Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vanusa_hora.pdf: 894481 bytes, checksum: 1cff4e13f238f761e9054b5864d2655e (MD5) Previous issue date: 2006-10-30 / Schistosomiasis, caused by Schistosoma mansoni, is the second most prevalent parasitic disease worldwide causing chronic disease in millions of people in developing countries. Similarly, fascioliasis, caused by the trematode Fasciola hepatica, represents a recognized unsolved agricultural problem responsible for economic losses as well as causing a significant number of human infections worldwide. Although chemotherapy for both parasites has been available, this approach has limitations, including high reinfection rates in endemic areas. Vaccines represent the most attractive long-term alternative to invert this scenario. Accordingly, the World Health Organization selected S. mansoni fatty acid-binding protein 14kDa (Sm14) as one out of two anti-schistosome vaccine priority candidates for human clinical trials. Furthermore, Sm14 is the only vaccine candidate to have been shown to afford significant immune protection against both of the above-mentioned helminthes. The objective of this study was to develop and evaluate in mice a recombinant subunit vaccine containing the Sm14 fused to the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (LTB), which is a potent immunoadjuvant; furthermore, was describe the production and characterization of monoclonal antibodies (MAbs) against the Sm14 for use as a tool to detect and characterize Sm14 and for development of future diagnostic test. The ltb and sm14 gene were obtained by PCR amplification from E. coli DNA and plasmid pAESm14, respectively, and fused by PCR. The recombinant chimera was expressed in E. coli and purified by nickel affinity chromatography. Groups of outbreed Swiss mice were immunized with three footpad doses of either rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 plus aluminum hydroxide (Al(OH)3), rSm14 plus Al(OH)3, rLTB or Al(OH)3. Levels of protection were determined by number of worms recovered after S. mansoni cercarial challenge. The pooled sera of immunized mice were evaluated by ELISA and Western blot. The results showed that the chimera protein was able to elicit specific antibody production to rSm14 and rLTB, however the use of LTB as adjuvant to rSm14 immunization failed to enhance protection against challenge. Furthermore, seven MAbs were obtained after immunization of BALB/c mice with rLTB/Sm14. MAbs isotyping revealed that five were of the isotype IgG1, one belonged to the IgG2b isotype and another to the IgM isotype. These MAbs will be usefull for monitoring protein expression in recombinant systems, protein stability and may have potential for developing diagnostic test. / A esquistossomose, causada por Schistosoma mansoni, é a segunda doença parasitária mais prevalente no mundo causando doença crônica em milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Semelhantemente, a fasciolose, causada pelo trematódeo Fasciola hepatica, representa um reconhecido problema agrícola responsável por perdas econômicas assim como causa um significante número de infecções em humanos por todo mundo. Embora a quimioterapia para ambos os parasitas esteja disponível, ela tem apresentado limitações, incluindo altas taxas de reinfecção em áreas endêmicas. Vacinas representam a alternativa mais atraente para inverter este cenário. Assim, a Organização Mundial da Saúde selecionou a proteína ligadora de ácidos graxos 14kDa de S. mansoni (Sm14) como uma de duas candidatas à vacina anti-esquistossomose prioritárias para triagem clínica em humanos. Além disso, a Sm14 é a única proteína candidata a vacina que induz imunidade protetora significativa contra ambos os helmintos acima mencionados. O objetivo deste estudo foi desenvolver e avaliar em camundongos uma vacina de subunidade contendo a Sm14 fusionada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), a qual é um potente imunoadjuvante; além disso, foi descrever a produção e caracterização de anticorpos monoclonais (MAbs) contra a Sm14 para usa-los como uma ferramenta para detectar e caracterizar a Sm14 e para o desenvolvimento de futuro teste diagnóstico. Os genes ltb e sm14 foram amplificados por PCR a partir do DNA de E. coli e do plasmídeo pAESm14, respectivamente, e fusionados por PCR. A quimera recombinante foi expressa em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade em coluna com níquel. Grupos de camundongos suíços não singênicos foram imunizados por via subcutânea com três doses de rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 mais hidróxido de alumínio (Al(OH)3), rSm14 plus Al(OH)3, rLTB ou Al(OH)3. Os níveis de proteção foram determinados através do número de parasitas recuperados após desafio com cercárias de S. mansoni. O pool de soros dos camundongos imunizados foi avaliado por ELISA e Western blot. Os resultados mostraram que a proteína quimera foi capaz de estimular a produção de anticorpos específicos para Sm14 e LTB, contudo o uso de LTB como adjuvante para imunização de rSm14 falhou em aumentar a proteção contra o desafio. Além disso, sete MAbs foram obtidos após imunização de um camundongo BALB/c com rLTB/Sm14. A isotipagem dos MAbs revelou que cinco foram do isotipo IgG1, um pertencente ao isotipo IgG2b e outro ao isotipo IgM. Estes MAbs serão úteis para monitorar a expressão da proteína em sistemas recombinantes, a estabilidade protéica e pode ter potencial para desenvolver teste diagnóstico.

Schistosomiasis is a water-borne disease caused by Schistossoma Mansoni and its clinical evolution can vary from asymptomatic forms to severe conditions. Schistosomiasis mansoni is a global endemic disease, occurring in 74 countries and territories of three continents. To verify through a parasitological examination of fecal samples the occurrence of Schistossoma Mansoni among landless rural workers and their families in settlements in riverside cities from the south region of the State of Sergipe. Materials and Methods: It is a quantitative cross-sectional approach study conducted on landless rural workers from the south region of the State of Sergipe. A physical examination was performed on 822 landless rural workers and 601 of them had a parasitological examination of fecal samples to confirm the infection. A 4.3 % prevalence of Schistosomiasis among landless rural workers was found with a positive result for the infection in 61.5 % among the 13 settlements studied. In a 100% of positive cases the clinical form of the disease found was the chronic intestinal. The population portrayed is a low-income community, living in floor soil ground four-room households (living-room, bedroom, bathroom and kitchen). The literacy level in these communities is low. In these populations 73.3% of the citizens had attended elementary school, 16.3 % of them are illiterate and 10 10.4% attended high school or higher education. In all the settlements there is poor sanitary condition, no tap water and sewer system. Occurrences of Schistosomiasis mansoni were evidenced in 8 (61.5%) of the Landless Rural Workers settlements studied and 26 (4.3%) of them had a positive result for the disease, although the prevalence of Schistosomiasis among landless rural workers from the south region of the State of Sergipe is relatively low in comparison to the whole state rates and in some cases from the south region. The predominant form of the disease is the chronic intestinal possibly due to the short period of exposure to this environment and to the characteristics of the migratory population. The socio environmental condition of the population is practically the same: low literacy level, predominance of rural work, lack of sanitation or sewer system and few of the rural workers have access to tap water. It was evidenced a very distinct prevalence between the settlements despite the resemblance of the socio environmental conditions, possibly due to differences concerning the deposit water to which this population is currently exposed. / A esquistossomose é uma doença de veiculação hídrica causada pelo Schistossoma mansoni, com evolução clínica que pode variar desde formas assintomáticas até quadros graves, é uma endemia mundial, ocorrendo em 74 países e territórios de três continentes. Objetivos: Verificar através do exame parasitológico de fezes a prevalência da infecção pelo Schistosoma mansoni em famílias de Sem Terra assentadas localizadas em cidades ribeirinhas da região Sul do Estado de Sergipe. Trata-se de um estudo transversal, realizado em treze assentamentos de trabalhadores rurais sem terra da região sul do estado de Sergipe. Foi realizada uma avaliação clínico epidemiológica em um total de 822 trabalhadores rurais sem terra, destes 601 realizaram o exame parasitológico de fezes para confirmação da infecção. A prevalência total da esquistossomose em trabalhadores rurais sem terra foi de 4.3%, dos treze assentamentos 61,5% apresentaram resultado positivo para a infecção. A forma clinica encontrada foi a intestinal em 100% dos casos positivos, a população estudada é pobre, as casas possuem quatro cômodos (sala, 01 quarto, banheiro e cozinha), o piso é de chão batido. O nível de escolaridade baixo 73,3% possui ensino fundamental, 16,3% são analfabetos e 10,4% possuem ensino médio incompleto ou mais. Todos os assentamentos encontram-se em condições sanitárias precárias, sem saneamento básico, rede de esgotos e poucos possuem água encanada. A esquistossomose mansônica esteve presente em 8 (61,5%) dos assentamentos de Sem Terra estudados, 26 (4,3%) dos trabalhadores rurais sem terra apresentaram resultado positivo para a doença, embora a prevalência da esquistossomose em Trabalhadores Rurais Sem Terra da região sul de Sergipe seja relativamente baixa, quando comparada à do Estado e em alguns casos da própria região sul. Há o predomínio da forma clínica intestinal, possivelmente devido ao pequeno tempo de exposição e este ambiente e pelas características da população migratória. A população possui condição sócio ambiental muito semelhante, com baixa instrução, predomínio do trabalho agrícola de onde extrai recursos para subsistência, não dispõem de saneamento básico, rede de esgotos e poucos usufruem de água encanada. Constatou-se uma prevalência bem distinta entre os assentamentos, apesar da condição sócio ambiental semelhante, possivelmente devido a diferença na fonte hídrica em que a população está exposta e do aspecto focal da doença.

A esquistossomose é uma doença causada por trematódeos do gênero Schistosoma. Dentre os genes identificados no transcriptoma do parasita, membros da família gênica SmVAL (Schistosoma mansoni Venom Allergen-Like) foram apontados como candidatos vacinais. SmVALs foram identificadas em secreções de cercárias e esquistossômulos cultivados in vitro, os transcritos SmVAL4 e 24 foram localizados nas glândulas acetabulares de germ ball e a proteína nativa SmVAL4 foi identificada em extrato de cercárias, indicando funções durante a penetração da pele. Já os transcritos SmVAL13 e 14 foram localizados na glândula esofágica anterior de vermes adultos, sugerindo papéis no processo de alimentação sanguínea. A imunização com as proteínas rSmVAL4, 6, 7, 13, 14 e 18 coadministradas não protegeu camundongos contra o desafio experimental, porém, observou-se uma diminuição do número de fêmeas e do número de ovos no grupo imunizado. A investigação de funções para as proteínas secretadas mostrou que a rSmVAL18 interage com plasminogênio in vitro favorecendo a invasão do hospedeiro. / Schistosomiasis is a disease caused by trematodes of the genus Schistosoma. Among the genes identified in the parasite transcriptome, members of SmVAL (Schistosoma mansoni Venom Allergen-Like) gene family were proposed as vaccine candidates. SmVALs were identified in cercariae and schistosomule secretions in vitro, the SmVAL4 and 24 transcripts were located to the germ ball acetabular glands and SmVAL4 native protein was identified in cercariae extract, indicating functions in skin penetration. On the other hand, SmVAL13 and 14 transcripts were located to the anterior esophageal gland of adult worms, suggesting roles in the blood feeding processes. Immunization with rSmVAL4, 6, 7, 13, 14 and 18 proteins co-administered did not protected mice against experimental challenge, however, there was a decrease in the number of females and the number of eggs in the immunized group. The investigation of functions for secreted proteins showed that rSmVAL18 interacts with plasminogen in vitro thus favoring the host invasion.

Os genes micro-exons (MEGs) foram recentemente identificados no genoma do Schistosoma mansoni, verme responsável pela esquistossomose, doença que afeta mais de 262 milhões de pessoas em mais de 78 países. Devido à capacidade de produção de proteínas variantes pelo splicing alternativo de MEGs, expressão preferencial em estágios do ciclo de vida em contato com o hospedeiro definitivo e a verificação de que várias proteínas codificadas por estes genes são secretadas para o meio externo ao parasito, acredita-se que estas proteínas possuam um papel importante na interação parasito-hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar e caracterizar a estrutura e dinâmica conformacional das proteínas codificadas por MEG-11 e MEG-14 e verificar a interação da proteína MEG-14 com proteínas humanas. A análise das proteínas MEG-11 e MEG-14 produzidas em sistema recombinante com a técnica de dicroísmo circular (CD) demonstrou que ambas as proteínas apresentavam estruturas secundárias majoritariamente desordenadas quando em solução aquosa. Entretanto, foi verificado que a presença de TFE, a desidratação das proteínas e o aumento de temperatura favoreciam o surgimento de estruturas ordenadas nestas proteínas. Um ganho de estrutura secundária também foi observado para a proteína MEG-14 na presença de vesículas de fosfolipídios e micelas de detergente carregadas negativamente. Estes resultados suportam a identificação destas proteínas como clássicas proteínas intrinsicamente desordenadas (IDPs) e abre a possibilidade de sua interação com diferentes parceiros e fatores a serem relacionados com os papéis multifuncionais e estados dentro do hospedeiro. Resultados prévios de experimentos de duplo-hibrido do nosso grupo apontavam uma possível interação de MEG-14 com a proteína humana S100A9. Através da técnica de pulldown foi possível confirmar uma interação dependente da presença de cálcio entre estas duas proteínas. Análises adicionais da interação MEG-14/S100A9 com as técnicas de ITC e SPR permitiram calcular a constante de dissociação entre as proteínas em aproximadamente 2 μM. Finalmente, experimentos ex vivo permitindo a ingestão da proteína S100A9 acoplada a uma molécula fluorescente pelo S. mansoni resultaram na acumulação da proteína na glândula do esôfago, local onde já foi localizada a proteína MEG-14 em S. japonicum, sugerindo que a interação observada nos experimentos in vitro está ocorrendo com a proteína MEG-14 nativa. / The micro-exon genes (MEGs) were recently identified in Schistosoma mansoni’s genome, worm responsible for schistosomiasis, a disease that affects more than 262 million people in more than 78 countries. Due to the capacity of variant protein production by alternative splicing of MEGs, preferential expression in certain life stages in contact with the definitive host, and the confirmation that many proteins coded by these genes are secreted to the external environment, It’s believed that these proteins have an important role in parasite-host relationship. The objective of this work was to study and characterize the structure and conformational dynamics of proteins coded by MEG-11 and MEG-14 and verify the interaction of Meg-14 protein with human proteins. The analysis of MEG-11 and MEG-14 proteins produced in recombinant system with circular dichroism (CD) shows that both proteins present secondary structures mostly disordered in aqueous solution. However, It was found that in presence of TFE, the dehydration of proteins and the increasing of temperature favor the surging of ordered structures. An increase of secondary structure was observed too for MEG-14 protein in presence of phospholipid vesicles and negative charged detergent micelles. These results support the identification of these proteins as classical intrinsically disordered proteins (IDPs) and opens the possibility of its interaction with different partners and factors related with the multifunctional roles and states in the host. Previous results of double-hybrid experiments pointed a possible interaction between MEG-14 and the human protein S100A9. By pulldown technique was possible confirm an calcium dependent interaction between these proteins. Additional analysis of MEG-14/S100A9 interaction with ITC and SPR experiments were able to calculate the dissociation constant between proteins equals to 2 μM. Finally, ex vivo experiments permit the ingestion of S100A9 coupled to a fluorescent molecule by S. mansoni, resulting in the accumulation of protein in the esophageal gland, where was localized the MEG-14 in S. japonicum, suggesting that the interaction observed in the in vitro experiments are occurring with the native MEG-14.

Die Infektion mit Schistosoma mansoni resultiert in einer Th2-Immunantwort mit Eosinophilie und erhöhtem IgE-Titer, wobei der wasserlösliche Extrakt der S. mansoni Eier (SEA) ausreicht um diese Reaktion auszulösen. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass sich IL-4-produzierende CD4+ T-Lymphozyten in Zellkulturen mit SEA-konditionierten Dendritischen Zellen (DCs) trotz gleichzeitig vorkommenden IFN-gamma entwickeln und SEA die Expression von Faktoren in DCs, die üblicherweise mit einer Th1-Antwort einhergehen, auf Transkriptions- und Proteinebene selektiv hemmt. Um den Faktor aus S. mansoni Eiern zu isolieren, der zur Expression von IL-4 in CD4+ Zellen und zur Inhibition von IL-12 in DCs führt, wurde eine Gelfiltrationschromatographie der exkretorisch/sekretorischen Ei-antigene (ES) durchgeführt und die Fraktionen in vitro getestet. Darin wurde gezeigt, dass Fraktionen mit einer Proteinbande von 30 kD die Expression von IL-4 in CD4+ Zellen induzieren. Dieses ES-Protein wurde durch N-terminale Sequenzierung als hepatotoxische Ribonuclease Omega-1 identifiziert, welches ebenfalls die Expression von IL-12 in DCs inhibiert und die Produktion von IL-4 in CD4+ Zellen bei einer 10-fach geringeren Proteinkonzentration als mit dem Kontrollansatz SEA induziert. Zudem sollte untersucht werden, inwieweit Toll-like Rezeptoren in der Generierung einer Th2 Antwort gegen schistosomale Antigene involviert sind. Dazu wurden TLR2-, TLR3-, TLR4- und MyD88-defiziente Mäuse mit S. mansoni infiziert und immunologische und pathologische Daten in der akuten und chronischen Phase der Infektion analysiert. Demnach sind TLR2, TLR3, TLR4 und MyD88-abhängige Signaltransduktionswege nicht für eine-Th2 Antwort notwendig, jedoch ist letzteres Molekül in der Ausprägung der typischen Leberfibrose involviert. / Infection with Schistosoma mansoni results in the induction of a Th2 immune response, eosinophilia and increased levels of IgE. The water-soluble extract of S. mansoni eggs (SEA) is sufficient to promote TH2 polarization in a dendritic cell-dependent manner. In this thesis, it was demonstrated that IL-4+ CD4+ cells emerge in cultures with SEA-conditioned dendritic cells (DCs) in the presence of IFN-gamma and that SEA inhibits selectively the expression of IL-12 and co-stimulatory markers in DCs on the transcriptional and protein level. To identify the putative protein in S. mansoni eggs mediating a Th2 induction, a gel filtration chromatography of the excretory/secretory egg antigens (ES) was conducted and the fractions tested in vitro. Fractions containing a single band of 30 kD were sufficient to promote IL-4 induction in naïve CD4+ cells. Using N-terminal sequencing this ES-protein was identified as the hepatotoxic S. mansoni ribonuclease omega-1 which displayed both biological functions observed with SEA: inhibition of IL-12 in LPS-stimulated DCs and induction of IL-4+ CD4 cells at a 10 fold lower protein concentration than SEA. In order to understand, if the innate immune receptors TLR2, TLR3, TLR4 or the TLR adaptor molecule MyD88 are involved in the generation of the Th2 response against schistosomal antigens, the respective knock out mice were infected and immunological and pathological parameters were analyzed during acute and chronic phase of infection. This study showed that during S. mansoni infection TLR2, TLR3, TLR4 and TLR activation through the MyD88-dependent pathway are neither required for the induction (priming and polarization) nor for the down-regulation of Th2 responses, however, the fibrotic response against S. mansoni eggs was significantly reduced in MyD88-deficient mice suggesting a detrimental role of this pathway in liver pathology.

Este trabalho demonstrou a construção de minibibliotecas de \"Expressed Sequence Tags\" (EST) com o uso de RT-PCR de baixa estringencia e \"primer\" consenso-degenerado. Através do estudo de parâmetros críticos como concentração de sais, temperatura e velocidade de ciclagem, composição dos \"primers\" e qualidade do RNA mensageiro, foi possível padronizar um protocolo. Tal protocolo permitiu um aumento do numero de seqüências por minibiblioteca em relação a protocolos similares existentes na literatura (Dias neto et al., 1997 e 2000) sem perda de características desejáveis como amplificação preferencial do centro dos genes e nomalização das mensagens. As seqüências produzidas levaram a um significativo aumento das seqüências de EST de S. mansoni disponíveis publicamente e permitiu a detecção da existência de novos fragmentos de genes expressos na fase adulta do parasita. Neste trabalho também clonamos uma apirase de S. mansoni cuja a seqüência não havia sido descrita anteriormente. O gene possui cerca de 2,7 mil pares de bases e codifica para uma proteína de 544 aminoácidos. Esta foi expressa em sistema heterologo e utilizada para obtenção de anticorpos policlonais contra esta proteína. Utilizando estes anticorpos foi possível detectar a proteína no tegumento do parasita. / This work demonstrates the construction of EST minilibraries employing low stringency RT-PCR and consensus-degenerate primers. Through the study of critical parameters such as salt concentration, cycling temperature and ramp speed, composition of primers and quality of messenger RNA a standard protocol was obtained. Such protocol allowed an increase in the number of sequences per minilibrary in relation to similar protocols in the literature (Dias Neto et al., 1997 and 2000) without no loss in desirable characteristics such as preferential amplification of the central portion of messages and normalization of messages. The sequences produced allowed a significant increase in the publicly available EST sequences of S. mansoni and permitted discovery of new gene fragments expressed in adult stage of the life cycle of the parasite. In this work we also cloned an apyrase of S. mansoni whose sequence had never been described previously. The gene has about 2.7 kilobases and codes for a protein of 544 aminoacids. This protein was expressed in a heterologous system and was used for production of a polyclonal antibody. This antibody was used for detection of this protein in the tegument of the parasite.

Introdução - A esquistossomose é uma parasitose de grande relevância para a saúde pública. O Estado de São Paulo tem um perfil de baixa endemicidade, com transmissão focal. A região do Vale do Ribeira é uma das principais áreas endêmicas do Estado, e desde a década de 1980 se investiu muito em controle e vigilância da esquistossomose, principalmente em Itariri e Pedro de Toledo. Apesar dos esforços, verifica-se que antigas coleções hídricas com moluscos parasitados permanecem na região. Aspectos relativos ao hospedeiro intermediário da região suscitam considerações sobre os efeitos da infecção parasitária sobre sua biologia. Objetivos - Avaliar os dados de controle e vigilância do hospedeiro intermediário, em municípios do Vale do Ribeira, e observar os efeitos da infecção parasitária em Biomphalaria tenagophila de Itariri. Metodologia - Foram levantados dados epidemiológicos da esquistossomose, do período de 1981 a 2006, e dados das pesquisas planorbídicas, do período de 1997 a 2006, em municípios do Vale do Ribeira. Um estudo experimental foi conduzido para verificar os efeitos da infecção parasitária em espécimes de Biomphalaria tenagophila, procedentes de Ana Dias, Itariri. Delineamento experimental: 69 moluscos da geração (P) de laboratório formaram grupos controles e experimentais. Os moluscos experimentais se submeteram à infecção com 10 miracídios do Schistosoma mansoni - linhagem SJ. Variáveis observadas: fecundidade, mortalidade, tamanho e eliminação de cercárias. Análise histológica foi realizada em moluscos parasitados para verificar os efeitos da infecção. Resultados - constatou-se que nos últimos 10 anos Itariri, Pedro de Toledo e Miracatu continuam sendo os principais municípios com importância epidemiológica para esquistossomose. Pesquisa planorbídica: houve um aumento das coleções hídricas com presença de moluscos parasitados, em Itariri, e diminuição em Pedro de Toledo; houve um aumento na taxa de infecção dos moluscos de Itariri e Pedro de Toledo, nos últimos cinco anos; Infecção experimental: foram observados nos moluscos infectados, deformação nas conchas, maior mortalidade e diminuição da fecundidade na fase patente; a taxa de infecção foi de 59 %. O exame histológico revelou presença de esporocistos secundários e cercárias. Concluiu-se que houve uma evolução no potencial de riscos de transmissão da esquistossomose, em vários municípios do Vale do Ribeira, especialmente nos municípios de Itariri e Pedro de Toledo, que aliada à adaptação existente entre hospedeiro e parasita poderá levar a um aumento da transmissão do Schistosoma mansoni. Recomenda-se um trabalho de vigilância epidemiológica integrado com SUCEN e grupos técnicos da VIGILÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA do Vale do Ribeira. / Introduction - Schistosomiasis is a parasite with great importance for public health. The São Paulo State has a low endemicity profile, presenting some local focuses of the disease. The Ribeira Valley is one of the main endemicity areas in the State and, since the 1980's, a great deal has been invested in the control and surveillance of Schistosomiasis, particularly in the Itariri and Pedro de Toledo areas. In spite of efforts, old-established hydric collections with parasite-infected molluscs remain in the region. Aspects related to the intermediate hosts found in the region have taken us to considerations about parasitary infection effects in hosts' biology. Objectives - Evaluate the control and surveillance data of the Schistosomiasis intermediate host in the Ribeira Valley districts and observe the parasitary infection effects on the Biomphalaria tenagophila in the Itariri region. Methodology - Survey of Schistosomiasis epidemiological data, between 1981 and 2006, and survey of planorbidic research results, from 1997 to 2006, in the Ribeira Valley. Experimental work to assess the effects of parasitary infection on Biomphalaria tenagophila, from Ana Dias, Itariri. Experimental criteria: 69 laboratory-generated individuals (P) were employed to form control and experimental groups. The experimental molluscs were infected with 10 Schistosoma mansoni strains ("miracidias") - from the SJ lineage. Observed variables: fecundity, mortality, size and cercarie elimination. Histological analysis of parasite-infected molluscs to assess the infection effects. Results - Itariri, Pedro de Toledo and Miracatu have remained as the main Schistosomiasis epidemiological-importance centres in the last ten years. Planorbidic research: increase of hydric collections with the presence of parasite-infected molluscs, in the Itariri region, and decrease of it in the Pedro de Toledo region. Increase in molluscs' infection rate, in the Itariri and Pedro de Toledo regions, in the last five years. Experiemental infection: shell deformation, higher mortality rate, fecundity-capacity reduction were observed in the infected molluscs in the patent phase. It was observed a 59 %-infection rate. The histological study showed the presence of secondary sporocysts and cercaries. This leads to the conclusion that there has been an increase of Schistosomiasis' transmission risk in several Ribeira Valley districts, particularly in the Itariri and Pedro de Toledo regions, which allied to the parasite's and host's adaptation capacity, may lead to Schistosoma mansoni transmission. It is recommended that articulated efforts between the SUCEN and EPIDEMIOLOGIC-SURVEILLANCE technical groups are implemented in the Riberia Valley.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estudos em animais experimentais evidenciaram associações significativas entre esquistossomose mansoni e hipercolesterolemia. Estudos in vitro e in vivo já demonstraram que o colesterol é essencial para Schistosoma mansoni, embora este não tenha capacidade de sintetizá-lo. A captação é realizada a partir do ambiente (cultivo ou hospedeiro) através do tegumento. O colesterol está envolvido nos mecanismos de evasão do helminto contra a resposta imunológica, além de poder participar na modulação da sinalização celular e reprodução, estimulando os órgãos reprodutores dos helmintos adultos como observado na fase aguda da infecção experimental. Este trabalho tem como objetivo avaliar se o mesmo fenômeno ocorre na fase crônica. Os helmintos foram recuperados de dez camundongos submetidos à dieta hiperlipídica ou padrão (controle) foram corados pelo carmin cloridrico e montados, individualmente, em lâmina histológica com bálsamo do Canadá. A preparação foi analisada por microscopia de campo claro nos seguintes caracteres: tegumento e o sistema reprodutor nos vermes machos (lobos testiculares, vesícula seminal, lobos testiculares supranumerários e canal ginecóforo) e, nas fêmeas (ovário, oótipo, útero, ovo, glândulas vitelínicas e espermateca). Posteriormente, algumas lâminas foram separadas para visualização pela microscopia confocal dos órgãos do sistema reprodutores acima descritos. Apesar de ter sido observado uma maior quantidade de espermatozoides, uma maior quantidade de oócitos sendo liberados no grupo da dieta, não houve diferença estatística significativa (p>0,05) entre os grupos analisados. Houve um aumento na oogênese como observado na fase aguda. Dessa forma, o colesterol pode estar relacionado com a estimulação na atividade dos órgãos reprodutores dos helmintos adultos na fase crônica da infecção. / Studies in experimental animals showed significant associations between with schistosomiasis and hypercholesterolemia. In vitro and in vivo studies have demonstrated that cholesterol is essential for Schistosoma mansoni, although this is not able to synthesize it. The capture is carried out from the environment (cultivation or host) through the tegument. The capture is carried out from the middle (cultivation or host) through the tegument. Cholesterol is involved in the helminth evasion mechanisms against the immune response, and can participate in the modulation of cell signaling and reproduction of worms by stimulating the reproductive organs of adult worms as observed in the acute phase of experimental infection. This study aims to evaluate whether the same phenomenon occurs in the chronic phase. Helminthes recovered from ten mice subjected to high fat diet or standard (control) were stained with hydrochloric carmine and mounted individually on histological slide with Canada balsam. The preparation was analyzed by bright field microscopy the following characteristics: oral sucker and ventral sucker, tubercles on tegument and the reproductive system in male worms (lobes testicular, seminal vesicles, supernumerary testicular lobes and gynaecophoric canal), and in females (ovary, ootype, uterus, egg, vitelline glands and spermatheca). Subsequently, some slides were separated for confocal microscopy for visualization of the organs of the reproductive system described above. Despite having been observed a higher amount of sperm, a larger number of oocytes are released in the diet group, there was no statistically significant difference (p> 0.05) between the groups. There was an increase in oogenesis as observed in the acute phase. Thus, cholesterol may be related to the stimulation of the activity of the reproductive organs of adult helminths in the chronic phase of infection.

O parasita Schistosoma mansoni é um dos principais causadores da esquistossomose, doença que acomete 200 milhões de indivíduos no mundo. O parasita possui um complexo ciclo de vida composto de seis estágios evolutivos em dois hospedeiros. S. mansoni possui um sofisticado sistema de interação com seus hospedeiros de modo a escapar da resposta imune e interagir com moléculas produzidas por eles. Alguns trabalhos na literatura descreveram o efeito do TNF-α humano sobre o processo de ovoposição do parasita adulto. Nosso trabalho teve por objetivo analisar o perfil de expressão gênica do S. mansoni ao longo de seus estágios de desenvolvimento, avaliar o efeito do TNF-α humano sobre o perfil de expressão gênica do parasita em dois estágios de desenvolvimento e descrever o gene homólogo ao receptor de TNF-α humano em S. mansoni. Para isso, duas plataformas de microarrays distintas foram utilizadas: uma composta por 4000 sondas de cDNA dupla fita produzida pelo nosso grupo de pesquisa e a outra, composta por 44000 sondas de oligonucleotídeos desenhadas pelo nosso grupo e produzida pela empresa Agilent Technologies. Com estas plataformas foi detectada a expressão de 5798 genes em vermes adultos, sendo que 156 genes apresentavam a transcrição nas fitas senso e anti-senso; 6 destes tiveram confirmadas a transcrição nas duas fitas por transcrição reversa fita específica seguida de PCR em Tempo Real. Adicionalmente foram identificados 229 genes diferencialmente expressos entre vermes adultos machos e fêmeas. A análise de expressão gênica entre 5 estágios de desenvolvimento do parasita mostrou dois tipos de conjuntos de dados: (i) 1423 genes diferencialmente expressos entre dois estágios subseqüentes de desenvolvimento e (ii) 342 genes com expressão enriquecida em um estágio exclusivamente. 68 destes são transcritos intrônicos que não possuem potencial codificador de proteinas. Um gene ortólogo ao receptor de TNF-α humano (SmTNFR) foi clonado e sequenciado. O transcrito SmTNFR possui 1967pb e codifica uma proteína de 599 aminoácidos. Outros 9 genes codificando elementos conservados da via de sinalização de TNF-α também foram identificados no conjunto de ESTs público, revelando uma via completa de sinalização de TNF-α no parasita. Por fim, identificamos com microarrays o conjunto de genes com expressão alterada pela adição de TNF-α humano em esquistossômulos e vermes adultos. 340 genes tiveram expressão alterada em vermes adultos utilizando a plataforma de cDNA. 411 genes sofreram mudanças de expressão em esquistossômulos e 1093 genes em vermes adultos detectados na plataforma de oligonucleotídeos. Este trabalho representa uma importante contribuição no entendimento da relação parasita-hospedeiro em nível molecular. / The parasite Schistosoma mansoni is one of major causative agents of schistosomiasis, a disease which affects 200 million people in the world. The parasite has a complex life cycle with six developmental stages in two hosts. S. mansoni has a sofisticated system of interaction with the hosts, permitting it to escape the immune response and to interact with molecules produced by the hosts. The effect of human TNF-α on adult parasite egg-laying has been described in the literature. The present work intended to analyse the gene expression profile of S. mansoni among its developmental stages, to evaluate the effect of human TNF-α on gene expression profile in two different developmental stages and to describe a homologous gene to human TNF-α receptor in S. mansoni. Two microarrays platfoms were used: one comprised by 4000 cDNA probes and printed by our research group and another, comprised by 44000 oligonucleotide probes designed by our group and printed by Agilent Technologies Company. With these platforms, we detected the expression of 5798 genes in adult worms, of which 156 showed transcription in sense and anti-sense strands; 6 of them had their expression levels confirmed by strand specific Real Time PCR. 229 genes were identified as differentially expressed between male and female adult worms. Gene expression analysis among 5 parasite developmental stages identified two data sets: (i) 1423 differentially expressed genes between two subsequent developmental stages and (ii) 342 expressed genes enriched in one exclusive stage. 68 of them are intronic transcripts with no protein-coding potential. An ortologue to human TNF-α receptor (SmTNFR) was cloned and sequenced. SmTNFR transcritpt has 1967bp and encodes a 599-amino acid protein. Other 9 genes encoding conserved elements of the TNF-α signaling pathway were identified among the public S. mansoni ESTs dataset, thus revealing a complete TNF-α signaling pathway in the parasite. Finally, we identified with microarrays the set of genes that have an altered gene expression upon exposure of schistosomula and adult worms to human TNF-α. 340 genes were identified with altered expression in adult worms using the cDNA platform. 411 genes changed their expression pattern in schistosomula and 1093 genes in adult worms using the oligonucleotide platform. This work represents an important contribution to the understanding of host-parasite interaction at the molecular level.

A Esquistossomose é uma das mais importantes doenças endêmicas do mundo, com mais de 200 milhões de pessoas infectadas em 76 países. É estimado que mais de 600 milhões de pessoas estejam em áreas endêmicas. Em 2003 dados do transcriptoma do Schistosoma mansoni foram disponibilizados. As informações de proteínas codificadas permitiram a análise de suas funções, e auxiliaram na procura de novos candidatos vacinais. A análise do transcriptoma permitiu a identificação de três famílias de proteínas homólogas à dineína de cadeia leve (DLC) de mamíferos. Uma delas é a família L8, com ao menos 18 membros, com proteínas em torno de 10 kDa. Essas proteínas são expressas em diferentes estágios do ciclo de vida do Schistosoma mansoni. Duas DLCs foram reconhecidas no tegumento de S. japonicum, sugerindo que elas são expostas ao sistema imune do hospedeiro. Salmonelas atenuadas como vacinas vivas têm sido descritas como bons veículos para apresentação de antígenos heterólogos. No nosso laboratório uma importante ferramenta tem sido desenvolvida para auxiliar o uso de salmonelas como vacinas vivas recombinantes, foi desenvolvido um vetor plasmididal baseado no regulon soxRS para controlar a expressão de genes heterólogos in vivo. Este sistema de expressão promove a expressão de proteínas recombinantes sob condições de estresse oxidativo, como aquele imposto ao microorganismo dentro do macrófago. Para investigar o potencial vacinal das DLCs, três genes foram selecionados para serem clonados e expressos em E. coli e em salmonelas atenuadas. A antigenicidade e imunogenicidade desses parálogos foram testadas em camundongos depois de serem imunizados com proteínas purificadas ou com salmonelas recombinantes. As DLCs mostraram ser bastante imunogênicas, aumentando os título de IgG. A proteína DLC1 também aumentou os níveis de IgE no soro dos animais, fato que poderia estar relacionado com reações alérgicas observadas em populações infetadas. Altos níveis de IgE também podem ser relacionados com uma marca de resistência existente em pessoas que vivem em áreas endêmicas. Depois de imunizados os animais foram desafiados com cercárias para investigar possível proteção. Foi observado que a imunização com proteínas purificadas resultou em aproximadamente 40% de diminuição da carga parasitária. A análise dos granulomas hepáticos com 45 dias depois da infecção indicou uma significativa redução, maior que 70% das áreas dos granulomas, sgerindo que a imunização com as DLCs promove uma importante interferência na formação dos granulomas hepáticos. Por outro lado, nossos estudos com salmonelas atenuadas recombinantes, carregando as DLCs, mostraram que foram ineficientes na apresentação dos antígenos ao sistema imune. Relacionando os resultados de diminuição de carga parasitária e das áreas dos granulomas depois da imunização com as DLCs purificadas sugere-se que essas proteínas podem ser consideradas como interessantes candidatos vacinais, uma vez que elas afetam as mais importantes causas da patologia da esquistossomose. / Schistosomiasis is one of the most important endemic diseases in the world, with more than 200 million people infected in 76 countries. It is estimated that more than 600 million people live in endemic areas. In 2003 extensive data from the transcriptome of Schsitosoma mansoni was made available. The information on the encoded proteins allowed the analysis of protein function and improved the search for vaccine candidates. The analysis of the transcriptome allowed the identification of three families of proteins homologs to the mammalian dynein light chain (DLC). One of these was the L8 family, with at least 18 members, all proteins with around 10 kDa. These proteins were found to be expressed in the different stages of the S. mansoni life cycle. Two DLCs were recognized in the tegument of S. japonicum, suggesting that they are exposed to the host immune system. Attenuated salmonellas, as live vaccines, have been described as good vehicles for presentation of heterologous antigens. At our laboratory an important tool has been developed to improve the use of salmonellas as live recombinant vaccines, a plasmidial vector based on the soxRS regulon to control the expression of heterologous genes in vivo. This expression system promotes the expression of recombinant proteins under conditions of oxidative stress, such as that imposed to the microorganism in the macrophage environment. To investigate the vaccine potential of DLCs, three genes were selected to be cloned and expressed in E. coli and in attenuated salmonellas. Antigenicity and immunogenicity of these paralogous were tested in mice after immunization with purified proteins or with the recombinant salmonellas. The DLCs were proven to be very immunogenic, increasing the IgG titers. DLC1 also increased the IgE levels in the sera of animals, what could be related to allergenic reactions observed in infected population. High level of IgE can also be related to the resistance mark of people living in endemic areas. After immunization, the animals were challenged with cercarias to investigate the protective profile. It was observed that immunization with purified proteins resulted in approximately 40% decreasing in the worm burden. The analysis of the hepatic granulomas 45 days after infection indicated a significant, up to 70 %, reduction of the granuloma areas, suggesting that immunization with DLCs promotes important interference in the hepatic granuloma formation. On the other hand, our studies with the attenuated recombinant salmonellas, carrying DLCs, showed no effective antigen presentation to the mice immune system. Taking together, the results of decreasing the worm burden and the granuloma size after immunization with purified DLCs suggest that these proteins could be considered as interesting vaccine candidates, affecting the main causes of the pathology of schistosomiasis.