Submitted by Rômulo Aguiar (romulo.aguiar@ucsal.br) on 2018-05-10T14:38:39Z No. of bitstreams: 1 TESEMIGUELALMEIDA.pdf: 2536339 bytes, checksum: f42138012a9efc9972d05653bd85c536 (MD5) / Approved for entry into archive by Rosemary Magalhães (rosemary.magalhaes@ucsal.br) on 2018-05-10T14:47:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TESEMIGUELALMEIDA.pdf: 2536339 bytes, checksum: f42138012a9efc9972d05653bd85c536 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-10T14:47:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESEMIGUELALMEIDA.pdf: 2536339 bytes, checksum: f42138012a9efc9972d05653bd85c536 (MD5) Previous issue date: 2018-01-25 / Com o objetivo de investigar e identificar os fatores associados à prevalência endêmica da esquistossomose no município de Santa Inês/BA, foi realizado este estudo, de natureza qualitativa, em função de seu viés sociológico. Assim, este estudo teve como parâmetros a pesquisa das políticas públicas de saúde, adotadas no Brasil, e pesquisa de campo por intermédio de questionários e entrevistas na área estudada. Foram realizadas pesquisas bibliográfica, exploratória/explicativa e de campo. Na pesquisa de campo, foram aplicados 10 (dez) questionários a acometidos pela esquistossomose, residentes no referido município, e realizadas 03 (três) entrevistas, sendo 01 (uma) com a Secretária municipal, gestora de Saúde e 2 (duas) com os únicos profissionais que atuam no PCE, para atender toda a demanda municipal. Os resultados indicaram que os fatores relacionados à prevalência endêmica, estão associados à fragilização da saúde na área estudada. Falta de pessoal de saúde para atender às demandas do PCE no município, infraestrutura deficiente, falta de material e de veículos para atender às atividades operacionais de rotina, inexistência de uma política de educação em saúde, carência de medicamentos, de informação para a população, inexistência de parcerias entre a Secretaria de Saúde e outros órgãos públicos, estão entre os principais fatores identificados, que contribuem para a prevalência endêmica da Esquistossomose no município de Santa Inês/BA. / In order to investigate and identify the factors associated with the endemic prevalence of schistosomiasis in the of Santa Inês city / BA, this qualitative study was carried out in function of its sociological bias. Thus, this study had as parameters the research of the public policies of health, adopted in Brazil, and field research through questionnaires and interviews in the studied area. Bibliographic, exploratory / explanatory and field research were carried out. In the field survey, 10 (ten) questionnaires were applied to the schistosomiasis patients, living in referred county, and three (03) interviews were conducted, being one (1) the Municipal Secretary, Health Manager and two (2) with the only professionals working in the PCE, to meet all municipal demand. The results indicated that the factors related to the endemic prevalence, are associated to the weakening of health in the studied area. Shortage of health personnel to meet PCE demands in the municipality, poor infrastructure, lack of material and vehicles to attend to routine operational activities, lack of a health educational policy, scarcity of medicines, lack of information for the population, lack of partnerships between the Department of Health and other public agencies, are among the main factors identified, contributing to the endemic prevalence of Schistosomiasis in the Santa Inês county/ BA.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:02:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6626.pdf: 3445812 bytes, checksum: 7cade950ece338c3975f5a311fc17e38 (MD5) Previous issue date: 2014-08-08 / Universidade Federal de Minas Gerais / Mansonic schistosomiasis is a disease that infected more than 240 million people worldwide, it is caused by Schistosoma mansoni. It is the second only to malaria in public health importance. The only drug currently effective against S. mansoni is Praziquantel (PQZ), however, has been reported strains of S. mansoni with loss of sensitivity. Such reports reinforce the need to develop new safer treatment against S. mansoni. The natural compounds are important to develop new drugs. Mentha piperita L. also known as peppermint, studies reported the treatment as antiparasitic diseases (for example giardiasis). In ours laboratory showed a decrease of inflammatory process of schistosomiasis in a murine model after treatment with ethanolic extract of M. piperita. However don´t know nothing about action of this plant against adult worms of S. mansoni. Harpagophytum procumbens is a plant that has origins in Africa, studies showed promising results antibacterial and against rheumatism diseases, but has no studies against schistosomiasis. In this study we evaluated effect of ethanolic extract of H. procumbens and ethanolic extract of Mentha piperita L. and its fractions against Schistosoma mansoni, its observed for optical microscopic and change in protein expression, after in vitro assay. It was observed that all extract and its fraction caused the motor activity reduction and separation of couple worms. Exceptions of hydroalcoholic fraction of M. piperita, S. mansoni adult worms were death after treatment. We observed that ethanolic extract of H. procumbens showed more promising results when compared with M. piperita. And we observed that ethyl acetate shoed more promising result than ethanolic extract of M. piperita and its other fractions.In this work was observed change in protein expression in 2D gel electrophoresis after all ethanolic extractions and fractions treatment. The proteins in gel electrophoresis have been identified by mass spectrometry. The mass spectrometry assay showed important proteins for S. mansoni homeostasis and possible therapeutic target, for example actin, enolasis, fructose-biphosphate aldolase, and others important proteins. These results indicate that these plants may be anthelmintic activity against S. mansoni. However, it has need for more studies to complete undesiring of these extract against S. mansoni. / A esquistossomose mansônica, doença que afeta mais de 240 milhões de pessoas no mundo é causada por um trematódeo, o Schistosoma mansoni. Entre as doenças tropicais, ocupa o segundo lugar em mortalidade no mundo, perdendo apenas para a malária. A presença de cepas com perda de sensibilidade ao tratamento com o farmaco comercial disponível (Praziquantel) sugere a necessidade de desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento desta doença. O uso de compostos naturais é uma área de grande interesse no desenvolvimento de novos farmacos. A Mentha piperita L. conhecida popularmente como hortelã pimenta, tem seus efeitos terapêuticos comprovados no tratamento de algumas parasitoses (como giardíase). Estudos recentes em nosso laboratório demonstraram diminuição do processo inflamatório no modelo murino da esquistossomose, quando os animais foram tratados com extrato da M. piperita. No entanto, nada se sabe sobre a ação da M. piperita no parasito. E a planta, nativa da África, Harpagophytum procumbens apresenta eficácia contra bactérias e doenças reumáticas, mas nada foi descrito contra a esquistossomose. Dessa forma, propomos a avaliação do efeito do extrato etanólico e suas diferentes partições da Mentha piperita e o extrato etanólico da Harpagophyrum procumbens em vermes adultos de S. mansoni, observando efeito por microscopia óptica e a ocorrência de alterações no perfil da expressão proteica, após o tratamento in vitro. As analises por microscopia revelou que, todos os extratos testados induziram separação dos casais e redução da atividade motora. E exceção foi observada com a partição hidroalcoólica da M. piperita, onde todos os vermes adultos de S. mansoni estavam mortos, após exposição. O extrato da H. procumbens provocou mortes dos vermes adultos, com menor concentração, comparado ao extrato da M. piperita. E entre os extratos com a M. piperita foi observado que, a partição com o acetato de etila apresentou resultados mais promissores no controle dos parasitas. Na análise proteômica, todos os tratamentos revelaram spots diferentes em géis de eletroforese bidimensionais após analises por software. Posteriormente, as proteínas presentes nos spots foram reveladas, e utilizando a espectrometria de massas identificadas proteínas que se apresentam como importantes para homeostase celular do S. mansoni e podem ser consideradas como possíveis alvos para vacinas, como actina, enolase, Frutose-bifosfato aldolase, entre outras. Nossos resultados sugerem que, estas plantas podem apresentar efeito antihelmintico contra S. mansoni. Por tanto é preciso mais estudos para melhores entendimentos dos efeitos dos extratos destas plantas nesse modelo.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3782.pdf: 3163554 bytes, checksum: 0618bd2bdada0c2a03100442eff64044 (MD5) Previous issue date: 2011-07-22 / Universidade Federal de Minas Gerais / Schistosoma mansoni is the parasite responsible for schistosomiasis mansonica, a disease that affects about 207 million people worldwide, and does not have the purine de novo sinthetic pathway, depending entirely on the purine salvage pathway to supply its demands on purines. Adenosine kinase (AK) and Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HGPRT) are important enzymes of the purine salvage, the AK directly phosphorylates adenosine into adenosine monophosphate (AMP) and HGPRT is responsible for the reversible phosphorybosylation of hypoxanthine or guanine into IMP or GMP. The purine salvage pathway has been reported as a potential target for developing new drugs against schistosomiasis. The nucleotide coding region of the isoform 2 of AK enzyme was amplified and cloned into pGEM vector and pET28a, the recombinant protein was expressed in E.coli BL21 (DE3), purified in a his-tag nickel-affinity resin and AMP-agarose resin, tested for its activity and crystallized. Two data sets were obtained by X-ray diffraction: a ternary complex of AK2-AMP-adenosine in the MX2 light line of the Synchrotron Light National Laboratory and a binary complex AK2-tubercidin in the rotatory anode X-ray source of the Institute of Physics at Sao Carlos - USP, both at 2.3A of resolution. The nucleotide coding region of the enzyme HGPRT was also amplified, cloned into pGEM and pET28a, which heterologous expression was done in E.coli BL21 (DE3) cells at 18°C and purified on a cobalt his-tag affinitiy resin. / Schistosoma mansoni e o parasita responsavel pela esquistossomose mansonica, doenca que afeta cerca de 207 milhoes de pessoas em todo mundo, e nao possui a via de sintese de novo de purinas, dependendo integralmente da via de salvacao para seu suprimento de purinas. A adenosina kinase (AK) e a Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (HGPRT) sao importantes enzimas desta via, sendo a AK responsavel pela fosforilacao direta de adenosina para adenosina monofosfato (AMP) e a HGPRT pela fosforibosilacao reversivel de hipoxantina ou guanina para IMP ou GMP respectivamente. Essa via tem sido citada como alvo potencial para o desenvolvimento de novos farmacos contra a esquistossomose. A regiao nucleotidica codificadora da enzima AK, isoforma 2, foi amplificada e clonada em vetor pGEM e pET28a, a proteina recombinante foi expressa em E.coli BL21 (DE3), purificada em coluna de niquel e AMP-agarose, submetida a ensaios de atividade e cristalizada. Dois conjuntos de dados foram obtidos por difracao de raio-X: um complexo ternario de AK2- AMP-adenosina na linha de luz MX2 do Laboratorio Nacional de Luz Sincrotron e um complexo binario de AK2-tubercidina no raio-X do Instituto de Fisica de Sao Carlos USP anodo rotatorio, ambos a 2.3A de resolucao. A regiao nucleotidica codificadora da enzima HGPRT tambem foi amplificada, clonada em pGEM e pET28a, sendo a proteina recombinante expressa em E.coli BL21 (DE3) a 18°C e purificada em coluna de cobalto.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-22T20:13:29Z No. of bitstreams: 1 JaneteCunhaLima_DISSERT.pdf: 3013582 bytes, checksum: d401198755cf83fbccff88970e69f861 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-03-08T21:51:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 JaneteCunhaLima_DISSERT.pdf: 3013582 bytes, checksum: d401198755cf83fbccff88970e69f861 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-08T21:51:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JaneteCunhaLima_DISSERT.pdf: 3013582 bytes, checksum: d401198755cf83fbccff88970e69f861 (MD5) Previous issue date: 2016-01-29 / O presente estudo objetivou avaliar a express?o dos receptores da imunidade inata em linhagens de camundongos suscet?veis e resistentes ? infec??o pelo Schistosoma mansoni. Cerca de 30 cerc?rias da cepa LE do S. mansoni foram inoculadas por via subcut?nea em camundongos machos das linhagens Balb/c, C57BL/6 e Swiss. Duas, sete, 12 e 16 semanas ap?s a infec??o (SAI) os camundongos foram mortos e quando poss?vel foram avaliados os seguintes par?metros: parasitismo (por meio de perfus?o hep?tica), oograma, presen?a de granulomas hep?ticos, e express?o do RNA mensageiro (RNAm) de citocinas da imunidade inata (IL-1?, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-18 e TNF-?), dos receptores do tipo Toll (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9), dos receptores do tipo Nod (NALP1 e NALP3) e mol?culas adaptadoras (Myd88, ASC, Caspase-1) em tecido hep?tico, por meio de PCR em tempo real. Camundongos Balb/c e C57BL/6 apresentaram sobreviv?ncia de 70%, enquanto camundongos Swiss apresentaram sobreviv?ncia de 100%, quando avaliados at? 16 SAI. Em duas SAI os camundongos Swiss apresentaram maior express?o do RNAm de NLRP1, NLRP3, Caspase-1, IL-1? e IL-18, quando comparados aos Balb/c e C57BL/6. Os animais das linhagens Balb/c e C57BL/6 apresentaram maior express?o do RNAm de TLR2, TLR3, TLR5, NLRP3 e ASC em sete SAI, quando comparados aos Swiss. Em adi??o, a linhagem Balb/c apresentou express?o aumentada do RNAm de TLR6, TLR7, TLR9, Myd88, NLRP1 e TNF-?. Ademais, camundongos Swiss apresentam menor quantidade de parasitos adultos no sistema porta hep?tico e menor quantidade de ovos no fragmento ?leo distal, em sete e 12 SAI, quando comparados aos C57BL/6 e Balb/c. Em conclus?o, os camundongos C57BL/6 e Balb/c apresentam express?o elevada dos receptores TLRs e NLRs em sete SAI (in?cio da oviposi??o), sugerindo maior suscetibilidade a infec??o, com consequente aumento na taxa de mortalidade nestes animais. Outrossim, camundongos Swiss apresentam acentuado perfil inflamat?rio inicial (em duas SAI), o que poderia auxiliar no controle do parasitismo. E a supress?o da ativa??o dos receptores e citocinas da imunidade inata, em sete SAI, poderiam ocasionar menor mortalidade e maior resist?ncia ? infec??o neste per?odo. / This study aimed to evaluate innate immune receptors expression in susceptible and resistant mouse strains to infection with Schistosoma mansoni. About 30 S. mansoni cercariae, LE strain, were inoculated subcutaneously into Balb/c, C57BL/6 and Swiss male mice. Two, seven, 12 and 16 weeks after infection (WAI) mice were euthanized and when possible evaluated the following parameters: parasitism by hepatic portal system perfusion, oogram, presence of hepatic granulomas, and cytokines of innate immunity (IL-1?, IL-6, IL-10, IL-12p35, IL-18 and TNF-?) mRNA expression, innate immunity Toll-like receptor (TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9) mRNA expression, Nod-like receptor (NALP1 and NALP3), and adapter molecules (Myd88, ASC, and Caspase-1) mRNA expression in liver tissue, by Real-time PCR. Balb/c and C57BL/6 mice showed survival of 70%, while Swiss mice showed 100% survival when evaluated by 16 WAI. In two WAI Swiss mice showed higher NLRP1, NLRP3, caspase-1, IL-1? and IL-18 mRNA expression when compared to Balb/c and C57BL/6. Balb/c and C57BL/6 mice showed higher TLR2, TLR3, TLR5, NLRP3 and ASC mRNA expression in seven WAI when compared to the Swiss. In addition, Balb/c mice showed increased TLR6, TLR7, TLR9, MyD88, NLRP1 and TNF-? mRNA expression. Moreover, Swiss mice have a lower number of adult parasites in the hepatic portal system and fewer eggs in the distal ileum fragment in seven and 12 WAI when compared to Balb/c and C57BL/6. In conclusion, C57BL/6 and Balb/c mice showed high TLRs and NLRs receptors mRNA expression in seven WAI (oviposition beginning), suggesting intensify susceptibility to infection, with consequent increase in the mortality rate in these animals. Furthermore, Swiss mice exhibited increase initial inflammatory profile (in two WAI), which could assist in the control of parasitism. And the mRNA activation suppression of cytokines and receptors of innate immunity, in seven WAI, could cause lower mortality and greater resistance to infection during this period.

O parasita Schistosoma mansoni não possui a via de síntese de bases púricas e depende integralmente da via de salvação de purinas para o seu requerimento de purinas. Uma das enzimas participantes desta via é a Purina Nucleosídeo Fosforilase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). A PNP catalisa a fosforólise reversível de nucleosídeos de purina para gerar a base correspondente e ribose-1-fosfato. No Projeto Genoma de Schistosoma mansoni, o gene para esta enzima foi identificado.O cDNA para a PNP de S. mansoni (SmPNP), possui 1055pb e codifica para uma proteína de 287 aminoácidos, que possui 49% de identidade quando comparada a PNP de eritrócitos humana ou de Baco bovino. O gene foi clonado no vetor de expressão pMAL C2G, e expresso na forma de uma proteína de fusão, com MBP (80mg/L). Após a purificação da proteína de fusão, a clivagem proteolítica das duas proteínas foi realizada utilizando-se o Factor Xa. A SmPNP foi então purificada utilizando uma coluna de troca catiônica. Foram determinadas as constantes catalíticas para a fosforólise de inosina pela SmPNP, as quais são 3?M para o KM e 222 s-1para o kcat. O valor para o KM é O menor já descrito para uma PNP de baixa massa molecular. Foram obtidos cristais da SmPNP utilizando 18-24 % de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Quando utilizado o aditivo NDSB195 na cristalização da SmPNP a solução de cristalização foi 28-30% de PEG 1500, 20% de glicerol em 32mM de tampão acetato de sódio pH 4,9-5,O. Cinco conjuntos de dados de difração de raios X foram obtidos tanto na presença como na ausência de ligantes. A resolução deste conjuntos de dados variou de 2,75? a 1,75 ?. Todas estas estruturas foram resolvidas pelo método da substituição molecular, sendo que na primeira estrutura resolvida (a 2,75?) foi utilizado a estrutura da PNP bovina como modelo de busca, e na resolução das estruturas subsequentes foi utilizado a estrutura da SmPNP como modelo de busca. A estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução foi obtida a partir de um cristal crescido na presença de NDSB 195, e após sua resolução foi encontrado este composto ligado em todos os sítios ativos da SmPNP via a sítio de ligação do fosfato. Foram também obtidas as estruturas da SmPNP na forma apo a 1,9? de resolução e em complexo com fosfato a 2,0? de resolução. Todas as estruturas foram utilizadas na comparação com outras PNPs de baixa massa molecular. Utilizando a estrutura da SmPNP a 1,75? de resolução, foi realizada uma busca por compostos (Virtual Screening) que ligassem a SmPNP. Nesta busca foi utilizando o programa GOLD, utilizando uma base de dados de cerca de 36000 compostos com peso molecular inferior a 280 Da. Vinte e dois compostos foram selecionados com base no escore de docking e pelas interações (pontes de hidrogênio) com os resíduos chave do sítio ativo. Utilizando PNP bovina e a mesma abordagem de docking foram selecionados 19 compostos. Estes compostos foram ensaiados contra a SmPNP e 12 compostos se mostraram capazes de inibir a SmPNP. Um complexo entre a SmPNP e o composto AT2169 (oriundo do VS) foi obtido e refinado. Esta abordagem foi validada utilizando ligantes conhecidos das PNPs. / The parasite Schistosoma mansoni, unlike its mammalian hosts, lacks the \"de novo\" pathway for purine biosynthesis and depends on the salvage pathways for its purine requirements. One component of this pathway is Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) (E.C. 2.4.2.1). PNP catalyzes the reversible phosphorolysis of purine nucleosides to generate the corresponding purine base and ribose 1-phosphate. In the Schistosoma mansoni Genome Project the gene for this enzyme was isolated. The SmPNP cDNA was sequenced, corresponding to 1055 bases that code for a 287 amino acid protein with 49% sequence identity to its human erythrocyte homologue. The SmPNP gene was cloned into the pMAL C2G expression vector and the recombinant fusion protein was produced and purified using an amylose affinity column (approx. 80mg/mL). The fusion protein is composed of a Maltose Binding Protein adjoined to the SmPNP. After cleavage with Factor Xa, the cleavage product was purified using a cation exchange column. The KM and kcat of SmPNP for inosine phosphorolisis was determined to be 3?M and 222 s-1 respectively. This corresponds to the lowest value for KM yet described for a low molecular mass PNP. SmPNP crystals were obtained by the hanging drop method, using 18-24% PEG 1500, 20% glycerol in the presence of 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.0). When NDSB195 was used as an additive in the SmPNP crystallization the solution used was 28-30% PEG 1500, 20% glycerol and 32mM sodium acetate buffer (pH 4.9-5.O).Five datasets were obtained in the presence and absence of ligands, varying in resolution from 2,75 to 1,75?. All structures were solved by the molecular replacement method. The first structure (at 2,75?) was solved using the bovine PNP as the search model and in the remaining structures the search model was the SmPNP structure itself. The 1,75? structure was obtained from a crystal grow in the presence of the additive NDSB195, and after its determination NDSB195 was observed bound to the SmPNP active site via its phosphate binding site. Structures were also obtained for the apo SmPNP at 1,9? and its complex with phosphate at 2,0? resolution. All structures were used in the comparison with other low molecular mass PNPs. The SmPNP structure at 1,75A resolution was used in the search small molecule ligands, which potentially bind to SmPNP via virtual screening. For this purpose the program Gold together with a database of 36000 compounds with MW lower than 280Da was used. As a result 22 compounds were selected using the docking score and the H-bonding interaction with the key residues of the SmPNP active site. Using the bovine PNP and same docking approach 19 compounds were selected. These 41 compounds were assayed against SmPNP enzyme and 12 compounds were active against the SmPNP. One complex between SmPNP and one of these compound (AT2 169) was obtained and refined. This virtual screening approach was validated using known ligands of PNPs including inosine, guanosine, immucilins, etc.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Francisco Javier Medrano Martin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T15:38:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dantas_DeysedeSouza_D.pdf: 4937353 bytes, checksum: 5c9b26f6ef8ed34e974ca6c8bb0708f2 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os genes que codificam para a 6-oxopurina fosforribosiltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) dos organismos Pyrococcus horikoshii e Schistosoma mansoni foram clonados em vetores de expressão. As proteínas foram expressas e purificadas em larga escala no sistema de expressão de Escherichia coli. Estudos cinéticos mostraram que a enzima de P. horikoshii é capaz de usar hipoxantina, guanina e xantina. Os dois primeiros substratos apresentam uma eficiência catalítica semelhante. A xantina apresenta um valor menor (ao redor de 20 vezes mais baixo), mas a constante catalítica é comparável com a da hipoxantina. A proteína não foi capaz de se ligar a GMP-agarose, mas sim pode ligar o outro substrato da reação reversa, pirofosfato inorgânico, com baixa afinidade (Kd = 4,7 ± 0,1 mM). Os dados de espalhamento dinâmico de luz, gel filtração e espalhamento de raios X a baixo ângulo mostram que esta proteína é um homohexâmero em solução. Este hexâmero é compacto e resistente à ação limitada de enzimas proteolíticas. Estudos de estabilidade frente a agentes químicos mostraram que a proteína é bastante estável resistindo os efeitos da uréia sem desenovelar completamente com a maior concentração do agente (8,0 M). Os dados obtidos com cloreto de guanidina mostraram que a proteína possui, no mínimo, um estado intermediário de desnaturação, como mostram os diferentes perfis obtidos com as diferentes técnicas usadas nos estudos de desnaturação. Os dados preliminares obtidos com a HPRT de S. mansoni mostraram que, na presença da cauda de histidinas, a proteína está presente como um octâmero alongado. Mas, muito provavelmente ela deve ser um tetrâmero. A presença de caudas fusionadas nas proteínas recombinantes pode afetar a estrutura e função das proteínas / Abstract: The genes that code for the 6-oxopurine phosphoribosyltransferase (HPRT, EC2.4.2.8) from the organisms Pyrococcus horikoshii and Schistosoma mansoni were cloned in expression vectors. The proteins were expressed and purified in large scale in the de Escherichia coli expression system. Kinetic studies showed that the enzyme from P. horikoshii is able to use hypoxanthine, guanine and xanthine. The first two substrates show a similar catalytic efficiency. Xanthine show a lower value (around 20 times), but the catalytic constant is comparable to that of hypoxanthine. The protein was unable to bind to GMP-agarose, but was able to bind the other substrate of the reverse reaction, inorganic pyrophosphate, with low affinity (Kd = 4.7 ± 0.1 mM). Dynamic light scattering, gel filtration and small angle X-ray scattering data show that the protein is a homohexamer in solution. This hexamer is compact and resistant to the limited action of proteolytic enzymes. Stability studies with chemical agents showed that the protein is very stable being able to stand the effects of urea without unfolding completely at the highest agent concentration (8.0 M). Data obtained with guanidine hydrochloride showed that the protein presents, at least, one unfolding intermediate state, as can be seen with the different profiles obtained with different techniques used in the unfolding studies. Preliminary data obtained from HPRT from S. mansoni showed that in the presence of the histidine tag, is present as a long octamer. But, most likely it should be a tetramer. The presence of histidine tag fused to the recombinant proteins could affect the structure and function of proteins / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A Esquistossomose à uma doenÃa causada por parasitos do gÃnero Schistosoma matando centenas de milhares de pessoas por ano no mundo. O Schistosoma tem vÃrias espÃcies com interesse clÃnico. No Brasil o causador da Esquistossomose à o S. mansoni e o principal hospedeiro e reservatÃrio do parasito à o homem sendo a partir desse que os ovos sÃo eliminados nas fezes. Os hospedeiros intermediÃrios sÃo os caramujos. As principais espÃcies de caramujos hospedeiros do Schistosoma mansoni no Brasil sÃo: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria tenagophila e Biomphalaria straminea. Sendo a terceira espÃcie a predominante no CearÃ. A doenÃa tem presenÃa constante em mais de 74 paÃses (praticamente todos subdesenvolvidos). Cerca de 500 a 600 milhÃes de pessoas correm riscos de serem atingidas e mais de 200 milhÃes sÃo infectadas a cada ano, e isso se deve principalmente a falta de saneamento bÃsico e educaÃÃo sanitÃria. Para a melhor profilaxia desta doenÃa, deve ser feito o diagnÃstico e o tratamento da populaÃÃo, orientando para evitar entrar em contato com Ãguas que contenham caramujos (aÃudes, lagos, lagoas, rios etc). à uma doenÃa que pode evoluir para complicaÃÃes graves, eventualmente levando ao Ãbito em funÃÃo de extensa fibrose decorrente da presenÃa em parÃnquima hepÃtico de ovos do Schistosoma mansoni, formando granulomas. O principal objetivo desse estudo foi desenvolver uma estratÃgia para aumentar a eficÃcia na identificaÃÃo de pacientes infectados com S.mansoni, em Ãrea de baixa endemicidade, no Estado do CearÃ, usando um protocolo combinando uma tÃcnica sorolÃgica (IgG â ELISA) com exames de fezes seqÃenciais. Esse trabalho foi realizado em etapas, no qual na primeira, dos 287 indivÃduos que realizaram o mÃtodo de Kato-Katz, 11 (3,8%) apresentaram resultados positivos para S. mansoni. Com relaÃÃo aos outros helmintos foram encontrados: Trichuris trichiura 25 (8,7%), Ascaris lumbricoides 19 (6,6%) e Ancilostomideos 15(5,2%). Em relaÃÃo ao testes de ELISA, 97 (33,8%) foram positivos. Todos os pacientes que apresentaram ovos nas fezes foram positivos no teste sorolÃgico. Neste grupo estÃo inclusos os 11 que foram positivos na coproscÃpia. Dos pacientes com ELISA positivo e Kato-Katz negativos, apenas 56 entregaram as trÃs amostras de fezes para uma segunda anÃlise coproscÃpica. Desses, 14 (25%) foram positivos para Schistosoma mansoni. Dos 42 pacientes que continuavam negativos, 22 responderam no questionÃrio que nunca tiveram esquistossomose como tambÃm nunca receberam tratamento para a doenÃa. O presente estudo nÃo trata sà de determinar a prevalÃncia da doenÃa no municÃpio, e sim de identificar o maior nÃmero possÃvel de indivÃduos infectados, usando o mÃtodo sorolÃgico que foi aplicado de forma a contemplar a populaÃÃo residente em Ãreas de risco de transmissÃo ou expostas ao risco de infecÃÃo, principalmente por atividades domÃsticas e de lazer. Diante destes resultados, acredita-se, em concordÃncia com outros autores, que utilizando a tÃcnica de ELISA combinado com anÃlises repetidas de no mÃnimo 5 lÃminas de fezes, torna-se mais fÃcil diagnosticar pacientes com a esquistossomose, melhorando assim a hipÃtese que provavelmente em um futuro prÃximo, seremos capazes de combinar mÃtodos parasitolÃgicos e sorolÃgicos no programa de controle da esquistossomose, um fator importante para detecÃÃo de novos portadores da doenÃa. / Schistosomiasis is a disease caused by parasites of the genus Schistosoma, killing hundreds of thousands of people each year worldwide.. The Schistosoma has several species of clinical interest. In our country the cause of Schistosomiasis is the S. mansoni and the main reservoir host and the parasite is starting with the man that the eggs are removed in feces. The snails are the intermediate host. The main species of snails host of Schistosoma mansoni in Brazil are: Biomphalaria glabrata, Biomphalaria tenagophila and Biomphalaria straminea. The third kind in the predominant in CearÃ. The disease has presence in over 74 countries (virtually all underdeveloped). Around state 500 to 600 million people are at risk of being affected and more than 200 million are infected every year, and this is mainly due to lack of sanitation and health education. To the best prevention of this disease is to be made the diagnosis and treatment of the population to avoid targeting comes in contact with water containing snails (ponds, lakes, rivers etc). It is a disease that can develop into serious complications, possibly leading to death according to extensive fibrosis caused by the presence in liver parenchyma of the Schistosoma mansoni eggs, forming granulomas. So the main objective of this study was to develop a strategy to increase effectiveness in identifying patients positive for Schistosomiasis in areas of low endemic in the state of Ceara, using a protocol combining a technique in which antibodies (IgG - ELISA) with examinations of sequential stool. This work was followed by steps, in which the first of the 287 patients who underwent the method of Kato-Katz, 11 (3.8%) showed positive results for S. mansoni. On the other helminths are: Trichuris trichiura 25 (8.7%), A. lumbricoides 19 (6.6%) and Hookworms 15 (5.2%). For the tests, ELISA, 97 (33.8%) were positive. All patients who had eggs in the feces were positive in the serologic test. In this group are included the 11 that were positive in feces analysis (Figure 1). From patients with Elisa positive and negative Kato-Katz, only 56 handed the three samples of stool for a second analysis Of these, 14 (25%) were positive for Schistosoma mansoni. Of the 42 patients who remained negative, 22 responded in the questionnaire that had never schistosomiasis but never received treatment for the disease. Our present study was to not only determine the prevalence of the disease in the municipality, and to identify the largest possible number of infected individuals, the serological method was applied in order to accommodate the population living in those areas of risk of transmission or at risk of infection, mainly by domestic and leisure activities. In view of our results, we believe, in agreement with other authors, that using the ELISA technique combined with repeated analysis of at least 5 simples of feces, it becomes easier to diagnose patients positive for schistosomiasis, thus improving the hypothesis that probably in the near future, being able to combine parasitological and sorological in the programme for the control of schistosomiasis, an important factor for detection of new carriers of the disease.

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A esquistossomose é uma das principais causas de morbidade em países Tropicais e Subtropicais, gerando graves consequências socioeconômicas. Atualmente, os fármacos disponíveis para o tratamento da desta doença são praziquantel e oxamniquina, porém relatos de baixa susceptibilidade do parasita a esses medicamentos sugerem a necessidade de novas estratégias terapêuticas para o tratamento da doença. Todavia, existe pouco interesse da indústria farmacêutica no desenvolvimento de fármacos contra doenças tropicais e negligenciadas, entre as quais se encontra a esquistossomose. Devido a estes fatores, o presente trabalho teve por objetivo geral utilizar ferramentas computacionais para identificar inibidores da SmDHFR candidatos a novos fármacos. Avaliou-se as características exclusivas para a proteína de S. mansoni por meio de uma análise das sequências FASTA em comparação com a DHFR de outros organismos. A fim de garantir a ação seletiva dessas moléculas frente a enzima do parasita, os campos moleculares de interação seletivos para SmDHFR foram calculados e empregados na construção do modelo farmacofórico, o qual foi utilizado na triagem virtual de inibidores de SmDHFR. Os estudos computacionais realizados nos permitiram a seleção de 20 moléculas com uma boa complementariedade com o modelo farmacofórico gerado e com potencial para serem inibidores de SmDHFR. / Schistosomiasis is one of morbidity\'s main causes in tropical and subtropical countries, which leads to serious socioeconomic consequences. Praziquantel and oxamniquina are the drugs currently available for treating this disease, but reports points that the parasite has been resistant to both drugs, which suggests the need for new therapeutic strategies for the treatment of this disease. However, there is little interest in the pharmaceutical industry in developing drugs against neglected tropical diseases, including schistosomiasis. Due to these factors, the present work has the general objective to use computational tools to identify SmDHFR inhibitors which could be good candidates for developing new drugs. Evaluation of the exclusive characteristics of the S. mansoni protein were performed by FASTA sequence analyses in comparison to DHFR from other organisms. In order to guarantee the selective action of these molecules against the parasite enzyme, the molecular interaction fields selective for SmDHFR were calculated and used in the construction of the pharmacophoric model, which was further used in the virtual screening of SmDHFR inhibitors. Computational studies were performed and those led us to 20 molecules with a good complementarity with the pharmacophoric model that was previously generated and with potential to be SmDHFR inhibitors.

A esquistossomose é uma doença importante em saúde pública. Dos genes selecionados como diferencialmente expressos em esquistossômulos a partir do transcriptoma do S. mansoni, 56% foram confirmados por RT-PCR em tempo real. Entre eles, a proteína Ly6.5, está presente no tegumento de esquistossômulos e vermes adultos por âncoras de GPI. Não foi detectada a função de inibir o sistema complemento, mas pode estar envolvido na manutenção do tegumento. O gene SmVal7 revelou transcritos nas glândulas esofágicas de vermes adultos por hibridização in situ, enquanto a localização da proteína não está definida. Anexina está associada ao tegumento de esquistossômulos e vermes adultos, de maneira dependente de cálcio. A supressão do gene por RNAi não resultou em alteração fenotípica significativa em esquistossômulos in vitro. Foi observada atividade parcial de inibição de coagulação e potencial atividade de endocitose de anticorpos ligados à superfície. A imunização com rLy6.5, rSmVal7, rAneI-II ou rAneII-III não levou a redução da carga parasitária após desafio. / Schistosomiasis is an important disease in public health. Genes selected from the S. mansoni transcriptome, 56% of them were confirmed as differentially expressed in schistosomula by real time RT-PCR. Among them, the protein Ly6.5 is present in the tegument of schistosomula and adult worms by GPI anchors. The function of inhibiting the complement system was not detected, but it may be involved in maintenance of the tegument. The gene SmVal7 revealed transcripts in the esophageal glands of adult worms by in situ hybridization, while the localization of the protein is not defined. Annexin is associated with the membranes of the schistosomula and adult worms tegument in a calcium-dependent manner. The suppression of the gene by RNAi did not resulted in a significant phenotypic change in schistosomula in vitro. Parcial inhibition of the coagulation activity and potential function of endocytosis of membrane-bound antibodies were observed. Immunization with the rLy6.5, rSmVal7, rAneI or rAneII-II-III did not show reduction in worm burden recovery after challenge.