A sepse é responsável por uma alta taxa de internação hospitalar e morbimortalidade. Devido à gravidade do quadro clínico e às limitações dos métodos tradicionais para identificação e isolamento bacteriano, é recomendado o início empírico de antimicrobiano(s) de largo espectro. O desenvolvimento da biologia molecular, particularmente da reação em cadeia da polimerase (PCR), tornou possível o diagnóstico rápido de agentes infecciosos. Entretanto, devido à diversidade dos possíveis agentes etiológicos na sepse, a utilização da PCR com primers específicos para cada agente se torna pouco prática. Com a PCR de largo espectro é possível que em uma só reação se identifique qualquer bactéria, possibilitando um tratamento precoce e direcionado. Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar o papel da PCR de largo espectro no diagnóstico etiológico de pacientes com sepse e a comparação desta técnica com os métodos tradicionais de cultura. Foram incluídos 74 pacientes com diagnóstico de sepse atendidos na Unidade de Emergência do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto USP e 14 voluntários sadios. Foi realizada a extração do DNA do soro, plasma e buffy-coat dos pacientes, seguida da realização da PCR de largo espectro com dois diferentes pares de primers, e sequenciamento das amostras positivas. Dos 74 pacientes, 39 (53%) eram homens; a média de idade foi 55 ± 19 anos; 37 (50%) tiveram sepse grave e 37 (50%) choque séptico; e a mortalidade foi 51%. A maioria das infecções primárias teve origem respiratória (66%), seguida de infecções gênito-urinárias (20%). A hemocultura foi positiva em 22 (30%) pacientes, e sua positividade foi significativamente maior em pacientes mais velhos (p< 0,05) e com valores mais altos de proteína C reativa (CRP) (p< 0,05). A PCR de largo espectro foi positiva em 44 (59%) pacientes considerando os dois pares de primers, sendo sua positividade significativamente maior que a da hemocultura (p< 0,001). Para o par Bak11W/Bak2 ela foi positiva em 25 (34%) pacientes, e para o par Taf/Tar, em 29 (39%) pacientes. Em relação às frações do sangue, amostras de 24 pacientes foram positivas na fração soro; 22 na fração plasma; e 18 na fração buffy-coat. Nenhuma característica clínica ou demográfica dos pacientes influenciou a positividade da PCR de largo espectro. A PCR de largo espectro foi negativa em todas as frações do sangue dos voluntários sadios. A sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo da PCR foram 59%, 100%, 100% e 32%, respectivamente. Em 40 (54%) pacientes os resultados da PCR e hemocultura foram concordantes. O coeficiente de concordância kappa obtido foi 0,147 (p = 0,131). Em relação ao sequenciamento, em 21 amostras de 16 pacientes foi possível identificar um agente etiológico. As bactérias mais detectadas foram Escherichia coli (3), Enterococcus sp. (2), Staphylococcus sp. (2) e Ralstonia sp. (2). Em apenas dois pacientes as amostras tiveram a mesma espécie bacteriana detectada na hemocultura e PCR de largo espectro (E. coli e Streptococcus pneumoniae). Em resumo, a PCR de largo espectro foi mais sensível do que a hemocultura na identificação bacteriana em pacientes com sepse atendidos em um Hospital de Emergência / Sepsis is responsible for a high rate of hospitalization and mortality. Due to the severity of clinical presentation and limitation of traditional methods for bacterial identification and isolation, it is recommended to initiate empirically broad-spectrum antimicrobial treatment. The development of molecular biology, particularly the polymerase chain reaction (PCR), enabled to realize a rapid diagnosis of infectious agents. However, due to the diversity of possible etiologic agents in sepsis, the use of PCR with specific primers for each agent becomes impractical. With the broad-range PCR, it is possible, in a single reaction, to identify any bacteria, allowing an early and directed treatment. Thus, this study aimed to evaluate the role of broad-range PCR in the etiologic diagnosis of patients with sepsis and compare this technique with traditional methods of culture. Seventy-four patients with sepsis admitted to the Emergency Unit of Clinical Hospital of Ribeirão Preto Medical School USP and 14 controls were included in the study. DNA from serum, plasma and buffy-coat were extracted from all patients and controls. Broad-range PCR was performed in all samples, followed by DNA sequencing of the amplicons. Out of 74 patients, 39 (53%) were male, mean age was 55 ± 19 years old; 37 (50%) patients had severe sepsis and 37 (50%) septic shock; the mortality rate was 51%. Most of primary infections were from respiratory tract (66%), followed by urinary tract infection (20%). Blood culture was positive in 22 (30%) patients, and its positivity was greater in older patients (p< 0,05) and patients with higher levels of C reactive protein (CRP) (p< 0,05). Broad-range PCR was positive in 44 (59%) patients, when considering both pairs of primers, and was significantly increased compared to blood culture positivity (p< 0,001). Broad-range PCR using Bak11W/Bak2 primers was positive in 25 (34%) patients, and using Taf/Tar primers, in 29 (39%) patients. Related to blood fractions, samples from 24 patients were positive in serum; 22 in plasma fraction; and 18 in buffy-coat. None of clinical and demographic characteristics influenced the broad-range PCR positivity. The sensitivity, specificity, positive predicted value and negative predictive value, when considered healthy persons as negative control, were 59%, 100%, 100% and 32%, respectively. In 40 (54%) patients, blood culture and PCR results were concordant. The concordance coefficient kappa obtained was 0,147 (p = 0,131). Regarding to etiologic agents, in 21 samples, from 16 patients, a bacteria was identified by sequencing. The most common bacteria were Escherichia coli (3), Enterococcus sp. (2), Staphylococcus sp. (2) and Ralstonia sp. (2). In only two patients, the same bacterial species were identified in both, blood culture and broad-range PCR (E. coli e Streptococcus pneumoniae). In conclusion, broad-range PCR was more sensitive than blood culture for bacterial identification in septic patients admitted to an Emergency Unit

O sistema nervoso central (SNC) é uma das primeiras regiões a ser acometida durante a sepse e choque séptico, o que contribui para o aumento da taxa de morbidade e mortalidade. Pacientes em choque séptico apresentam disfunção neuronal aguda, tais como o delírio, desorientação e coma. Em longo prazo, o dano cognitivo pode ocorrer ocasionando o comprometimento do aprendizado e formação de memória. Estudos demonstram que durante a resposta inflamatória sistêmica exacerbada, mediadores inflamatórios presentes na circulação sistêmica, são capazes de chegar ao SNC e ocasionar a ativação de células gliais, conduzindo a um estado de neuroinflamação. Nesse processo, algumas estruturas do SNC, tais como o hipocampo são mais vulneráveis à ação de espécies reativas de oxigênio (ERO), e a mediadores inflamatórios produzidos de forma excessiva durante a sepse. Neste contexto, a investigação de novas estratégias terapêuticas que sejam capazes de atenuar a resposta inflamatória exacerbada se faz necessário. Assim, o presente projeto teve como objetivo investigar prováveis propriedades antioxidante e anti-inflamatória do Hidrogênio molecular (H2), bem como sua possível ação neuroprotetora em ratos submetidos à sepse polimicrobiana, induzida por ligadura e perfuração cecal (CLP). Para isso o projeto foi dividido em dois protocolos experimentais. No primeiro protocolo ratos Wistar submetidos à cirurgia de CLP ou Sham, foram submetidos ao tratamento com inalação do H2 a 2%, por um período de 1h durante 10 dias consecutivos, e logo após foram submetidos a testes comportamentais para avaliação da memória de habituação, discriminativa e aversiva. No segundo protocolo os animais foram tratados com inalação do H2 por um período de 3h, e 24h após ao término da cirurgia de CLP/Sham foram decapitados para coleta do sangue e cérebro. A partir dos resultados dos testes comportamentais observamos que o tratamento com inalação do H2 durante a sepse experimental preveniu a perda de memória e o dano cognitivo, bem como foi capaz de diminuir os níveis de citocinas pró-inflamatórias de fase aguda tais como IL-1?, IL-6 e TNF? no córtex pré-frontal e hipocampo. A estratégia também foi capaz de diminuir os níveis de TBARS no plasma. Observamos um aumento da concentração da enzima catalase nos animais tratados com H2. Em conjunto os resultados indicam que o H2 foi capaz de inibir a resposta inflamatória e prevenir o dano cognitivo, agindo como uma substância neuroprotetora em ratos submetidos ao choque séptico experimental / The central nervous system is one of the first regions to be affected during Sepsis and septic shock, which contributes to the increased rate of morbidity and mortality. Patients with severe sepsis may present acute neuronal dysfunction such as delirium, disorientation, and unconscious. In the long term, cognitive damage can occur causing the commitment of learning and memory formation. Studies show that during the exacerbated systemic inflammatory response, inflammatory mediators present in the systemic circulation, are able to reach the CNS and cause the activation of glial cells, leading to a state of neuroinflammation. In this process, some CNS structures such as the hippocampus are more vulnerable to the action of reactive oxygen species (ROS), and to inflammatory mediators produced excessively during sepsis. In this context, the investigation of new therapeutic strategies that are capable of attenuating the exacerbated inflammatory response is necessary. Thus, the present project aimed to investigate the probable antioxidant and anti-inflammatory properties of molecular hydrogen (H2), as well as its possible neuroprotective action in rats submitted to polymicrobial sepsis induced by ligature and cecal puncture (CLP). In order to check this hypothesis, the project was divided into two experimental protocols. In the first protocol Wistar rats submitted to CLP or Sham surgery were submitted to 2% H2 inhalation treatment for a period of 1h for 10 consecutive days, and soon after they underwent behavioral tests to evaluate habituation memory, discriminative and aversive. In the second protocol the animals were treated with H2 inhalation for a period of 3h and 24h, and at the end of the treatment, they were decapitated for blood and brain collection. Plasma was already used for nitrate dosage, lipid peroxidation, antioxidant enzymes and inflammatory cytokines. From the results of the behavioral tests, we observed that treatment with H2 inhalation during the experimental sepsis prevented memory loss and cognitive damage, and was able to decrease the levels of acute-phase inflammatory cytokines such as IL-1?, IL -6 and TNF? in the prefrontal cortex and hippocampus. The therapeutic strategy was also able to decrease plasma TBARS levels. We also observed an increase in the concentration of the enzyme catalase in H2-treated animals. Together the results indicate that molecular hydrogen was able to inhibit the inflammatory response and prevent cognitive damage, acting as a neuroprotective substance, in rats submitted to experimental septic shock

Made available in DSpace on 2015-04-14T14:51:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 386732.pdf: 399583 bytes, checksum: fd819014b2d965768d8d68375135c0ff (MD5) Previous issue date: 2006-09-14 / O CD14 ? uma prote?na de 53-55kD que n?o possui por??o citoplasm?tica e atua como um receptor de uma ampla gama de microorganismos onde reconhece diferentes estruturas de lipopolissacar?deos (LPS). O CD14 pode ser encontrado sob duas formas: na superf?cie de mon?citos, macr?fagos e neutr?filos (mCD14 ou CD14 de membrana) ou na forma de CD14 sol?vel (sCD14). Tanto o mCD14 quanto o sCD14 desempenham um importante papel na gera??o de uma resposta imune inata contra pat?genos bacterianos. A ativa??o do sistema imune inato por componentes bacterianos pode ser modulada pela diferente express?o do mCD14 e varia??es do sCD14. Sugere-se que a express?o aumentada do CD14 pode trazer benef?cios para pacientes com sepse. Um polimorfismo de nucleot?deo ?nico (SNP) de transi??o de uma citosina para uma timina na posi??o -260 na regi?o promotora do gene CD14 foi identificado. Este SNP parece ter um papel significante na express?o do CD14. De fato, existem estudos sugerindo que homozigotos TT apresentam um aumento na densidade do mCD14 e nos n?veis de sCD14 quando comparados aos indiv?duos que carregam o alelo C. O objetivo deste estudo foi verificar se o polimorfismo -260C>T do promotor do gene que codifica para o CD14 interfere na sua express?o, e se se relaciona com o desfecho de sobrevida em pacientes s?pticos, al?m de verificar se existe diferen?a significativa na express?o do CD14 entre indiv?duos saud?veis e pacientes s?pticos. Observamos que a express?o do CD14, medida pela densidade de mCD14 e n?veis de sCD14, estava aumentada em pacientes s?pticos quando comparados com indiv?duos saud?veis e tamb?m detectamos que o gen?tipo TT estava associado com altos n?veis de mCD14. N?s verificamos, ap?s incuba??o com LPS, que existe um aumento significativo na densidade de mCD14. Esta foi a primeira vez em que pacientes s?pticos foram avaliados para o polimorfismo -260C>T, express?o do CD14 e mortalidade. Entretanto, nenhuma associa??o estatisticamente significativa entre estas tr?s vari?veis foi encontrada. Nossos resultados est?o de acordo com estudos pr?vios, nos quais o aumento da express?o do CD14 pode estar associado com o gen?tipo TT, embora isto n?o tenha influenciado o desfecho cl?nico dos pacientes s?pticos.

Sepse é um importante problema de saúde pública, uma vez que seu tratamento gera altos custos a um sistema de saúde já sobrecarregado. É uma síndrome de alta mortalidade e morbidade que afeta, em geral, pacientes jovens com plena capacidade produtiva. A identificação e o tratamento precoce desta síndrome reduzem a morbimortalidade, assim como o custo. A proteína C reativa (PCR) e a procalcitonina (PCT) são bem estudadas como ferramentas para diagnóstico de infecção bacteriana em imunocompetentes, mas seu uso como ferramenta diagnóstica ainda não está estabelecido em pacientes imunossuprimidos. Portanto, a proposta deste estudo é avaliar a acurácia diagnóstica destes biomarcadores, em pacientes críticos imunossuprimidos (vírus da imunodeficiência adquirida  HIV positivos, portadores de tuberculose (TBC), cirróticos e transplantados). Como o uso da proteína C ainda não está estabelecido, a primeira questão de pesquisa investigou seu potencial diagnóstico quando comparado ao teste padrão (cultural). O segundo artigo comparou a PCR com a PCT. Para isto foram realizados dois artigos de revisão sistemática com metanálise. O primeiro artigo comparou a acurácia em determinar infecção bacteriana em imunossuprimidos da PCR ao teste padrão-ouro (as culturas). A primeira revisão incluiu 1.418 pacientes e demonstrou uma boa acurácia da PCR como biomarcador no diagnóstico de infecção bacteriana, apresentando sensibilidade de 69% e especificidade de 76% com uma área sob a curva (AUC) de 0,77. Os resultados encontrados são similares aos da literatura para imunocompetentes,(3) sensibilidade de 75%, especificidade de 67% e Área Sob a Curva Receiver Operating Characteristic (AUROC) de 0,92. Quando a PCT foi comparada com a PCR, ambos os biomarcadores mostraram acurácia moderada na utilização como ferrramenta de diagnóstico de infecção bacteriana, com um diagnóstico da razão de chances (DOR) de 7,24 (95% CI (2,83-14,60) para PCT e de 5,56 (95% CI (5,21-10,30) para PCR. A PCT e a PCR apresentaram sensibilidade de 69% e 68% e uma especificidade de 75% e 71%, respectivamente. Ambas mostraram resultados semelhantes, podendo ser utilizadas no diagnóstico de sepse em imunossupressos. / Sepsis is a major public health problem, since its treatment generates high costs, a health system already overburdened. A high mortality and morbidity syndrome affects, in general, young patients with full production capacity. The identification and early treatment of this syndrome reduce morbidity and mortality as well as the cost. C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT) are well studied as tools for diagnosis of bacterial infection in immunocompetent patients, but its use as a diagnostic tool is not yet established in immunocompromised patients. Therefore, the purpose of this study is to evaluate the diagnostic accuracy of these biomarkers in immunosuppresses critical patients (human immunodeficiency virus, cirrhotic and transplant). As the use of the c protein is not yet established, the first research question investigated their diagnostic potential when compared to the pattern (cultural). The second article compared to CRP and PCT. For this, there were two articles of a systematic review and meta-analysis. The first article compared the accuracy in determining bacterial infection in immunosuppresses of CRP to the gold standard (cultures). Our first review included 1,418 patients and showed good accuracy of CRP as a biomarker for the diagnosis of bacterial infection presenting a sensibility of 69% and 76% specificity with an area under the curve (AUC) 0.77. The results are similar to those found in the literature for immunocompetent,(3) sensitivity 75%, specificity of 67% and Area Under the Receiver Operating Characteristic Curve (AUROC): 0.92. When the PCT was compared with PCR, both biomarkers showed a moderately accurate for use as tool diagnostic bacterial infection with a Odds ratio diagnostic (DOR) 7.24 (95% CI (2.83-14.60) and PCT to 5:56 (95% CI (5.21-10.30) for CRP. the PCT and CRP had a sensitivity of 69% and 68% and a specificity of 75% and 71%, respectively. Both showed similar results may be used in the diagnosis of sepsis in immunosuppression.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:33:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 450704.pdf: 1216281 bytes, checksum: a16c733b3a9d112bfc2d785ebec59977 (MD5) Previous issue date: 2013-08-26 / During the neonatal period, the administration of lipopolysaccharide (LPS) generates a stressful immune stimulation resulting in the expression of cytokines in the central nervous system. As result, brain changes in certain regions of the hippocampus of adult rats, as well as activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA) in neonates is observed. The objective of this study is to evaluate the long-term effects of neonatal inflammation on the oxidative and inflammatory status during experimental sepsis in adult life. On day ten after birth, Balb/c mice received different treatments: nLPS, received 100 &#956;L of a 100 &#956;g/kg i.p. LPS solution or nSal, received 100 &#956;L of i.p. saline solution. As adults, animals were submitted to i.p. administration of saline solution or LPS. After 12 hours, serum samples and liver were collected to measure inflammatory cytokines and to determine mitochondrial complexes and oxidative stress, respectively. There was an increase in the fear/anxiety behavior in the nLPS group. The complexes II and II-III increased in the nLPS saline group when compared to control. The LPS administration in the adult females induced a decrease of the glutathione enzyme activity. There were no differences in the inflammatory cytokines. The results indicate that the neonatal inflammation was effective in inducing programming. The mitochondrial respiratory chain metabolism seems to be influenced by the neonatal inflammation in males. LPS neonatal stress seems not to change the cytokine inflammatory profile in an experimental model of sepsis / A administra??o de lipopolissacar?deo (LPS) no per?odo neonatal gera um est?mulo imunol?gico estressante capaz de estimular a express?o de citocinas no sistema nervoso central e causar altera??es cerebrais em certas regi?es do hipocampo de ratos adultos, al?m de ativar o eixo hipot?lamo-pituit?ria-adrenal (HPA) em neonatos. O objetivo deste estudo ? avaliar os efeitos em longo prazo da inflama??o no per?odo neonatal sobre o perfil inflamat?rio e oxidativo na sepse experimental na vida adulta. No d?cimo dia ap?s o nascimento, camundongos Balb/c receberam diferentes tratamentos: nLPS, recebeu 100 L de solu??o 100 g/Kg de LPS i.p. ou nSal em que foi administrado 100 L de solu??o salina i.p. Quando adultos, os animais foram submetidos ? administra??o i.p. de solu??o salina ou LPS e, 12 horas ap?s, foram coletados o soro para mensura??o das citocinas inflamat?rias e o f?gado para determina??o dos complexos mitocondriais e estresse oxidativo. Houve aumento do comportamento de medo/ansiedade no grupo nLPS. Os complexos II e II-III aumentaram nos machos nLPS-salina quando comparados ao controle. A administra??o de LPS nas f?meas adultas provocou uma diminui??o da atividade da enzima glutationa reduzida. N?o houve diferen?as em rela??o ?s citocinas inflamat?rias. Os resultados indicam que a inflama??o no per?odo neonatal foi efetiva na indu??o do programming. O metabolismo da cadeia respirat?ria mitocondrial parece ser influenciado pela inflama??o neonatal em animais machos. O estresse neonatal por LPS parece n?o alterar o perfil inflamat?rio das citocinas no modelo de sepse experimental.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:36:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 467262.pdf: 918245 bytes, checksum: f68b514ae6abf640bc976915b5b7f951 (MD5) Previous issue date: 2014-12-12 / Sepsis remains the leading cause of death in the ICU and can express rates of up to 80% mortality. Despite the importance and demand for resources, the early recognition is still a challenge, allowing the occurrence of multiple organ dysfunction syndromes (MODS), shock and fatal outcomes. Recent research has shown theories about the pathophysiological mechanism of sepsis in the search for new therapies. The principal responsable for sepsis severity is inflammatory response, represented by the secretion of inflammatory cytokines. An important step in the inflammatory process is the activity of inflammasome, which functions through the activation of Caspase-1, allowing the release of active forms of interleukins IL-1&#946; and IL-18, signaling the beginning of the response of the innate immune system. Therefore the inflammasome has been widely studied. Our study aims to assess whether the different severity of sepsis inflamossomo activity (measured by levels of IL-1 &#946; and IL-18 in plasma) have different expression between groups, and their relationship with mortality. The results showed that the activity of inflamasoma with increased serum levels of IL-18 may be responsible for high mortality in sepsis, independent of the level of IL-1&#946;, although the activation process and route of expresss?o be simultaneous and same. Therefore, our findings may help to understand the inflammatory events that lead to sepsis, which may influence the future therapeutic and research in reducing mortality / A sepse permanece sendo a principal causa de morte em UTI, podendo expressar ?ndices de at? 80% de mortalidade. Apesar de sua import?ncia e a demanda de recursos, seu reconhecimento precoce ainda ? um desafio, deixando margem para a ocorr?ncia de disfun??o de m?ltiplos ?rg?os e sistemas (DMOS), choque e desfechos fatais Estudos recentes vem apresentando teorias sobre o mecanismo fisiopatol?gico da sepse, na busca por novas alternativas terap?uticas. O principal respons?vel pela gravidade da sepse ? a resposta inflamat?ria sist?mica, representada pela secre??o de citocinas inflamat?rias. Uma importante etapa do processo inflamat?rio ? a atividade do inflamasoma, o qual funciona atrav?s da ativa??o da Caspase-1, permitindo a libera??o de formas ativas das interleucinas IL- 1&#946; e IL-18, sinalizando o in?cio da resposta do sistema imune inato. Sendo assim o inflamasoma vem sendo amplamente estudado. Nosso estudo tem como objetivo avaliar se nas diferentes gravidades da sepse a atividade do inflamasoma (medida pelos n?veis de IL-1 &#946; e IL-18 no plasma) tem express?o diferente entre os grupos, e sua rela??o com a mortalidade. Os resultados demonstraram que a atividade do inflamasoma com o aumento dos n?veis s?ricos de IL-18 pode ser o respons?vel pelo alto ?ndice de mortalidade na sepse, independente do n?vel de IL-1&#946;, apesar do processo de ativa??o e via de expresss?o ser simult?nea e a mesma. Portanto, nossas descobertas podem auxiliar na compreens?o dos eventos inflamat?rios que levam a sepse, podendo influenciar na investiga??o de terap?uticas futuras e na redu??o de mortalidade

Objetivo: Citocinas são sintetizadas e secretadas em resposta a uma variedade de estímulos inflamatórios, razão pela qual podem ser indicadores muito precoces de sepse neonatal precoce. A proposta deste estudo foi avaliar a contribuição da interleucina-6, fator de necrose tumoral-a e interleucina-1 P para o estabelecimento de critérios diagnósticos de sepse neonatal precoce. F oram estudadas correlações dos níveis plasmáticos dessas citocinas com testes laboratoriais comumente utilizados (leucograma) e com a presença de febre. Método: Foi realizado um estudo de coorte controlado com 117 recém-nascidos (RN) admitidos na Unídade Neonatal do HCPA no período compreendido entre julho de 1995 e agosto de 1996, com idade de zero a 5 dias de vida e suspeita clínica de infecção suficiente para o médico assistente indicar a necessidade de avaliação laboratorial. Nesse momento foi coletado material para hemograma, hemocultura ou qualquer outro teste cultural, dosagens plasmáticas de IL-6, TNF-a e IL-1 P, pela técnica de enzimoimunoensaio, utilizando-se kits R & D Systems. Os pacientes foram divididos em quatro grupos: Grupo I, sepse neonatal comprovada (n= 13); Grupo li, sepse presumível, sem uso de antibiótico pela mãe no periparto (n=36); Grupo III, sepse presumível, no entanto a mãe recebeu antibioticoterapia no periparto (n=17) e Grupo IV (n=51 ), RNs saudáveis, ou seja, aqueles com alguma suspeita clínica inicial de sepse, sem, no entanto, necessidade de antibioticoterapia para melhorarem e com ausência de germe na hemocultura e demais exames de cultura. Resultados: Os quatro grupos tiveram composição semelhante quanto ao peso de nascimento, idade gestacional, tipo de parto e escore de Apgar no 5° minuto. Não foi observada diferença entre os quatro grupos quanto a leucopenia, leucocitose, relação VT 2 </ 0,2, neutropenia e trombocitopenia. Um número reduzido de pacientes apresentou alguma dessas alterações laboratoriais. Como o comportamento dos parâmetros clínicos e laboratoriais dos Grupos I, II e III não mostrou diferença estatisticamente significativa, foi possivel agrupá-los em RN infectados (n=66) e compará-los com os não-infectados (n=Sl). A maioria dos RNs (82,9%) teve seu sangue coletado para avaliação dos níveis plasmáticos das citocinas nas primeiras 24 horas de vida. Interleucina-6 e TNF-a. foram significativamente mais elevados nos Grupos I, II e III, quando comparados com o Grupo IV. As medianas dos valores de IL-lP nos quatro grupos não foram estatisticamente diferentes. IL-6 e IL-1 p tiveram seus níveis plasmáticos mais elevados na presença de febre. A IL-1 p foi o melhor mediador da resposta febril no RN. Foram obtidas curvas ROC (receiver operating characteristics) para IL-6 e TNF-a. , a fim de estabelecer o ponto de corte ideal para esses mediadores. Com um ponto de corte de 32 pg/rnl para IL-6, a sensibilidade foi de 90%, e a especificidade, de 43%; o valor preditivo positivo foi de 67,4%, e o valor preditivo negativo, de 78,6%. Com relação ao TNF-a., o ponto de corte de 12 pg/rnl forneceu uma sensibilidade de 87,9% e uma especificidade de 43%. Os valores preditivos positivos e negativos foram, respectivamente, de 66,7% e 73,3%. Combinando os valores de pontos de corte de IL-6 e de TNF-a, a sensibilidade aumentou para 98,5%, demonstrando que essas citocinas contribuem decisivamente para o diagnóstico precoce de sepse neonatal precoce. Conclusão: É possível caracterizar a resposta inflamatória e o comportamento dos mediadores quando precocemente estudados na evolução da sepse neonatal precoce, pois as citocinas, de um modo geral, alteram-se no início da instalação do processo inflamatório e apresentam meia-vida muito curta. A avaliação do leucograma (leucopenia, relação 1/T) não foi efetiva para o diagnóstico de sepse neonatal precoce, provavelmente porque esses parâmetros laboratoriais necessitam de maior tempo para se mostrarem alterados que as citocinas estudadas. Os níveis plasmáticos de IL-6 e TNF -a foram significativamente mais elevados em RNs com sepse neonatal precoce comprovada ou presumível quando comparados com os de RNs saudáveis. A associação desses mediadores mostrou-se o melhor marcador para sepse no período pós-natal imediato. / Objectives: Cytokines are synthetysed and secreted in response to a variety of inflammatory stimuli, therefore they can be very initial indicators of early onset neonatal sepsis. The purpose of this study was to evaluate the contribution of interleukin-6, tumor necrosis facto r-a., and interleukin-1 J3 for the diagnosis of early onset neonatal sepsis. We studied the correlation between cytokine plasma leveis with commonly used laboratory tests (leukogram) and the presence offever. Methods: A cohort of 117 newborn infants (postnatal age within zero and 5 days old) admitted to the Neonatal Unit of Hospital de Clínicas de Porto Alegre, between July 1995 and August 1996, with a clinicai suspicion of infection were included in the study. At that moment, samples were collected for complete blood count, blood culture or any other culture, plasma leveis o f IL-6, TNF -a. and IL-1 J3 by enzyme-immunoassay (R&D Systems kits). Patients were divided in four groups: Group I: proved neonatal sepsis (n=13); Group II: probably infected with no maternal peripartum use of antibiotic (n=36); Group ill: probably infected but mother received peripartum antibiotic (n=17), and Group IV: newborn infants that did not receive any antibiotic therapy (n=Sl ). Resu1ts: The four groups were similar in relation to birth weight, gestational age, type o f delivery and Apgar scores in the fifth rninute o f life. There were no differences among the four groups in relation to the presence of leukopenia, leukocytosis, VT ratio </ 0.2, neutropenia, and thrombocytopenia. Very few patients had such alterations. There were no statistícal differences among groups I, Il and III in relation to clinicai and laboratory findings, therefore, they were put together (n=66) and compared with group IV. Most of the newborn infants (82.9%) had their blood collected in the first 24 hours of life. IL-6 and TNF-a. were significantly higher in groups I, II and III than in group IV. The median leveis of IL-1 p were similar in ali four groups. Newborn infants with fever had the highest leveis of IL-6 and IL-1 p. The latest was the best mediator for fever in the neonatal period. The optimal cutoff point obtained with the receiver operating characteristics (ROC) curve was 32 pglml for IL-6 (sensitivity = 90%, specificity = 43%, positive predictive value = 67.4%, negative predictive value = 78.6%) , and 12 pglml for TNF-a. (sensitivity = 87.9%, specificity = 43%, positive predictive value = 66. 7%, nega tive predictive value = 73.3% ). Combining IL-6 and TNF-a. cutoff points provides a sensitivity of 98%. Conclusion: It is possible to evaluate the inflammatory response during the evolution of early onset neonatal sepsis. Cytokines become abnormal very early. The blood count was not useful for diagnosis of early onset neonatal sepsis. IL-6 and TNF-a. leveis were signjficantly higher in newborn infants with neonatal sepsis than in normal newborn infants. The combination o f IL-6 and TNF -a. appears to be a highly sensitive marker o f sepsis in the immediate post-natal period.

Os leucotrienos (LTs) e as citocinas são mediadores inflamatórios produzidos durante a sepse e que podem apresentar uma tarefa moduladora na secreção de arginina-vasopressina (AVP). Na fase aguda da sepse as concentrações plasmáticas de AVP encontram-se aumentadas e na fase tardia em níveis basais, apesar da hipotensão progressiva. Nosso objetivo foi analisar o efeito da injeção intraperitoneal de MK-886, (inibidor da síntese de leucotrienos), sobre a produção de LTs e de citocinas no sítio infeccioso e plasma de animais sépticos. Foram usados ratos Wistar que receberam injeções intraperitoneais de MK-886 (4mg/kg) ou veículo (DMSO 5%) 1h antes da indução de sepse experimental por ligadura e perfuração cecal (CLP) ou da operação fictícia (OF). Os animais foram decapitados 0, 4 e 24h após CLP ou OF. O sangue foi coletado para a determinação do sódio sérico, hematócrito, citocinas, LTB4. O lavado peritoneal foi coletado para dosagem de citocinas. O hipotálamo foi removido e incubado para a análise de cis-LTs. O sódio sérico diminuiu, o hematócrito aumentou e os cis-leucotrienos hipotalâmicos não apresentaram alterações significantes após 4 horas de CLP. A sepse provocou um aumento nas concentrações de TNF-a, no sítio infeccioso, mas não foi detectada no plasma. As citocinas IL-1b e a IL-6 aumentaram em 4 horas tanto no sítio infeccioso como no plasma. A análise dos resultados de LTB4 plasmático mostrou uma diminuição das concentrações 24 horas após o CLP. A administração do MK-886 não modificou o sódio, o hematócrito e aparentemente nem os cis-leucotrienos hipotalâmicos. No sítio infeccioso a droga causou um aumento nas concentrações de TNF-a 4 e 24 horas enquanto as de IL-1b não se modificaram e as de IL-6 aumentaram apenas 4 horas após o CLP. Entretanto, no plasma, a droga diminuiu acentuadamente as concentrações tanto de IL-1b como de IL-6. A análise do LTB4 plasmático mostrou efeito da droga em 4 horas, mas não em 24 horas da sepse. Os resultados deste estudo sugerem que os LTS regulam de maneira diferente a produção de citocinas no plasma e no foco infeccioso e podem explicar os efeitos destes mediadores sobre a secreção de AVP durante a sepse. / Leukotrienes (LTs) and cytokines are inflammatory mediators produced during sepsis and may have a task in modulating the secretion of vasopressin (VP). In the acute phase of sepsis, the plasma AVP concentrations are increased and in the late stage at basal levels, despite the progressive hypotension. Our goal was to analyze the effect of intraperitoneal injection of MK-886 (leukotriene synthesis inhibitor) on the production of LTs and cytokines in the infectious site and plasma of septic animals. We used Wistar rats that received intraperitoneal injection of MK-886 (4.0mg/kg) or vehicle (DMSO 5%) 1 h before induction of experimental sepsis by cecal ligation and puncture (CLP) or sham operation (OF).The animals were decapitated at 0, 4 and 24 h after surgeries and blood was collected for determination of serum sodium, hematocrit, cytokines and LTB4. The peritoneal fluid was collected for cytokine assay. The hypothalamus was removed and incubated for the analysis of cis-LTs. Serum sodium decreased, hematocrit increased and hypothalamic cis-leukotrienes did not show significant changes after 4 hours of CLP. Sepsis caused increase in the TNF-a concentrations in the site of infection, but was not detected in plasma. The cytokines IL-1b and IL-6 increased by 4 hours both in the plasma as in the site of infection. The results of LTB4 showed a decrease in plasma concentrations 24 hours after CLP. The administration of MK-886 did not alter sodium, hematocrit, and apparently neither the cis-hypothalamic leukotrienes. At the site of infection the drug caused an increase in the concentrations of TNF-a 4 and 24 hours while IL-1b remained unchanged and IL-6 increased only 4 hours after CLP. However, in the plasma the drug markedly diminished the concentrations of IL-1b and IL-6. The analysis of LTB4 in plasma showed effects of the drug in 4 hours but not 24 hours of sepsis. The results of this study suggest that LTs differentially regulate the cytokine production in the plasma and in the site of infection, and may explain the effects of these mediators in AVP secretion during sepsis.

É bem estabelecido que respostas imunes possam ser influenciadas pelo sistema nervoso. O neuropeptídeo, peptídeo liberador de gastrina (GRP) tem sido detectado na produção e liberação de citocinas, em modelo animal e em humanos com doenças inflamatórias e sabe-se que o antagonista do receptor de GRP, RC-3095 modula a resposta de citocinas pro-inflamatórias em macrófagos ativados por lipopolissacarídeo (LPS) molhando a sobrevivência em modelo animal de sepse induzida por ligação e perfuração cecal (CLP). Neste contexto, neste estudo avaliamos o efeito modulatório de GRP em modelos animais de doenças inflamatórias agudas: injúria pulmonar associada à pleurisia induzida por carragenina e sepse induzida por CLP e adicionalmente, em pacientes sépticos através da correlação dos seus níveis com o desfecho clínico. Para esta proposta, no Capítulo 1 avaliamos em pleurisia induzida por carragenina os seguintes parâmetros: migração celular, atividade da lactato desidrogenase, conteúdo de proteínas totais, concentração de nitrito/nitrato e níveis de TNF-α e IL- β no exsudato pleural e atividade da mieloperoxidade e marcadores de dano oxidativo em lipídios e proteínas no tecido pulmonar. Assim, o RC-3095 exibiu significante ação anti-inflamatória através da inibição do influxo de leucócitos e bloqueio da mieloperoxidade, conteúdo de nitrito/nitrato e níveis de citocinas. Além disso, os resultados mostraram que RC-3095 exerce ação contra o dano oxidativo em lipídios e proteínas, bem como o aumento na viabilidade celular. Isto sugere que RC- 3095 tem propriedades anti-inflamatórias que podem estar relacionadas com a redução do dano oxidativo. No Capítulo 2, entretanto, nós seguimos no modelo animal de sepse onde buscamos o entendimento do papel protetor que exerce o RC-3095. Vários estudos sugerem o envolvimento de TLR-4 como um importante elemento de defesa do hospedeiro durante a infecção, e importantes eviências indicam que esses receptores também possuem um papel na patofisiologia da sepse, onde camundongos deficientes de TLR-4 não apresentam falência na migração de neutrófilos para a cavidade peritoneal durante a sepse polimicrobiana induzida por CLP letal, e como conseqüência, foram mais resistentes para sepse que controles. Nossos resultados indicam que este efeito protetor pode ser atribuído para uma atenuação de sinalização de TLR-4 em cultura de células RAW 264.7 estimuladas por LPS e tecido pulmonar em ratos CLP, levando a uma diminuição de citocinas proinflamatórias as quais a via de ativação de GRPR mostra seletividade como verificado no Capítulo 3, possibilitando a explicação dos baixos níveis de citocinas pro-inflamatórias em pacientes sépticos tratados com RC-3095. Esta atenuação favorece a infiltração de neutrófilos, resultando na diminuição de bacteremia preservando o controle da infecção no local melhorando o desfecho da sepse. Nossos resultados ainda mostram que níveis plasmáticos de GRP podem predizer o desfecho na sepse, mas não em pacientes SIRS sugerindo que GRP exerce funções diferenciais nas duas condições e sugere que o antagonismo de GRPR modula a inflamação incontrolada por agir em respostas mediadas por TLR-4 e funcionalidade imunoregulatória. Em conclusão, os presentes resultados indicam que o antagonista de GRPR exerce um papel na inflamação aguda e pode ser utilizado como uma nova terapia alternativa para sepse bacteriana Gram-negativa. / It is well established that immune responses may be influenced by the nervous system. The neuropeptide gastrin-releasing peptide (GRP) has been detected on the production and release of cytokines, both in animal models and humans with inflammatory diseases and reported that the GRP receptor antagonist RC-3095 modulates the response of proinflammatory cytokines in activated macrophages by lipopolysaccharide and improved the survival in an animal model of sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP). Within this context, in this work we evaluate the GRP modulatory effect in animal models of acute inflammatory illnesses: lung injury associated with carrageenan-induced pleurisy, and in CLP-induced sepsis and additionally in septic patients through the correlations of its levels with the clinical outcome. For this purpose, in Chapter 1 we evaluated in carrageenan-induced pleurisy the following parameters: cell migration, lactate dehydrogenase activity, total protein content, nitrite/nitrate concentration, TNF-α and interleukin-1β (IL-1β) levels in pleural exudates; myeloperoxidase activity and lipid and protein oxidative damage markers in lung tissue. Thus, RC-3095 exhibited pronounced anti-inflammatory actions by inhibition of leukocyte influx and blockade of myeloperoxidase, nitrite/nitrate content and cytokine levels. Moreover, the results showed that RC-3095 elicits action against oxidative damage in lipids and proteins, as well as increases cell viability. These suggest that RC-3095 has anti-inflammatory properties that can be related with the reduction of oxidative damage. In Chapter 2, however, we follow the animal model of sepsis where we search the agreement of the protective role that RC-3095 exerts. Increasing evidences suggest the evolvement of TLR-4 as an important element of host defense during an infection, a growing body of evidence indicates that these receptors also may play a role in the pathophysiology of sepsis where TLR-4 defective mice did not present failure of neutrophil migration to the peritoneal cavity during polymicrobial sepsis induced by lethal CLP, and as consequence, they were more resistant to sepsis than controls Our results further indicate that this protective effect can be attributed to an attenuation of TLR-4 signaling in RAW 264.7 cell culture stimulated by LPS and lung tissue in CLP rats, leading to a decrease of release of proinflammatory cytokines which the pathway of activation of GRPR shows selectivity as verified in Chapter 3, and can additionally explain the lower levels of the proinflammatory cytokine in RC-3095-treated septic patients. This attenuation favors neutrophil infiltration, resulting in decreased bacteremia preserving the control of infection in situ improving sepsis outcome. Our finding still show that plasma GRP levels could predict outcome in sepsis but not SIRS patients suggesting that GRP plays different roles in the two conditions and suggest that GRPR antagonism modulates uncontrolled inflammation by targeting TLR-4-mediated responses and immunoregulatory functionality. Taken together, the present results indicate that a GRPR antagonist plays a role in acute inflammation and could be developed as a new alternative therapy for Gram-negative bacterial sepsis.

Submitted by Setor de Tratamento da Informa??o - BC/PUCRS (tede2@pucrs.br) on 2016-06-28T19:46:53Z No. of bitstreams: 1 DIS_ROBERTA_MARCO_PARCIAL.pdf: 357218 bytes, checksum: ccd065d6d86c0db5b61fa4f1315c12bc (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-28T19:46:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_ROBERTA_MARCO_PARCIAL.pdf: 357218 bytes, checksum: ccd065d6d86c0db5b61fa4f1315c12bc (MD5) Previous issue date: 2015-08-31 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / Introduction: coagulase-negative Staphylococcus is recognized as the main pathogen involved in sepsis on neonatal period, and Staphylococcus epidermidis the most frequent. Objective: To describe the epidemiology of newborns affected by primary bloodstream infection caused by coagulase-negative Staphylococcus in neonatal intensive care units. Methods: Cross-sectional, retrospective study performed in the neonatal intensive care unit (NICU) of the Moinhos de Vento Hospital and S?o Lucas Hospital from January 2011 to December 2013. The data were collected prospectively by Hospital Infection Control Service both institutions and held records consulted by researchers when necessary. Results: All primary bloodstream infections caused by coagulase-negative Staphylococcus (n = 99) were included. It more frequent in boys, patients with gestational age <32 weeks and those who used parenteral nutrition, peripherally inserted central catheter and mechanical ventilation. The five weight groups are heterogeneous. It was found that 49.5% of infections are caused by Staphylococcus epidermidis. Bloating, down saturation, apnea and the need for increased supply of oxygen were the most frequent symptoms in infants less than 30 weeks of gestational age and birth weight less than 1003 grams; underactive, vomiting and fever occurred in babies with appropriate weight and gestational age. The antimicrobial treatment regimen was used over monotherapy with vancomycin, vancomycin and amikacin followed by association. The most common outcome in this population was hospital discharge. Conclusion: As in other studies, Staphylococcus epidermidis was the most common organism identified in this population. The use of invasive devices must be questioned daily with the aim of early withdrawal. The medical-care team of the NICU should be engaged in preventing these infections in order to ensure safety and quality of care / treatment of newborns. / Introdu??o: O Staphylococcus coagulase-negativo ? reconhecido como o principal pat?geno envolvido em sepse no per?odo neonatal, sendo o Staphylococcus epidermidis o mais frequente. Objetivo: descrever a epidemiologia dos rec?m-nascidos acometidos por infec??o prim?ria de corrente sangu?nea causada por Staphylococcus coagulase-negativo em unidades de terapia intensiva neonatal. M?todos: estudo transversal, retrospectivo, realizado nas unidades de terapia intensiva neonatal da Associa??o Hospitalar Moinhos de Vento e Hospital S?o Lucas da PUCRS no per?odo de janeiro de 2011 a dezembro de 2013. Os dados foram coletados prospectivamente pelos Servi?os de Controle de Infec??o Hospitalar de ambas as institui??es e realizada consulta de prontu?rios pelos pesquisadores quando necess?rio. Resultados: Foram inclu?das todas as infec??es prim?rias de corrente sangu?nea causadas por Staphylococcus coagulase-negativo (n=99). O sexo masculino foi mais frequente, bem como pacientes com idade gestacional <32 semanas e que utilizavam nutri??o parenteral total (NPT), cateter central de inser??o perif?rica (PICC) e ventila??o mec?nica (VM). As cinco faixas de peso s?o heterog?neas. Verificou-se que 49,5% das infec??es foram ocasionadas pelo Staphylococcus epidermidis. Distens?o abdominal, queda de satura??o, apneia e necessidade de aumento da oferta de oxig?nio foram os sintomas mais frequentes em beb?s com menos de 30 semanas de idade gestacional e peso ao nascer menor que 1003 gramas; hipoatividade, v?mitos e febre acometeram beb?s com peso e idade gestacional maior. O esquema de tratamento antimicrobiano mais utilizado foi a monoterapia com Vancomicina, seguido da associa??o de Vancomicina e Amicacina. O desfecho mais frequente nesta popula??o foi a alta hospitalar. Conclus?o: Assim como em outros estudos, o Staphylococcus epidermidis foi o mais frequente microrganismo identificado na popula??o estudada. O uso de dispositivos invasivos deve ser questionado diariamente com o objetivo de retirada precoce. A equipe m?dico-assistencial das unidades de terapia intensiva neonatal (UTIN) deve estar engajada na preven??o dessas infec??es a fim de garantir uma seguran?a e qualidade no atendimento/tratamento dos rec?m-nascidos.