O estudo de processos de tradução do código genético em proteínas desperta o interesse pelo seu papel central no metabolismo celular, em particular, o estudo da via de síntese de novos aminoácidos, como a selenocisteína e a pirrolisina, que resultam na expansão do código genético dos 20 aminoácidos canônicos para um total de 22 aminoácidos. A selenocisteína (Sec, U) é um aminoácido que representa a principal forma biológica do elemento selênio e sua incorporação ocorre através de um processo cotraducional em selenoproteínas como resposta ao códon UGA em fase, usualmente interpretado como códon de parada. Essa incorporação requer uma complexa maquinaria molecular distinta entre os três domínios da vida em que as selenoproteínas estão presentes: Bactéria, Arquéia e Eucária. Em Escherichia coli, a via se inicia com a aminoacilação do tRNA específico para a incorporação de selenocisteínas (SelC, tRNASec) com um resíduo de L-serina pela seril-tRNA sintetase (SerRS) formando o tRNA carregado Ser-tRNA[Ser]Sec que é entregue ao complexo homodecamérico selenocisteína sintase (SelA) responsável pela conversão Ser-Sec utilizando a forma biológica de selênio entregue pela enzima selenofosfato sintetase (SelD). Uma vez carregado com L-selenocisteína, o Sec-tRNASec é então carreado pelo fator de elongação específico para selenocisteínas (SelB) para a sua incorporação na cadeia polipeptídica nascente na posição UGA adjunta ao elemento SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence), uma estrutura em grampo presente no RNA mensageiro que indica o códon de inserção de selenocisteínas. Uma vez que elementos contendo selênio são tóxicos para o ambiente celular, interações entre as enzimas da via se fazem necessárias, onde as enzimas participantes em procariotos são conhecidas e caracterizadas individualmente, no entanto, suas interações macromoleculares nas diferentes etapas ainda não foram caracterizadas. Este projeto visa à caracterização macromolecular e estrutural das interações entre as enzimas SelA e SelB com os RNAs participantes tRNASec e SECIS além do ribossomo de E. coli. Para isso, amostras de SelA, SelB, tRNASec, SECIS e ribossomo foram obtidas através de diferentes metodologias. Para SelA e tRNASec foram utilizados protocolos já estabelecidos enquanto que, para SelB, fez-se necessário a otimização do protocolo previamente publicado e, consequentemente, nova caracterização biofísica através de metodologias como dicroísmo dircular (CD) e fluorescência intrínseca (IFS). Para análise das interações, medidas de espectroscopia de anisotropia de fluorescência (FAS), ultracentrifugação analítica (AUC) e calorimetria de varredura diferencial (DSC) foram utilizadas para determinação dos parâmetros de interação dos diferentes complexos estudados. Somado a isso, experimentos de cinética GTPásica foram realizados na formação dos complexos e, além disso, foram gerados modelos estruturais utilizando diferentes metodologias como espalhamento de raios-X a baixo ângulo (SAXS) além de estudos por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os estudos propostos irão auxiliar no entendimento do mecanismo de incorporação deste aminoácido em bactérias bem como nos demais domínios da vida além de elucidar o mecanismo sequencial de eventos, provendo conhecimento e desenvolvendo metodologias para sistemas complexos de interação proteína-proteína e proteína-RNA. / The study of genetic code processes in proteins is a central role in cell metabolism, in particular the study of the synthesis pathway of new amino acids, such as selenocysteine and pyrrolisine, which resulted in the expansion of the genetic code of the 20 canonical amino acids for 22 amino acids. Selenocysteine (Sec, U) is an amino acid that represents a major biological form of selenium element and its incorporation through a co-translational process in selenoproteins in response to the in-phase UGA-codon, usually interpreted as stop-codon. This incorporation requires a complex molecular machinery distinct between the three domains of life in which, as selenoprotein has present: Bacteria, Archaea and Eukaria. In Escherichia coli, an initiation pathway with an aminoacylation of the tRNA specific for the incorporation of selenocysteines (SelC, tRNASec) with an L-serine residue by seril-tRNA synthetase (SerRS) resulting in the charged tRNA Ser-tRNA[Ser] Sec that is delivered to the homodecameric complex selenocysteine synthase (SelA), responsible for Ser-Sec conversion using the biological form of selenium delivered by the enzyme selenophosphate synthetase (SelD). Once loaded with L-selenocysteine, Sec-tRNASec is then carried by the selenocysteine-specific elongation factor (SelB) for incorporation into the nascent polypeptide chain at the UGA position attached to the SECIS (SElenoCysteine Insertion Sequence) element, staple structure that indicates the insertion codon of selenocysteines. Since elements containing selenium are toxic to the cell, interactions between how pathway enzymes are made, where the enzymes participating in concepts are known and characterized individually, however, their macromolecular interactions in the different steps have not yet been characterized. This project aims at the macromolecular and structural characterization of the interactions between SelA and SelB enzymes with the RNAS tRNASec and SECIS participants in addition to the E. coli ribosome. For this, as samples of SelA, SelB, tRNASec, SECIS and ribosome were obtained through different methodologies. For SelA and tRNASec, protocols were used to determine parameters for SelB, it was necessary to optimize a previously published protocol and, consequently, a new biophysical characterization through methodologies such as circular dichroism (CD) and intrinsic fluorescence spectroscopy (IFS). To analyze the interactions, measurements of fluorescence anisotropy spectroscopy (FAS), analytical ultracentrifugation (AUC) and differential scanning calorimetry (DSC) were used to determine the interaction parameters of different complexes studied. In addition, GTPases activity experiments were carried out in the formation of the complexesand, in addition, we have generated models that characterize different methodologies such as small angles X-ray scattering (SAXS) and transmission electron microscopy (TEM). The proposed studies will aid in understanding the mechanism of incorporation of this amino acid into bacteria as well as the other domains of life besides elucidating the sequential mechanism of events, providing knowledge and development of methodologies for complex protein-protein and RNA-protein interaction systems.

A existência de uma maior variedade de aminoácidos codificados pelo código genético tem estimado estudos sobre os mecanismos de síntese, reconhecimento e incorporação desses resíduos nas cadeias polipeptídicas nascentes. Um exemplo é a via de incorporação de selenocisteína evento cotraducional dirigido pelo códon UGA. Em bactérias, essa via conta com uma complexa maquinaria molecular composta por: Selenocisteína Sintase (SelA), Fator de Elongação Específico de Reconhecimento (SelB), Selenofosfato Sintetase (SelD), tRNA específico (SelC ou tRNAsec), sequência específica no mRNA (Sequência de Inserção de Selenocisteínas - SECIS) e Aminoacil tRNA Sintetase (aaRS). Pelo fato do selênio ter uma toxicidade elevada em ambientes celulares, é fundamental a compreensão do mecanismo catalítico e razão estequiométrica na formação dos complexos da via na etapa de incorporação junto ao tRNAsec, bem como sua caracterização estrutural foram os objetivos deste trabalho. A proteína SelA foi expressa e purificada para utilização em análises envolvendo microscopia de força atômica, microscopia eletrônica de transmissão com contraste negativo e em gelo vítreo foram realizadas nos complexos SelA e SelA-tRNAsec, visando obter um modelo estrutural e a razão estequiométrica dos complexos. A fim de compreender o mecanismo de passagem do selênio, ensaios de anisotropia de fluorescência e de microcalorimetria, corroborados pelas análises de troca de hidrogênio-deutério acoplado a espectrometria de massa e espectroscopia de infravermelho, elucidaram a formação e estequiometria do complexo ternário SelAtRNA sec-SelD. Tentativas de cristalização e análises cristalográficas também foram realizadas, no entanto, sem sucesso. Com os resultados obtidos foi possível propor que o reconhecimento de SelD e, consequentemente, a entrega do selenofosfato, seja uma etapa crucial da via de incorporação de selenocisteínas. / The existence of a greate variety of amino acids encoded by the genetic code has stimulated the study of the mechanisms of synthesis, recognition and incorporation of these residues in the nascent polypeptide chains. An example of genetic code expansion is the selenocysteine incorporation pathway an event cotraducional by the UGA codon. In bacteria, this pathway has a complex molecular machinery comprised: Selenocysteine Synthase (SelA), Specific Elongation Factor (SelB), Selenophosphate Synthetase (SelD), tRNA-specific (SelC or tRNAsec), Specific mRNA Sequence (SElenocysteine Insertion Sequence - SECIS) and Aminoacyl tRNA Synthetase (aaRS). Because selenium has high toxicity in cellular environments; it is essential for cell survival the association of this compound with proteins, in this case, selenoprotens and the associated proteins involved in the selenocysteine synthesis. Therfore the understanding of the catalytic mechanism, stoichiometric ratio, protein complex formation with the tRNAsec, and its structural characterization were the objectives of this work. The SelA protein was expressed and purified to used in analyzes involving atomic force microscopy, transmission electron microscopy with negative stain and in vitreous ice were performed in the complex SelA and SelA-tRNAsec in order to obtain a structural model of the complex and the stoichiometric ratio of its components. To study the selenium association with protein of the synthesis pathway, fluorescence anisotropy assays and isothermal titration calorimetry corroborated by the analysis hydrogen-deuterium exchange coupled to mass spectrometry and infrared spectroscopy were employed.Crystallization attempts were made and preliminary crystallographic analyzes were also performed, however, so far unsuccessfuly. The results obtained were possible to develop the hypothesis about the SelD recognition and, consenquently, the selenophosphate delivery, a crucial stage of the selenocysteine incorporation pathway.

A principal forma biológica do selênio em vários organismos é o aminoácido Selenocisteína (Sec, U), que é incorporado em um polipeptídio emergente em códons UGA específicos. Em Escherichia coli, esta incorporação requer os genes que codificam para Seril-tRNA Sintetase (SerRS), Selenocisteína Sintase (SELA), um tRNASec específico (SELC), Selenofosfato Sintetase (SELD) e um fator de elongação de transcrição específico (SELB). A proteína Selenofosfato Sintetase (EC 2.7.9.3) pertence à família AIRS, de proteínas que têm o ATP como substrato, e produz o composto biologicamente ativo doador de selênio, o monoselenofosfato, a partir de ATP e seleneto. O gene selD em E. coli tem 1041 pares de bases e codifica uma proteína com 347 aminoácidos e massa molecular de 37 kDa. A fase aberta de leitura do gene selD foi amplificada do DNA genômico de E. coli e clonada em vetor de expressão pet28a(+) (Novagen). A proteína recombinante foi superexpressa em E. coli por indução com IPTG e purificada por cromatografia de afinidade por ligação a metal e a fração eluída foi concentrada por ultrafiltração. Em seguida, o produto foi submetido à clivagem da cauda de histidinas com Trombina. Para purificar o produto de reação de clivagem com protease e para estimar sua massa molecular e estado oligomérico, empregou-se cromatografia de exclusão molecular. A proteína pura foi utilizada em experimentos de Gel Nativo e em estudos das suas propriedades hidrodinâmicas realizados por meio de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS), Espalhamento de Raios-X a Baixo Ângulo (SAXS) e Ultracentrifugação Analítica (AUC). Os resultados obtidos revelam uma mistura de oligômeros em solução, em um equilíbrio dímero-tetrâmero e tetrâmero-octâmero. Um modelo tridimensional para o homodímero de SELD de E. coli foi obtido por Modelagem Molecular e suas propriedades hidrodinâmicas preditas concordam com aquelas obtidas experimentalmente. Adicionalmente, triagens de condições de cristalização da proteína revelaram condições em que a proteína cristaliza na forma de pequenas agulhas e ensaios de otimização por variação da concentração de agente precipitante e pH não resultaram em monocristais adequados para difração de raios-X. A análise do papel da SELD na via de biossíntese de Selenocisteínas levanta a hipótese de que esta proteína deve entregar o monoselenofosfato para o complexo SELA-SELC de modo que o selênio seja incorporado para formação do aminoácido Selenocisteína, já que os compostos de selênio são tóxicos quando estão livres na célula. Portanto, a investigação da interação da SELD com o complexo SELA-SELC foi observada pelo monitoramento da anisotropia de fluorescência do complexo SELA-SELC mediante titulação de SELD. A análise local da interação para manutenção do complexo SELD-SELA-SEC foi feita por meio de espectrometria de massas com troca H/D, que revelou possíveis sítios de interação na superfície da SELD. Os resultados mostrados neste trabalho ampliam o conhecimento sobre a via de biossíntese de Selenocisteína, revelando detalhes da interação da SELD com o complexo SELA-SELC. / The main biological form of selenium in several organisms is the amino acid Selenocysteine (Sec, U), which is incorporated into selenoproteins in specific UGA codons. In Escherichia coli, it requires the genes that codify to Seryl-tRNA Synthetase (SerRS), Selenocysteine Synthase (SELA), a specific tRNASec (SELC), Selenophosphate Synthetase (SELD) and a specific translation elongation factor (SELB). Selenophosphate Synthetase (EC 2.7.9.3) belongs to AIRS superfamily of proteins that have ATP as a substrate and this protein produces the biologically active selenium donor compound, monoselenophosphate, from ATP and selenide. The selD gene from E. coli is 1041 base pairs long and codifies a protein with 347 amino acids and molecular mass of 37 kDa. The open reading frame of selD gene was amplified from E. coli genomic DNA and cloned into pET28a(+) expression vector (Novagen). The recombinant protein was overexpressed in E. coli by IPTG induction and purified by metal affinity chromatography, and the eluted fraction was concentrated by ultrafiltration. The product was used for Thrombin protease cleavage of the 6-His tag. In order to purify the product of proteolysis and to estimate its molecular mass and oligomeric state, we used size exclusion chromatography. The pure protein sample was used for Native Gel Electrophoresis. Hydrodynamic properties of the protein were studied by Dynamic Light Scattering (DLS), Small angle X-ray scattering (SAXS) and Analytical Ultracentrifugation (AUC). The results show an equilibrium between SELD oligomeric forms, as dimer-tetramer and tetramer-octamer association in solution. A tridimensional model of E. coli SELD was obtained by Molecular Modelling and its predicted hydrodynamic properties agree with those observed experimentally. In addition, crystal screening revealed crystallization conditions suitable for protein crystallization as small needles, but optimization of these conditions by precipitant agent and pH variation did not result in monocrystals reliable for X-ray diffraction. An analysis of SELD´s role in the Selenocysteine biosynthesis pathway indicates that SELD must deliver monoselenophosphate to the SELA-SELC complex so that the selenium is incorporated to the amino acid to form selenocysteyl-SEC, since selenium compounds are toxic when they are freely available in the cell. This interaction was observed by fluorescence anisotropy. The local analysis of complex formation was monitored by mass spectrometry after H/D exchange and revealed possible sites for this interaction on SELD surface. The results improve our knowledge about the Selenocysteine pathway in the cell, showing details of the interaction between SELD and the SELA-SELC complex.

A síntese de selenocisteína e sua incorporação co-traducional em selenoproteínas como resposta a um códon UGA em fase requerem uma complexa maquinaria molecular. Em eucariotos, foram identificados componentes que participam da reação de formação de selenocisteína: Seril-tRNA sintetase (SerRS), O-fosfoseril-tRNA quinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 SBP2, um fator de elongação específico para Sec (EFSec), selenofosfato sintetase 1 (SPS1) e selenofosfato sintetase 2 (SPS2), SEPSECS, proteína ligante de RNA SECp43, proteína ribossomal L30, um tRNA de inserção de selenocisteína (tRNASec, SELC) e uma sequência específica no RNA mensageiro (elemento SECIS). O primeiro passo da incorporação de selenocisteína em proteínas é realizado pela SerRS, que aminoacila o tRNA com serina através da ativação da serina por Mg+2 e ATP, levando a formação de um intermediário ligado a enzima (Ser-AMP). Posteriormente, ocorre a mudança do radical Ser do intermediário Ser-AMP para o tRNASec, e subsequentemente, a conversão enzimática de Ser-tRNASec para Sec-tRNASec. Através de análises in sílico nosso grupo identificou componentes da maquinaria de inserção de selenocisteína em espécies de Kinetoplastida. Foram identificados homólogos de tRNASec e as enzimas TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS e TbEFSec. Nosso principal alvo é o estudo estrutural da SerRS de Trypanosoma brucei nativa e em complexo com o tRNASec e com as isoformas do tRNASer. Uma nova metodologia no processo de purificação desta enzima foi desenvolvida e, através das técnicas de cromatografia de exclusão molecular, espalhamento de luz dinâmico e ultracentrifugação analítica conseguimos determinar o estado oligomérico da TbSerRS. O resultado de dímeros em solução corroborou com dados reportados na literatura, além de verificarmos por meio de estudos de cinética enzimática que a enzima encontra-se ativa sob as condições utilizadas. A técnica de ultracentrifugação analítica de sedimentação em equilíbrio também nos permitiu verificar a formação do complexo SerRS-tRNA, mas não nos possibilitou definir a estequiometria deste complexo. Estudos estruturais da enzima nativa e em interação com os tRNAs SELC e com as isoformas do tRNASer, L-serina, um análogo não hidrolisável de AMP, MgCl2, e com porções menores dos tRNAs foram realizados por meio da cristalografia por difração de raios X. Através dessa técnica, dezessete conjunto de dados foram coletados, processados e estão em fase de refinamento. Algumas análises estruturais possibilitaram confirmar a presença de duas moléculas de glicerol em cada monômero na região do sítio ativo para a estrutura da TbSerRS nativa e uma molécula de dAMP para o complexo TbSerRS-dAMP. / The synthesis of selenocysteine and its co-translational incorporation in selenoproteins in response to a UGA codon in frame require complex molecular machinery. In eukaryotes, components that participate in the reaction of selenocysteine formation were identified: SeryltRNA synthetase (SerRS), O-phosphoseryl-tRNA kinase (PSTK), SECIS Binding Protein 2 - SBP2, a selenocysteine-specific elongation factor (EFSec), selenophosphate synthetase 1 (SPS1) and selenophosphate synthetase 2 (SPS2), SEPSECS, SECp43 RNA binding protein, ribosomal protein L30, selenocysteine tRNA (tRNASec, SELC), and a specific sequence in the messenger RNA (SECIS element). The first step for selenocysteine incorporating is performed by SerRS that aminoacylates the tRNA with serine through serine activation by Mg2+ and ATP leading to the formation of an intermediate linked to the enzyme (Ser-AMP). Subsequently, the change of the Ser radical to tRNASec takes place followed by the enzymatic conversion of Ser-tRNASec to Sec-tRNASec. Through in silico analysis our group has identified components of the selenocysteine insertion machinery in species of Kinetoplastida. Homologues of tRNASec and the enzymes TbSerRS, TbSPS2, TbPSTK, TbSepSecS and TbEFSec were identified. Our main target is the structural study of the native SerRS from Trypanosoma brucei and SerRS in complex with the tRNASec and the tRNASer isoforms. A new methodology in the purification process of this enzyme has been developed, and through molecular exclusion chromatography, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation techniques we were able to determine the oligomeric state of TbSerRS. The result of dimers in solution corroborated with the data reported in the literature. Moreover, we were able to verify through studies of enzyme kinetics that the enzyme is active. The sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation technique also demonstrated the formation of the SerRS-tRNA complex, however, it did not allow the definition of the complex stoichiometry. Structural studies of the native enzyme and its interaction with SELC, tRNASer isoforms, L-serine, a non-hydrolyzable AMP analog, MgCl2, and smaller portions of tRNAs were performed by X-ray diffraction crystallography. Through this technique, seventeen data sets were collected, processed, and are being submitted to refinement processes. Initial structural analysis allowed the confirmation of the presence of two glycerol molecules in each monomer in the active site region in the native structure of TbSerRS and one dAMP molecule in the TbSerRS-dAMP complex.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4383.pdf: 5759644 bytes, checksum: 0a6a6bb722062f7934be619267686311 (MD5) Previous issue date: 2012-04-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / Selenium (Se) is an essential element found in selenoproteins as the 21st amino acid (Selenocysteine Sec).For the Sec incorporation and the related biosynthetic pathaway, several elements are required: tRNASec, a UGA codon and a Sec insertion sequence (SECIS), a conserved motif downstream of the selenoprotein encoding gene. Selenoproteins generally participate in the cellular redox balance, playing an important role on cell growth and proliferation. These proteins, as well as the the Sec synthesis pathway, are present in members of the Bacteria, Archaea and Eukarya domains, being identified in several protozoa, including the kinetoplastids. Auranofin, a gold-contaning antirheumatic drug, is a known selenoproteins inhibitorand Trypanosoma brucei and Leishmania majorcells are sensitive to this compound, with a LD50 in nanomolar range. This indicates a possible dependence of these parasites on selenoproteins. Theselenophosphate synthetase (SELD/SPS2) is responsible for the formation of monoselenophosphate from selenide and ATP, being essencial for selenoprotein biosynthesis. SPS2 knockdown led to apoptosis under sub-optimal growth conditions. The selenoproteome of these flagellated protozoa consists of distant homologs of the mammalian SelK and SelT, and a novel selenoprotein designated SelTryp, a kinetoplastidspecific protein. The functions of any of these selenoproteins are not known.We have investigated the effect of their downregulation in T. brucei to interpret their possible physiological role. The TbSelK depletion shows no effect on growth under optimal conditions, but the cells became more sensitive to endoplasmic reticulum stress agents and oxidative stress, suggesting that SelK is an ER stress-regulated protein and plays an important role in protecting T. brucei cells from ER stress agent. The TbSelT gene silence by RNA interference hampers the parasite survival, but the sensitivity to the agents tested was not asevident as it was forTbSelK, suggesting a role for TbSelT in protection against stress, but not specifically ER stress. Our results show the importance of selenocysteine and selenoproteins to parasite survival. / Selênio (Se) é um elemento essencial encontrado em selenoproteínas na forma do 21º aminoácido selenocisteína (Sec U). A incorporação co-traducional de Sec depende de uma complexa via de síntese, de um códon de terminação UGA em fase de leitura e uma estrutura terciária do RNA mensageiro conhecida como elemento SECIS. A maioria das selenoproteínas conhecidas participa de processos de manutenção do estado redox das células, tendo um importante papel no crescimento e proliferação celular. Essas proteínas, bem como os componentes da via de síntese de Sec, estão presentes em membros dos domínios de Bactérias, Arquéais e Eucaria, tendo sido identificada em diversos protozoários, incluindo os kinetoplastidas. Auranofin, um composto de ouro usado como agente antireumático, tem sido descrito como um inibidor de selenoproteínas através de sua ligação com o aminoácido selenocisteína e células de Trypanosoma brucei e Leishmania major são altamente sensíveis a este composto, apresentando um LD50 na faixa de nanomolar. Esta evidência indica uma possível dependência destes parasitas por selenoproteínas e consequentemente pela sua via de síntese. A selenofosfato sinetase (SELD/SPS2) é a enzima responsável pela síntese de monoselenofosfato a partir de seleneto e ATP, sendo, portanto uma proteína fundamental na síntese de selenocisteína. Sua depleção levou a apoptose celular quando mantidas em condições de estresse. Esse efeito pode ser causado pela consequente falta das selenoproteínas ou pelo acúmulo de espécies tóxicas de selênio, como o seleneto. Os protozoários apresentam número reduzido de selenoproteínas e kinetoplastidas apresentam 3, duas homólogas distantes de mamíferos, SelK e SelT, e uma nova proteína exclusiva denominada SelTryp, que não apresentam homologia com nenhuma outra proteína descrita. O papel dessas proteínas não é conhecido, e nós investigamos suas possíveis funções através da inibição de sua expressão. A depleção de TbSelK não mostrou efeito sob condições normais, mas tornou as células mais sensíveis a agentes indutores de estresse de retículo endoplasmático, o que nos permite inferir uma função de manutenção da homeostase dessa organela. A depleção de TbSelT causou uma diminuição no crescimento celular, mas o aumento da sensibilidade aos agentes indutores de estresse não foi tão pronunciada como em TbSelK. Nossos resultados revelam a importância de selenocisteína para parasitas, uma vez que esses organismos enfrentam diversos tipos de estresses para manter a viabilidade e a progressão da doença nos diferentes hábitats encontrados ao longo do seu ciclo de vida.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA11MA081.pdf: 22717 bytes, checksum: 41112e9e69fe9ceac2afe9b11e56e60f (MD5) Previous issue date: 2011-02-25 / Trypanosoma evansi is the pathogenic trypanosomatid with the worldwidest distribution, generating economic losses in Africa, South America, Europe, Asia and Oceania. This protozoan is the etiologic agent of the disease know as Surra or Mal das Cadeiras, wich affects almost all species of mammals, with a recent case in humans. An important metabolic pathway described in all the three kingdoms of life is the incorporation of selenium into proteins, wich mainly has an antioxidant function. Selenium is used in the form of the amino acid selenocysteine, which is incorporated into the nascent polypeptide co-translationally through the stop codon "UGA". Some elements plays a key role into this pathway: a signaling nucleotide structure in the messenger RNA (SECIS), a specifc tRNA (tRNASec) and an enzyme complex that allows the conversion of selenium in its active form monoselenophosphate (SPS), its aminoacylation in tRNASec (SerRS, PSTK, SepSecS) and the coupling of nucleotidic and proteic structures (SECIS, EF-Sec, SBP2) in the UGA codon to translation and insertion of selenocysteine into the protein. This work demonstrated that T. evansi express the genes selB (EF-Sec), selC (tRNASec), selD (SPS) and pstk in its mRNA. The domains analysis of T. evansi selB, selD and PSTK genes found regions that are consistent with the predicted proteins functions. The predicted secondary structure of T. evansi tRNASec shares the most of the characteristics of eukaryotic tRNASec. Using Southern Blot, we showed that selB, selD and pstk are single copie genes in T. evansi genomic DNA. The SPS proteis was correctly localized in the total protein extract of the parasite, with a 43 kDa band. The same protein has a cytoplasmatic localization in T. evansi, as showed by indirect immunofluorescence. The gene of a trypanosomatid exclusive selenoprotein, selTRYP, was amplified of the cDNA and sequenced. Through these results, we suggest that T. evansi is capable of using selenium for the formation of selenoproteins, and the presence of the selTRYP, selb, selc, seld and pstk genes may indicate a potential future therapeutic target, since recent data show an increase in the parasite resistance to the commercial available drugs in different continents / O Trypanosoma evansi é o tripanossomatídeo patogênico de maior distribuição mundial, causador de prejuízos econômicos na África, América do Sul, Europa, Ásia e Oceania. Este protozoário é o agente etiológico da doença conhecida como Surra ou Mal das Cadeiras, que afeta praticamente todas as espécies de mamíferos, com um recente caso em humanos. Uma importante via metabólica descrita em todos os reinos da vida é a incorporação de selênio em proteínas, com função, principalmente, antioxidante. O selênio é utilizado na forma do aminoácido selenocisteína, que é incorporada ao polipeptídeo nascente co-traducionalmente através do códon de parada UGA . Para que isto ocorra, são necessárias uma estrutura nucleotídica sinalizadora no RNA mensageiro (SECIS), um RNA transportador específico (tRNASec) e um complexo de enzimas que permitem a conversão do selênio em sua forma ativa, monoselenofosfato (SPS), sua aminoacilação no tRNASec (SerRS, PSTK, SepSecS) e o acoplamento de estruturas nucleotídicas e protéicas (SECIS, EF-Sec, SBP2) para que o códon UGA seja traduzido em selenocisteína e a mesma seja inserida na proteína. Neste trabalho foi demonstrado que o T. evansi expressa os genes selB (EF-Sec), selC (tRNASec), selD (SPS) e PSTK. A análise de domínios dos genes selB, selD e PSTK de T. evansi encontrou regiões condizentes com as características funcionais das proteínas formadas. A estrutura secundária predita do tRNASec de T. evansi compartilha a maioria das características dos tRNASec de eucariotos. Através da técnica de Southern Blot, demonstrou-se que os genes selB, selD e PSTK possuem cópia única no DNA genômico de T. evansi. Utilizando-se Western Blot, a proteína SPS foi localizada corretamente no extrato protéico do protozoário, formando uma banda de 43 kDa. Foi realizada também uma imunolocalização da SPS, sendo que a mesma possui localização citoplasmática neste protozoário. O gene de uma selenoproteína exclusiva de tripanossomatídeos, a selTRYP, foi amplificado do cDNA e parcialmente sequenciado. Através desses resultados, sugere-se que o T. evansi é capaz de utilizar selênio para a formação de selenoproteínas, e a presença dos genes da via de inserção de selenocisteína pode indicar um potencial futuro alvo terapêutico, visto que recentes dados demonstram um crescimento de cepas resistentes aos medicamentos disponíveis no mercado em vários continentes