Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1999. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 120-138).

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The catecholamines norepinephrine and epinephrine are important regulators of vertebrate physiology. Insects such as honeybees do not synthesize these neuroactive substances. Instead, they use the phenolamines tyramine and octopamine for similar physiological functions. These biogenic amines activate specific members of the large protein family of G protein-coupled receptors (GPCRs). Based on molecular and pharmacological data, insect octopamine receptors were classified as either - or -adrenergic-like octopamine receptors. Currently, one - and four -receptors have been molecularly and pharmacologically characterized in the honeybee. Recently, an 2-adrenergic-like octopamine receptor was identified in Drosophila melanogaster (DmOct2R). This receptor is activated by octopamine and other biogenic amines and causes a decrease in intracellular cAMP ([cAMP]i). Here, we show that the orthologous receptor of the honeybee (AmOct2R), phylogenetically groups in a clade closely related to human 2-adrenergic receptors. When heterologously expressed in an eukaryotic cell line, AmOct2R causes a decrease in [cAMP]i. The receptor displays a pronounced preference for octopamine over tyramine. In contrast to DmOct2R, the honeybee receptor is not activated by serotonin. Its activity can be blocked eciently by 5-carboxamidotryptamine and phentolamine. The functional characterization of AmOct2R now adds a sixth member to this subfamily of monoaminergic receptors in the honeybee and is an important step towards understanding the actions of octopamine in honeybee behavior and physiology.

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Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste responsable du développement de maladies nosocomiales. Il provoque des infections en employant différents facteurs de virulence dont le principal, associé aux infections sévères, est le système de sécrétion de type 3 (SST3). Les souches de type PA7, taxonomiquement marginales, sont dépourvues de SST3 et leur pouvoir pathogène repose sur le nouveau système de virulence ExlBA. Ce SST5b, ou TPS, est composé du transporteur ExlB qui permet la translocation d’ExlA, une toxine induisant la perméabilisation de la membrane plasmique des cellules eucaryotes.Ce travail représente la première investigation des mécanismes de régulation du système ExlBA. Ainsi, il a été mis en évidence que la déplétion en fer est un signal d’activation de l’expression des gènes exlBA. De plus, les deux principaux messagers secondaires, AMPc et di-GMPc, sont impliqués dans la régulation du TPS. En effet, la voie CyaB-AMPc/Vfr, connue pour réguler le SST3, contrôle la toxicité des souches de type PA7 grâce à une activation transcriptionnelle directe des gènes exlBA, qui peut être stimulée par la chélation du calcium extracellulaire. Parallèlement, alors qu’ExlA était supposée être sécrétée pour agir sur les cellules eucaryotes, cette étude a montré que la toxine doit être exposée à la surface de la membrane bactérienne pour provoquer la lyse de ces cellules, ceci par un mécanisme dépendant du di-GMPc. Effectivement, une forte concentration en di-GMPc empêche la sécrétion d’ExlA en induisant de façon post-traductionnelle son maintien au niveau du transporteur ExlB, ce qui favoriserait l’action de la toxine sur les membranes eucaryotes. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for nosocomial diseases. It provokes infections due to several virulence factors. Among them the most aggressive is the type 3 secretion system (T3SS), associated with severe infection. PA7-like strains, that are taxonomic outliers, lack the T3SS but are still pathogenic thanks to the novel virulence system ExlBA. This T5bSS, or TPS, is composed by the transporter ExlB that allows translocation of ExlA toxin to induce permeabilisation of eukaryotic cell membrane.This study is the first investigation of regulatory mechanisms that modulate ExlBA. It provided evidence that iron depletion is an activator signal of exlBA gene expression. Furthermore, the two main second messengers, cAMP and c-di-GMP, are involved in ExlBA regulation. CyaB-cAMP/Vfr pathway, known to regulate T3SS, controls toxicity of PA7-like strains through direct transcriptional activation of exlBA. This pathway may be stimulated by an extracellular calcium chelation. At the same time, while ExlA was supposed to be secreted to kill eukaryotic cells, this work showed that the toxin must be exposed at the surface of the bacterial membrane to cause lysis of these cells, by a mechanism dependent on c-di-GMP. Indeed, a c-di-GMP high concentration prevents ExlA secretion by inducing its maintenance at the ExlB transporter, that would promote the action of the toxin on eukaryotic membranes.

Der sekundäre Botenstoff c-di-GMP kommt in vielen Bakterienspezies vor und fördert dort die Bildung von Biofilmen. Für Abbau und Synthese von c-di-GMP in der Zelle sorgen Diguanylatzyklasen (DGCs) und Phosphodiesterasen (PDEs), an deren N-Terminus häufig Sensordomänen die enzymatische Aktivität steuern. In dieser Arbeit wurde die Regulation und Wirkungsweise einer Gruppe von PDEs mit einer neuartigen Sensordomäne, der CSS-Domäne, genauer charakterisiert. Die CSS-Domäne ist im Periplasma lokalisiert und besitzt zwei hochkonservierte Cysteine, von denen eines in dem namensgebenden CSS-Motiv arrangiert ist. Die Integration in die innere Membran erfolgt durch zwei Transmembrandomänen (TM1 und TM2), wobei TM2 die Verbindung zu der C-terminal gelagerten EAL-Domäne mit PDE-Aktivität herstellt. Die Analyse von PdeC als eine von fünf CSS-PDE in Escherichia coli K-12 zeigte, dass die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen den konservierten Cysteinen vom oxidierende DsbA/DsbB-System katalysiert wird und zu einer Verminderung der enzymatischen Aktivität der EAL-Domäne führt. Im Gegensatz dazu führt die reduzierte freie Thiol-Form der CSS-Domäne zu einer stark erhöhten PDE-Aktivität verbunden mit der Dimerisierung über die TM2. Die Reduktion der CSS-Domäne führt außerdem zur Prozessierung durch die HtrA-Proteasen DegP und DegQ in ein membranständiges Fragment aus TM2+EAL-Domäne mit hoher enzymatischer Aktivität. Der Abbau durch DegP und DegQ im Periplasma ist sehr effizient. Auf der cytoplasmatischen Seite hingegen erfolgt die weitere Degradierung durch noch unbekannte Proteasen eher langsam, wodurch es unter bestimmten Bedingungen zur Akkumulierung der hochaktiven TM2+EAL-Form kommt. Durch das Zusammenspiel von redox-abhängiger Aktivitätskontrolle und Proteolyse der c-di-GMP-spezifischen PDE PdeC wird die Produktion der amyloiden Curli-Fasern und Cellulose reguliert, welche Hauptbestandteil der extrazellulären Matrix von Biofilmen sind. / The second messenger c-di-GMP promotes biofilm formation in many bacterial species. Phosphodiesterases (PDEs) and diguanylatcyclases (DGCs) - often controlled by various N-terminal sensor domains - degrade and synthesize c-di-GMP. The aim of this study was to characterize the mode of activation and physiological function of a new class of sensor domains, the CSS domain, which is coupled to an EAL domain with PDE activity and therefore potentially controlling c-di-GMP degradation. The CSS sensor domain contains two highly conserved cysteins in the periplasmic loop, of which one is arranged in the characteristic CSS motif. Integration into the inner membrane is ensured by two flanking transmembrane domains (TM1 and TM2), with TM2 providing a connection to the C-terminal EAL domain. Analysis of PdeC as one of 5 CSS-PDEs in Escherichia coli K-12 revealed a close linkage to the disulfide bond (DSB) system as well as important periplasmic proteases. Thus, formation of a DSB between the two conserved cysteins is promoted by the oxidizing DsbA/DsbB-system and reduces enzymatic activitiy of the EAL domain. In contrast, the free thiol form increases PDE activity and dimerizes via the TM2 domain. Moreover, reduction of the CSS domain results in degradation by the periplasmic HtrA proteases DegP and DegQ. These redundantly process PdeC to a shorter fragment containing the TM2 and EAL domain only, which shows dimerization as well and has high PDE activity. Degradation in the periplasm mediated by DegP and DegQ is very efficient. In contrast, further proteolysis in the cytoplasm by yet unidentified proteases is rather slow, allowing the accumulation of the highly active TM2+EAL form. Finally, the interplay of redox dependent activity control and proteolysis of the c-di-GMP specific PDE PdeC regulates production of curli and cellulose as major matrix components of the bacterial biofilm.

Lebewesen nutzen nukleotid-basierte sekundäre Botenstoffe um extra- und intrazelluläre Signale zur Induktion einer entsprechenden Zellantwort weiterzuleiten. Das zyklische Dinukleotid c-di-AMP steuert verschiedene physiologische Prozesse und ist für viele Bakterien unter bestimmten Bedingungen essentiell. Dieses Signalmolekül muss präzise reguliert werden, da seine Akkumulation oft toxisch ist. Diadenylatzyklasen mit einer DAC-Domäne synthetisieren c-di-AMP, welches von Phosphodiesterasen (PDE) mit DHH/DHHA1- oder HD-Domänen abgebaut wird. Streptomyceten sind im Boden lebende, Gram-positive Actinobakterien mit einem komplexen Lebenszyklus, während welchem sie vielzählige sekundäre Metabolite, inklusive Antibiotika, produzieren. Die Regulierung des zellulären c-di-AMP und seine Bedeutung in der Streptomyceten-Biologie waren zu Beginn dieser Studie weitgehend unbekannt. Zur c-di-AMP-Synthese nutzen Streptomyces die DAC DisA, besitzen aber keine der typischen PDEs sowie die meisten der bekannten c-di-AMP-bindenden Effektoren. Diese Arbeit zeigt, dass DisA die wichtigste c-di-AMP-Synthetase in Streptomyces venezuelae ist. AtaC wurde als eine PDE identifiziert, welche eine neue Klasse von c-di-AMP PDEs begründet. Während eine ataC-Deletion zu Störungen in Differenzierung und Wachstum in S. Venezuelae führt, führt die Inaktivierung von disA zur Sensitivität gegenüber erhöhten Konzentrationen von monovalenten Kationen im Medium. CpeA und CpeD wurden als erste c-di-AMP-bindende Proteine im Streptomyces Signalnetzwerk charakterisiert. Die entsprechenden Gene sind in Operons mit putativen Kation/Proton-Antiportern cpeB bzw. cpeE kodiert und die jeweiligen Genprodukte interagieren c-di-AMP-abhängig in vivo. Obwohl Deletion von cpe und Überexpression von cpeABC in S. venezuelae keine Phänotypen zeigten, verbesserte die CpeABC-Expression in Escherichia coli das Wachstum in Kalium-supplementierten Medien, was auf eine Funktion von cpe in der Regulation von Kalium hindeutet. / Nucleotide second messengers are used by all forms of life to transduce extra and intracellular signals and translate them into a physiological cell response. The cyclic dinucleotide c-di-AMP is a signaling molecule involved in diverse functions in bacterial physiology and is essential for many bacteria under certain growth conditions. However, this second messenger has to be tightly regulated since increased levels of c-di-AMP can be toxic. In many bacteria diadenylate cyclases with a conserved DAC domain synthesize c-di-AMP and phosphodiesterases (PDEs) with a DHH/DHHA1 or HD domain degrade it. Streptomyces spp. are soil-inhabiting gram-positive Actinobacteria characterized by a sophisticated developmental life cycle during which they produce various secondary metabolites, including antibiotics. The regulation and role of c-di-AMP is not well understood in Streptomyces biology. For c-di-AMP synthesis, streptomycetes utilize the DAC DisA but do not encode any canonical PDE and most of the known effector proteins for c-di-AMP signal transduction are absent. In this work, I demonstrated that DisA is the primary c-di-AMP synthetase in Streptomyces venezuelae and characterized AtaC as the founding member of a novel class of c-di-AMP-specific PDEs. In S. venezuelae, deletion of ataC interferes with development and growth, whereas disA inactivation affects bacterial survival under high ion osmotic stress conditions. Further, I identified CpeA and CpeD as the first c-di-AMP-binding proteins in Streptomyces. The respective genes are encoded in operons with the predicted cation/proton antiporters cpeB and cpeE, respectively, and the gene products interact in vivo in a c-di-AMP-dependent manner. Although neither cpe deletion nor overexpression of cpeABC produced a phenotype in S. venezuelae, expression of cpeABC in Escherichia coli improved growth in liquid media supplemented with potassium, suggesting that Cpe transporters are involved in potassium homeostasis.

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