L'adhérence à la matrice extracellulaire dépendante des intégrines est un processus dynamique et hautement régulé assurant la motilité cellulaire. La protéine ICAP-1alpha interagit avec le domaine cytoplasmique de l'intégrine beta1 et désorganise les adhérences focales in vitro. Comme ICAP-1alpha est absent des adhérences, cette protéine pourrait avoir une action transitoire et finement régulée au niveau de beta1. Dans un premier temps, j'ai pu montrer que ICAP-1alpha ralentit la phase d'assemblage des adhérences en maintenant l'intégrine beta1 en état de faible affinité pour son ligand. De façon surprenante, la régulation négative de l'affinité de l'intégrine beta1 par ICAP-1alpha assure la perception des faibles densités de matrice extracellulaire et l'adaptation de la réponse cellulaire adhésive à cet environnement. ICAP-1alpha agit comme un capteur mécanique qui limite l'assemblage des sites d'adhérence et ralentit la migration et l'étalement des cellules sur des matrices peu denses. Dans un second temps, la voie de signalisation contrôlant l'activité de ICAP-1alpha sur la fonction de l'intégrine beta1 a été caractérisée. ICAP-1alpha possède des sites consensus de phosphorylation dont un reconnu par la protéine kinase dépendante du calcium et de la calmoduline de type II, la CaMKII. Plusieurs évidences révèlent que la CaMKII régule la fonction d'ICAP-1alpha. La phosphorylation d'ICAP-1alpha sur le site reconnu par la CaMKII stimule la liaison de cette protéine sur beta maintient cette intégrine en état de faible affinité pour son ligand et réduit la formation des adhérences focales.

La signalisation cellulaire induite par les r écepteurs à sept domaines transmembranaires (R7TM) contrôle les principales fonctions physiologiques humaines. Ces R7TMs sont cibles de m édicaments et initient de larges réseaux d'interactions. Nous avons modélisé dynamiquement les réseaux de signalisation du récepteur à l'hormone folliculo-stimulante (FSH) régulant la fonction de reproduction et du récepteur angiotensine, un R7TM modèle régulant la tension pour comprendre le fonctionnement de ces réseaux et prédire des données inaccessibles expérimentalement. Notre modélisation a utilisé des équations différentielles ordinaires, en assimilant une variable par espèce et un paramètre par constante cinétique. Les paramètres manquant ont été déterminés par optimisation paramétrique. Puis, nous avons d éveloppé un environnement afin de comparer plusieurs algorithmes d'optimisation et de créer une nouvelle méthode hybride plus performante et adaptée à la paramétrisation des réseaux de signalisation.

Le striatum dorsal et le noyau accumbens (NAc) jouent un rôle crucial dans la sélection et l’exécution de mouvements résultant de l’intégration de signaux dopaminergiques et d’informations glutamatergiques sensorielles. A ce jour, les mécanismes moléculaires à travers lesquels la dopamine (DA) régule la plasticité des neurones épineux moyens du striatum (MSNs) sont peu connus. La synthèse des protéines est un événement essentiel requis pour la plasticité synaptique et la mémoire à long terme. Dans de nombreuses régions cérébrales, l’initiation, étant l'étape limitante de la synthèse protéique, est contrôlée par la phosphorylation de facteurs d’initiation de la traduction (eIFs). Notre hypothèse est que la DA pourrait réguler la traduction d’ARNm dans le striatum à travers des mécanismes moléculaires similaires. La première partie de cette thèse visait à étudier le rôle de la DA dans la régulation de la machinerie de traduction dans les MSNs. Pour ce faire, nous avons analysé au niveau du striatum, la phosphorylation de différents eIFs en réponse à l’administration aigue ou répétée de d-amphetamine (d-amph), entraînant une augmentation transitoire ou de longue durée de la transmission dopaminergique, respectivement. Bien que l’administration de la d-amph est associée à une légère augmentation de pS209-eIF4E, l’état de phosphorylation de S1108-eIF4G reste inchangé. En revanche, une forte augmentation de p51-eIF2α a été observée après administration répétée d-amph. Nous démontrons que la phosphorylation de 51-eIF2α est corrélée à une diminution transitoire de la synthèse protéique globale dans le striatum. En outre, la d-amph induit également une importante augmentation de la phosphorylation de la protéine ribosomale S6 (rpS6). Cet effet se produit spécifiquement dans MSNs exprimant le récepteur D1 à la DA et implique la cascade de signalisation AMPc/PKA/DARPP-32, tout en étant indépendant des voies mTORC1/S6K et ERK. La phosphorylation de rpS6 est couramment utilisée pour marquer de l'activité neuronale bien que son rôle biologique dans le cerveau reste énigmatique. Compte tenu sa régulation significative par la DA, la deuxième partie de cette thèse a eu pour but d’acquérir de nouvelles connaissances sur la fonction de la phosphorylation de rpS6 en utilisant un modèle de souris rpS6 déficient de ses sites de phosphorylations, rpS6P-/-. Dans ces souris transgéniques la synthèse protéique globale est normale dans diverses régions du cerveau. Néanmoins, les souris rpS6P -/- présentent une altération de la traduction d'un sous-ensemble de ARNm, ceci sélectivement dans le NAc, suggérant le rôle potentiel de la phosphorylation de rpS6 dans la régulation de la traduction de transcrits bien spécifiques au sein de cette sous-région du striatum. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes engagés par DA pour contrôler la traduction d’ ARNm dans les MSNs du striatum. / The dorsal striatum and the nucleus accumbens (NAc) process dopamine (DA) signals in order to generate appropriate behavior in response to given glutamatergic sensory cues. The molecular mechanisms through which DA promotes long-lasting changes in striatal GABAergic medium-sized spiny neurons (MSNs) are still not fully understood. It is widely accepted that protein synthesis is an essential event required for several forms of synaptic plasticity and long-term memory. In various brain areas, initiation is the rate-limiting step of translation and is regulated through phosphorylation of translation initiation factors (eIFs). Whether DA could regulate mRNA translation in the striatum through similar mechanisms is yet poorly investigated. A first part of this thesis aimed to shed light on the role of DA in the regulation of the translational machinery in MSNs. Here, we measured the phosphorylation state of eIFs following single and repeated in vivo d-amphetamine (d-amph) administration, resulting in a transient or long-lasting increase of the dopaminergic transmission, respectively. Although d-amph exposure slightly enhances the striatal pS209-eIF4E, pS1108-eIF4G remains unchanged. In contrast, a strong increase in p51-eIF2α is observed after repeated d-amph administration. We demonstrate that d-amph-induced p51-eIF2α is associated to a transient decrease in generall striatal protein synthesis. In addition, d-amph markedly increases the striatal phosphorylation of the 40S ribosomal protein S6 (rpS6). This effect occurs selectively in D1 DA receptor (D1R)-expressing MSNs and requires the cAMP/PKA/DARPP-32 cascade but is independent of mTORC1/S6K and ERK signaling. rpS6 phosphorylation is commonly used as a marker for neuronal activity even though its biological role in the brain remains puzzling. Given the significant regulation of striatal rpS6 phosphorylation by DA, the second part of this thesis sought to gain new insights into the function of this post-translational event by using a phosphodeficient rpS6P-/- mouse model. We showed that rpS6P-/- mice display unaltered global protein synthesis in different brain regions. Nonetheless, rpS6P-/- mice exhibit impaired translation of a subset of mRNA selectively in the NAc, pointing to the potential role of rpS6 phosphorylation in the regulation of transcript-specific translation within this striatal sub-region. Overall, the results presented in this thesis provide a better understanding of the mechanisms engaged by DA to control mRNA translation in striatal MSNs.

Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

Les cellules β pancréatiques synthétisent et sécrètent l'insuline, seule hormone hypoglycémiante de l'organisme. Dans le cas du diabète de type 2, du diabète de type 1 et suite à une greffe d'îlots de Langherans, on observe une diminution drastique de cette masse fonctionnelle β. L'hyperglycémie chronique et la libération de cytokines proinflammatoires jouent un rôle cytotoxique prépondérant dans ces phénomènes. Dans le but de préserver ou de restaurer cette masse fonctionnelle β chez les patients diabétiques, notre objectif était d'identifier des outils permettant de protéger des effets délétères de l'hyperglycémie chronique et des cytokines proinflammatoires, en s'intéressant à 3 cibles potentielles. Nous montrons tout d'abord que les activités du système ubiquitine protéasome (UPS), impliqué dans la dégradation de protéines, sont altérées en condition d'hyperglycémie chronique. Ces altérations sont corrélées à l'émergence d'un programme apoptotique au sein des cellules β. L'activation du récepteur du GLP-1 (Glucagon-Like Peptide-1), stratégie thérapeutique majeure dans le diabète de type 2, protège l'UPS des effets délétères de l'hyperglycémie chronique. Le facteur de transcription CREB (cAMP Response Element Binding Protein), essentiel pour la survie et la fonction des cellules β, est dégradé par l'hyperglycémie chronique et l'inflammation. Nous montrons que la prévention de sa dégradation prévient les effets de l'hyperglycémie chronique, mais pas de l'inflammation. Ces observations nous ont amenés à étudier la MAP3 kinase Tpl2 (Tumor progression locus 2), impliquée, notamment via l'activation de ERK1/2 (Extra-cellular Regulated Kinases 1/2), dans les processus inflammatoires d'autres types cellulaires. Nous montrons que Tpl2 est exprimé dans la lignée cellulaire β INS-1E, et dans les îlots murins et humains, et qu'elle gouverne spécifiquement l'activation des kinases ERK1/2 induite par les cytokines proinflammatoires IL-1β, TNFα et IFNγ. Cette protéine est surexprimée dans des conditions d'inflammation (in vitro et modèle de diabète murin). L'inhibition de Tpl2 protège contre l'apoptose induite par les cytokines, dans les INS-1E et les îlots de souris et restaure la capacité sécrétrice d'insuline des ilots de souris altérée suite à une exposition aux cytokines. En combinaison avec un analogue du GLP-1, l'inhibition pharmacologique de cette kinase protège totalement contre les effets délétères des cytokines sur la fonction et la survie des îlots humains. Ces données suggèrent que l'inhibition pharmacologique de la kinase Tpl2, seule ou en combinaison avec un analogue du GLP-1, pourrait constituer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour protéger contre l'altération de la masse fonctionnelle β pouvant survenir chez des patients diabétiques de type 2 ou après la transplantation d'îlots. / Pancreatic β cells synthesize and secrete insulin, the sole hormone of the organism able to reduce glycemia. In the course of type 2 and type 1 diabetes, and after islet transplantation, there is a drastic loss of function and mass of these cells. Among the common origins of this decrease, chronic hyperglycemia and the release of proinflammatory cytokines play major roles. With the aim to preserve or to restore this functional β cell mass in diabetic patients, our objective was to identify tools able to protect against deleterious effects of these two phenomenons, interesting in three potential targets. We first demonstrated that the ubiquitin-proteasome system (UPS) activities, that degrade proteins, are altered in β cells exposed to chronic hyperglycemia, and correlated with apoptosis. Activation of the GLP-1 (Glucagon-Like Peptide-1) receptor, a key therapeutic strategy in type 2 diabetes, protects UPS from deleterious effects of chronic hyperglycemia. The transcription factor CREB (cAMP Response Element Binding Protein), crucial for β cell survival and function, is involved in deleterious effects of chronic hyperglycemia and inflammation. We demonstrated that prevention of CREB degradation protects β cells from chronic hyperglycemia, but not from the deleterious effects of the proinflammatory cytokines. These observations prompted us to study the MAP3 kinase Tpl2 (Tumor progression locus 2), known to be implicated in inflammatory process in other cell types, through the activation of the kinases ERK1/2 (Extra-cellular Regulated Kinases 1/2). We showed that Tpl2 is expressed in INS-1E clonal β cells and in mouse and human islets, and that it governs specifically the activation of ERK1/2 in response to proinflammatory cytokines IL-1β, TNFα and IFNγ. This protein is overexpressed by inflammatory conditions and in a rat type 2 diabetes model. Inhibition of Tpl2 protects against cytokine-induced apoptosis in INS-1E and in mouse islets. Furthermore, the capacity of mouse islets to secrete insulin in response to glucose, that is altered by a chronic exposure to cytokines, is restored by Tpl2 inhibitor. Finally, we showed that in combination with GLP-1 analog (Exendin-4), Tpl2 inhibitor can entirely restore the survival and function in human islets cultured in pro-inflammatory conditions. These results suggest that pharmacological inhibition of Tpl2, alone or in combination with Exendin-4, may be novel therapeutic strategies to alleviate β-cell failure observed in Type 2 diabetes and islets transplantation.

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Depuis la découverte de la première protéine possédant une activité tyrosine kinase (protein tyrosine kinase [PTK]) dans les années 1980, l’importance des PTKs et de la phosphorylation sur résidu tyrosine dans la régulation des événements de signalisation intracellulaire est bien établie. Quant aux protéines qui possèdent une activité tyrosine phosphatase (protein tyrosine phosphatase [PTP]), dont l’existence n’a été dévoilée qu’une dixaine d’années plus tard, elles ont longtemps été perçues comme des enzymes dont le rôle ne se résumait qu'à contrecarrer passivement les activités des PTKs. Il est maintenant clair que les activités des PTPs sont spécifiques, hautement régulées, et qu’elles doivent être coordonnées avec celles des PTKs pour une régulation adéquate des événements de signalisation intracellulaire. En dépit de cette évidence, la contribution des PTPs à la régulation des différents processus physiologiques fondamentaux demeure encore peu caractérisée. C’est le cas, notamment, de l’angiogenèse, le processus par lequel de nouveaux vaisseaux sanguins sont formés à partir de ceux préexistants. Le VEGF (Vascular endothelial growth factor), un des facteurs angiogéniques les plus importants, est connu pour induire majoritairement ses effets biologiques via l’activation du récepteur à activité tyrosine kinase VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). Puisque l’angiogenèse est impliquée dans le développement d’une multitude de pathologies, dont la progression tumorale, une meilleure caractérisation des PTPs qui assurent la qualité de la réponse angiogénique en agissant de pair avec le VEGFR2 s’avère cruciale et ce, afin de raffiner les outils thérapeutiques actuels. L’expression de la PTP DEP-1 corrèle avec la déphosphorylation du récepteur VEGFR2 localisé au niveau des jonctions cellules-cellules et contribue à l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales en réponse au VEGF lorsque les cellules sont à confluence. Par contre, la contribution spécifique de DEP-1 à la régulation des voies de signalisation et des réponses biologiques induites par le VEGF demeurait toujours inconnue. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse démontrent tout d’abord que DEP-1 régule négativement l’activité tyrosine kinase de VEGFR2 en déphosphorylant spécifiquement les résidus tyrosine Y1054/Y1059 de sa boucle d’activation. Cette déphosphorylation mène par conséquent à une diminution générale de la phosphorylation du récepteur et à une atténuation de la plupart des voies de signalisation induites par le VEGF, incluant la voie mitogénique PLCγ-ERK1/2. Par ailleurs, malgré ce rôle négatif global, nos travaux révèlent étonnement, et pour la première fois, que DEP-1 contribue d’une manière positive à la promotion de la survie des cellules endothéliales via l’activation de la voie Src-Gab1-Akt en aval du récepteur VEGFR2. Ce pouvoir pro-survie de DEP-1 dans les cellules endothéliales réside avant tout dans sa capactié à déphosphoryler la tyrosine inhibitrice de Src (Y529). Au cours de notre étude, nous avons pu identifier deux résidus tyrosine au niveau de l’extrémité carboxy-terminale de DEP-1, Y1311 et Y1320, dont la phosphorylation est dépendante de Src. Nos travaux révèlent par ailleurs que ces deux résidus tyrosine phosphorylés lient le domaine SH2 de Src et que la Y1320 est principalement requise pour l’activation de Src et d’Akt en réponse au VEGF dans les cellules endothéliales. Ces résultats constituent donc une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels DEP-1 peut réguler le programme angiogénique dépendant du VEGF. De plus, cette découverte d’un rôle positif pour DEP-1 dans la survie des cellules endothéliales pourrait mener à l’élaboration de nouvelles approches thérapeutiques visant à inhiber cette fonction spécifique de DEP-1 pour bloquer l'angiogenèse pathologique. / Since the discovery of the first protein tyrosine kinase [PTK] in 1980, the importance of these proteins and of tyrosine phosphorylation cascades in the regulation of intracellular signaling events has been well-established. The protein tyrosine phosphatases [PTPs], whose existence was only revealed ten years later, have been regarded for a long time as passive PTKs conteracting enzymes. It is now evident that PTPs activities are specific, exquisitely regulated, and that they have to be coordinated with PTKs activities for an appropriate regulation of intracellular signaling events. Despite these findings, the contribution of PTPs to the regulation of many fundamental physiological processes is not well-characterized. This is the case of angiogenesis, the process whereby new vessels are generated from pre-existing ones. Vascular endothelial growth factor (VEGF), one of the most important angiogenic factors, is known to induce its biological effects mainly by activating VEGFR2 (Vascular endothelial growth factor receptor 2). As angiogenesis is involved in the development of a multitude of pathologies, including tumoral progression, a better characterization of PTPs, which ensure the quality of the angiogenic response by acting together with VEGFR2, is crucial to refine current therapeutic tools. Expression of a PTP called DEP-1 correlates with dephosphorylation of VEGFR2, and contributes to the inhibition of VEGF-induced endothelial cell proliferation at high cell confluence. However, the specific contribution of DEP-1 to the regulation of signaling pathways and biological responses induced by VEGF remained unknown. The research presented in this thesis demonstrates that DEP-1 negatively regulates the tyrosine kinase activity of VEGFR2 by dephosphorylating the specific tyrosine residues Y1054/Y1059 in its activation loop. Consequently, this leads to a global decrease in the phosphorylation of the receptor and to a reduced activation of most of the signaling cascades induced by VEGF, including the mitogenic PLCγ- ERK1/2 pathway. Moreover, despite this negative role, our work reveals for the first time that DEP-1 contributes in a positive way to promote the survival of endothelial cells via the activation of the Src-Gab1-Akt pathway downstream of VEGFR2. This survival function of DEP-1 in endothelial cells is accomplished by the dephosphorylation of the Src inhibitory tyrosine (Y529). During our study, we identified two residues in the carboxy-terminal tail of DEP-1, Y1311 and Y1320, whose phosphorylation is dependent on Src. These two phosphorylated tyrosine residues bind to the SH2 domain of Src, and our work also revealed that mostly Y1320 is required for Src and Akt activation upon VEGF stimulation of endothelial cells. These findings represent a major step forward in our understanding of the molecular mechanisms by which DEP-1 may regulate the VEGF-dependent angiogenic program. Moreover, the discovery of a positive role for DEP-1 in the survival of endothelial cells could lead to the development of new therapeutic approaches to inhibit this specific function of DEP-1 in order to block pathological angiogenesis.

L'étirement est un stimulus hypertrophique qui active de nombreuses voies de signalisation similaires à celles mises en évidence lors de l'étude de l'hypertrophie cellulaire. L'objectif principal de mon travail de thèse était de caractériser les évènements moléculaires impliqués dans l'activation des MAPKinases (MAPK), ERK et JNK lors de l'étirement. Nous avons étudié ces protéines par 2 approches différentes. D'une part, nous nous sommes intéressés aux rôles de protéines potentiellement nécessaires à l'activation des MAPK. D'autre part, nous avons cherché à mettre en évidence des interconnexions moléculaires entre les différentes voies de signalisation activées par l'étirement cellulaire, en montrant notamment la formation de complexes protéiques nécessaires à l'activation des différents partenaires. Nous montrons ainsi que deux protéines à activité tyrosine kinase, l'Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) et la Proline-rich tyrosine kinase 2 (Pyk2), sont respectivement nécessaires à l'activation de ERK et de JNK lors de l'étirement. Ces cascades de transduction peuvent être dépendantes de la petite protéine G Ras. Bien que les voies des MAPK et de PI3K/Akt soient considérées comme indépendantes, nous montrons également que Akt participe à l'activation de ERK par l'étirement. Enfin, nous avons montré la formation d'un complexe Protein Kinase C (PKC)/Calcineurine nécessaire à l'activation et à la translocation de la PKC lors de l'étirement. Cette étude de différentes voies de signalisation et des interactions protéiques apporte une meilleure connaissance des mécanismes activés par l'étirement cellulaire et permet donc de mieux comprendre la signalisation impliquée dans l'hypertrophie ventriculaire

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Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine. / Circulating polymorphonuclear neutrophils (PMN) possess a short half-life and are constantly renewed by the bone marrow to ensure the first-line of defense. Therefore, homeostasis must be maintained through a well-regulated process of apoptosis. Survival of PMN can be regulated by several cytokines as well as conditioned media (CM). Although PMN are crucial for protection against microorganisms, activated neutrophils can lead to severe tissue damage in diseases characterized by chronic inflammation. Indeed, in rheumatoid arthritis (RA), activated PMN contribute to tissue damage by releasing a number of destructive agents. On the other hand, chronic activation of PMN could prevent opportunistic infections present in immunosuppressed patients. This project addresses the isolation and mechanism of action of synovial liquid components on the survival of neutrophils based on previous work (Lagraoui, 1999). Following tangential flow filtration (MW cut off: 30 and 50 kDa), concentrated CM enhanced the viability (75%) of 24-hour cultured human neutrophils isolated from peripheral blood of healthy volunteers (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01) as seen in Lagraoui (1999) previous work. N-terminal protein sequence analysis of the concentrated CM and fractionated conditioned media from previous work revealed 2 known proteins contained in both analysis: albumin, and fetuin. In view of the importance of neutrophiles in immune defense, we compared the benefits of albumin and fetuin to those of granulocytes macrophages-colony stimulating factor (GM-CSF), a growth factor used as an adjunct to cancer chemotherapy. Albumin and fetuin were tested by the AnnexinV-FITC/7-AAD method and displayed an inhibition of neutrophil apoptosis of two to three folds relative to control value. Moreover, albumin (A : 200μM) and fetuin (F : 200μM) rescue human PMN from mutamycin-induced apoptosis, comparable to GM-CSF (GM : 10ng/ml); (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). Albumin also induces cellular signaling pathways activation via PI3-K and ERK, whereas fetuin acts through PI3-K pathway only. They induce the differentiation of HSCs into erythrocytes progenitors BFU-E. In immunosuppressed mice, albumin protects white blood cells depletion induced by cytotoxic agent from spleen and blood. Considering all the benefits of albumin and fetuin, their targeting as an adjunct to cancer chemotherapy could be disappointing in view of their lack of specificity. On the other hand, their multiple benefits could have a major impact on neurodegenerative disorders and ischemic events.