Les lymphocytes T régulateurs (Treg) jouent un rôle majeur dans la modulation de l’alloréactivité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques et permettent notamment de contrôler la réaction du greffon contre l’hôte (GVH) dans des modèles expérimentaux. Le potentiel thérapeutique des Treg est donc très important dans ce domaine, mais aussi dans l’auto-immunité ou en cancérologie. Cependant, de nombreuses barrières rendent difficile l’élaboration de stratégies thérapeutiques reposant sur le transfert adoptif de Treg chez l’homme et une meilleure compréhension des facteurs et mécanismes contrôlant la prolifération et les capacités suppressives de ces cellules permettrait de les cibler directement et si possible spécifiquement in vivo.Dans ce travail, après avoir élaboré un nouveau système d’évaluation clinique de la GVH chez la souris et démontré sa simplicité, sa reproductibilité et sa performance, nous avons pu montrer que l’action suppressive des Treg dans la GVH dépendait de l’interaction entre le TNFα produit par les lymphocytes T conventionnels (Tconv) du donneur et le récepteur TNFR2 exprimé par les Treg. En effet, en bloquant cette interaction de 3 façons différentes, à savoir par un anticorps monoclonal bloquant anti-TNFR2, ou en utilisant soit des Treg n’exprimant pas TNFR2 soit des Tconv ne produisant pas de TNFα, nous avons à chaque fois montré que l’effet protecteur des Treg était aboli en l’absence du signal TNF. Le récepteur TNFR2 étant exprimé préférentiellement par les Treg par rapport aux Tconv, nos résultats ouvrent la voie au ciblage des Treg in vivo via TNFR2, soit pour activer ce récepteur par un agoniste et donc stimuler les Treg afin de contrôler la GVH, soit à l’inverse pour bloquer l’axe TNFα/TNFR2 par un antagoniste et ainsi inhiber les Treg, ce qui permettrait alors de lever un frein à l’alloréactivité dans les situations où l’on cherche à la stimuler pour renforcer l’effet anti-tumoral, comme par exemple dans le cas des rechutes post-allogreffe. / Regulatory T cells (Tregs) are key players involved in the modulation of alloreactivity after hematopoietic stem cell transplantation. Indeed, Tregs can prevent graft-versus-host disease (GVHD) in experimental models. Therefore, the therapeutic potential of these cells in GVHD is substantial, as it is in other fields like auto-immunity or oncology. However, many obstacles still make the application of cellular therapy strategies based on the adoptive transfer of Tregs in humans quite complicated. A better understanding of factors and mechanisms that control the proliferation and suppressive capacities of Tregs could allow for a direct and specific targeting of these cells in vivo.In this work, after designing a new clinical grading system for murine GVHD and demonstrating its ease of use, reproducibility and performance, we have shown that the suppressive action of Tregs in GVHD depends on the interaction between TNFα produced by donor conventional T cells (Tconvs) and TNFR2 expressed by Tregs. Using 3 different ways to block this interaction, i.e. with an anti-TNFR2 blocking monoclonal antibody, or Tregs that do not express TNFR2 or donor Tconvs that cannot produce TNFα, we were able to show in each situation that blocking TNF signaling resulted in a loss of protection by Tregs. TNFR2 being highly expressed by Tregs as compared with Tconvs, our results pave the way for in vivo targeting of Tregs through TNFR2, either to activate this receptor with an agonist and therefore stimulate Tregs to control GVHD, or to block the TNFα/TNFR2 axis with an antagonist and in this case inhibit Tregs, which could boost alloreactivity, as expected in some particular settings like post-transplant relapse.

La leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC) est une hémopathie myéloïde rare du sujet âgé. Les caractéristiques cliniques, génétiques et moléculaires de la maladie sont bien connues. L’expression très hétérogène de la maladie ne peut être expliquée par la seule hétérogénéité génétique du clone leucémique. Les altérations épigénétiques jouent manifestement un rôle important. Le rôle de facteurs extrinsèques issus du microenvironnement est plus obscur. La niche hématopoïétique est le siège d’interactions entre cellules. Deux schémas non-exclusifs d’altération primaire ou secondaire de la niche sont proposés. Le premier implique que l’émergence d’un clone hématopoïétique modifie son environnement. Le second postule que le premier évènement dans l’émergence d’une hémopathie clonale est une altération de l’environnement. Mon travail de thèse a étudié les altérations du microenvironnement médullaire chez les patients et leur impact sur la physiopathologie de la maladie selon 2 axes: 1) la mise au point d’un modèle murin de reconstitution de la niche hématopoïetique humaine et 2) la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses des patients. Dans une première partie, j’ai transposé un modèle rapporté en 2016 à l’étude de la LMMC. Ce modèle de greffe de cellules médullaires humaines chez la souris immunodéprimée s’est avéré difficilement reproductible. Dans la seconde partie, j’ai analysé les cellules souches mésenchymateuses de patients atteints de LMMC. J’ai identifié la production excessive d’IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2), conséquence probable d’une dérégulation épigénétique. Le séquençage des CSM à l’échelle unicellulaire a révélé une restriction de l’hétérogénéité de ces cellules dont une fraction seulement produit IGFBP2. Finalement, j’ai montré qu’IGFBP2 favorise la différenciation des progéni-teurs myéloïdes vers la lignée monocytaire. IGFBP2 pourrait donc contribuer à amplifier la monocytose caractéristique de cette maladie.En conclusion, la LMMC s’accompagne de modifications des cellules de la niche hématopoÏétique dont certaines produisent des quantités excessive d’IGFBP2. La recherche de l’origine de ce dérèglement et de son importance dans la progression de la maladie permettra d’évaluer l’intérêt potentiel d’une neutralisation de cette cytokine à des fins thérapeutiques. / Chronic myelomonocytic leukemia (CMML, is a rare myeloid hemopathy of the elderly. Clinical, genetic and molecular characteristics of the disease are well-known. The highly heterogeneous expression of the disease can’t be solely explained by genetic heterogeneity of the leukemic clone. Epigenetic alterations obviously play an important role. However, the role of extrinsic factors from the medullar microenvironment in CMML physiopathology is still poorly understood. The hematopoietic niche hosts a lot of bi-directionnal interactions between cells. Two non-exclusive schemes of primary and secondary alterations of the niche can be proposed. First postulate implies that the emergence of a hematopoietic clone alters its environment. The second one supposes that the first event causing the emergence of a clonal hemopathy is an alteration of the environment. My PhD work consisted of studying medullar alterations in patients and their impact on CMML physiopathology upon 2 axes: 1) to set up a murine model of human hematopoietic niche reconstitution 2) to caracterise mesenchymal stem cells from CMML patient ex vivo. During the first part of my PhD, I adapted a model published in 2016 to CMML. This model of human MSC graft in immunodeficient mice proved to be hardly reproducible. During the second part, I analysed of CMML patients MSC. I identified an excessive production of IGFBP2 (Insuline-like Growth Factor Binding Protein 2) probably secondary to an epigenetic disregulation. Single cell RNA sequencing revealed a restriction of MSC heterogeneity of which only a fraction produces IGFBP2. Finally, I showed that IGFBP2 favors myeloid progenitors differenciation towards monocytic lineage. IGFBP2 could therefore contribute to the amplification of CMML characteristic monocytosis.To conclude, CMML goes along with modifications of hematopoietic niche cells, some of which produce excessive amounts of IGFBP2. Investigation on the origin of this alteration and its significance in disease progression should allow to evaluate the potential interest of its neutralization for therapeutic strategies.

De nos jours, la greffe de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) de type allogénique est le traitement standard pour de nombreuses hémopathies malignes, et ce, en dépit des taux élevés de complications liées à la transplantation, telles que les infections, les rechutes et la maladie du greffon contre l’hôte (GVH), associées à cette procédure. Depuis les deux dernières décennies, plusieurs stratégies visant à contrôler la maladie du GVH ont émergé et incluent la déplétion partielle et la manipulation ex vivo des cellules T du greffon. En revanche, ces stratégies peuvent entrainer de sévères déficits immunitaires post-greffe. En comparaison avec les autres sources de cellules souches, une faible incidence de la maladie du GVH et de rechute est observée chez les patients recevant une greffe de sang de cordon ombilical (SC). En contrepartie, ce type de greffe engendre des retards dans la restauration immunitaire, rendant ainsi les patients plus susceptibles aux agents pathogènes. À l’inverse, une augmentation plus importante de la production de cellules T naïves, d’émigrants thymiques récents et de l’abondance des clonotypes des cellules T fut détectée chez les patients ayant reçu une GCSH dérivée du sang d’un seul cordon traité avec UM171, une molécule utilisée pour l'amplification ex vivo des CSHs dérivés de SC, relativement aux patients ayant reçu une GCSH standard. Dans ce mémoire, nous essaierons de comprendre le mécanisme moléculaire sous-jacent à la restauration immunitaire chez les patients transplantés avec un greffon de SC traité avec UM171, nous tenterons de déceler des progéniteurs lymphoïdes au sein des cellules de SC traitées avec UM171 et nous essaierons d’identifier un marqueur de surface qui pourrait être utilisé pour enrichir les progéniteurs lymphoïdes. Nos résultats démontrent la présence de deux "clusters" lymphoïdes, PCL et LMPP, qui expriment potentiellement CD10, et sont plus nombreux dans les échantillons de SC CD34+ traités avec UM171 comparativement aux contrôles. En utilisant les marqueurs de surface CD10 et CD45RA, nous avons pu identifier deux populations CD34+ (CD10medCD45RAmed/lo et CD10hiCD45RAhi) qui sont multipliées dans les cultures traitées avec UM171 relativement aux contrôles. En outre, nous démontrons également que seules les cellules CD45RA- peuvent générer les deux populations CD10+ in vitro, ce qui suggère que les cellules CD10medCD45RAmed/lo définissent une population plus primitive que les cellules CD10hiCD45RAhi. De surcroit, nous proposons que la population CD10medCD45RAmed/lo pourrait contenir des LMPPs qui se différencieront en PCLs inclus dans la population CD10hiCD45RAhi. D'un point de vue fonctionnel, nous observons un développement et une maturation des lymphocytes T nettement plus rapide pour la population CD10+CD34+ relativement à la population CD34+ totale à 3 et 6 semaines, ce qui suggère que CD10 pourrait être utilisé comme marqueur de progéniteurs lymphoïdes. Par ailleurs, nous détectons également un pourcentage plus élevé de cellules ayant un phénotype ILC dans la population CD10+CD34+ comparativement à la population CD34+ totale, ce qui suggère que la population CD10+CD34+ peut potentiellement contenir des progéniteurs lymphoïdes capables de produire différents types de cellules immunitaires. D’autre part, la population CD45RA+ produit plus rapidement des lymphocytes T contrairement à la population CD45RA-. En conséquence, nous proposons que la population CD45RA- contient des cellules primitives (ex. CSH) qui à leur tour génèrent des progéniteurs multipotents contenus dans la population CD10+CD34+ (ex. LMPP) et qui éventuellement produiront des progéniteurs à potentiel plus restreint inclus dans la population CD45RA+ (ex. CLP). En somme, ce mémoire identifie pour la première fois une population CD10+CD34+ présente dans le greffon traité avec UM171 avec un potentiel T et produisant potentiellement des ILCs. L’un des problèmes majeurs liés à la GCSH dérivée du SC est une restauration immunitaire retardée; par conséquent, optimiser l’infusion de cellules CD34- en augmentant le nombre de progéniteurs lymphoïdes pourrait considérablement aider à stimuler la restauration immunitaire chez les patients recevant une GCSH dérivée de SC. / Currently, allogeneic hematopoietic stem cell transplantation is a standard treatment for many hematological malignancies, although high rates of transplant-related complications such as infections, relapse, and GVHD has constrained the implementation of HSCT. Strategies have emerged to manage GVHD and include partial T-cell depletion and ex vivo manipulation of donor T cells, albeit they have adverse effects on post-transplantation immune recovery and can cause profound immunodeficiency. In comparison to other stem cell sources, a lower incidence of chronic GVHD and relapse is reported in patient receiving cord blood (CB) transplant, although they also display an enhanced susceptibility to pathogens caused by an ineffective T-cell reconstitution. In contrast, we reported a greater increase in naïve T cells production, recent thymic emigrants and T cell clonotype from 3 months to 6 and 12 months in patient transplanted with a single CB graft expanded with UM171, a small molecule used for the ex vivo expansion of CB HSCs, as compared to counterpart patients receiving unmanipulated CB graft. In this master research, we aimed to understand the molecular mechanism underlying T-cell reconstitution in patients transplanted with UM171- expanded CB graft. We tried to identify lymphoid progenitors within the highly heterogeneous CD34+ CB cells treated with UM171 using Cite-Seq, find a surface marker that can be used to enrich for early lymphoid progenitors using flow cytometry, and assess their lineage potential using artificial thymic organoids. Our results highlight the presence of two lymphoid clusters, CLP and LMPP, expressing CD10. The LMPP cluster is about 6 fold expanded in UM171-treated cells as compared to uncultured and DMSO-treated cells. Using the marker CD10 and CD45RA we identify two CD34+ populations (CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) that are significantly expanded in CD34+ CB cells cultured in the presence of UM171 in contrast to uncultured CD34+ CB cells and DMSO-supplemented cultures. Furthermore, we demonstrate that only the CD45RA-negative cells can give rise to both CD10-positive subsets in vitro, suggesting that CD10medCD45RAmed/lo cells define a subset with a more primitive phenotype than CD10hiCD45RAhi. We propose that the CD10medCD45RAmed/lo subset could contain LMPPs that will commit to CLPs contained within the CD10hiCD45RAhi subset. Functionally, we compared T-cell development and maturation of the CD10+CD34+ subset (including CD10medCD45RAmed/lo and CD10hiCD45RAhi) to the CD45RA+CD34+, CD45RA-CD34+ and total CD34+ subsets and denote a faster T cell development and maturation at 3 and 6 weeks within the CD10-positive subset in contrast to the total CD34+ subset, suggesting that CD10 can be used as a marker of lymphoid precursors in UM171 cultures. We also observe a higher percentage of ILC-like cells within the CD10-positive subset as compared to total CD34+ cells suggesting that the CD10- positive subset potentially contains lymphoid precursors with multilineage capacity. Faster T cell development is observed for the CD45RA+ subset whereas CD45RA- cells display the slowest T cell development, hence we propose that the CD45RA- subset contains primitive cells (e.g. HSC) that segregate into lineage-biased multipotent progenitors enriched in the CD10-positive subset (e.g. LMPP) that will give rise to lineage-restricted precursors that are CD45RA+ (e.g. CLP). In sum, our findings represent the first identification of a CD10-positive population within the UM171- expanded graft that has T potential and could potentially produce ILCs. Delayed immune reconstitution is a major obstacle impeding the implementation of CB HSCT; therefore optimizing infusion of CD3+ donor cells by enriching for lymphoid precursors could help boost T-cell reconstitution following allogeneic HSCT.

La rétinopathie induite par l’oxygène (RIO) est un modèle animal semblable aux rétinopathies vue chez l’homme. Dans ce modèle, une destruction des microvaisseaux rétiniens est suivie d’une néovascularisation pathologique qui chez l’homme peut mener à un détachement de la rétine et subséquemment une perte de vision. Afin de remédier à cette revascularisation anarchique, un traitement de cellules souches (hématopoïétiques et mésenchymateuses) a été effectué chez des souris soumises à ce modèle. Les cellules injectées ont pu migrer à la rétine et induire une revascularisation saine (surtout les cellules souches mésenchymateuses). L’injection du milieu de culture de ces cellules induit aussi une revascularisation semblable à celle vue chez les souris traitées avec les cellules indiquant que l’effet thérapeutique des cellules semble être accompli par l’entremise de facteurs paracrines. Ces résultats suggèrent que ces cellules peuvent jouer un rôle au niveau de l’angiogénèse et indiquent un potentiel thérapeutique pour les rétinopathies. / Oxygen induced retinopathy (OIR) is an animal model that mimics the developing phases of retinopathies seen in humans such as diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity. An initial destruction of retinal microvasculature is followed by pathological neovascularization that can lead to retinal detachment in humans and therefore blindness. Utilizing bone marrow derived stem cells (mesenchymal and hematopoietic), we aimed to repopulate the retina with normal vessels which are affected in the OIR model. Cells injected into the vitreous migrated to the retina and reduced both the area of vasoobliteration and neovascularization. Injection of conditioned cell medium also induced proper vascular repair similar to that seen in mice injected with cells indicating that the cells therapeutic effect is achieved through paracrine action. These results suggest that bone marrow stem cells play a role in angiogenesis and could be a potential therapeutic aid in treating retinopathies.

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La rétinopathie induite par l’oxygène (RIO) est un modèle animal semblable aux rétinopathies vue chez l’homme. Dans ce modèle, une destruction des microvaisseaux rétiniens est suivie d’une néovascularisation pathologique qui chez l’homme peut mener à un détachement de la rétine et subséquemment une perte de vision. Afin de remédier à cette revascularisation anarchique, un traitement de cellules souches (hématopoïétiques et mésenchymateuses) a été effectué chez des souris soumises à ce modèle. Les cellules injectées ont pu migrer à la rétine et induire une revascularisation saine (surtout les cellules souches mésenchymateuses). L’injection du milieu de culture de ces cellules induit aussi une revascularisation semblable à celle vue chez les souris traitées avec les cellules indiquant que l’effet thérapeutique des cellules semble être accompli par l’entremise de facteurs paracrines. Ces résultats suggèrent que ces cellules peuvent jouer un rôle au niveau de l’angiogénèse et indiquent un potentiel thérapeutique pour les rétinopathies. / Oxygen induced retinopathy (OIR) is an animal model that mimics the developing phases of retinopathies seen in humans such as diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity. An initial destruction of retinal microvasculature is followed by pathological neovascularization that can lead to retinal detachment in humans and therefore blindness. Utilizing bone marrow derived stem cells (mesenchymal and hematopoietic), we aimed to repopulate the retina with normal vessels which are affected in the OIR model. Cells injected into the vitreous migrated to the retina and reduced both the area of vasoobliteration and neovascularization. Injection of conditioned cell medium also induced proper vascular repair similar to that seen in mice injected with cells indicating that the cells therapeutic effect is achieved through paracrine action. These results suggest that bone marrow stem cells play a role in angiogenesis and could be a potential therapeutic aid in treating retinopathies.

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La greffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) constitue une avancée thérapeutique considérable dans le traitement de maladies hématologiques et non hématologiques. Toutefois, malgré qu’elle sauve des vies, elle n’est pas sans risque. Le syndrome lymphoprolifératif post-transplantation (SLPT) est l’une des complications qui peut survenir après ce type de greffe avec un risque de mortalité pouvant atteindre 80% en l’absence de traitement. Par ailleurs, les traitements disponibles pour limiter le développement de ce syndrome ne sont pas sans effets néfastes. Le SLPT est surtout une conséquence d’une primo-infection ou d’une réactivation non-contrôlée du virus d’Epstein-Barr (VEB). Au moins 90% des adultes sont porteurs du VEB alors que ce pourcentage est d’environ 50-70% chez les enfants. Il est important de bien comprendre les facteurs de risque de l’infection active du VEB et du SLPT pour une meilleure gestion des greffés. Cette thèse a pour objectif de contribuer aux connaissances quant aux déterminants du VEB et du SLPT chez les greffés pédiatriques de CSH. Dans un premier temps, une revue systématique combinée à une méta-analyse a été réalisée pour élaborer un portrait exhaustif des facteurs de risque connus du VEB et du SLPT chez les greffés adultes et pédiatriques de CSH. Ensuite, à l’aide d’une étude de cohorte prospective multicentrique canadienne qui a enrôlé 156 patients pédiatriques greffés de CSH, le lien entre la transfusion de produits sanguins et l’infection VEB post-greffe a été analysé. Finalement, l’étude de cohorte multicentrique a aussi permis d’explorer des nouveaux facteurs de risque des évènements liés au VEB allant de l’ADNémie VEB à la suspicion du SLPT. Les résultats de la revue systématique et de la méta-analyse ont montré que l’utilisation de la globuline antithymocyte (ATG) pour prévenir la maladie du greffon contre l’hôte est le principal facteur impliqué dans la survenue post-greffe des infections actives du VEB et du SLPT. La forte hétérogénéité entre les études a limité la comparaison des résultats et très peu d’études portaient exclusivement sur les patients pédiatriques. D’autre part, l’analyse statistique au sein de la cohorte multicentrique n’a pas révélé une augmentation statistiquement significative du risque d’infection du VEB post-greffe associé à la transfusion. Toutefois, une analyse de génotypage du virus a indiqué que la transfusion serait très probablement liée à la primo-infection VEB d’un patient séronégatif, et ce malgré la leucoréduction (qui élimine virtuellement la présence des virus associés aux composantes cellulaires des produits sanguins). Par ailleurs, nos analyses dans la cohorte multicentrique ont corroboré l’association entre l’ATG et les évènements liés au VEB post-greffe et mis en relief deux nouvelles associations. Le mycophénolate mofétil, un médicament utilisé pour prévenir la maladie du greffon contre l’hôte, limiterait le risque des évènements liés au VEB par son action antiproliférative des lymphocytes T et B (incluant ceux infectés par le VEB), tandis que les filles seraient plus à risque des formes relativement sévères de l’infection du VEB post-greffe que les garçons. Le rationnel autour de cette dernière association n’est pas connu. Des nouvelles recherches permettront d’apprécier la reproductibilité de ces résultats. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSC) constitutes a notable therapeutic advance in the treatment of hematological and non-hematological diseases. However, despite saving lives, it is not without risk. Post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD) is one of the complications that can occur after this type of transplant with a mortality risk of up to 80% if left untreated. Moreover, the treatments available to limit the development of this disease are not without harmful effects on transplant recipients. PTLD is predominantly a consequence of primary infection or uncontrolled reactivation of Epstein-Barr virus (EBV). At least 90% of adults are carriers of EBV, compared to around 50-70% in the pediatric population. It is important to understand the risk factors for active EBV infection and PLTD in order to better manage transplant recipients. This thesis aims to contribute to knowledge on the determinants of active EBV infection and PTLD in pediatric HSC transplant recipients. A systematic review combined with a meta-analysis was carried out to develop a comprehensive portrait of the known risk factors for EBV and PTLD in adult and pediatric HSC transplant recipients. Then, using a Canadian multicenter prospective cohort study that enrolled 156 pediatric HSC transplant patients, the link between blood product transfusion and post-transplant EBV infection was analyzed. Finally, the multicenter cohort study also explored new risk factors for EBV-related events ranging from EBV DNAemia to suspicion of PTLD. The results of the systematic review and the meta-analysis revealed that the use of anti-thymocyte globulin (ATG) to prevent graft-versus-host disease is the main factor implicated in the post-transplant occurrence of active EBV infection and PTLD. The high heterogeneity between studies limited the comparison of results and very few studies focused exclusively on pediatric patients. On the other hand, statistical analysis within the multicenter cohort did not reveal a significant increase in the risk of post-transplant EBV infection associated with transfusion. However, genotyping analysis of viral strains from blood donors of an EBV-negative patient who received an EBV-negative graft indicated that one of the blood donors was the source of the primary EBV infection in the patient, despite leukoreduction (which virtually eliminates the presence of cell-associated viruses in blood products). Furthermore, our analyses in the multicenter cohort corroborated the association between ATG and post-transplant EBV-related events, and highlighted two new associations. First, mycophenolate mofetil, a drug used to prevent graft-versus-host disease, is believed to reduce the risk of EBV-related events through its antiproliferative action on T and B lymphocytes (including EBV-infected B cells). Second, girls are more at risk of relatively severe forms of post-transplant EBV infection than boys. The rationale behind this latter association is unknown. New research will make it possible to assess the reproducibility of these results.