Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T10:33:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moura_Claudiade_D.pdf: 2791356 bytes, checksum: 7830cb1ece9ec9ac3c34c2794b264c93 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Escherichia coli é um membro comensal da microbiota de animais, porém podem causar doenças desde diarréias até sepses. A caracterização dos seus antígenos de superfície O (somático) e H (flagelar) auxilia na determinação de linhagens patogênicas dentro da espécie. Contudo, algumas bactérias não expressam flagelo in vitro, demonstrado que a amplificação do gene fliC, a análise dos fragmentos de polimorfismo (PCR-RFLP) e sequenciamento podem ser utilizadas para identificação dos antígenos H, em substituição à sorologia convencional. Até meados de 1980, pensava-se que, diferentemente da Salmonella, E. coli possui um único gene para expressão de flagelina (fliC), mas algumas amostras podem conter genes para expressão de flagelina flkA, fllA, flmA, flnA e fljA (repressor de fliC). Em nosso trabalho, analisamos 31 amostras de E. coli isolados de animais e alimentos que apresentavam o fenótipo HNT em ensaios de sorologia. Utilizamos PCR-RFLP e sequenciamento para descrever novos genes para flagelina, da qual foram obtidos antissoros. Identificamos por PCR e sequenciamento os genes responsáveis pela variação de fase fljA, flkA e flmA, realizamos experimentos de motilidade para determinar a variação de fase flagelar e detectar a expressão dos genes através de RT-PCR. Dezessete amostras tiveram seus antígenos H caracterizados, sendo nove caracterizadas por PCR-RFLP: H2 (duas amostras) H16 (duas amostras), H34 (três amostras), H33 (uma amostra) e H38 (uma amostra). Na análise de sequenciamento identificamos duas amostras portadoras do gene fliCh25, duas amostras fliCh7 e uma amostra apresentando fliCh32. Três novos genes para flagelina foram descritos: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Identificamos o gene fljA em duas amostras HNT (3C e 4C) e na amostra padrão H35. O gene das amostras HNT apresentaram homologia ao fljA de Salmonella enterica, cuja variação de fase é bem estabelecida. As amostras padrão H11, H35, H40 e H47, bem como as amostras HNT 3C e 4C foram positivas para o gene flmA. As amostras padrão H3 e H53 são portadoras do gene flkA, contudo apenas a amostra H53 apresentou fljA. A amostra H54 é portadora de fljA e flmA. Nenhuma amostra H padrão mostrou variação de fase, diferentemente da literatura, sugerindo a perda da capacidade de variar a fase flagelar. A amostra 4C mostrou variação de fase positiva quando induzida em meios de cultura contendo antissoros anti-H48, anti-H54 e anti-H4C. Do mesmo modo, a detecção dos RNAm em diferentes condições de cultura confirmou a variação de fase. Como resultado um esquema de identificação para detecção de grupos de antígenos H e identificação de fliC foi testado. A técnica de fliC-RFLP provou ser eficiente e rápida, auxiliando a sorologia clássica para detecção de antígenos H de E. coli. Um modelo geral de variação de fase da amostra 4C é expresso por fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. Além disso, nós verificamos que a amostra 4C apresenta um gene novo para expressão de flagelina. Este trabalho é pioneiro em relação à variação de fase flagelar, demonstrando uma nova associação entre os antígenos H48 e H54 / Abstract: Escherichia coli are a species of microflora, and characterization of the cell surface lipopolysaccharide O antigen and the flagellar H antigen allow the grouping of pathogenic clones within this species. Moreover, some bacteria in vitro do not obtain to express its flagella, demonstrated that PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and sequencing analysis has been used for the identification of these antigens, in substitution of traditional serology. Moreover, until middle of years 80, are believed, differently of the Salmonella, E. coli possesss an only gene for flagelin expression (fliC), but some s/strains can contain genes for flagellin expression flkA, fllA, flmA, flnA and fljA (repressor of fliC). In this work, we analyzed 31 strains of E. coli isolated from animals and foods that presented HNT phenotype in serology assays. We use PCR-RFLP and sequencing to describe new genes for flagellin, of which antiserum were obtained. We identify for PCR and sequencing the genes for phase variation fljA, flkA and flmA, we carry through motility experiments to determine the flagellar phase variation and to detect the expression of the genes (RNAm) through RT-PCR. Seventeen strains had had its H antigen characterized and nine of then were characterized for PCR-RFLP: H2 (two strains) H16 (two strains), H34 (three strains), H33 (one strain) and H38 (one strain). Through sequencing analysis we identify to two carrying strains of the gene fliCh25, two strains fliCh7 and one strain presenting fliCh32. Three new genes for flagellin had been described: fliCh2', fliC4c, fliC40c. Using PCR and sequencing, we identify fljA gene in two strains HNT (3C and 4C) and in the H35 control strain. The HNT genes showed homology to fljA of Salmonella enterica, whose variation of phase well is established. The control strains H11, H35, H40 and H47, as well as HNT 3C and 4C strains were positive for flmA gene. The control strains H3 and H53 are carrying of flkA gene, however only the H53 strain presented fljA. The H54 control strain is carrying of fljA and flmA. No H control strain showed phase variation, differently of literature, suggesting the loss of the capacity to flagellar phase variation. The 4C strain showed positive phase variation when cultured with antiserum anti-H48, anti-H54 and anti-H4C. In a similar way, the detention of RNAm in different conditions of culture confirmed the phase variation. As a result, an identification scheme was tested to deduce H antigen groups and new genes of fliC. The fliCRFLP technique proved to be faster than classic serotyping for the deduction of the E. coli H antigen, characterizing the antigens with few days and indicating new putative genes. Thus, a general model for flagellar phase variation in 4C strain can be expressed as fliCoff + flmAon ? fliCon + flmAoff. In addition, we found that strains 3C and 4C express unidentified flagellin antigens. This is the first report of flagellar phase variation in wild E. coli strains. We have also provided evidence that strain 4C, identified here for the first time, expresses three flagellar antigens, H48, H54 and a previously unidentified flagellin / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Domingos da Silva Leite / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-14T15:47:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tiba_MoniqueRibeiro_D.pdf: 3934673 bytes, checksum: 211302f7129afd8376ba9096064a21c4 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Escherichia coli tem sido isolada, com certa freqüência, apresentando antígenos flagelares (H) que não são reconhecidos por nenhum dos anti-soros disponibilizado pelo mais importante centro de referência de E. coli, The International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO) do Statens Serum Institut, Copenhague, Dinamarca. Atualmente são reconhecidos 53 antígenos "H" e, nos últimos 29 anos, nenhuma modificação ocorreu na lista dos antígenos flagelares associados à Escherichia coli. Isto posto, os objetivos deste trabalho foram identificar os antígenos flagelares das cepas de E. coli que expressam H não tipável (HNT) e que apresentam fatores de virulência associados à diferentes enteropatias. Esta identificação foi realizada inicialmente, pela reação em cadeia da polimerase (PCR) do gene fliC, responsável pela proteína flagelina, das 53 amostras padrões para os antígenos H e das 20 amostras HNT (H não-tipável). Em seguida, os amplicons foram digeridos por enzimas de restrição e daquelas amostras que apresentaram perfis de restrições distintos daqueles observados para as amostras padrões de antígeno H, foram produzidos soros em coelhos. Foram realizados testes de titulação frente aos 53 antígenos padrões, frente ao antígeno homólogo e frente aos antígenos das amostras HNT. As seqüência gênicas das amostras HNT, obtidas na reação de sequenciamento, foram comparadas aos diferentes genes de fliC armazenados no banco de dados do "National Center for Biotecnology Information" (NCBI) através do sistema BLAST, e o programa ClustalW foi utilizado para alinhamento das seqüências. Os resultados demonstraram que estas amostras apresentaram similaridade com antígenos padrões, entretanto, elas não possuem a mesma seqüência nucleotídica e também não reagiram fenotipicamente com o anti-soro esperado. Os dados obtidos permitem concluir que no conjunto de amostras estudado, treze amostras apresentaram antígeno flagelar diferente daqueles já descritos na literatura, quando utilizado as técnicas de PCR e/ou sorologia. / Abstract: Escherichia coli has been isolated frequently, showing flagellar antigens that are not recognized by any of the antisera, provided by the most important reference center of E. coli, The International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO) of the Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark. Are currently recognized 53 H antigens and in the last 29 years, no change occurred in the list of flagellar antigens associated with Escherichia coli. The objectives of this study were to identify the flagellar antigens of E. coli that do not express non-typeable H antigens and presenting the virulence factors associated with different diseases. This identification was performed initially by gene amplification of the fliC, (flagellin protein) by the polymerase chain reaction (PCR) in all 53 standards E. coli strains for the H antigens and 20 non-typeable H-antigens E. coli strains, being then, the amplicons were digested by restriction enzymes. Anti-sera were produced in rabbits, those strains that showed different restriction profiles of these patterns observed for the nontypeable H antigens E. coli strains. Agglutination testes were carried out against the 53 antigens standards, against the homologous antigen and H antigens of the non-typeable strains. DNA sequences were compared to different fliC genes stored in the database of the National Center for Biotecnology Information (NCBI) through the BLAST, and ClustalW program was used to align the sequences. The results showed that although these strains have homology with a standard H-antigen, they do not have the same nucleotide sequence and did not phenotypically reacted with the antiserum expected. The data obtained showed that thirteen strains had a different H antigen those already described in the literature when used the techniques of PCR-RFLP and/or serology. / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

A urbanização e a ocupação de espaços de uma forma desordenada podem contribuir para mudanças importantes no ambiente, favorecendo a poluição e o uso de recursos naturais e contribuindo para a proliferação de algumas doenças parasitárias, em especial doenças transmitidas por água e vetores. A esquistossomose é uma dessas doenças, causada por um parasito trematódeo, Schistosoma mansoni, que requer um caramujo de água doce para servir como hospedeiro intermediário. Esta é uma doença de larga distribuição e representa um importante problema de saúde pública no Brasil. Este estudo foi realizado em Pindamonhangaba, cidade situada no Vale do Paraíba, onde os primeiros casos de esquistossomose foram notificados em 1955; com grandes campos de arroz e diferentes tipos de atividades agrícolas, fazendo uso de riachos e canais de irrigação, a região apresentava alguns aspectos ambientais que favoreciam a proliferação de caramujos, que costumavam lançar no ambiente aquático grande número de cercárias, tendo em vista as precárias condições sanitárias da população e a contaminação ambiental. O objetivo do presente estudo foi verificar a ocorrência e a distribuição dos casos de esquistossomose nas diferentes localidades da cidade, relacionando os dados colhidos nos últimos 15 anos (1992 a 2006) com as transformações ambientais observadas. Um total de 275 casos foram notificados no período estudado, e as localidades com maior número de casos foram Colméia e Mombaça, respectivamente com 144 e 29 casos. Os índices de prevalência, em 100.000 habitantes, variaram de 57,24 a 3,58, respectivamente em 1992 e 2005. Uma baixa prevalência também foi observada no inquérito soro-epidemiológico realizado com crianças de 2 a 4 série do ensino fundamental, nas escolas situadas em localidades que historicamente representavam áreas de risco para a doença; do total de 544 amostras de sangue submetidas ao teste sorológico para detecção de anticorpos anti-Schistosoma, apenas uma foi reagente. A redução do número de casos de esquistossomose pode estar relacionada às mudanças nos hábitos da população e aos processos de urbanização, com a substituição de atividades agrícolas para as relacionadas com o comércio e a indústria; foi observada a mecanização dos arrozais e substituição do cultivo por áreas de pastagens. Melhorias nas condições de saneamento básico, associada ao aumento do índice escolar também contribuíram para o controle da esquistossomose. / The urbanization and the occupation of spaces in a disordered way can contribute for important changes in the environment, favoring the pollution and the use of natural resources, and contributing for the proliferation of some parasitic diseases, in special waterborne and vector-borne diseases. Schistosomiasis, one of these diseases, is caused by a trematode parasite, Schistosoma mansoni, which requires a freshwater snail to serve as intermediate host. This is an illness of large distribution and represents an important problem of public health in Brazil. This study was carried out in Pindamonhangaba, city located in the Valley of the Paraíba river, where the first cases of schistosomiasis were reported in 1955; with great irrigated rice fields and different types of agricultural activities, requiring streams and irrigation channels, the region showed some environmental aspects that favored the proliferation of snails, which used to shed high number of cercariae, due to the poor sanitation conditions of the population and contamination of the environment. The objective of the present study was to verify the occurrence and distribution of schistosomiasis cases in the different localities of the city, by relating the data collected in the last 15 years (1992 to 2006) with the observed environmental transformations. A total of 275 cases were notified in the studied period, and the localities with higher number of cases were Colméia and Mombaça, respectively with 144 and 29 cases. The prevalence indices, in 100.000 inhabitants, varied from 57.24 to 3.58, respectively in 1992 and 2005. A low prevalence was also observed in a sero-epidemiological survey conducted with children from 2nd to 4th elementary school levels, living in localities historically considered as areas of risk for the disease; from the total of 544 blood samples submitted to detection of anti-Schistosoma antibodies, only one showed to be positive. The reduction in the number of schistosomiasis cases can be related to the changes in the habits of the population and the urbanization processes, with substitution of the agricultural activities for those related to the business and the industry; it was observed the mechanization of the rice fields and substitution of the farming for pastures areas. Improvements in the basic sanitation conditions, associated to the increasing of the scholar index can also be contributed for the control of the schistosomiasis.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-28T12:32:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2014-11-28T13:14:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-28T13:14:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Emerth Mayra Hungria Pinto - 2013.pdf: 1722909 bytes, checksum: e6a82b8a35ca4753b2bb8ca10dd21280 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2013-02-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The development of laboratory tests applicable for the diagnosis/classification of the different clinical forms of leprosy is considered a research priority. The completion of Mycobacterium leprae genome together with new gene cloning/expression techniques and new bioinformatic tools have promoted the production and availability of new M. leprae recombinant proteins for immunologic assessment. Goal: This study assessed the serologic reactivity to M. leprae recombinant proteins among leprosy patients and controls from two hiperendemic regions in Brazil: “Rondonópolis/MT” and “Vila do Prata/Igarapé-Açú/PA” (former leprosy colony). Material and Methods: IgG antibodies to M. leprae recombinant proteins (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) and IgM antibodies for the PGL-I synthetic trissacaride (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) were detected by ELISA. The following study groups were included (n=847): newly diagnosed untreated leprosy patients (paucibacillary- PB and multibacillary- MB), household contacts of MB patients (HHC), healthy endemic controls (EC) and former MB that concluded leprosy multidrug therapy (MDT) (post MDT). Results: Among participants from Rondonópolis/MT (n=764), the seropositivity of MB patients (n=58) was 59% for 92f, 81% for 46f, 89% for LID-1, 84% for ML0405; 83% were anti-PGL-I positives. Among 10 anti PGL-I negative MB patients, 5 recognized LID-1 e 4 had IgG antibodies to 92f, 46f and ML0405. Among PB leprosy patients (n=93) seropositivity rates to M. leprae recombinant proteins ranged from 5-16%; 8% were anti PGL-I positives. In the HHC (n=192) and in the EC groups (n=282) low reactivity rates were detected ranging from 3-7%. For the post MDT group, positivity rates ranged from 17-45%. Among participants from “Vila do Prata” 3-8% of HHC were seropositives for recombinant proteins; 11% were anti- PGL-I positives. In the post MDT group from “Vila do Prata” (n=47) 33-50% were seropositives for recombinant proteins. Conclusion: High positivity rates to M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 were detected among MB leprosy patients with different genetic/ethnic profiles from distinct geographical regions. These results indicate that the development of a serologic test for leprosy employing both M. leprae recombinant proteins and PGL-I can potentially detect the majority of MB patients from different hiperendemic regions. The use of this diagnostic tool by the public health system can contribute for the early diagnosis and treatment of MB disease which are crucial for the control/elimination of leprosy in Brazil. / O desenvolvimento de testes laboratoriais para o diagnóstico/classificação das diferentes formas clínicas da hanseníase é tema prioritário em pesquisa. O sequenciamento completo do genoma do Mycobacterium leprae, avanços em técnicas de clonagem e expressão gênica e novas ferramentas de bioinformática promoveram a produção e a disponibilidade de novas proteínas recombinantes para avaliação imunológica. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar reatividade sorológica a proteínas recombinantes do M. leprae em pacientes com hanseníase e controles de duas áreas hiperendêmicas para hanseníase do Brasil: Rondonópolis/MT e Vila do Prata/Igarapé-Açú/PA. Materiais e Métodos: A presença de anticorpos IgG para as proteínas recombinantes do M. leprae (92f, 46f, LID-1, ML0405 e ML1213; 2 g/ml) e IgM para o trissacarídeo sintético do PGL-I (NT-P-BSA; 0.01 g/ml) foi avaliada por ELISA. Os grupos de estudo incluíram (n=847): pacientes recém diagnosticados com hanseníase (paucibacilar- PB e multibacilar- MB) virgens de tratamento, contatos domiciliares de MB (CD), controles saudáveis de área endêmica (CS) e casos antigos de hanseníase MB que concluíram a multidrogaterapia (MDT) (pós MDT). Resultados: Entre os participantes de Rondonópolis/MT (n=764), a soropositividade de pacientes MB (n=58) foi de 59% para 92f, 81% para 46f, 89% para LID-1, 84% para ML0405; 83% apresentaram IgM para PGL-I. Dentre 10 pacientes MB soronegativos para PGL-I, 5 reagiram com LID-1 e 4 reconheceram 92f, 46f e ML0405. Entre os pacientes PB (n=93) as taxas de sororeatividade para as proteínas recombinantes variaram de 5-16% e 8% apresentaram sorologia anti- PGL-I positiva. Nos CD (n=192) e CS (n=282) as taxas de reatividade variaram de 3-7%. No grupo pós MDT as taxas de positividade variaram de 17-45%. Na Vila do Prata a taxa de positividade para as proteínas recombinantes nos CD (n=36) variou de 3-8% e 11% dos CD apresentaram anticorpos anti-PGL-I. Entre os indivíduos pós MDT (n=47) as taxas de reatividades variaram de 33-50%. Conclusões: Taxas de positividade acima de 80% foram detectadas para proteínas recombinantes do M. leprae- 46f, ML0405 e LID-1 em pacientes com hanseníase MB com diferentes características genéticas/ étnicas de distintas regiões geográficas. Estes resultados indicam que o desenvolvimento de um teste sorológico para hanseníase que associe proteínas recombinantes e PGL-I tem o potencial de detectar a grande maioria dos pacientes MB provenientes de diferentes regiões hiperendêmicas. O uso deste teste pelo sistema de saúde pública poderá contribuir para o diagnóstico e tratamento precoces da hanseníase MB que são cruciais para o controle/eliminação da doença no Brasil.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-27T11:53:11Z No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-12-27T11:57:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-27T11:57:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Emerith Mayra Hungria Pinto - 2016.pdf: 2353103 bytes, checksum: b1bbe820e4f67491cf8298bcd67dc8b5 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-11-11 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / This thesis concerns two immunologic issues which are relevant for leprosy control activities: laboratory diagnosis of paucibacillary leprosy/PB and evaluation of the prognostic value of Mycobacterium leprae specific serology for leprosy reactions. Immunodiagnostic laboratory tests for PB leprosy (PB) depend on cellular immunity and these tests and this study evaluated a whole blood assay/WBA prototype using antigen combinations in PB and multibacillary leprosy patients (MB) and controls from two Brazilian endemic regions (Goiânia/GO and Fortaleza/CE). The M. leprae specific cellular immunity was evaluated by WBA using heparinized tubes containing different antigen combinations: 46f+LID-1 and ML0276+LID-1; controls: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. After 24 hours incubation (37°C, 5% CO₂) plasma was collected and ELISA used to detect IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) and CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Newly diagnosed, untreated leprosy patients (MB, n=30, PB, n=38) and controls (27 household contacts/HHC, 61 endemic controls/EC) were tested. The new platform in tube validated previous IFNγ results obtained in culture plates. Production of IFNγ to 46f+LID-1 was detected in 84% PB patients, 55% HHC; for ML0276+LID-1: 71% PB, 55% HHC. For both antigen combinations, the IFNγ response of PB leprosy patients differed from the EC (p<0.0001), however the response in PB leprosy and HHC was similar (p>0.05). Studies in tuberculosis/TB have shown that the CXCL10 response differentiate individuals with active TB from those with latent Mycobacterium tuberculosis infection. In leprosy, CXCL10 levels did not differentiate PB leprosy from HHC. Despite this limitation, our results show that WBA in tube could be a supplementary tool in assessing M. leprae infection rates and evaluating the impact of control measures. The application of leprosy serology as a predictor for the occurrence of leprosy reactions observed during clinical monitoring post treatment was evaluated by ELISA tests to detect M. leprae-specific antibodies, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 and IgM and IgG anti ND-O-LID. Serum samples from 452 patients were tested and these patients participated of Clinical Trial for Uniform Multidrug Therapy Regimen for Leprosy Patients in Brazil/U-MDT/CT-B who were clinically monitored for more than six years post treatment for the development of leprosy reactions. Serological tests were performed in samples collected in untreated patients at diagnosis (baseline) and the results were analyzed taking into account the clinical outcome post treatment (reaction and reaction-free). Reactional patients (RR and ENL) had higher seropositivity rates and optical density/OD medians for PGL-I, LID-1 and ND-O-LID compared to reaction-free patients (p<0.0001). In leprosy, both the development of reactions and the serologic response are strongly influenced by the patients’ bacillary index (BI) and a positive correlation was found between both the BI and the proportion of reactional patients and the antibody levels. Negative BI group: 10% reactional patients, intermediary BI (>0<3): 50% reactional patients, high BI (>=3): 66% reactional patients. The serological results stratified according to the BI showed: in BI negative patients higher anti-PGL-I levels in RR patients compared to reaction-free ones (p=0.014); group IB> 0<3: reactional patients (RR) showed higher anti-PGL-I (p=0.014) and anti-LID-1 (p=0.035) antibody levels compared to reaction-free patients; group IB => 3: patients who developed ENL showed higher levels of anti-LID-1 antibodies (p=0.028) when compared with reaction-free ones. The accuracy of a serological test to predict the occurrence of leprosy reactions as determined by ROC curve showed that only anti-PGL-I serology provided limited value to predict RR (area-under-the-curve/AUC=0.702). The anti-PGL-I serology showed low sensitivity for RR prognosis, indicating the need to identify other plasma biomarkers for prediction of RR. In patients who developed ENL during follow-up was observed high positivity in the anti-LID-1 serology at diagnosis indicating the potential application of serology in the identification of patients at higher risk of developing ENL. / Esta tese aborda dois temas imunológicos importantes para o controle da hanseníase: diagnóstico laboratorial da hanseníase paucibacilar/ PB e valor prognóstico da sorologia específica para Mycobacterium leprae para reações hansênicas. O diagnóstico laboratorial da hanseníase PB se baseia em testes que avaliam a imunidade celular e este estudo avaliou um protótipo de ensaio de sangue total/EST com combinações antigênicas do M. leprae em pacientes multibacilares-MB e PB e controles de duas regiões endêmicas (Goiânia/GO e Fortaleza/CE). A avaliação da imunidade celular específica se baseou em EST em tubos heparinizados contendo diferentes combinações de antígenos do M. leprae: 46f+LID-1 e ML0276+LID-1; controles: PBS, PHA, MLCS-M. leprae cell sonicate, PPD. Após 24 horas de cultura (37ºC, 5% CO₂), o plasma foi coletado e ELISA utilizado para mensurar IFNγ (QuantiFERON/Qiagen, cut-off: 50pg/mL) e CXCL10 (Sigma-Aldrich®, St. Louis, Missouri, USA, cut-off: 500 pg/mL). Pacientes com hanseníase, recém diagnosticados, não tratados (30 MB, 38 PB) e controles (27 contatos domiciliares/CD, 61 controles saudáveis/CS) foram avaliados. A nova plataforma de tubos foi validada demonstrando produção de IFNγ similar a obtida em placas de cultura. A produção específica de IFNγ para a combinação 46f+LID-1 foi: 84% pacientes PB, 55% CD; para ML0276+LID-1: 71% PB, 55% CD. Para ambas as combinações antigênicas a resposta de IFNγ em pacientes PB diferiu da obtida para os CS (p<0,0001), contudo foi similar em pacientes PB e CD (p>0,05). Estudos em tuberculose/TB mostraram que a produção de CXCL10 discrimina indivíduos com TB ativa daqueles com infecção latente pelo Mycobacterium tuberculosis. Avaliamos na hanseníase se a produção de CXCL10 é capaz de diferenciar pacientes PB/infecção ativa de CD com infecção “latente”, assintomática. Nossos resultados mostraram produção de CXCL10 induzida por combinações antigênicas do M. leprae, entretanto sem diferenciar resposta de infecção ativa em PB de infecção assintomática em CD. Apesar desta limitação, nossos resultados mostram que o EST em tubo poderia ser uma ferramenta para avaliar as taxas de infecção PB pelo M. leprae e o impacto das medidas de controle. A aplicabilidade da sorologia específica para hanseníase como ferramenta preditora de reações hansênicas foi avaliada por ELISA para detectar anticorpos para específicos do M. leprae, IgM anti PGL-I, IgG anti LID-1 e IgM e IgG anti ND-O-LID Utilizamos amostras de soro de 452 pacientes que participaram do Ensaio Clínico para Avaliação da Eficácia de um Esquema Único de Multidrogaterapia em pacientes com hanseníase no Brasil (U-MDT/ CT-BR) que foram monitorados por mais de 6 anos após o tratamento quanto ao desenvolvimento de reações. Resultados da sorologia realizada em amostras coletadas ao diagnóstico, antes do início da terapia (baseline) foram analisados segundo os desfechos clínicos (ocorrência ou não de reações hansênicas). Independente do tipo de reação (reação reversa/RR ou eritema nodoso hansênico/ENH), pacientes reacionais apresentaram maior soropositividade e medianas de D.O para PGL-I, LID-1 e ND-O-LID comparados com pacientes não reacionais (p<0,0001). Na hanseníase o desenvolvimento de reações e a soropositividade são fortemente influenciadas pelo índice bacilar (IB) do paciente. Nossos resultados corroboram este paradigma mostrando associação positiva do IB tanto com a proporção de pacientes reacionais como com os níveis de anticorpos. Grupo de pacientes com IB negativo: 10% reação, IB intermediário (IB>0<3) 50% reacionais e IB >3, 66% de pacientes reacionais. Os resultados da sorologia, estratificados de acordo com o IB mostrou no grupo com IB negativo que pacientes que desenvolveram RR apresentaram maiores níveis de anticorpos anti PGL-I comparados com pacientes não reacionais (p=0,014); Grupo com IB>0<3: pacientes reacionais (RR) apresentaram maiores níveis de anticorpos para PGL-I (p=0,014) e LID-1 (p=0,035) comparados com pacientes não reacionais; Grupo IB=>3: pacientes que desenvolveram ENH apresentaram maiores níveis de anticorpos anti LID-1 comparados com pacientes não reacionais (p=0,028). De acordo com resultados da curva ROC para avaliar a acurácia de um teste sorológico para prever o desenvolvimento de reações durante o monitoramento, a sorologia anti PGL-I apresentou limitado valor para prever o desenvolvimento futuro de RR (área sob a curva/AUC=0,702). A sorologia para LID-1 mostrou capacidade de prever o desenvolvimento de ENH (AUC= 0,85). A sorologia anti-PGL-I apresentou baixa sensibilidade para prognóstico da RR, indicando a necessidade da identificação outros biomarcadores plasmáticos para predição da RR. Já em pacientes que desenvolveram ENH durante o seguimento apresentaram alta positividade na sorologia anti LID-1 ao diagnóstico, indicando a potencial aplicação da sorologia na identificação de pacientes com maior risco de desenvolver ENH.

A infecção por Cryptosporidium serpentis é uma das enfermidades mais importantes em répteis e se caracteriza por infecção crônica, clínica ou subclínica, e presença de gastrite hipertrófica severa, regurgitação, perda de peso progressiva, mortalidade eventual e eliminação contínua e intermitente de oocistos em fezes. O objetivo deste estudo foi padronizar um teste imunoenzimático (ELISA) indireto para detecção de anticorpos contra C. serpentis, e acompanhar a evolução clínica, parasitológica e da resposta imune humoral em serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis. Foram utilizadas 21 serpentes naturalmente infectadas com C. serpentis e alojadas no Instituto Butantan, São Paulo, Brasil. As análises clínica e parasitológica foram realizadas em 21 serpentes por meio do registro diário dos sinais clínicos apresentados e pesquisa mensal da eliminação fecal de oocistos, em lâminas coradas pela técnica de Kinyoun. A avaliação sorológica foi realizada mensalmente utilizando o ELISA indireto para pesquisa de anticorpos anti-C. serpentis, pelo período de 12 meses em 8 animais, 8 meses em 3 animais e 6 meses em 1 animal. O ELISA indireto foi padronizado em bloco com utilização de antígeno produzido a partir de oocistos de C. serpentis, IgY de galinha anti-gamaglobulinas de serpentes e conjugado contendo IgG de coelho anti-IgY de galinha ligada à peroxidase. Os sintomas clínicos observados foram regurgitação, inapetência alimentar e perda de peso progressiva. A análise parasitológica revelou eliminação de quantidade variável de oocistos, de forma intermitente, em todas as serpentes, com positividade de 92% (116/126). O ELISA indireto apresentou positividade em 42,9% (54/126) das amostras. Foi observada resposta imune humoral na maioria dos animais, no entanto, com presença título flutuante de anticorpos e alternância de resultados positivos e negativos, em um mesmo animal. / Infection by Cryptosporidium serpentis is one of the most important diseases in reptiles, and is characterized by chronic infection, clinical or subclinical, and the presence of severe hypertrophic gastritis, food regurgitation, progressive weight loss, mortality, and intermittent and continuous shedding of oocysts in feces. The objective of this study was to standardize an indirect enzyme immunoassay (ELISA) to detect antibodies against C. serpentis, and evaluate the clinical, parasitological and humoral immune response in snakes naturally infected with C. serpentis. Twenty one snakes naturally infected with C. serpentis and housed at the Instituto Butantan, São Paulo, Brazil, were used for accomplish clinical and parasitological analyzes of C. serpentis infection, through the daily record of clinical signs and monthly survey of fecal shedding of oocysts using Kinyoun staining technique. The serological evaluation was performed monthly using the indirect ELISA for the detection of anti-C. serpentis antibodies, for a period of 12 months in eight animals, eight months in three animals, and six months in one animal. The indirect ELISA was standardized on the basis of block titration using antigen produced from oocysts of C. serpentis, chicken IgY anti-snake gamaglobulins and a conjugate containing rabbit IgG anti-chicken IgY linked to peroxidase. Clinical symptoms consisted in food regurgitation, inappetence, and progressive weight loss. The parasitological analysis revealed intermittent fecal shedding of variable number of oocysts in all snakes, with positivity in 92% (116/126) of the samples. The indirect ELISA was positive in 42.9% (54/126) of the samples. Humoral immune response was observed in most animals, however, fluctuating antibodies levels with rotation of positive and negative results were observed in some snakes.

O Papaya ringspot virus (PRSV) é uma espécie do gênero Potyvirus, sendo que a maioria dos isolados pertence a duas estirpes distintas: "papaya" (P) e "watermelon" (W). O Papaya ringspot virus - estirpe W (PRSV-W) tem sido considerado um dos vírus mais importantes no cultivo de cucurbitáceas pela predominância e pelos prejuízos significativos que causa no Brasil. O controle do mosaico da abobrinha-de-moita, causado pelo PRSV-W, tem sido obtido de forma satisfatória através da premunização com as três estirpes fracas, designadas PRSV-W–1, PRSV-W–2 e PRSV-W-3. O principal objetivo desse estudo foi comparar essas estirpes fracas com estirpes severas PRSV-W-C, PRSV-W-PR e PRSV-W-PE, com base na seqüência de nucleotídeos do gene que codifica a proteína da capa protéica e na mobilidade dessa proteína em SDS-PAGE. A seqüência de nucleotídeos da capa protéica das estirpes fracas PRSV-W-1 e PRSV-W-2 apresentou 100 % de homologia. Quando comparadas com a estirpe fraca PRSV-W-3, a homologia foi de 98 %. As estirpes fracas PRSV-W–1 e PRSV-W–2 apresentaram 95 % de homologia com as estirpes severas PRSV-W-C e PRSV-W-PE. Essas duas estirpes severas, por sua vez, apresentaram respectivamente, 93 e 95 % de homologia com a estirpe fraca PRSV-W-3. O alinhamento das seqüências de nucleotídeos entre as estirpes fracas e as severas evidenciou a inserção de 6 nucleotídeos na região conservada desse gene nas estirpes fracas. Essa inserção refletiu na adição de dois amino ácidos (Asn e Asp) na seqüência de amino ácidos deduzidos dessa proteína. A mobilidade da capa protéica em SDS-PAGE foi semelhante para todas as estirpes estudadas. / Papaya ringspot virus (PRSV), a species of the enus Potyvirus, is classified into two strains: "papaya" (P) and "watermelon" (W). Papaya ringspot virus - type W (PRSV-W) has been considered one of the most important viruses infecting cucurbits in Brazil due to its predominance and significative damage caused on the crops. The control of the disease caused by this virus has been efficiently achieved by means of cross protection with three mild strains, namely PRSV-W-1, PRSV-W-2, and PRSV-W-3. The main purpose of the present study was to compare these mild strains with the severe strains PRSV-W-C, PRSV-W-PR, and PRSV-W-PE, based on the nucleotide sequence of the coat protein gene and on the mobility of the capsid protein in SDS-PAGE. The nucleotide sequence of the coat protein gene of the mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 showed 100 % of homology. When compared with the coat protein gene of the mild strain PRSV-W-3, the homology was 98 %. The mild strains PRSV-W-1 and PRSV-W-2 showed 95 % of homology with the severe strains PRSV-W-C and PRSV-W-PE. These two severe strains, otherwise, showed respectively, 93 and 95 % of homology with the mild strain PRSV-W-3. The alignment of the nucleotide sequences of the mild and the severe strains indicated an insertion of 6 nucleotides in the conserved region of the coat protein gene of the mild strains. This insertion reflected on the addition of two amino acids (Asn e Asp) in the amino acid deduced sequence of this protein. The mobility of the coat protein in SDS-PAGE was similar for all the strains studied.

Os vírus da influenza A (IA) provocam epidemias e pandemias em humanos. As aves selvagens são os reservatórios naturais desses vírus, dentre essas, as migratórias possuem um importante papel como transmissores da doença. A região subantártica abriga populações de aves marinhas, as quais reproduzem-se no verão austral formando colônias com milhares de aves, o que potencializa a importância do estudo do vírus IA em aves marinhas neste ambiente. Os objetivos deste trabalho foram analisar a presença do vírus IA em swabs orotraqueal e cloacal, e de anticorpos anti-IA em soro de aves marinhas da região subantártica, caracterizar molecularmente as amostras positivas, e conhecer mais a ecologia deste vírus. Foram coletadas amostras biológicas de pinguim-papua, pinguim-de-barbicha, pinguim-de-adelie, skua-subantártica, pomba-do-cabo, e petrel-gigante-do-sul, entre 2010-13, nas ilhas Elefante e Rei George. Das 615 amostras de swab, 13 foram positivas por One Step Real Time RT-PCR, e uma foi caracterizada como H6N8. Das 673 amostras de soro, 108 foram positivas por Ensaio Imonoenzimático competitivo (cELISA). O estudo contribuiu para o conhecimento do vírus IA na região e foram feitas recomendações para a prevenção a introdução de patógenos na Antártica. / Influenza A (IA) viruses cause epidemics and pandemics in humans. Wild birds are the natural reservoir of these viruses, among these, migratory ones have an important role as transmitters of disease. The subantarctic region is home to seabird populations, which breed in the austral summer forming colonies with thousands of birds, which enhances the importance of the study of AI viruses in waterfowl in this environment. The objectives of this study were to analyze the presence of IA virus in tracheal and cloacal swabs, and anti-IA antibodies in serum of seabirds from subantarctic region, molecular characterization of positive samples, and learn more about this virus ecology. Biological samples were collected of gentoo penguin, chinstrap penguin, adelie penguin, brown skua, cape petrel, and southern giant petrel, from Elephant and King George islands, between 2010-13.Of the 615 swab samples, 13 were positive by Real Time One Step RT-PCR, and one was characterized as H6N8. Of the 673 serum samples, 108 were positive by competitive enzyme-linked immunosorbent assay (cELISA). The study contributed to AI virus knowledge in the region and recommendations for preventing the introduction of pathogens in Antarctica were made.

Abstract Chlamydia trachomatis epidemic continues at a slowly, albeit steadily increasing rate in the Western world despite health education, easy/user-friendly diagnostic measures, and effective treatment. In Finland, 8,031 and 13,227 C.trachomatis infections were reported in 1995 and 2012, respectively. Over half of the Chlamydia cases were diagnosed among young women, who suffer from the Chlamydia-related complications such as infertility many years after initial infection. The rates of all but first of the following major Chlamydia-related complications: cervical intraepithelial neoplasia, ectopic pregnancy, hospitalized pelvic inflammatory disease, tubal factor infertility have, however, decreased since the 1990s. The aim of this study was to clarify the discordance between the apparently increasing incidence of C. trachomatis and decreasing C.trachomatis IgG antibody rates (seroprevalence). The study material consisted of a random subsample of first trimester serum samples of 7,999 women from the population-based Finnish Maternity Cohort (FMC) registry from 1983 to 2005, and 147,148 women and men with a total of 177,138 C. trachomatis genital infections reported to the Finnish National Infectious Diseases Registry (NIDR) during 1995–2009. Both registries are maintained by the National Institute for Health and Welfare (THL). Serum IgG antibodies were measured by a C.trachomatis major outer membrane protein-specific peptide enzyme immunoassay (EIA) and the standard micro-immunofluorescence (MIF) method. We found that while C. trachomatis seroprevalences decreased >50% among fertile-aged women the seroconversion rates (seroincidences) were comparable to the NIDR reported rates. The numbers of annual repeated C. trachomatis infection in the NIDR increased until 2009 by 49% in women and 39% in men. In 2009, about 25% of the females and 20% of the males had had an earlier C.trachomatis infection. During the whole follow-up time, 34% of all the repeat diagnoses occurred within 12 months. Most of the first infections were observed among females and males under 25 years of age, but the numbers of repeated chlamydial infections increased up to the age of 30 years. The C. trachomatis serotype distribution changed between the 1980s and 1990s, but the leading 1980 serotypes bounced back by 2005. The numbers of women with multiple serotype infections peaked in the 1990s, and serotypes G and J were temporarily replaced by serotypes E and D. In conclusion, the serological observations fit the polymerase chain reaction (PCR) -based data on C. trachomatis epidemiology. The observed increases in the repeated chlamydial infections among young women and men comply with increasing sexual risk-taking behaviour in Finland. Our observations help to understand the discrepancy between C. trachomatis occurrence and sequelae rates as the overall C. trachomatis infection burden in the population may be decreasing despite the increasing incidence trend. / Tiivistelmä Chlamydia trachomatis -epidemia jatkuu yhä länsimaissakin terveyskasvatuksesta, helposta diagnostiikasta sekä tehokkaasta hoidosta huolimatta. Vuonna 1995 maassamme raportoitujen klamydiainfektioiden määrä oli 8 031 ja viime vuonna 13 227. Näistä yli puolet todettiin nuorilla naisilla, joilla klamydian pitkäaikaishaitat, kuten hedelmättömyysongelmat, tulevat esille usein vasta usean vuoden kuluttua. Klamydiainfektioon liittyvät komplikaatiot, eli kohdunkaulan syövän esiasteet, kohdunulkoinen raskaus, vaikea sisäsynnytintulehdus ja munanjohdinperäinen hedelmättömyys ovat ensimmäistä lukuun ottamatta olleet maassamme laskussa 1990-luvulta lähtien. Tämän väitöskirjatyön tarkoituksena oli selvittää klamydian ilmaantuvuuden nousun ja C. trachomatis IgG vasta-ainetasojen laskun välistä ristiriitaa. Väestötasoisen tutkimuksen aineisto koostui äitiseerumipankista (Finnish Maternity Cohort, FMC) vuosilta 1983–2005 satunnaistetusti poimittujen 7 999 naisen verinäytteistä ja kansalliseen tartuntatautirekisteriin vuosina 1995–2009 raportoiduista klamydiatapauksista, joita havaittiin 147&#160;148 naisella ja miehellä yhteensä 177&#160;138 tapausta. Molemmat rekisterit ovat Terveyden ja hyvinvoinnin laitoksen (THL) ylläpitämiä. Klamydia IgG vasta-aineet määritettiin entsyymi-immunologisesti (EIA) sekä mikroimmunofluoresenssimenetelmällä (MIF) verinäytteistä. Keskeisinä tuloksina havaittiin klamydian seroprevalenssin lasku > 50&#160;% hedelmällisessä iässä olevilla naisilla, vaikka infektion ilmaantuvuus serologisessa aineistossa oli samaan aikaan samankaltainen kuin tartuntatautirekisterissä. Lisäksi havaitsimme, että vuositasolla toistuvien klamydiainfektioiden määrä on tartuntatautirekisterin perusteella lisääntynyt tutkimusaikana naisilla 49&#160;% ja miehillä 39&#160;%. Vuonna 2009 neljännes naisten ja viidennes miesten klamydiainfektioista oli uusintainfektioita. Koko seuranta-aikana 34&#160;% toistuvista tapauksista ilmaantui 12 kuukauden sisällä. Suurin osa klamydiainfektioista todettiin alle 25-vuotiailla naisilla ja miehillä, mutta toistuvia infektioita havaittiin vielä runsaasti 30 ikävuoteen asti. Klamydiaserotyyppien jakaumassa tapahtui muutoksia 1980- ja 1990-lukujen välissä, mutta jakauma palautui vuoteen 2005 mennessä samankaltaiseksi kuin 1980-luvulla. Useamman serotyypin infektioiden lukumäärä oli korkeimmillaan 1990-luvulla, jolloin serotyypit G ja J korvautuivat väliaikaisesti serotyypeillä E ja D. Yhteenvetona voimme todeta, että serologiset havaintomme ovat yhteneväisiä polymeraasiketjureaktiolla (PCR) tutkittujen klamydiaepidemiologisten tulosten kanssa. Toistuvien klamydiainfektioiden määrän nousu aineistossamme sopii havaintoon nuorten naisten ja miesten lisääntyneestä seksuaalisesta riskikäyttäytymisestä maassamme. Tutkimustuloksemme auttavat ymmärtämään ristiriitaa klamydian ilmaantuvuuden nousun ja klamydiaperäisten komplikaatioiden laskun välillä, koska kaiken kaikkiaan klamydiaan liittyvä pitkäaikaissairastavuus väestötasolla voi olla vähenemässä.

The climate in the north is changing over time, which affects the nature in many ways. For instance, some microorganisms that cause infections might become more common. This might have negative consequences for reindeer husbandry. In Sweden, this is an industry that is relatively large. However, even though the reindeer is common in the north the knowledge about its diseases is limited.In this study the prevalence of microorganisms that may cause infection in reindeer was investigated. Comparisons between different sami villages and previous studies were performed to detect differences that could occur due to climate changes. The diseases and microorganisms that were analyzed with PCR were malignant catarrhal fever, herpes infections, Chlamydia sp. and bovine viral diarrhea (BVD). The cause of eye problems in reindeer was also investigated. BVD and bovine leukemia virus where analyzed with ELISA. Next generation sequencing where used for broader screening of samples for microorganisms that might be of interest of future analysis in more detailed follow-up studies.Since not enough samples were available at the time of this study findings could not be linked to changing climate. In the reindeer with eye infection Chlamydia sp., Moraxella sp. and Neisseria sp. can probably be involved causing disease. This should be further investigated to be able to determine whether it is true or not by analyzing samples from individuals without changes in the eyes. The prevalence of reindeers with antibodies against BVD has increased in Sweden since 2012. There will be further studies in this field with reindeers from other northern countries.