticos com 45 dias depois da infecção indicou uma significativa redução, maior que 70% das áreas dos granulomas, sgerindo que a imunização com as DLCs promove uma importante interferência na formação dos granulomas hepáticos. Por outro lado, nossos estudos com salmonelas atenuadas recombinantes, carregando as DLCs, mostraram que foram ineficientes na apresentação dos antígenos ao sistema imune. Relacionando os resultados de diminuição de carga parasitária e das áreas dos granulomas depois da imunização com as DLCs purificadas sugere-se que essas proteínas podem ser consideradas como interessantes candidatos vacinais, uma vez que elas afetam as mais importantes causas da patologia da esquistossomose. / Schistosomiasis is one of the most important endemic diseases in the world, with more than 200 million people infected in 76 countries. It is estimated that more than 600 million people live in endemic areas. In 2003 extensive data from the transcriptome of Schsitosoma mansoni was made available. The information on the encoded proteins allowed the analysis of protein function and improved the search for vaccine candidates. The analysis of the transcriptome allowed the identification of three families of proteins homologs to the mammalian dynein light chain (DLC). One of these was the L8 family, with at least 18 members, all proteins with around 10 kDa. These proteins were found to be expressed in the different stages of the S. mansoni life cycle. Two DLCs were recognized in the tegument of S. japonicum, suggesting that they are exposed to the host immune system. Attenuated salmonellas, as live vaccines, have been described as good vehicles for presentation of heterologous antigens. At our laboratory an important tool has been developed to improve the use of salmonellas as live recombinant vaccines, a plasmidial vector based on the soxRS regulon to control the expression of heterologous genes in vivo. This expression system promotes the expression of recombinant proteins under conditions of oxidative stress, such as that imposed to the microorganism in the macrophage environment. To investigate the vaccine potential of DLCs, three genes were selected to be cloned and expressed in E. coli and in attenuated salmonellas. Antigenicity and immunogenicity of these paralogous were tested in mice after immunization with purified proteins or with the recombinant salmonellas. The DLCs were proven to be very immunogenic, increasing the IgG titers. DLC1 also increased the IgE levels in the sera of animals, what could be related to allergenic reactions observed in infected population. High level of IgE can also be related to the resistance mark of people living in endemic areas. After immunization, the animals were challenged with cercarias to investigate the protective profile. It was observed that immunization with purified proteins resulted in approximately 40% decreasing in the worm burden. The analysis of the hepatic granulomas 45 days after infection indicated a significant, up to 70 %, reduction of the granuloma areas, suggesting that immunization with DLCs promotes important interference in the hepatic granuloma formation. On the other hand, our studies with the attenuated recombinant salmonellas, carrying DLCs, showed no effective antigen presentation to the mice immune system. Taking together, the results of decreasing the worm burden and the granuloma size after immunization with purified DLCs suggest that these proteins could be considered as interesting vaccine candidates, affecting the main causes of the pathology of schistosomiasis.

The blood fluke Schistosoma mansoni and the hard tick Ixodes ricinus produce an aspartic protease cathepsin D which initiates degradation of hemoglobin, their key nutrient. First, in the presented work, the protocol for refolding and activation of the zymogen of cathepsin D from I. ricinus (IrCatD) was developed and optimized. In acidic pH the propeptide of IrCatD zymogen was removed by an auto-activation mechanism. Further, a kinetic assay with fluorogenic substrates was employed to study functional properties of IrCatD including pH optimum, substrate and inhibition specificities. Second, two isoforms of cathepsin D from S. mansoni (SmCatD) were produced using recombinant expression in E. coli. These recombinant proteases were isolated from inclusion bodies using affinity chromatography under denaturating conditions, and protocol for their refolding was developed and optimized. The studied aspartic proteases are pharmacological targets: inhibitors of SmCatD represent potential chemotherapeutics for the treatment of schistosomiasis, and IrCatD is a candidate antigen for the development of novel anti-tick vaccines.

La schistosomiase représente actuellement la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme. Annuellement, cette pathologie est responsable de 280 000 décès et 700 millions d’individus y sont exposés dans 74 pays à travers le monde. Actuellement, le traitement de la schistosomiase repose sur l’utilisation d’un seul médicament, le Praziquantel®. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments est devenu une priorité absolue pour l’OMS. Dans cette étude, notre objectif a été d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de développer de nouveaux précurseurs de médicaments. Au cours de ce projet, nous avons focalisé nos recherches sur les enzymes impliquées dans la modification des histones et plus particulièrement sur les sirtuines, qui sont des lysines désacétylases NAD+ dépendantes.Dans une première partie, nous avons caractérisé 5 orthologues de sirtuines de mammifères chez Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 et 7). De plus, nous avons étudié le potentiel des sirtuines comme cibles thérapeutiques pour le traitement de la schistosomiase en évaluant la toxicité d’inhibiteurs génériques de sirtuines humaines sur des parasites maintenus en culture. Ainsi, nous avons montré que les inhibiteurs de sirtuines humaines affectent in vitro la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes. De plus, ces inhibiteurs induisent des changements morphologiques de l’appareil génital du ver femelle.Dans une seconde partie, nous avons entrepris d’étudier plus spécifiquement le rôle de SmSirt2 en tant que cible thérapeutique. Ainsi, l’expression de la protéine recombinante en bactérie E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) ainsi que l’optimisation d’un dosage fluorimétrique nous ont permis de montrer que SmSirt2 présente une activité lysine désacétylase in vitro (collaboration: M. Jung, Université Albert-Ludwigs, Freibourg). De plus, l’utilisation de ce dosage nous a permis de mettre en place le criblage à haut débit d’une chimiothèque de plus de 80 000 composés afin d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices de l’enzyme SmSirt2 (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm). Les composés les plus prometteurs, ont été testés in vitro sur des parasites en culture. Les résultats obtenus démontrent que les inhibiteurs de SmSirt2 affectent également la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes.Dans une dernière partie, nous avons mis en place un criblage d’une banque d’ADNc de vers adultes par la technique du double hybride en levure dans le but d’identifier les partenaires protéiques de Sirt1 chez S. mansoni. L’analyse partielle des résultats nous a permis de mettre en évidence que SmSirt1 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans la régulation des gènes chez le schistosome. Au cours de ce projet, nous avons également développé et optimisé un protocole permettant d’étudier l’activité enzymatique de SmSirt1 par injection d’ARNm dans des ovocytes de Xénope. Ainsi, nous avons pu montrer que le sirtinol et la salermide, deux inhibiteurs de Sirt1 humaine, présentent également une activité inhibitrice sur l’enzyme du parasite (collaboration: K. Cailliau, Université des Sciences et Technologies, Lille).L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse suggère que les sirtuines sont des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de la schistosomiase. Parmi les 5 orthologues identifiés chez S. mansoni, SmSirt2 semble une cible prometteuse. De plus, le criblage à haut débit que nous avons réalisé sur l’enzyme recombinante a permis d’identifier des molécules qui, après bio-optimisation, pourront être des candidats médicaments. Pour finir, ces résultats participent à une meilleure compréhension du rôle biologique des sirtuines chez S. mansoni et plus particulièrement sur leur implication dans la survie et la reproduction du parasite. / Schistosomiasis is the second most important parasitic disease worldwide after malaria. It is responsible for about 280 000 deaths annually and 700 million people in 74 countries are exposed to infection. Treatment of schistosomiasis currently depends on the use of the only available drug, praziquantel, and for this reason the development of new drugs is a strategic priority of the W.H.O. In this study, our objective was to identify novel therapeutic targets in order to develop new lead molecules for drug development. During this project we have focused our research on enzymes involved in histone modification, and more particularly on sirtuines, which are NAD+-dependent lysine deacetylases.In the first part of the project, we have identified 5 homologues of mammalian sirtuins in Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 and 7). Moreover, we studied the potential of sirtuins as therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis by evaluating the toxicity for parasites maintained in culture of generic inhibitors of human sirtuins. In this way we showed that these inhibitors affect the viability of schistosomula and the stability of pairing and egg production of adult worms. Moreover, these inhibitors caused major morphological changes, particularly to the female worm genital apparatus.A second part of our work was devoted to the more detailed study of SmSirt2 as a therapeutic target. Immunisation of mice with the recombinant protein allowed us to obtain specific antibodies and to show that SmSirt2 protein is expressed at all parasite developmental stages. Furthermore, the use of the recombinant SmSirt2 expressed in E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) and the optimization of a fluorimetric assay allowed us to show that SmSirt2 possesses a lysine deacetylase activity (collaboration: M. Jung, University Albert-Ludwigs, Freibourg). Moreover, the use of this assay allowed the setting up of a high-throughput screen (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm) of more than 80 000 compounds in order to identify novel inhibitors. The most promising candidates were tested on parasites in culture and the results obtained showed that SmSirt2 inhibitors also affect the viability of schistosomula, as well as the stability of pairing and egg production of adult worms.In parallel, we have carried out screening of a yeast two-hybrid cDNA library in order to identify protein partners of Sirt1 in S. mansoni. The partial analysis of the results obtained shows that SmSirt1 interacts with several proteins involved in gene regulation. In the course of this project, using the enzyme expressed in Xenopus oocytes we were able to show that both sirtinol and salermide, inhibitors of human Sirt1, also inhibit the schistosome enzyme (Collaboration: K. Cailliau, University of Sciences and Technologies, Lille).Taken together, the results of this thesis project suggest that sirtuins are potential therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis. Of the five orthologues of human sirtuins identified in S. mansoni, SmSirt2 seems to be a promising target. Moreover, high-throughput screening using the recombinant enzyme identified inhibitors that, after bio-guided optimization, could be drug candidates. Finally, these results contribute to a better understanding of the biological role of S. mansoni sirtuins and in particular their importance in parasite survival and reproduction.

Intensive study of interleukin-4 for more than three decades has revealed multiple functions of this cytokine in diverse processes. Nevertheless, the wide distribution of Interleukin-4 suggests the possibility of unexplored roles. Indeed, in here we present a novel role of IL-4 for the maintenance of different populations of stromal cells in peripheral lymph nodes at homeostasis and describe a role of IL-4 in the expansion of these stromal populations following antigen challenge. In consequence, IL-4 is fundamental for mounting an appropriate humoral response to a primary immunization, and absence of this cytokine is detrimental for the development of a Type 2 response. Furthermore, we describe the role of IL-4 in the immune responses of offspring antenatally exposed to <i>Schistosoma mansoni</i>antigens. Diminished IL-4 production is linked to reduced cellular T and B cells responses in offspring derived from infected mothers, which is of critical relevance to understand vaccination failure. Finally, we describe the protective role of Schistosomiasis infection in atherosclerosis and propose possible mechanism that helps explain the athero-protection. This will contribute to the discovery of novel pathways inducing protection from cardiovascular disease and help to identify possible targets for novel treatments

A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada, com alta morbidade e mortalidade, que afeta atualmente mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo. Para a Organização Mundial de Saúde o praziquantel (PZQ) é a droga de escolha para o tratamento de indivíduos parasitados, porque apresenta um amplo espectro de ação sobre Schistosoma mansoni. No entanto, alguns estudos descrevem várias cepas do parasito que são resistentes ao PZQ, fazendo-se necessário, estudos de novos medicamentos que possam ser utilizados no tratamento da esquistossomose. Neste sentido, as propriedades esquistossomicida do extrato etanólico do epicarpo de Garcinia brasiliensis, bem como suas frações obtidas por partição, tais como a hexânica, a acetato de etilia, a aquosa e os compostos isolados 7-epiclusianona e fuketina foram testadas in vitro em vermes adultos de Schistosoma mansoni. Os resultados indicam que, a fração hexânica apresentou melhor atividade in vitro sobre vermes adultos de S. mansoni, quando comparada com o extrato etanólico do epicarpo de G brasiliensis e com as frações aceto de etíla e aquosa. Com base nesse achado foi feito um cromatograma cujo resultado confirmou a 7-epiclusianona como componente majoritário da fração hexânica. Esta fração foi então cromatografada em coluna de sílica gel proporcionando a molécula purificada 7-epiclusianona, a qual mostrou uma atividade significativa contra esquistossômulo, cercárias e vermes adultos de S. mansoni. A atividade sobre os vermes adultos foi investigada pelo monitoramento da mortalidade, danos na superfície da membrana e atividade do sistema excretor. Os danos na superfície da membrana e a atividade do sistema excretor puderam ser observados pelas sondas fluorescentes Hoechst 33258 e Resorufin, respectivamente. Os resultados indicam o seu forte efeito contra esse parasita e também mostraram um efeito inibitório sobre a postura de ovos nos vermes adultos fêmeas de S. mansoni, quando comparada com o extrato original e suas frações. Ao avaliar a atividade sinérgica da 7-epiclusianona em associação com o Praziquantel no contexto in vitro foram observados efeitos sinérgicos devido a essa associação. A eficácia da 7-epiclusinona isoladamente e em associação com o PZQ também foi avaliada in vivo por meio da contagem e distribuição de vermes no mesentério e fígado e mudanças no oograma. No esquema quimioterápico utilizado, a 7-epiclusianona não apresentou atividade esquistossomicida e o resultado da associação com praziquantel não foi significativamente diferente da obtida quando administrada isoladamente. Os resultados in vitro obtidos no presente estudo confirmam que o extrato etanólico do epicarpo da G. brasiliensis, bem como suas frações hexânica e acetato de etila e a molécula isolada 7-epiclusianona isoladamente e em associação com o PZQ apresenta forte atividade esquistossomicida. No entanto, nos ensaios preliminares in vivo não foi possível observar os efeitos encontrados nos testes in vitro, da 7-epiclusianona isolada e em associação com o praziquantel. Isso provavelmente está relacionado ao fato da 7-epiclusianona ser uma substância altamente lipossolúvel o que dificulta sua solubilidade nos solventes adequados para administração oral. Ensaios posteriores serão realizados tendo como abordagem a mudança da lipofilicidade da 7-epiclusionona nos ensaios esquitossomicidas in vitro e in vivo. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease with high morbidity and mortality, which currently affects over 200 million people around the world. For the World Health Organization praziquantel (PZQ) is the drug of choice for treatment of infected individuals, because it has a broad spectrum of activity against S. mansoni. However, few studies describe several strains of the parasite that are resistant to PZQ, making studies of new drugs that can be used in the treatment of schistosomiasis necessary. In this sense, the properties of the schistosomicidal ethanolic extract of Garcinia brasiliensis epicarp and its fractions obtained by partitioning, such as hexane, the ethyl acetate, the aqueous and the compounds isolated and 7-epiclusianone and fukugetina were tested in vitro with adult worms of Schistosoma mansoni. The results indicate that the hexane fraction showed better activity in vitro on adult worms of S. mansoni, when compared with the ethanol extract of the G. brasiliensis epicarp and with ethyl acetate and aqueous fractions. Based on this finding a chromatogram was made and the results confirmed the 7-epiclusianone as major component of the hexane fraction. This fraction was then chromatographed on silica gel column providing the purified molecule 7-epiclusianone, which showed significant activity against schistosomula, cercariae and adult worms of S. mansoni. Activity on adult worms was investigated by monitoring the mortality, surface membrane damage and excretory system activity, where the damage to the surface of the membrane and on the activity of the excretory system could be observed by fluorescent probes Hoechst 33258 and Resorufin, respectively. The results indicate its strong effect against all stages of parasite and also showed an inhibitory effect on the oviposition of female adult worms of S. mansoni when compared with the original extract and its fractions. Synergistic activity of 7-epiclusianone was also evaluated in vitro in combination with Praziquantel, and synergistic effects were observed due to this association. The efficacy of 7-epiclusianone alone and in combination with PZQ in vivo has been evaluated through counting and distribution of worms in the liver and the mesentery and changes in oogram. In the chemotherapy regimen used, the 7-epiclusianone showed no schistosomicidal activity and the result of the combination with praziquantel was not significantly different from that obtained when these latter two drugs were administered alone. The in vitro results obtained in the present study confirm that the ethanol extract of the G. brasiliensis epicarp and its fractions hexane, ethyl acetate and the isolated substance 7-epiclusianone alone and in combination with PZQ shows strong schistosomicidal activity. However, in preliminary tests in vivo it was not possible to observe the 7-epiclusianone alone and in combination with praziquantel effects found in in vitro tests. Probably this is related to the fact that 7-epiclusianone be a highly liposoluble substance which makes its solubility difficult in appropriate solvents for oral administration. Subsequent tests will be conducted in order to study the change of the 7-epiclusionone lipophilicity in vitro and in vivo schistosomicidal assays.

A esquistossomose é uma doença parasitária, crônica, debilitante e em alguns casos fatal, que afeta principalmente indivíduos em áreas rurais, sendo endêmica em países tropicais e subtropicais. Por volta de 779 milhões de pessoas residem em áreas endêmicas e estão expostas ao risco de infecção. Metade dos pacientes infectados é sintomático e menos de 20 milhões apresenta manifestações severas da doença. Possui como principais transmissores os caramujos pertencentes à família Planorbidae, que, compreende o gênero Biomphalaria, que abriga três espécies transmissoras de S. mansoni no Brasil: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria tenagophila e Biomphalaria straminea. A identificação morfológica dos moluscos de água doce de importância médica é muito complexa pela grande variação intra-específica das características morfológicas, utilizadas para a identificação clássica. Para ultrapassar este problema, tem sido proposta a utilização de técnicas de biologia molecular como ferramentas adicionais para a identificação destes moluscos. Neste contexto, a PCR tem sido bem sucedida como método específico, sensível e de rápida detecção de patógenos em uma variedade de matrizes, tais como água, solo e alimentos. Portanto, o trabalho visou utilizar a biologia molecular através da PCR para auxiliar a identificação de moluscos transmissores da esquistossomose situados nas cidades do sul de Minas Gerais e pesquisa do parasita no caramujo. Estas cidades são consideradas áreas de risco devido à presença do hospedeiro intermediário e de portadores da doença vindos de outras regiões do estado ou do país. Através da técnica de PCR foi possível evidenciar a presença dos caramujos da espécie Biomphalaria tenagophila guaibenses na cidade de Arceburgo, dos quais dois deles apresentavam-se infectados, e Biomphalaria peregrina na cidade de Fama. A presença da infecção provavelmente deve-se a migração de indivíduos portadores da doença de áreas endêmicas para região estudada devido à oportunidade de emprego em plantações de cana-de-açúcar e café. O surgimento de novos vetores infectados leva a necessidade de um aumento no controle e vigilância da esquistossomose na região. / Schistosomiasis is a parasitic disease, chronic, debilitating and lethal in some cases. It is endemic in tropical and subtropical countries and affects individuals in rural areas. Around 779 million people live in endemic areas and are at risk of infection. Fifty percent of infected patients are symptomatic and less than 20 million have severe manifestations of the disease. Its main vectors snails belong to Planorbidae family, which includes genus Biomphalaria and comprises three species of Schistosoma mansoni vectors in Brazil: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria tenagophila and B. straminea. Morphological identification of freshwater molluscs with medical importance is very complicated due the large intra-specific variations in morphological characteristics used in classical identification. In order to solve this problem, molecular biology techniques were used as additional tools for the identification of these molluscs. PCR has been successfully used as a specific, sensitive and rapid detection of pathogens in water, soil and food. Therefore, this study aimed to use PCR to confirm the identity and search for parasites in vectors of schistosomiasis in the cities of south Minas Gerais. These cities are considered risk areas due to the presence of both intermediate hosts and carriers of the disease coming from other regions of the state or country. PCR was able to demonstrate the presence of Biomphalaria tenagophila guaibenses snails in the city of Arceburgo, which presented two infected samples, and non-infected samples Biomphalaria peregrina snails in the city of Fama. The presence of infection probably occurs due to the migration of individuals, who come to work in sugarcane and coffee plantations, from endemic areas to the study area,. The occurrence of new infected vectors increases the necessity for control and surveillance of schistosomiasis in the region. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

A esquistossomose é uma doença tropical negligenciada, com alta morbidade e mortalidade, que afeta atualmente mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, tendo o praziquantel (PZQ) como única opção de tratamento. Estudos descrevem várias cepas do parasito que são resistentes ao PZQ, fazendo-se necessário, estudos de novos medicamentos que possam ser utilizados no tratamento da esquistossomose. Um dos princípios do planejamento racional de fármacos consiste na escolha de alvos onde a droga produza efeito tóxico seletivo ao patógeno, e para isso é necessário definir o mecanismo de ação do fármaco proposto. A 7-epiclusianona (7-epi) é uma benzofenona que já teve atividade esquistossomicida descrita, tendo como critérios de eficácia a motilidade, danos no tegumento, acasalamento, postura de ovos, movimentação do sistema digestório e excretor. Neste sentido, o presente estudo analisou o impacto da 7-epi nos mecanismos de proteção dos vermes adultos de S. mansoni com o auxílio de ferramentas bioquímicas e biomoleculares. Uma investigação do grau de estresse oxidativo pela titulação de malondialdeído mostrou que a 7-epi na concentração de 12,5 μg/mL possui uma taxa de peroxidação lipídica no parasito reduzida quando comparada ao controle Kolliphor®, mas aumentada na concentração de 50 μg/mL (p < 0,001). De modo similar, quando se investigou a atividade no contexto ex vivo da superóxido dismutase (SOD), uma importante enzima detoxificadora do parasito, foi possível visualizar que a 7-epi interfere na sua atividade de forma significativa em relação aos controles RPMI 1640 e Kolliphor® à partir da concentração de 12,5 μg/mL (p < 0,001). Essa dosagem corresponde a 30% de inibição da atividade enzimática total em relação ao Kolliphor® e está muito próxima da dosagem de 7-epi que matou 90% dos parasitos (ED90=13,08 μg/mL) e na qual os danos no tegumento se apresentaram intensos. Complementarmente, na análise pelo docking molecular pode-se observar que a inibição da enzima não foi realizada diretamente no sítio, e que as melhores energias de interação com a 7-epi foram em uma cavidade próxima ao sítio e na junção dos monômeros. Finalmente, foram feitas análises quantitativas por qPCR do RNAm da SOD do parasito, cujos resultados não demonstraram mudança expressiva na transcrição da enzima após ação da 7-epi. Embora haja um impacto sobre a atividade da SOD do S. mansoni, este não parece ser o mecanismo principal de ação da 7-epi. Desta forma, é imprescindível a avaliação inibitória deste composto em outras enzimas do parasito, bem como a análise de outros mecanismos não enzimáticos que elucidem a ação da 7-epi em vermes adultos de S. mansoni. / Schistosomiasis is a neglected tropical disease with high morbidity and mortality, which currently affects more than 200 million people worldwide, counting only with praziquantel (PZQ) as a treatment option. Studies describe various parasite strains that are resistant to PZQ, making it necessary, studies of new drugs that can be used to treat schistosomiasis. One of the principles of drugs rational planning is to choose targets where the drug produces selective toxic effects on the pathogen, and for this is necessary to define the action mechanism of the proposed pharmaco. 7-epiclusianone (7-epi) already has schistosomicidal activity described, using as criteria of effectiveness: the motility, integument damage, mating, egg-laying and motility of the digestive and excretory system. In this direction, the present study analyzed the impact of the 7-epi against the protective mechanisms of adult worms of S. mansoni with the support of biochemical and biomolecular tools. An investigation of the degree of oxidative stress by malondialdehyde titre showed that the 7-epi at a concentration of 12,5 μg/mL has lower levels of lipid peroxidation rate comparing to the Kolliphor® control, but increased in concentration of 50 μg/ml (p <0,001). Similarly, when it investigated the activity of superoxide dismutase (SOD), an important parasite detox enzyme, in ex vivo context it was possible to see the 7-epi interfere in its activity significantly, compared to controls RPMI-1640 and Kolliphor® at a concentration of 12,5 μg /mL (p <0,001). This value corresponds to 30% of the entire enzyme activity regarding Kolliphor® and is close to the effective dose that killed 90% of the parasites (ED90=13,08 μg/mL) in which integument damages were intense. In addition, the analysis by molecular docking can observe that the inhibition of the enzyme was not performed directly on site, and that the best interaction energies with 7-epi were in a cavity near the site and in the dimer’s junction. Finally, quantitative analyzes were made by qPCR of mRNA from SOD of the parasite, that results showed no significant change in enzyme transcription after the 7-epi action. Although there is an impact on the activity of SOD of S. mansoni, this does not seem to be 7-epi main mechanism of action. Thus, it is essential the inhibitory evaluation of this compound in other parasite enzymes as well as the analysis of other non-enzymatic mechanisms that elucidate the action of 7-epi in adult worms of S. mansoni. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A esquistossomose mansônica é uma doença endêmica de países em desenvolvimento, com mais de 200 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. No Brasil, 25 milhões de pessoas vivem em área de risco, onde 10 – 20% dos indivíduos estão infectados. A doença de Chagas é uma doença infecciosa causada por protozoário intracelular obrigatório denominado Trypanosoma cruzi, com prevalência de cerca de 7 a 8 milhões pessoas infectadas em todo o mundo. A doença atinge predominantemente países da América do Sul e Central e atualmente representa uma doença tropical negligenciada. Considerando que existem áreas endêmicas comuns para ambas às doenças, o presente estudo investigou a instalação e progressão das lesões no fígado, coração e pulmão de animais coinfectados experimentalmente com Schistosoma mansoni e T. cruzi. Como o perfil imunológico que se desenvolve ao longo de cada doença é antagônico, o presente estudo admite a hipótese de que interações imunológicas negativas podem modificar a evolução natural das infecções e alterar os padrões de lesão no fígado, coração e pulmão, importantes órgãos alvos da esquistossomose e doença de Chagas. Nossos resultados demonstraram que a infecção prévia pelo S. mansoni modificou o curso natural da doença de Chagas, aumentando o número de parasitas sanguíneos, que ao contrario dos animais infectados somente com T. cruzi, mantiveram a parasitemia patente durante todo o experimento. Entretanto, a coinfecção mostrou-se benéfica ao reduzir a severidade da cardiomiopatia chagásica e a lesão pulmonar em áreas remotas ao granuloma esquistossomótico. No fígado, houve aumento da susceptibilidade à infecção pelo T. cruzi, evidenciado por maior parasitismo, lesões hepáticas acentuadas e aumento de granulomas esquistossomóticos não organizados. / Schistosomiasis mansoni is endemic in developing countries, with over 200 million people infected worldwide. In Brazil, 25 million people live in risk areas, where 10 - 20% of individuals are infected. Chagas' disease is an infectious disease caused by obligate intracellular protozoan parasite Trypanosoma cruzi called, with a prevalence of about 7 million to 8 million people infected worldwide. The disease predominantly affects countries of South and Central America and currently is a neglected tropical disease. Whereas there are common areas endemic for both diseases, the present study investigated the onset and progression of liver damage, heart and lung coinfected animals experimentally with Schistosoma mansoni and T. cruzi. As the immune profile that extends along each disease is antagonistic, this study supports the hypothesis that adverse immunological interactions may alter the natural course of infections and change lesion patterns in the liver, heart and lung, major target organs of schistosomiasis and Chagas disease. Our results showed that prior infection with S. mansoni modified the natural history of Chagas disease, increasing the number of blood parasites, which unlike the animals infected only with T. cruzi, maintained the patent parasitaemia throughout the experiment. However, coinfection was beneficial to reduce the severity of Chagas cardiomyopathy and lung damage in remote areas to schistosomiasis granuloma. In the liver, an increase in susceptibility to infection with T. cruzi, evidenced by higher parasitism, pronounced liver damage and increased granulomas schistosomiasis unorganized. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

La schistosomiase est la deuxième endémie parasitaire mondiale après le paludisme; 200 millions d'individus sont infectés à travers le monde et la morbidité reste élevée (environ 200 000 morts par an) malgré l'utilisation du praziquantel, seule drogue disponible. Cinq espèces de schistosomes infectent l'Homme dont celle que nous étudions, Schistosoma mansoni. Ce parasite possède un cycle de vie complexe, comportant 4 stades de développement morphologiquement distincts et 2 hôtes successifs, un hôte intermédiaire, le mollusque Biomphalaria glabrata et un hôte définitif, l'Homme. Afin de déterminer les mécanismes mis en jeu dans le contrôle du développement du schistosome et de caractériser des cibles potentielles de nouveaux agents chimiothérapeutiques, nous nous intéressons à certains acteurs impliqués dans la régulation génique, et plus particulièrement, les histones déacétylases, ou HDACs. Les HDACs sont des enzymes bien conservées dans le règne du vivant. Elles contrôlent l'expression de 5 à 10% des gènes, majoritairement en réprimant la transcription via la déacétylation des histones. Elles sont réparties en 3 classes, les classes I et II sont composées d'enzymes dont le site catalytique comporte un ion de zinc ; tandis que la classe III est composée des sirtuines, dépendantes du NAD+. Chez le parasite, une partie de nos études porte sur les 3 enzymes de classe I que nous avons identifiées et caractérisées au niveau moléculaire, SmHDAC1, 3 et 8. Ensuite nous avons réalisé une étude fonctionnelle de SmHDAC1 et mis en évidence sa capacité de répression de la transcription en système hétérologue. Puis nous nous sommes intéressés à l'inhibition de l'activité HDAC chez le parasite, grâce à l'utilisation de différents inhibiteurs des classes 1 et 2 des HDACs. Nous avons montré que des parasites cultivés en présence de trichostatine A (TSA) mouraient de manière dose dépendante. Nous avons approfondi notre étude au niveau moléculaire et avons étudié la variation d'acétylation des histones des parasites en présence de TSA et d'acide valproique. Nous avons montré une augmentation de l'acétylation de manière dose-dépendante de l'histone H4. Le traitement par la TSA entraîne la mort de nombreux types cellulaires par apoptose et provoque une surexpression de certains gènes impliqués dans ce processus. Nous avons démontré que ce traitement induit l'apoptose chez des larves maintenues en culture, ainsi qu'une activation des Caspases 3/7. Ensuite, la caractérisation des ADNc des Caspases 3 et 7 nous a permis de montrer par RT-PCR en temps réelle que les transcrits correspondants sont surexprimés après traitement par la TSA, tandis que celle-ci n'a aucun effet sur la transcription de SmHDAC1 et 3. Par la suite, nous avons corrélé cette augmentation avec le taux d'acétylation de H4 sur le promoteur de caspase7. Cette étude sera poursuivie à l'avenir par l'investigation de la relation structure/fonction des HDACs afin de développer des inhibiteurs spécifiques. En parallèle, nous étudions une HDAC de classe III, SmSirt1, que nous avons identifiée et caractérisée. La présence d'une grande insertion dans son domaine catalytique présage des fonctions modifiées par rapport à ses orthologues chez d'autres espèces. Nous souhaitons nous focaliser sur les conséquences de cette insertion spécifique chez S. mansoni. En effet, elle semble être la cible de potentielles modifications post-traductionnelles (site de phosphorylation par PKB/Akt), que nous voulons mettre en évidence. De plus, l'une des fonctions de Sirt1 est l'interaction avec le facteur de transcription FoxO et la régulation de la voie de signalisation insuline dépendante (impliquant PKB/Akt). Par ce biais FoxO et Sirt1 contrôlent le métabolisme, des mécanismes de survie cellulaire et la longévité. Une modification de la fonction de SmSirt1 pourrait être à la base de la durée de vie anormalement longue de S. mansoni. Nous avons donc également réalisé la caractérisation moléculaire de SmFoxO, afin de mettre en évidence son interaction avec Sirt1 ainsi que l'implication de cette interaction dans le contrôle de la transcription de gènes cibles. Par la suite nous étudierons le rôle de Sirt1 et FoxO dans la régulation de la signalisation insuline dépendante sur des parasites en culture