Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2016. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-06-10T13:37:23Z No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-30T11:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_RafaelCorrea.pdf: 2154891 bytes, checksum: 03393fdaa3d815a5abac7e5331e0d318 (MD5) / A Lisofosfatidilcolina (LPC) é um lisofosfolipídio que constitui a membrana plasmática e possui um papel importante na sinalização celular, pois está diretamente associada à albumina e a lipopoliproteínas. A LPC tem um amplo espectro de atividades pró-inflamatórias e exerce um papel fundamental durante a aterosclerose, pois ela é o principal componente fosfolipídio de lipoproteínas de baixa densidade oxidada (oxLDL). Ela também é capaz de induzir a formação de células gordurosas, as quais são componentes celulares fundamentais para o estabelecimento da aterosclerose e recrutamento leucocitário para o sítio desta patologia, induzindo a progressão da doença. No entanto, o papel de LPC na ativação do inflamassoma e na modulação da biogênese de corpúsculos lipídicos (CLs) neste processo ainda é mal compreendido. Este estudo tem por objetivo investigar se LPC é capaz de ativar o inflamassoma NLRP3 e induzir a secreção de IL-1β relacionando com os mecanismos de formação de células gordurosas por meio da análise da biogênese de CLs. Nossos resultados mostraram que a LPC induz um efeito citotóxico em altas concentrações em monócitos e células endoteliais, além de induzir a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e a ativação de caspase-1. A LPC induz a ativação do inflamassoma NLRP3 através da indução da secreção de IL-1β dependente de efluxo de potássio, dano lisossomal, reconhecimento via TLR-2, ativação de PPAR e estabilização das jangadas lipídicas em monócitos humanos e dependentes das caspases-1/11 e do inflamassoma NLRP3 em macrófagos peritoneais de camundongos. Além disso, a LPC induz a translocação do HMGB-1 do núcleo para o citoplasma tanto em células endoteliais quanto em monócitos. Outro resultado importante foi à indução da formação de células gordurosas, via LPC, em monócitos e células endoteliais in vitro, através do aumento da biogênese de CLs de maneira independente do inflamassoma NLRP3 e das caspases-1/11 in vivo. Além disso, as células endoteliais estimuladas com LPC ativam monócitos a se transformarem em células gordurosas, através da indução da biogênese de CL, por mecanismo ainda desconhecido. Portanto, o presente trabalho caracterizou diferentes mecanismos celulares e moleculares envolvidos na formação de células gordurosas, correlacionando-os com as vias de ativação dos inflamassomas e do metabolismo lipídico celular, e que corroboraram para a criação de um microambiente propício ao estabelecimento e manutenção da formação de placas ateroscleróticas. ______________________________________________________________________ ABSTRACT / Lysophosphatidylcholine (LPC) is a major lipid component of plasmatic membrane and has an important role in cell signaling because it is directly associated with albumin and lipoproteins. The LPC has a broad spectrum of pro-inflammatory activity and plays a key role in atherosclerosis, since it is a major phospholipid component of oxidized low density lipoprotein (oxLDL). Furthermore, LPC is also able to induce the formation of foam macrophages, which are the key cell component for the establishment of atherosclerosis and leukocyte recruitment on the site of the pathology. However, the role of LPC in modulating inflammasome activation and lipid droplet biogenesis in this process is poorly understood. This study is aimed to investigate if LPC is capable of inducing inflammasome activation and IL-1β secretion, verify the foam cell formation by analyzing lipid droplet biogenesis and characterize the signaling pathway involved in this process. Our results showed that LPC induces a cytotoxic effect in high concentrations in monocytes and endothelial cells, generation of reactive oxygen species (ROS) and activation of caspase-1. LPC induces activation of the inflammasome NLRP3 by induction of IL-1β secretion dependent of potassium efflux, and lysosomal damage via TLR-2 recognition, PPAR gamma activation and stabilization of lipid rafts in vitro, and caspase-1/11 and NLRP3 inflammasome in vivo assays. Furthermore, LPC induced translocation of HMGB1 from the nucleus towards the cytoplasm in endothelial cells and monocytes. Another important result was the induction of the formation of foam cells by LPC both in monocytes and endothelial cell in vitro assays, by increasing the biogenesis of lipid droplets in a manner independent of the NLRP3 inflammasome and caspase-1/11 in vivo. Additionally, endothelial cells stimulated with LPC activated monocytes to transform into foam cells through induction of lipid droplets biogenesis by unknown mechanism. Therefore, the present study characterized different cellular and molecular mechanisms involved in the formation of foam cells, correlating them with the activation pathways of inflammasomes and cellular lipid metabolism, and corroborated to create a favorable microenvironment for the establishment and maintenance of formation atherosclerotic plaques.

Submitted by RACHEL SANTINI PAULINO null (rachel_santini@hotmail.com) on 2018-04-04T13:58:29Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Mestrado 2.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-04-04T14:13:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 paulino_rs_me_jabo.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T14:13:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 paulino_rs_me_jabo.pdf: 1550212 bytes, checksum: 709a7ceb2f2c96479c741d61c71f0143 (MD5) Previous issue date: 2018-02-23 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O estresse oxidativo causado pela produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) é uma das respostas que as plantas apresentam frente a um estresse ambiental. Nosso objetivo foi avaliar o estresse oxidativo das macrófitas aquáticas Crinum americanum e Spartina alterniflora em duas condições: salinidade e nutrientes que ocorrem no estuário do rio Itanhaém (SP). Raízes e folhas (5 plantas) de C. americanum foram coletadas em cada área (5 amostras/área). O material vegetal para análises de clorofila (a+b), carotenóides, peróxido de hidrogênio (H2O2), malonaldeído (MDA) e enzimas antioxidantes SOD e CAT foram acondicionado em N2 líquido no campo e posteriormente armazenado em freezer a -80 °C. Também foram coletados em cada réplica material vegetal para avaliar o teor de N e P totais da planta e do sedimento Os dados obtidos foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA) e comparados pelo teste de Tukey (p < 0,05). Os resultados obtidos mostraram que: C. americanum e S. alterniflora sofreram maior estresse oxidativo em alto e médio estuário, respectivamente; Os indivíduos de S. alterniflora sofreram maior estresse na área de lançamento de esgoto. / The oxidative stress caused by the production of reactive oxygen species (ROS) is one of the responses that plants exhibit facing environmental stress. Our objective was to evaluate the oxidative stress of the aquatic macrophytes Crinum americanum and Spartina alterniflora under two conditions: salinity and nutrients that occur in the estuary of the Itanhaém river (SP). Roots and leaves (5 plants) of C. americanum were collected in each area (5 samples / area). The plant material for analysis of chlorophyll (a + b), carotenoids, H2O2, MDA and antioxidant enzymes SOD and CAT with platform in N2 without field and liquid in freezer at -80 ° C. Vegetable material was also collected in each replicate to evaluate the total N and P content of the plant and of the sediment. The data were submitted to Analysis of Variance (ANOVA) and compared by the Tukey test (p <0.05). The results showed that: C. americanum and S. alterniflora suffered higher oxidative stress in upper and middle estuary, respectively; The State of São Paulo changes have suffered greater stress in the area of sewage / 2018SLR05032

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-29. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:08Z : No. of bitstreams: 1 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 2 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 3 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 4 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5). Added 1 bitstream(s) on 2015-08-11T03:26:09Z : No. of bitstreams: 5 Publico-12671a.pdf: 457809 bytes, checksum: 35d7f6ecc589fbb39e877e1738e1887f (MD5) Publico-12671b.pdf: 728280 bytes, checksum: 32a141c21db6ea49fb176e1f6dc3df99 (MD5) Publico-12671c.pdf: 1578441 bytes, checksum: ec8da9ba80d717052e7ce5a4dea5ed15 (MD5) Publico-12671d.pdf: 1855087 bytes, checksum: 67b34f9a1e733efa6279c9269310368a (MD5) Publico-12671e.pdf: 132448 bytes, checksum: 7153a9583a94f50f2a56c79c6d7d320a (MD5) / O heparam sulfato (HS) tem importante papel no comportamento celular devido a sua capacidade de interagir com uma variedade de moléculas, tais como fatores de crescimento e enzimas. HS está envolvido na sinalização celular, e a ativação da cascata de sinalização está relacionada com a fosforilação de proteínas citosólicas, que levam à regulação gênica. Estudos anteriores mostram que o sindecam-4 (Syn4), um proteoglicano de heparam sulfato, está envolvido na modulação da adesão celular e na regulação do ciclo celular. Assim, o objetivo deste trabalho foi promover o “knock-down” do Syn4 em células endoteliais, pela utilização de pequenos RNAs em forma de grampo (shRNA) para um melhor entendimento da importância do Syn4 na sobrevivência celular. Células shRNA-Syn4-EC foram comparativamente estudadas com células endoteliais selvagens (EC), com células endoteliais que super-expressam o oncogene ras (EJ-ras-EC) e com células transfectadas com o plasmídeo vazio (mock EC). As diferentes células foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia confocal quanto à expressão da proteína Ras (Ras), integrina b1 (b1), fibronectina (FN), biglicam (Big), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), fator de Von Willebrand (vWF), além do esqueleto protéico do sindecam-4. Os clones foram selecionados por PCRsq para o Syn4 e incorporação de [35S]-sulfato nas cadeias de glicosaminoglicanos. A transfecção não alterou a expressão de vWF que é um marcador de células endoteliais. A expressão do sindecam-4 e incorporação de [35S]-sulfato variou nos diferentes clones de shRNA-Syn4-EC em até 80%. O “knock-down” do Syn4 levou à redução significativa na expressão de Ras, integrina b-1, e fibronectina, quando comparado com células endoteliais selvagens, bem como com EJ-ras-EC. Por outro lado, a super-expressão de Ras levou à superexpressão de Syn4, diminuição da expressão de VEGF e alteração na localização celular da integrina b-1. Além disso, as células shRNA-Syn4-EC apresentam fraca adesão ao substrato, indicando que a ausência de Syn4 leva à alteração nas interações célula-célula e célula-matriz. Todos esses resultados mostram claramente que o Syn4 exerce importante papel na biologia celular. / Heparan sulfate (HS) plays an important role in cell behavior due to its ability to interact with a variety of molecules modulating growth factors and enzymes. HS participates in cellular signaling, and the activation of downstream pathways is related to the phosphorylation of cytosolic proteins leading to gene regulation. Previous studies show that syndecan-4 (Syn4), a heparan sulfate proteoglycan, modulates cell adhesion and is involved in the regulation of cell cycle. Thus the aim of the present work was to promote Syn4 knock down on endothelial cells using small hairpin RNA (shRNA) in order to gather information on its effect on cell behavior. For comparison, shRNA-Syn4-EC cells were simultaneously investigated with wild type endothelial cells (EC), as well as endothelial cells that overexpress ras oncogene (EJ-ras-EC) and a control that was transfected with the empty plasmideo (mock EC). The different cells were evaluated regarding the expression of Ras protein (Ras), b1-integrin (b1), fibronectin (FN), biglycan (Big), vascular endothelial growth factor (VEGF), von Willebrand factor (vWF), besides the core protein for syndecan-4 (Syn4) by flow cytometry and confocal microscopy. Clones were selected through sqPCR for Syn4 and [35S]-sulfate incorporation into heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) chains. Regardless of the transfection, the expression of vWF, an endothelial cell marker, was maintained in all cells, confirming their endothelial origin. The expression of syndecan-4 and incorporation of [35S]- sulfate varied among the different clones of shRNA-Syn4-EC up to 80%. The knockdown of Syn4 lead to significant reduction in the expression of Ras, b-1 integrin and FN, when compared to wild type cells as well as EJ-ras-EC. The overexpression of Ras leads to an overexpression of Syn4 and a decrease in VEGF expression and cellular localization of b-1 integrin. Furthermore, shRNASyn4- EC shows weak adhesion to the substrate, indicating that the lack of Syn4 altered cell-cell and cell-matrix interactions. The combined results clearly show that Syn4 plays an important role in cellular biology. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Botropasina (Bt) é uma toxina isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca, associada a processos inflamatórios. Neste contexto da inflamação como fator desencadeante da angiogênese, verificamos se a botropasina, uma metaloproteinase isolada do veneno da serpente Bothrops jararaca, poderia modular diretamente as transições fenotípicas do processo angiogênico. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os efeitos da Botropasina, domínios DC e peptídeos sintéticos derivados dos domínios DC (Ca II, Ca III e HCR), sobre os eventos da angiogênese como proliferação, migração, secreção de gelatinases, tubulogênese, e os mecanismos moleculares envolvidos no sistema in vitro nas células endoteliais HUVEC-CS. Nossos resultados mostram que tanto as proteínas Bt e DC, e o peptídeo HCR induzem os eventos angiogênicos de proliferação, migração, secreção de MPPs e formação de túbulos em matrigel, e estes são dependentes da dose. Os peptídeos Ca II e Ca III não induziram todas as características próprias da angiogênese. A migração observada tanto nos ensaios 2D, 3D, assim como na expressão do DLL4 e as fibras de estresse do citoesqueleto, sugerem que o tratamento com botropasina e o peptídeo HCR induzem o fenótipo migratório - tip cells nas células endoteliais. A ativação da via de sinalização de Erk via integrinas, seria o mecanismo de sinalização das proteínas Bt e DC, enquanto o peptídeo linear HCR teria um mecanismo de interação direta com receptores intracelulares. O tratamento com a Bt estimula a fosforilação das proteínas Akt, Fak e p38, envolvidas na migração, sobrevida e estresse celular, mas sem alterações na morfologia. A presença de proteínas inflamatórias como vimentina e calistatina nas formas secretada, indica que os tratamentos com as proteínas Bt e DC induzem uma resposta inflamatória nas células endotelias, promovendo os eventos da angiogênese, enquanto o peptídeo HCR se mostra como altamente mitogênico e sem efeitos inflamatórios. / Botrophasin (Bt) is a metalloproteinase isolated from Bothrops jararaca snake venom, an associated with inflammatory processes. In the context of inflammation as a triggering factor of angiogenesis, we tested if botropasin, could directly modulate the phenotypic transitions of the angiogenic process. The objective of this work was to characterize the effects of Botropasin, DC domains and synthetic peptides derived from the DC domains (Ca II, Ca III and HCR), on the events of angiogenesis such as proliferation, migration, gelatinases secretion, tubulogenesis, and molecular mechanisms involved in the in vitro system in HUVEC-CS endothelial cells. Our results show that both Bt, DC proteins, and the HCR peptide induce the angiogenic events of proliferation, migration, MPP secretion and matrigel tubule formation, and these are dose dependent. Ca II and Ca III peptides did not induce all the angiogenesis characteristics. The migration observed in both the 2D and 3D assays, as well as in the expression of DLL4 and cytoskeletal stress fibers, suggests that treatment with bothropasin and the HCR peptide induce the migratory phenotype - tip cells in the endothelial cells. Activation of the Erk signaling pathway via integrins would be the signaling mechanism for Bt and DC proteins, whereas the linear peptide HCR would have a mechanism of direct interaction with intracellular receptors. Treatment with Bt stimulates the phosphorylation of Akt, Fak and p38 proteins, involved in migration, survival and cell stress, but without changes in morphology. The presence of inflammatory proteins such as secreted vimentin and kallistatin indicates that the treatments with Bt and DC proteins induce an inflammatory response in the endothelial cells, promoting the angiogenesis events, whereas the HCR peptide shows to be highly mitogenic and without inflammatory effects.

O câncer é a segunda doença com maior índice de mortalidade no Brasil e ainda é responsável por um elevado número de óbitos em todo o mundo. Durante a tumorigênese ocorrem diversas alterações no genoma, transcriptoma, proteoma, e interatoma que permitem o desenvolvimento da célula maligna. Alterações descritas na via de sinalização PI3K-Akt, tais como ganho de função da quinase PI3K ou perda de função da fosfatase PTEN, levam ao aumento de PIP3 com ativação constitutiva dos alvos downstream, como da quinase Akt. A regulação negativa da Akt pode ser realizada pela fosfatase PP2A, que é inibida pela proteína SET (ou inibidor 2 da PP2A). Existem diversos mecanismos que podem contribuir para a desregulação da sinalização celular e o aumento na quantidade de uma única proteína pode levar ao desequilíbrio no processo. Recentemente, nosso grupo identificou o aumento da proteína SET em diversas amostras de pacientes com carcinoma bucal, que foi associado à ativação da Akt. Sendo assim, o objetivo geral deste trabalho foi caracterizar os potenciais mecanismos de regulação da fosfatase PTEN pelas proteínas SET e PP2A e o papel de PTEN na predisposição ao carcinoma bucal. Para isso, através de vetores de expressão foi identificada dentre outras, a subunidade B56? da PP2A capaz de reduzir os níveis de PTEN fosforilado no resíduo de S380; a interação das proteínas PTEN e PP2A foi confirmada por co-imunoprecipitação (co-IP) e imunofluorescência; a atividade de PP2A e PTEN foram avaliadas frente a expressão de SET e regiões da SET na presença ou não de mutações sítio-específicas; e os níveis de expressão de PTEN foram relacionados ao acúmulo ou silenciamento (siRNA e shRNA) de SET em CECPs e no tratamento com agente hiperacetilante (TSA) e desmetilante (5aza-deoxicitidina). Também foi avaliado o papel de PTEN na expressão de BMAL1 in vitro e in vivo, utilizando animais geneticamente modificados com deleção de PTEN tecido-condicional ao epitélio. Os resultados obtidos sugerem a participação da SET em mecanismos de controle da expressão gênica de PTEN e a participação de PTEN no controle da expressão de BMAL. / Cancer is the second cause of death in Brazil and the oral cancer is among the most predominant cancers worldwide. During tumorigenesis several changes occur in the genome, transcriptome, proteome and interatoma leading to malignant cells development. Some of the more important modifications occur in the PI3K-Akt pathway, such as the loss of PTEN phosphatase function, which increase PIP3 and results in the constitutive activation of downstream targets, including the kinase Akt. PP2A is responsible for the negative regulation of Akt and is inhibited by SET (or Inhibitor 2 of PP2A). Many mechanisms can lead to deregulation of these signaling pathways and the increase in one protein can result in pathway loss of balance. Recently Leopoldino et.al. (2009) identified SET levels increased in oral cancer tissue samples, associate to Akt activation. The main objective of this project is evaluating how PP2A and SET regulate PTEN and its relation to cancer predisposition. For this, expression vectors were used to identify, among others, B56? subunit of PP2A reducing levels of p-PTEN S380; the interaction between PP2A and PTEN was confirmed by co-immunoprecipitation (co-IP) and immunofluorescence; PP2A and PTEN activity were evaluated against expression of SET and SET regions in the presence or not of site-specific mutations; and PTEN expression levels were related to the accumulation or silencing (siRNA and shRNA) of SET in CECPs and the treatment with agents for hyperacetylation (TSA) and demethylation (5-aza-deoxycytidine). The role of PTEN on BMAL1 expression was evaluated in vitro and in vivo, using transgenic animals with tissue-specific deletion of PTEN for epithelium. The results suggest the involvement of SET in control of PTEN gene expression and participation of PTEN in the control of BMAL expression.

Orientadores: Hisroshi Aoyama, Carmen Verissima Ferreira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-12T15:31:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_RobertaReginaRuelade_D.pdf: 21488471 bytes, checksum: e07168c1121fd17c1a2f6c9e820ff8eb (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A busca por compostos que atuem especificamente no tumor e causem menos efeitos colaterais é o grande desafio da pesquisa no tratamento contra o câncer. Muitos compostos naturais extraídos de plantas têm apresentado resultados promissores como agentes moduladores de vias de transdução de sinais em diversos tipos de tumores. Os flavonóides, compostos polifenólicos encontrados em diversos alimentos como frutas, chás e vinhos, têm recebido bastante atenção em função dos seus efeitos quimiopreventivos e quimioterapêuticos. Nos últimos anos, muitos estudos relacionados à ação dos terpenos em doenças foram desenvolvidos, decorrentes das suas propriedades anti-inflamatórias, antimicrobiana, gastroprotetora e antitumoral. Entretanto, poucos estudos com enfoque molecular foram desenvolvidos para entender o mecanismo de indução de morte de células tumorais por tais compostos. O objetivo deste trabalho foi estudar a ação dos flavonóides apigenina e fisetina e do diterpeno ferruginol, sobre as vias de transdução de sinal envolvidas na proliferação e morte em células de leucemia e câncer de próstata. Todos os três compostos estudados levaram à morte das células tumorais por apoptose. As células leucêmicas tratadas com fisetina apresentaram aumento da expressão de NFkB, ativação da MAPK p38 e aumento dos níveis de fosforilação de proteínas. A apigenina, por sua vez, mostrou-se um forte inibidor de quinases, especificamente as envolvidas com a proliferação celular, como PI3K, AKT, Src e MAPK, além de induzir apoptose através da via intrínsica. O ferruginol foi capaz de inibir e/ou regular negativamente PI3K, STAT3 e STAT5, proteínas tirosinas fosfatases e proteínas quinases envolvidas com a regulação do ciclo celular. Em ambiente redutor, o efeito citotóxico do ferruginol foi drasticamente impedido, indicando que sua atividade antitumoral pode estar relacionada com a modulação do status redox. O presente trabalho mostrou que os compostos naturais fisetina, apigenina e ferruginol apresentaram um grande potencial como agentes quimioterápicos. / Abstract: The search for compounds that specifically act on tumors, with low side effects, is a great aim in the studies related to cancer treatment. Many natural compounds isolated from plants have presented promising results as modulating agents of the signal transduction pathways in several types of tumors. Flavonoids, polyphenolic compounds largely distributed in foods such as fruits, teas and wines, have been greatly focused due to their chemopreventive and chemotherapeutic effects. In the last years, many studies about the action of terpenes in diseases have been done, due to their antiinflamatory, antimicrobial, gastroprotective and antitumoral properties. However, few molecular studies have been developed to understand the mechanism of cell death induction by these compounds. The aim of this work was to define the molecular action of apigenin, fisetin and ferruginol on the signal transduction pathways involved in the leukemic and prostate cancer cells proliferation and death. All the three compounds studied provoked the cell death by apoptosis. Leukemic cells treated with fisetin presented an increase of NF?B expression and protein phosphorylation levels and activation of p38 MAPK. Apigenin showed to be a strong inhibitor of kinases involved with cellular proliferation, such as, PI3K, AKT, Src, MAPK and additionally to induce apoptosis via the intrinsic pathway. Ferruginol was able to inhibit and/or to negatively regulate PI3K, STAT3 and 5, protein tyrosine phosphatases and protein kinases involved in the regulation of the cell cycle. In reducing environment, the cytotoxic effect of ferruginol was drastically impeded, which indicates that the anti-tumoral activity of ferruginol might be related to redox status modulation. The present work showed that the natural compounds fisetin, apigenin and ferruginol presented great potential as chemotherapeutic agents. / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Antonio Carlos Boschero / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T00:36:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rezende_LuizFernandode_D.pdf: 9509933 bytes, checksum: fc8e235ac3d4242d8e48c28911285e25 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Introdução: O CNTF pertence à família da IL-6, e sendo assim, sinaliza pelo complexo receptor gp130, ativando diversas vias de sinalização dependendo do tipo celular, principalmente as vias STAT3, MAPK e PI3K. Seus efeitos incluem diferenciação e/ou sobrevivência neuronal, e é diferencialmente expresso ao longo da vida do animal. As ilhotas pancreáticas, por sua vez, são ricamente enervadas e expressam receptores para NGFs, podem apresentar respostas neurotípicas e expressam o CNTF. O objetivo desse estudo foi investigar os possíveis efeitos do CNTF sobre a diferenciação e/ou sobrevivência de ilhotas pancreáticas de ratos neonatos, qual(is) via(s) de sinalização ele ativa nessas ilhotas e como é expresso nelas ao longo da vida dos animais. Material e Métodos: Ilhotas pancreáticas de ratos neonatos (1-2 dias) foram isoladas pelo método de colagenase e cultivadas por 3 dias em meio RPMI com (CNTF) ou sem (CTL) 1nM de CNTF. Após isso, foram analisados a secreção de insulina estimulada por glicose (RIE), metabolismo (MTS, produção de NADPH), metabolismo de glicose (produção de 14CO2), expressão gênica (RTPCR), protéica (Western-Blot), atividade de caspase-3 (DEVD) e apoptose (fragmentação de DNA). Resultados: O CNTF reduziu a secreção de insulina estimulada por glicose e o metabolismo de ilhotas pancreáticas, não alterando o metabolismo de glicose e expressão de proteínas cruciais para a função das ilhotas. Por outro lado, o CNTF aumentou a expressão de proteínas relacionadas à sobrevivência das ilhotas pancreáticas, como Cx36, PAX4, e BCL-2, reduziu a atividade da caspase-3 e a apoptose das ilhotas. O CNTF também aumentou a fosforilação de STAT3, sua translocação ao núcleo e expressão de genes-alvo, como a SOCS-3, levando à redução da GSIS e sobrevivências observadas, apesar de não ativar as vias da MAPK e PI3K. Mais ainda, a expressão do CNTF é aumentada em ilhotas pancreáticas de ratos de 2 meses de idade, e assim permanecendo até os 20 meses de idade. Conclusão: O CNTF não promove a maturação de ilhotas pancreáticas, mas sim sua sobrevivência, e esses efeitos são mediados através da via JAK/STAT3, sem ativar as vias MAPK ou PI3K. Finalmente, o CNTF possui expressão diferenciada ao longo da vida do animal / Abstract: Introduction: CNTF belongs to the IL-6 cytokine family and as such, it signals through gp130 receptor complex, activating many pathways depending on the cell-type, mainly STAT3, MAPK and PI3K. Its effects include increased neuron differentiation and/or survival, and are differentially expressed throughout the animal life. Meanwhile, pancreatic islets are richly innervated and express receptors for NGFs, may undergo neurotypic responses, and express CNTF. The aim of this study was to investigate possible effects of CNTF on neonatal rat pancreatic islet differentiation and/or survival, which signalling pathway (s) it activates on pancreatic islets and how it is expressed in the pancreatic islets throughout the animal life. Methods: Pancreatic islets from neonatal rats (1-2 d old) were isolated by the collagenase method and cultured for 3 days in RPMI medium with (CNTF) or without (CTL) 1nM of CNTF. Thereafter, glucose-stimulated insulin secretion (RIA), general metabolism by (NAD(P)H production) (MTS), glucose metabolism (14CO2 production), gene (RT-PCR), protein expression (Western-Blot), caspase-3 activity (DEVD), and apoptosis (DNA fragmentation) were analysed. Results: CNTF reduced pancreatic islets GSIS and metabolism, whereas not affecting glucose metabolism and the expression of proteins crucial for the islets function. Conversely, CNTF significantly expression of proteins related pancreatic islets survival, such as Cx36, PAX4, and BCL-2, reduced caspase-3 activity and islet-cells apoptosis. CNTF also increases STAT3 fosforilation, translocation to the nuclei and expression of target genes, resulting in the reduced GSIS and survival observed, although not affecting MAPK and PI3K pathways. Moreover, CNTF expression is increased in rats pancreatic islets after 2 months of age, and it remains so until 20 months of age. Conclusion: CNTF has no effect over maturation of pancreatic islets function, whereas it improves pancreatic islets survival, and also that these effects are mediated through JAK/STAT3 but not through MAPK or PI3K pathways. Finally, CNTF is differentially expressed in rat pancreatic islets throughout the animal life / Doutorado / Fisiologia / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Marcelo Ganzarolli de Oliveira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T02:21:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sassonia_RogerioCorte_D.pdf: 2947110 bytes, checksum: fc316c83bed9508d2e27063d89528d56 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: Este trabalho apresenta os resultados da aplicação da titulação calorimétrica isotérmica na caracterização termodinâmica de reações de S-nitrosação de tióis e de interações proteínaproteína e proteína-íon. Foram estudadas as reações de S-nitrosação da N-acetil-L-cisteína (NAC), L-cisteína (CYS), L-glutationa (GLU) e do ácido mercaptosuccínico. Também foram avaliadas as interações entre a proteína sinalizadora Shc (Src homology collagen-like) e as proteínas glutationa S-transferase (GST) e a ciclofilina A (CypA) e a interação entre a região Cterminal da proteína humana EFHC1 (EFHC1-C) com íons Ca e Mg. Os valores da variação de entalpia revelaram que a S-nitrosação é um fenômeno exotérmico e ocorre com diminuição de entropia. Estes dados termodinâmicos revelam que as reações de S-nitrosação investigadas são entalpicamente dirigidas a 25 °C (1 atm) e possuem valores semelhantes de variações de entalpia, entropia e energia livre, apesar das diferenças entre as estruturas químicas dos tióis. Verificou-se que a proteína EFHC1C liga-se tanto a íons Ca quanto Mg numa estequiometria de 1:1, com afinidades definidas por diferentes contribuições entálpicas e entrópicas. Este dado confirmou a existência de um suposto domínio EF-hand ligante de Ca na porção C-terminal previsto pela seqüência primária da EFHC1C. Por outro lado, a EFHC1C perde sua capacidade de interação com íons Ca e Mg em solução sem 1,4-ditiotreitol (DTT), provavelmente, devido à formação de dímeros. A ausência de sinais térmicos de ITC mostrou que nem a proteína GST, nem a proteína CypA interagem com a proteína Shc nas condições experimentais usadas. / Abstract: This work presents the results of isothermal titration calorimetry application in the thermodynamic characterization of thiol nitrosation reactions, protein-protein and protein-ion interactions. The S-nitrosation reactions of N-acetyl-L-cysteine (NAC), L-cysteine (CYS), Lglutathione (GLU) and acid mercaptosuccinic were studied. The interactions of the signaling protein Shc (Src homology collagen-like) with glutathione S-transferase (GST) and ciclofilina A (CypA) and of the EF-hand motif from human EFHC1C with Caand Mg ions were also evaluated. Enthalpy change values revealed that the S-nitrosation reaction is an exothermic phenomenum associated to a decrease in entropy. These thermodynamic data show that the S-nitrosation reactions investigated are enthalpically driven at 25 °C (1 atm) and have similar enthalpic, entropic and free energy change values, despite the differences among the chemical structures of the thiols. It was verified that the EFHC1C protein binds to both Ca and Mg ions in a 1:1 stoichiometry with affinities defined by different enthalpic and entropic contributions. These data confirmed the presence of a putative EF-hand Ca-binding motif at the C-terminal portion as expected by the primary sequence of EFHC1C. On the other hand, EFHC1C losses its ability to interact with Ca and Mgions in solution without 1,4-ditiotreitol (DTT) likely due to protein dimerization. The absence of ITC thermal signals showed that neither GST nor CypA interact with the Shc protein in the experimental conditions used. / Doutorado / Físico-Química / Doutor em Ciências

Orientadores: Eduardo Galembeck, Carmen Verissima Ferreira Halder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T23:42:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milani_Renato_D.pdf: 7268876 bytes, checksum: dfdb9d30aafa024539f758590409a4ca (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A leucemia mieloide crônica, caracterizada principalmente pelo gene de fusão BCR-ABL, ainda necessita de novos tratamentos aos pacientes, como ocorre com outros tipos de câncer. A resistência a quimioterápicos é um dos principais obstáculos a serem superados para o sucesso em seu tratamento. Assim, a identificação dos mecanismos moleculares que promovem e mantêm o fenótipo resistente a múltiplas drogas (MDR) é de extrema importância para a evolução dos protocolos terapêuticos. Contudo, ainda pouco se sabe sobre as vias de sinalização envolvidas nestes eventos. O mapeamento das vias de sinalização nas células resistentes pode gerar informações para o entendimento da resistência, bem como apontar alvos para a intervenção farmacológica. Neste trabalho, apresentamos uma análise comparativa do proteoma e fosfoproteoma das células K562 (célula leucêmica não resistente) e Lucena-1 (célula leucêmica resistente a múltiplas drogas). Diversas ferramentas biocomputacionais foram criadas para auxiliar na análise dos dados, com destaque para uma ferramenta, batizada de PhosphoActivity, capaz de enriquecer conjuntos de dados obtidos a partir de fosfoproteomas com os sítios responsáveis pela ativação e pela inibição das proteínas associadas a cada fragmento fosforilado. Estas ferramentas foram empregadas para reduzir o conjunto de 2209 proteínas e 4257 peptídios fosforilados correspondentes a 2053 fosfoproteínas identificadas por espectrometria de massas. Através da combinação de dados experimentais com predições baseadas em aprendizado de máquina, foram selecionadas 145 proteínas e fosfoproteínas para validação. A seleção inclui fatores de transcrição e proteínas estruturais, como ?-catenina, HDAC6 e o filamento intermediário vimentina. As proteínas e fosfoproteínas identificadas e validadas através de métodos computacionais e experimentais apontaram o envolvimento de vias como a reorganização do citoesqueleto, a proliferação celular e o metabolismo de carboidratos na quimiorresistência de Lucena-1. Além disso, a identificação da proteína tirosina fosfatase LMW-PTP como tendo um papel central na resistência em Lucena-1 aponta a natureza complexa e multifatorial deste processo / Abstract: Chronic myeloid leukemia, characterized by the BCR-ABL fusion gene, still poses challenges to patient treatment. One of them is chemoresistance, a major barrier for successful therapy approaches. Still, the molecular mechanisms responsible for promoting and keeping the multiple drug resistance (MDR) phenotype are largely unknown. The mapping of phosphorylation events in resistant cells may improve disease understanding at the cellular level and suggest new targets for pharmacological intervention. Here we present a comparative analysis of the proteome and phosphoproteome in K562, a chronic myeloid leukemia cell line, and Lucena-1, a K562-derived chemoresistant line. We developed several bioinformatics tools to help analyze the data, such as a phosphoproteomics dataset enrichment tool, titled PhosphoActivity, that is able to retrieve documented sites responsible for the activation or inhibition of the proteins related to each phosphorylated fragment. These tools were employed to sift through 2290 proteins and 4257 phosphorylated peptides corresponding to 2053 phosphoproteins previously identified by mass spectrometry. Combining experimental data with support vector machine-based predictions, we selected 145 proteins and phosphoproteins for validation. The selection includes transcription regulators and structural proteins, such as ?-catenin, HDAC6 and the intermediary filament vimentin. Proteins and phosphoproteins identified and validated through computational and epxerimental methods suggest the involvement of pathways such as cytoskeleton rearrangement, cell lproliferation and carbohydrate metabolism in the chemoresistance of Lucena-1. Furthermore, the identification of LMW-PTP, a protein tyrosine phosphatase, as having a pivotal role in the resistance process in Lucena-1, suggests it as a complex and multifactorial process / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira Halder / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T16:08:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Abrantes_JuliaLauraFernandes_D.pdf: 4562084 bytes, checksum: fba9dbca16cd31c006b311ff23a0b41b (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O melanoma é o tipo mais agressivo de câncer de pele. Seu tratamento permanece como um grande desafio, já que em estágio avançado torna-se extremamente refratário aos tratamentos convencionais. miR-34a é um microRNA supressor de tumor com expressão normalmente reduzida em células cancerosas. A fim de investigar o papel de miR-34a como supressor do melanoma, o principal objetivo deste estudo foi identificar alvos moleculares modulados pela expressão ectópica de miR-34a na linhagem celular de melanoma metastático humano SK-mel-103. miR-34a reduziu significativamente a viabilidade das células de melanoma, o que deve estar relacionado, pelo menos em parte, com o aumento na expressão da proteína pró-apoptótica Bax, ativação da caspase-3 e clivagem da PARP-1. Estes dados sugerem que miR-34a foi capaz de induzir apoptose nas células de melanoma. Além disso, houve redução na expressão de CDK4, CDK6, E2F3 e pRb, proteínas relacionadas com a progressão do ciclo celular. Aumento na expressão de p21, um inibidor de CDKs, também foi observado nessas células. Algumas moléculaschave envolvidas com os processos de proliferação celular e apoptose, como proteínas oncogênicas (Axl, AKT, ERK 1/2, ?-catenina e c-myc) e proteínas supressoras de tumor (p53 e PTEN), foram "down- e upreguladas" por miR-34a, respectivamente. Interessantemente, o fluxo autofágico foi aumentado por miR-34a, efeito que não foi correlacionado com alterações adicionais na viabilidade das células de melanoma. O aumento no fluxo autofágico ocorreu, provavelmente, como uma resposta celular ao estresse de retículo e a agregação de proteínas induzidos por miR-34a, fenômenos que também podem ter contribuído para a indução de apoptose nesse contexto. Os dados obtidos neste estudo trouxeram novos aspectos moleculares da ação de miR-34a como supressor tumoral, e permitem apontar este microRNA como um potencial alvo terapêutico contra o melanoma metastático humano / Abstract: Melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Its treatment remains a big challenge, since in advanced stage it is extremely refractory to conventional treatments. miR-34a has emerged as an important tumor suppressor, and its expression is normally reduced in cancer cells. To provide more information about the role of miR-34a as a melanoma suppressor, the main goal of this study was to identify key molecular players modulated by ectopic expression of this microRNA in the metastatic melanoma cell line SK-mel-103. miR-34a caused a reduction of melanoma cells viability, what may be related, at least in part, with the increased expression of pro-apoptotic marker, Bax, activation of caspase 3 and PARP-1 cleavage, which indicates that miR-34a triggered apoptosis in melanoma cells. In addition, the expression of CDK4, CDK6, E2F3 and pRb, proteins related to the cell cycle progression, was reduced. An increase in p21 expression, a CDK inhibitor, was also detected in these cells. Some key molecules involved with proliferation and apoptosis processes, such as oncogenic proteins (Axl, AKT, ERK 1/2 kinases, ?- catenin and c-myc) and tumor suppressor proteins (p53 and PTEN), were down- and upregulated by miR-34a, respectively. Interestingly, the autophagic flux was stimulated by miR-34a, but this effect was not correlated with further alterations in cell viability. The increased autophagy occurred probably as a cellular response against the reticulum stress and the protein aggregation induced by miR-34a in melanoma cells, which can also be contributing to the cell death by apoptosis in this context. Our findings brought up novel molecular aspects about the role of miR-34a as melanoma suppressor. The broad action of this microRNA on key molecular players of melanoma aggressiveness was crucial for reprogramming these cells in favor of apoptosis. Altogether, this study pointed out miR-34a as a potential therapeutic agent against advanced melanoma / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular