Les fibroses anormales sont responsables de plus de 40% des décès pour raison médicale ; elles se développent suite à une inflammation chronique. Les fibroses hépatiques causées par les schistosomes et par le virus HCV sont en grande partie déterminées par la génétique du malade. Notre thèse a consisté à poursuivre le travail de caractérisation du déterminisme génétique des fibroses hépatiques et cutanées.La première partie de notre thèse, est l’étude informatique et statistique des données de génotypage GWAS de Brésiliens qui présentent une fibrose hépatique bilharzienne grave sur plus de 2,5 millions de SNPs. 180 SNPs qui montraient une association suggestive avec les fibroses graves ont été sélectionnés, dont certains affectent les gènes des voies Wnt. Ces SNPs ont été testés sur une cohorte de 460 pêcheurs ougandais exposés à S.mansoni et nous avons confirmé l’association avec la fibrose de 4 SNPs.La deuxième partie de notre thèse est l’analyse transcriptômique (RNA-Seq) des mécanismes responsables des fibroses anormales de la peau de sujets affectés par des fibroses chéloïdes de 20 tissus chéloïdes, 7 tissus sains et 7 tissus affectés par des cicatrices hypertrophiques. Cette analyse montre que le développement des chéloïdes est la conséquence d’une stimulation anormale des voies de la cicatrisation en partie due à l’activation de la voie Wnt βcatenin et Wnt PCP. Pour conforter cette proposition, nous avons effectué une analyse génétique de la voie Wnt dans deux cohortes indépendantes. L’analyse statistique montre que des SNPs dans 6 gènes de la voie Wnt βcatenin contribuent au développement des fibroses chéloïdes. / Abnormal fibrosis is responsible for more than 40% of medical deaths. They develop as a result of chronicinflammation. Hepatic fibroses caused by schistosomes andHCV virus are largely determined by the genetic background of the patient. Our thesis consisted of continuing thework of characterizing the genetic determinism of liver and skin fibrosis.The first part of our thesis is the computer and statistical study of GWAS genotyping data of Brazilians whohave severe bilharzeal liver fibrosis on more than 2.5 million SNPs. 180 SNPs that showed suggestive associationwith severe fibrosis were selected, some of which affect the Wnt pathway. These SNPs were then tested on a cohortof 460 Ugandan fishers exposed to S.mansoni and the results confirmed the association of 4 SNPs with fibrosis.The second part of our thesis is the genomic analysis (transcriptome and genetics) of the mechanismsresponsible for the abnormal skin fibrosis with subjects affected by keloid scars. We performed an analysis of genes(RNASeq) expressed differently between 20 keloids, 7 healthy tissues and 7 tissues affected by hypertrophic scars.This analysis shows that the development of keloids is the consequence of an abnormal stimulation of cicatrizationpathways with strong activation of the Wnt βcatenin and Wnt PCP pathway. To support this proposal, we performeda genetic analysis of the Wnt pathway in two independant cohorts.The statistical analysis of the results shows that polymorphisms in 6 genes of the Wnt βcatenin pathway contributeto the development of keloid fibrosis.

Made available in DSpace on 2016-12-23T13:56:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao de Steveen Rios Ribeiro.pdf: 4201771 bytes, checksum: 56acf4462c81abd472caf4c84eb8dd80 (MD5) Previous issue date: 2011-03-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Introduction. The diagnosis of intestinal parasites can be accomplished by different techniques of parasitological stool examinations (EPF), each with advantages and disadvantages according to the parasite to be identified. Aims. The aim of the present study was to compare traditional techniques of EPF (Spontaneous Sedimentation in Tube, Kato-Katz and Baermann-Moraes) with more sophisticated techniques (stool culture, detection of coproantigen and PCR) and two commercially available kits in Brazil (Paratest® and TF-Test ®). Material and Methods. Faecal samples from 160 individuals, a total of 356 samples, were analyzed by traditional techniques of EPF (Spontaneous Sedimentation in Tube, Kato-Katz and Baermann-Moraes), culture of fresh faeces and sediment of feces, detection of coproantigen, PCR for detection and differentiation of the complex Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar and two commercially available kits in Brazil (Paratest® and TF-Test®). Results. The technique of Spontaneous Sedimentation in Tube had better sensitivity (80.43% of occurrences) for the diagnosis of eggs and larvae of helminths in feces. The Kato-Katz was better for identification of eggs of S. mansoni (100% of cases). The method of Baermann-Moraes found larvae of Strongyloides stercoralis detected similarly to spontaneous sedimentation. For the diagnosis of G. lamblia, C. parvum and E. histolytica, kits for detection of coproantigen showed better sensitivity. The stool culture showed excellent results for identification of Blastocystis hominis. The PCR was able to identify and differentiate the amoebas of the complex E. histolytica/ E. dispar. Both commercial kits showed lower sensitivity than the spontaneous sedimentation for the diagnosis of helminths, but Paratest® was the technique that has shown better sensitivity for protozoa (66.66% of cases). Conclusion. For the diagnosis of helminths, the Spontaneous Sedimentation Method in Tube showed better results, except for detection of eggs of S. mansoni, best detected by Kato-Katz. For the diagnosis of G. lamblia, E. histolytica and Cryptosporidium parvum, kits for detection of coproantigen were better. However, the kit for the diagnosis of E. histolytica does not detect the species E. dispar, best identified by the ABSTRACT PCR. The commercial kits (Paratest® and TF-Test ®), while facilitating the collection and preservation of the sample, have lower sensitivity than the Spontaneous Sedimentation method in Tube / O diagnóstico de parasitoses intestinais pode ser realizado por diferentes técnicas de Exame Parasitológico de Fezes (EPF), cada uma com vantagens e desvantagens de acordo com o parasito a ser identificado. Objetivos. Comparar técnicas tradicionais de EPF (Sedimentação Espontânea em Tubo, Kato-Katz e Baermann-Moraes) com técnicas mais sofisticadas (cultura de fezes, detecção de coproantígenos e PCR) e dois kits comerciais disponíveis no Brasil (Paratest® e TF-Test®). Material e Métodos. Amostras de fezes de 160 indivíduos, totalizando 356 amostras, foram analisadas por técnicas tradicionais de EPF (Sedimentação Espontânea em Tubo, Kato-Katz e Baermann-Moraes), cultura de fezes frescas e de sedimento de fezes, técnicas para detecção de coproantígenos nas fezes, PCR para detecção e diferenciação de Entamoeba do complexo histolytica/dispar e dois kits comerciais disponíveis no Brasil (Paratest® e TF-Test®). Resultados. A técnica de Sedimentação Espontânea em Tubo demonstrou melhor sensibilidade (80,43% das o corrências) para o diagnóstico de ovos e larvas de helmintos nas fezes. O Kato-Katz foi melhor para identificação de ovos do S. mansoni (100% das ocorrências). Já o método de Baermann-Moraes detectou larvas de Strongyloides stercoralis de modo semelhante à sedimentação espontânea. Para o diagnóstico de G. lamblia, C. parvum e E. histolytica, os kits de coproantígenos demonstraram melhor sensibilidade. A cultura de fezes mostrou excelentes resultados para identificação de Blastocystis hominis. O PCR conseguiu identificar e diferenciar as amebas do complexo E. histolytica/E. dispar. Os dois kits comerciais apresentaram sensibilidade mais baixa do que a Sedimentação Espontânea em Tubo para o diagnóstico de helmintos, mas o Paratest® foi a técnica que demonstrou melhor sensibilidade para protozoários (66,66% das ocorrências). Conclusão. Para o diagnóstico de helmintos o método de Sedimentação Espontânea em Tubo foi o que mostrou melhor resultado, exceto para detecção de ovos de S. mansoni, melhor detectados pelo Kato-Katz. Os kits de detecção de coproantígenos foram melhores para diagnóstico de G. lamblia, Cryptosporidium parvum e E. histolytica. Entretanto, o kit para diagnóstico de E. histolytica não detecta a espécie E. dispar, melhor identificada pelo PCR. Os kits comerciais (Paratest® RESUMO e TF-Test®), apesar de facilitarem a coleta e conservação da amostra, têm menor sensibilidade do que a Sedimentação Espontânea em Tubo

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral. / Schistosomiasis and malnutrition are both serious public health concerns in developing countries. Schistosoma infection causes a range of morbidities, which is influenced to a large extent by the nature of the induced immune response and the nutritional status of the host. During the schistosomiasis infection, the immune response produces cytokines which are released by stimulating production of nitric oxide. Numerous studies have demonstrated that the nutritional status and the immune response affect the phenotypic characteristics of the adult worms. However, whether nitric oxide plays a role is unknown. In this study, wild type mice (control group) and Knockout mice deficient in nitric oxide production either fed a commercial diet (UNILAB) or a regional basic diet with low protein diet (7.87%). By means of a digital system for image analysis (Image Pro Plus, USA) and confocal microscopy, we studied the morphology of the oral sucker, tegument and reproductive system of male and female worms. Malnourished male and female worms showed sloughing of the tegument. The dorsal surface of male malnourished worms presented irregular tubercles, unevenly distributed, and scarce. The reproductive system of female worms malnourished showed no morphological changes. The reproductive system of malnourished female worms did not show morphological changes. However, male worms from this group displayed smaller number of cells in differentiation process within the testicular lobes. In conclusion, our results suggest that the deficiency of nitric oxide does not induce morphological changes at the level of the integument and the reproductive system of male worms. In contrast, malnutrition is responsible by such morphological changes, mainly in the reproductive system and oral sucker.

Neste estudo, investigamos a organização qualitativa e quantitativa do tecido esplênico na fase aguda (nona semana) da infecção pelo Schistosoma mansoni em camundongos Swiss alimentados com uma dieta hipercolesterolêmica (29% lipídios) ou uma ração padrão (12% de lipídios). O volume do baço foi medido pelo método de Scherle. Os cortes histológicos (5m) foram corados com hematoxilina-eosina, Lennerts Giemsa e Picrosirius. O tecido foi avaliado por histopatologia, morfometria e estereologia. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Graph Pad Instat. Nossos resultados demonstraram que tanto a dieta quanto a infecção determinam perturbações em compartimentos esplênicos. Camundongos infectados, independentemente da dieta, tiveram aumento do baço (P=0,004) e arquitetura esplênica desorganizada quando comparado aos não infectados. O compartimento de polpa branca foi reduzida, enquanto a polpa vermelha e centro germinativo foram aumentadas (P<0,01). Camundongos infectados alimentados com alto teor de gordura apresentaram maior diâmetro de polpa branca (P=0,013) do que os não infectados. O exame microscópico do baço de camundongos não infectados alimentados com ração hipercolesterolêmica indicou que a polpa branca foi reduzida e indistinta. Além disso, camundongos infectados mostraram infiltrados celulares caracterizados por células polimorfonucleares, com mitose linfocítica intensa e células de Mott. Hemossiderina tende a ser em menor grau em camundongos infectados em comparação com os controles não infectados. A polpa vermelha mostrou um aumento significativo (P=0,008) no número médio de megacariócitos em comparação com camundongos não infectados. Camundongos alimentados com dieta padrão mostraram granuloma exsudativo-produtivo em torno de ovos do S. mansoni distribuídas apenas escassamente na polpa vermelha, enquanto que uma resposta do tecido caracterizada por uma infiltração de células em camundongos alimentados com alto teor de gordura foi encontrado. Os resultados do estudo sugerem que a ingestão de dieta rica em gorduras e a infecção contribuíram para a desorganização esplênica

Esquistossomose e desnutrição são graves problemas de saúde pública nos países em desenvolvimento. A esquistossomose provoca uma série de morbidades, que é influenciada, em grande maioria, pela natureza do estímulo à resposta imunológica e ao estado nutricional do hospedeiro. Durante a infecção esquistossomótica, a resposta imune produz citocinas que são liberadas e estimulam a produção de óxido nítrico. Numerosos estudos demonstraram que o estado nutricional e a resposta imune afetam as características fenotípicas dos vermes adultos. No entanto, se o óxido nítrico desempenha um papel neste fenômeno é desconhecido. Neste estudo, os camundongos do tipo selvagem (grupo controle) e camundongos knockout com deficiência na produção de óxido nítrico foram alimentados com uma dieta comercial (UNILAB) ou uma dieta básica regional, dieta com baixa concentração de proteína (7,87%). Por meio de um sistema digital de análise de imagem (Image Pro Plus, USA) e microscopia confocal, estudou-se a morfologia da ventosa oral, tegumento e o sistema reprodutor de vermes machos e fêmeas. Vermes machos e fêmeas recuperados de camundongos desnutridos com deficiência de oxido nítrico mostraram descamação do tegumento. A superfície dorsal de vermes desnutridos machos apresentaram tubérculos irregulares, distribuídos de forma desigual, e escassos. O sistema reprodutivo de vermes fêmeas desnutridas não demonstrou alterações morfológicas. No entanto, os machos deste grupo exibiram menor número de células no processo de diferenciação dentro dos lobos testiculares. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a deficiência de produção de óxido nítrico não induz alterações morfológicas em nível do tegumento e do sistema reprodutor de vermes machos. Em contraste, a desnutrição é responsável por tais alterações morfológicas, principalmente no sistema reprodutivo e na ventosa oral. / Schistosomiasis and malnutrition are both serious public health concerns in developing countries. Schistosoma infection causes a range of morbidities, which is influenced to a large extent by the nature of the induced immune response and the nutritional status of the host. During the schistosomiasis infection, the immune response produces cytokines which are released by stimulating production of nitric oxide. Numerous studies have demonstrated that the nutritional status and the immune response affect the phenotypic characteristics of the adult worms. However, whether nitric oxide plays a role is unknown. In this study, wild type mice (control group) and Knockout mice deficient in nitric oxide production either fed a commercial diet (UNILAB) or a regional basic diet with low protein diet (7.87%). By means of a digital system for image analysis (Image Pro Plus, USA) and confocal microscopy, we studied the morphology of the oral sucker, tegument and reproductive system of male and female worms. Malnourished male and female worms showed sloughing of the tegument. The dorsal surface of male malnourished worms presented irregular tubercles, unevenly distributed, and scarce. The reproductive system of female worms malnourished showed no morphological changes. The reproductive system of malnourished female worms did not show morphological changes. However, male worms from this group displayed smaller number of cells in differentiation process within the testicular lobes. In conclusion, our results suggest that the deficiency of nitric oxide does not induce morphological changes at the level of the integument and the reproductive system of male worms. In contrast, malnutrition is responsible by such morphological changes, mainly in the reproductive system and oral sucker.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos em animais experimentais evidenciaram associações significativas entre esquistossomose mansoni e hipercolesterolemia. Estudos in vitro e in vivo já demonstraram que o colesterol é essencial para Schistosoma mansoni, embora este não tenha capacidade de sintetizá-lo. A captação é realizada a partir do ambiente (cultivo ou hospedeiro) através do tegumento. O colesterol está envolvido nos mecanismos de evasão do helminto contra a resposta imunológica, além de poder participar na modulação da sinalização celular e reprodução, estimulando os órgãos reprodutores dos helmintos adultos como observado na fase aguda da infecção experimental. Este trabalho tem como objetivo avaliar se o mesmo fenômeno ocorre na fase crônica. Os helmintos foram recuperados de dez camundongos submetidos à dieta hiperlipídica ou padrão (controle) foram corados pelo carmin cloridrico e montados, individualmente, em lâmina histológica com bálsamo do Canadá. A preparação foi analisada por microscopia de campo claro nos seguintes caracteres: tegumento e o sistema reprodutor nos vermes machos (lobos testiculares, vesícula seminal, lobos testiculares supranumerários e canal ginecóforo) e, nas fêmeas (ovário, oótipo, útero, ovo, glândulas vitelínicas e espermateca). Posteriormente, algumas lâminas foram separadas para visualização pela microscopia confocal dos órgãos do sistema reprodutores acima descritos. Apesar de ter sido observado uma maior quantidade de espermatozoides, uma maior quantidade de oócitos sendo liberados no grupo da dieta, não houve diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos analisados. Houve um aumento na oogênese como observado na fase aguda. Dessa forma, o colesterol pode estar relacionado com a estimulação na atividade dos órgãos reprodutores dos helmintos adultos na fase crônica da infecção. / Studies in experimental animals showed significant associations between with schistosomiasis and hypercholesterolemia. In vitro and in vivo studies have demonstrated that cholesterol is essential for Schistosoma mansoni, although this is not able to synthesize it. The capture is carried out from the environment (cultivation or host) through the tegument. The capture is carried out from the middle (cultivation or host) through the tegument. Cholesterol is involved in the helminth evasion mechanisms against the immune response, and can participate in the modulation of cell signaling and reproduction of worms by stimulating the reproductive organs of adult worms as observed in the acute phase of experimental infection. This study aims to evaluate whether the same phenomenon occurs in the chronic phase. Helminthes recovered from ten mice subjected to high fat diet or standard (control) were stained with hydrochloric carmine and mounted individually on histological slide with Canada balsam. The preparation was analyzed by bright field microscopy the following characteristics: oral sucker and ventral sucker, tubercles on tegument and the reproductive system in male worms (lobes testicular, seminal vesicles, supernumerary testicular lobes and gynaecophoric canal), and in females (ovary, ootype, uterus, egg, vitelline glands and spermatheca). Subsequently, some slides were separated for confocal microscopy for visualization of the organs of the reproductive system described above. Despite having been observed a higher amount of sperm, a larger number of oocytes are released in the diet group, there was no statistically significant difference (p> 0.05) between the groups. There was an increase in oogenesis as observed in the acute phase. Thus, cholesterol may be related to the stimulation of the activity of the reproductive organs of adult helminths in the chronic phase of infection.

Neste estudo, investigamos a organização qualitativa e quantitativa do tecido esplênico na fase aguda (nona semana) da infecção pelo Schistosoma mansoni em camundongos Swiss alimentados com uma dieta hipercolesterolêmica (29% lipídios) ou uma ração padrão (12% de lipídios). O volume do baço foi medido pelo método de Scherle. Os cortes histológicos (5m) foram corados com hematoxilina-eosina, Lennerts Giemsa e Picrosirius. O tecido foi avaliado por histopatologia, morfometria e estereologia. A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa Graph Pad Instat. Nossos resultados demonstraram que tanto a dieta quanto a infecção determinam perturbações em compartimentos esplênicos. Camundongos infectados, independentemente da dieta, tiveram aumento do baço (P=0,004) e arquitetura esplênica desorganizada quando comparado aos não infectados. O compartimento de polpa branca foi reduzida, enquanto a polpa vermelha e centro germinativo foram aumentadas (P<0,01). Camundongos infectados alimentados com alto teor de gordura apresentaram maior diâmetro de polpa branca (P=0,013) do que os não infectados. O exame microscópico do baço de camundongos não infectados alimentados com ração hipercolesterolêmica indicou que a polpa branca foi reduzida e indistinta. Além disso, camundongos infectados mostraram infiltrados celulares caracterizados por células polimorfonucleares, com mitose linfocítica intensa e células de Mott. Hemossiderina tende a ser em menor grau em camundongos infectados em comparação com os controles não infectados. A polpa vermelha mostrou um aumento significativo (P=0,008) no número médio de megacariócitos em comparação com camundongos não infectados. Camundongos alimentados com dieta padrão mostraram granuloma exsudativo-produtivo em torno de ovos do S. mansoni distribuídas apenas escassamente na polpa vermelha, enquanto que uma resposta do tecido caracterizada por uma infiltração de células em camundongos alimentados com alto teor de gordura foi encontrado. Os resultados do estudo sugerem que a ingestão de dieta rica em gorduras e a infecção contribuíram para a desorganização esplênica

Os genes micro-exons (MEGs) foram recentemente identificados no genoma do Schistosoma mansoni, verme respons&aacute;vel pela esquistossomose, doen&ccedil;a que afeta mais de 262 milh&otilde;es de pessoas em mais de 78 pa&iacute;ses. Devido &agrave; capacidade de produ&ccedil;&atilde;o de prote&iacute;nas variantes pelo splicing alternativo de MEGs, express&atilde;o preferencial em est&aacute;gios do ciclo de vida em contato com o hospedeiro definitivo e a verifica&ccedil;&atilde;o de que v&aacute;rias prote&iacute;nas codificadas por estes genes s&atilde;o secretadas para o meio externo ao parasito, acredita-se que estas prote&iacute;nas possuam um papel importante na intera&ccedil;&atilde;o parasito-hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar e caracterizar a estrutura e din&acirc;mica conformacional das prote&iacute;nas codificadas por MEG-11 e MEG-14 e verificar a intera&ccedil;&atilde;o da prote&iacute;na MEG-14 com prote&iacute;nas humanas. A an&aacute;lise das prote&iacute;nas MEG-11 e MEG-14 produzidas em sistema recombinante com a t&eacute;cnica de dicro&iacute;smo circular (CD) demonstrou que ambas as prote&iacute;nas apresentavam estruturas secund&aacute;rias majoritariamente desordenadas quando em solu&ccedil;&atilde;o aquosa. Entretanto, foi verificado que a presen&ccedil;a de TFE, a desidrata&ccedil;&atilde;o das prote&iacute;nas e o aumento de temperatura favoreciam o surgimento de estruturas ordenadas nestas prote&iacute;nas. Um ganho de estrutura secund&aacute;ria tamb&eacute;m foi observado para a prote&iacute;na MEG-14 na presen&ccedil;a de ves&iacute;culas de fosfolip&iacute;dios e micelas de detergente carregadas negativamente. Estes resultados suportam a identifica&ccedil;&atilde;o destas prote&iacute;nas como cl&aacute;ssicas prote&iacute;nas intrinsicamente desordenadas (IDPs) e abre a possibilidade de sua intera&ccedil;&atilde;o com diferentes parceiros e fatores a serem relacionados com os pap&eacute;is multifuncionais e estados dentro do hospedeiro. Resultados pr&eacute;vios de experimentos de duplo-hibrido do nosso grupo apontavam uma poss&iacute;vel intera&ccedil;&atilde;o de MEG-14 com a prote&iacute;na humana S100A9. Atrav&eacute;s da t&eacute;cnica de pulldown foi poss&iacute;vel confirmar uma intera&ccedil;&atilde;o dependente da presen&ccedil;a de c&aacute;lcio entre estas duas prote&iacute;nas. An&aacute;lises adicionais da intera&ccedil;&atilde;o MEG-14/S100A9 com as t&eacute;cnicas de ITC e SPR permitiram calcular a constante de dissocia&ccedil;&atilde;o entre as prote&iacute;nas em aproximadamente 2 &mu;M. Finalmente, experimentos ex vivo permitindo a ingest&atilde;o da prote&iacute;na S100A9 acoplada a uma mol&eacute;cula fluorescente pelo S. mansoni resultaram na acumula&ccedil;&atilde;o da prote&iacute;na na gl&acirc;ndula do es&ocirc;fago, local onde j&aacute; foi localizada a prote&iacute;na MEG-14 em S. japonicum, sugerindo que a intera&ccedil;&atilde;o observada nos experimentos in vitro est&aacute; ocorrendo com a prote&iacute;na MEG-14 nativa. / The micro-exon genes (MEGs) were recently identified in Schistosoma mansoni&rsquo;s genome, worm responsible for schistosomiasis, a disease that affects more than 262 million people in more than 78 countries. Due to the capacity of variant protein production by alternative splicing of MEGs, preferential expression in certain life stages in contact with the definitive host, and the confirmation that many proteins coded by these genes are secreted to the external environment, It&rsquo;s believed that these proteins have an important role in parasite-host relationship. The objective of this work was to study and characterize the structure and conformational dynamics of proteins coded by MEG-11 and MEG-14 and verify the interaction of Meg-14 protein with human proteins. The analysis of MEG-11 and MEG-14 proteins produced in recombinant system with circular dichroism (CD) shows that both proteins present secondary structures mostly disordered in aqueous solution. However, It was found that in presence of TFE, the dehydration of proteins and the increasing of temperature favor the surging of ordered structures. An increase of secondary structure was observed too for MEG-14 protein in presence of phospholipid vesicles and negative charged detergent micelles. These results support the identification of these proteins as classical intrinsically disordered proteins (IDPs) and opens the possibility of its interaction with different partners and factors related with the multifunctional roles and states in the host. Previous results of double-hybrid experiments pointed a possible interaction between MEG-14 and the human protein S100A9. By pulldown technique was possible confirm an calcium dependent interaction between these proteins. Additional analysis of MEG-14/S100A9 interaction with ITC and SPR experiments were able to calculate the dissociation constant between proteins equals to 2 &mu;M. Finally, ex vivo experiments permit the ingestion of S100A9 coupled to a fluorescent molecule by S. mansoni, resulting in the accumulation of protein in the esophageal gland, where was localized the MEG-14 in S. japonicum, suggesting that the interaction observed in the in vitro experiments are occurring with the native MEG-14.

Este trabalho demonstrou a construção de minibibliotecas de \"Expressed Sequence Tags\" (EST) com o uso de RT-PCR de baixa estringencia e \"primer\" consenso-degenerado. Através do estudo de parâmetros críticos como concentração de sais, temperatura e velocidade de ciclagem, composição dos \"primers\" e qualidade do RNA mensageiro, foi possível padronizar um protocolo. Tal protocolo permitiu um aumento do numero de seqüências por minibiblioteca em relação a protocolos similares existentes na literatura (Dias neto et al., 1997 e 2000) sem perda de características desejáveis como amplificação preferencial do centro dos genes e nomalização das mensagens. As seqüências produzidas levaram a um significativo aumento das seqüências de EST de S. mansoni disponíveis publicamente e permitiu a detecção da existência de novos fragmentos de genes expressos na fase adulta do parasita. Neste trabalho também clonamos uma apirase de S. mansoni cuja a seqüência não havia sido descrita anteriormente. O gene possui cerca de 2,7 mil pares de bases e codifica para uma proteína de 544 aminoácidos. Esta foi expressa em sistema heterologo e utilizada para obtenção de anticorpos policlonais contra esta proteína. Utilizando estes anticorpos foi possível detectar a proteína no tegumento do parasita. / This work demonstrates the construction of EST minilibraries employing low stringency RT-PCR and consensus-degenerate primers. Through the study of critical parameters such as salt concentration, cycling temperature and ramp speed, composition of primers and quality of messenger RNA a standard protocol was obtained. Such protocol allowed an increase in the number of sequences per minilibrary in relation to similar protocols in the literature (Dias Neto et al., 1997 and 2000) without no loss in desirable characteristics such as preferential amplification of the central portion of messages and normalization of messages. The sequences produced allowed a significant increase in the publicly available EST sequences of S. mansoni and permitted discovery of new gene fragments expressed in adult stage of the life cycle of the parasite. In this work we also cloned an apyrase of S. mansoni whose sequence had never been described previously. The gene has about 2.7 kilobases and codes for a protein of 544 aminoacids. This protein was expressed in a heterologous system and was used for production of a polyclonal antibody. This antibody was used for detection of this protein in the tegument of the parasite.

O parasita Schistosoma mansoni é um dos principais causadores da esquistossomose, doença que acomete 200 milhões de indivíduos no mundo. O parasita possui um complexo ciclo de vida composto de seis estágios evolutivos em dois hospedeiros. S. mansoni possui um sofisticado sistema de interação com seus hospedeiros de modo a escapar da resposta imune e interagir com moléculas produzidas por eles. Alguns trabalhos na literatura descreveram o efeito do TNF-&#945; humano sobre o processo de ovoposição do parasita adulto. Nosso trabalho teve por objetivo analisar o perfil de expressão gênica do S. mansoni ao longo de seus estágios de desenvolvimento, avaliar o efeito do TNF-&#945; humano sobre o perfil de expressão gênica do parasita em dois estágios de desenvolvimento e descrever o gene homólogo ao receptor de TNF-&#945; humano em S. mansoni. Para isso, duas plataformas de microarrays distintas foram utilizadas: uma composta por 4000 sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisa e a outra, composta por 44000 sondas de oligonucleotídeos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com estas plataformas foi detectada a expressão de 5798 genes em vermes adultos, sendo que 156 genes apresentavam a transcrição nas fitas senso e anti-senso; 6 destes tiveram confirmadas a transcrição nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 229 genes diferencialmente expressos entre vermes adultos machos e fêmeas. A análise de expressão gênica entre 5 estágios de desenvolvimento do parasita mostrou dois tipos de conjuntos de dados: (i) 1423 genes diferencialmente expressos entre dois estágios subseqüentes de desenvolvimento e (ii) 342 genes com expressão enriquecida em um estágio exclusivamente. 68 destes são transcritos intrônicos que não possuem potencial codificador de proteinas. Um gene ortólogo ao receptor de TNF-&#945; humano (SmTNFR) foi clonado e sequenciado. O transcrito SmTNFR possui 1967pb e codifica uma proteína de 599 aminoácidos. Outros 9 genes codificando elementos conservados da via de sinalização de TNF-&#945; também foram identificados no conjunto de ESTs público, revelando uma via completa de sinalização de TNF-&#945; no parasita. Por fim, identificamos com microarrays o conjunto de genes com expressão alterada pela adição de TNF-&#945; humano em esquistossômulos e vermes adultos. 340 genes tiveram expressão alterada em vermes adultos utilizando a plataforma de cDNA. 411 genes sofreram mudanças de expressão em esquistossômulos e 1093 genes em vermes adultos detectados na plataforma de oligonucleotídeos. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação parasita-hospedeiro em nível molecular. / The parasite Schistosoma mansoni is one of major causative agents of schistosomiasis, a disease which affects 200 million people in the world. The parasite has a complex life cycle with six developmental stages in two hosts. S. mansoni has a sofisticated system of interaction with the hosts, permitting it to escape the immune response and to interact with molecules produced by the hosts. The effect of human TNF-&#945; on adult parasite egg-laying has been described in the literature. The present work intended to analyse the gene expression profile of S. mansoni among its developmental stages, to evaluate the effect of human TNF-&#945; on gene expression profile in two different developmental stages and to describe a homologous gene to human TNF-&#945; receptor in S. mansoni. Two microarrays platfoms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another, comprised by 44000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With these platforms, we detected the expression of 5798 genes in adult worms, of which 156 showed transcription in sense and anti-sense strands; 6 of them had their expression levels confirmed by strand specific Real Time PCR. 229 genes were identified as differentially expressed between male and female adult worms. Gene expression analysis among 5 parasite developmental stages identified two data sets: (i) 1423 differentially expressed genes between two subsequent developmental stages and (ii) 342 expressed genes enriched in one exclusive stage. 68 of them are intronic transcripts with no protein-coding potential. An ortologue to human TNF-&#945; receptor (SmTNFR) was cloned and sequenced. SmTNFR transcritpt has 1967bp and encodes a 599-amino acid protein. Other 9 genes encoding conserved elements of the TNF-&#945; signaling pathway were identified among the public S. mansoni ESTs dataset, thus revealing a complete TNF-&#945; signaling pathway in the parasite. Finally, we identified with microarrays the set of genes that have an altered gene expression upon exposure of schistosomula and adult worms to human TNF-&#945;. 340 genes were identified with altered expression in adult worms using the cDNA platform. 411 genes changed their expression pattern in schistosomula and 1093 genes in adult worms using the oligonucleotide platform. This work represents an important contribution to the understanding of host-parasite interaction at the molecular level.