Les petits ARN interférents (siRNA) sont encore rarement utilisés chez les vertébrés transgéniques pour inhiber l'expression de gènes. En effet, les vecteurs contenant un promoteur de type ARN polymérase III comme ceux des gènes U6 et H1 qui permettent une expression élevée des gènes codant pour des ARNi dans des cellules sont souvent silencieux in vivo. Dans cette thèse, divers vecteurs exprimant des petits ARN double brins (shRNA) ont été testés dans des cellules en culture et chez des souris transgéniques pour inhiber l'ARN m du gène précoce IE du virus de la pseudo rage porcine responsable de la maladie d'Aujeszky. La quantité et la séquence des si RNA produits ont été étudiées par qPCR. Dans des cellules CHO transfectées pour une expression transitoire, les vecteurs contenant les gènes U6-shRNA ont été de loin les plus efficaces pour inhiber le gène IE en raison du niveau élevé de siRNA produit. Par ailleurs, deux constructions contenant le promoteur de type ARN polymérase II, le promoteur du gène eF1-α etune séquence de shRNA bordée par 5T ou introduite dans un gène de microARN (miRNA) le miR30 ont permis d'obtenir une inhibition significative mais limitée de l'ARNm du gène IE. Ceci parait être du au niveau relativement faible de siRNA produit. Le siRNA produit par le gène du miRNA s'est avéré aussi efficace que ceux obtenus à partir des constructions U6-shRNA bien que ces derniers soient un peu plus longs. Ces diverses constructions ont été utilisées pour obtenir des souris transgéniques. Des souris contenant la séquence du shRNA n'ont pu être obtenues qu'à partir de la construction miRNA. Ceci peut être du au fait que les siRNA produits par les autres constructions ont exercé un effet inhibiteur sur des cibles aspécifiques (off-targeting) qui ne s'est pas produit avec le siRNA provenant de la construction miRNA car il contient quelques nucléotides en moins. Les souris transgéniques contenant la construction miRNA ont été soumises à une infection par le virus de la pseudo rage porcine. Bien que les souris exprimaient le gène shRNA qu'à un faible niveau. Quelques souris transgéniques ont résisté à l'infection. La seconde partie de la thèse a consisté à sélectionner d'autres séquences de shRNA capables d'inhiber l'expression du gène IE sans exercer des effets aspécifiques. Deux séquences de shRNA ont permis une telle inhibition. L'une est dirigée contre la région 5'UTR du gène IE et l'autre contre la région 3'UTR. Ces données suggèrent que (1) l'efficacité d'un shRNA n'est pas déterminée par sa séquence d'une manière totalement prévisible (2) l'efficacité d'un siRNA est d'autant plus élevé que sa séquence cible dans l'ARNm est en structure double brin (3) un effet inhibiteur intense et optimum peut être obtenu avec des concentrations faibles d'un siRNA (4) les effets secondaires et en particulier le off-targeting peuvent avoir lieu à faible concentration du siRNA mais ils ont d'autant plus de chance de se produire que la concentration du si RNA est plus élevée (5) un siRNA destiné à être utilisé chez des animaux transgéniques devrait être choisi pour sa capacité à inhiber efficacement un gène à faible concentration pour réduire ses effets secondaires.

Dans le but d'évaluer l'impact d'une exposition postnatale sur une population spécifique de neurones olfactifs, nous avons exposé au Lyral des souris transgéniques dont les neurones récepteurs olfactifs MOR23 expriment la protéine fluorescente, GFP. Nous avons évalué l'impact d'une exposition précoce sur la population des neurones MOR23, en utilisant plusieurs méthodes. Par des observations anatomiques, nous montrons que le nombre de neurones olfactifs exprimant MOR23 diminue chez les sujets traités. Cette baisse concerne principalement les neurones matures. Ensuite, des analyses en qPCR quantitatives sur de petits échantillons de cellules isolées indiquent que les neurones MOR23 des souris exposées expriment davantage de récepteurs, de canaux couplés aux nucléotides cycliques (CNGA2) et de phosphodiestérase (PDE1C). La surexpression du récepteur MOR23 par neurone est transitoire. Enfin, cette surexpression est corrélée avec les propriétés électriques des neurones en réponse au ligand du récepteur MOR23 étudiées en patch-clamp. Afin d'écarter tout effet aspécifique inhérent à une éventuelle toxicité du Lyral, nous avons réalisé des enregistrements d'électroolfactogramme (EOG), une étude " transcriptomique " (41 gènes) et une étude d'immunohistochimie sur la muqueuse olfactive montrant que l'EO reste intact après exposition de trois semaines au Lyral. Nous montrons également que l'effet est dépendant du couple ligand-récepteur. Enfin, par des observations comportementales, nous montrons que les souris exposées développent une préférence pour le Lyral et passent plus de temps à l'explorer.Ensemble, ces résultats suggèrent que les neurones olfactifs font preuve d'une certaine plasticité et sont capables de s'adapter à l'environnement

L’insuffisance rénale chronique (IRC) est associée à une diminution de la clairance métabolique des médicaments résultant en partie de l’inhibition des cytochromes P450 (CYP450) et des enzymes de phase II, notamment la N-acétyltransférase 2 (NAT2), tel que démontré chez le rat. Nous avons précédemment démontré le rôle de l'hormone parathyroïdienne (PTH) dans la diminution des CYP450 hépatiques chez le rat souffrant d’IRC. Toutefois, l’étude des mécanismes sous-jacents pouvant être facilitée par l’utilisation de souris transgéniques, l’objectif de cette étude consiste à confirmer ces résultats dans un modèle murin. D’abord, afin de valider ce modèle expérimental, une IRC a été induite par néphrectomie subtotale 3/4 chez des souris C57BL/6, puis l’expression protéique et génique des CYP450 et de la Nat2 hépatiques a été étudiée. Les résultats indiquent que l’IRC induit effectivement une diminution d’expression de ces enzymes dans un modèle murin. Ensuite, des souris mutantes pour le gène codant la PTH (PTH-/-) et les souris correspondantes de type sauvage (PTH+/+) ont été néphrectomisées, puis l’expression protéique et génique des CYP450 hépatiques a été analysée. Si la PTH est responsable de la diminution du CYP450 en situation d’IRC, les souris PTH-/- atteintes d’IRC ne devraient présenter aucune baisse d’expression. Les résultats obtenus pour les souris PTH-/- ne peuvent être interprétés, puisque chez les souris PTH+/+ atteintes d'IRC, le CYP450 hépatique est inchangé par rapport aux souris PTH+/+ témoins. Des expériences supplémentaires seront requises afin de déterminer si la régulation à la baisse du CYP450 précédemment observée est contrecarrée par l’absence de PTH. / Chronic renal failure (CRF) is associated with a decrease in the metabolic clearance of drugs, which is partly due to a reduced expression of cytochrome P450 (CYP450) and phase II enzymes, namely N-acetyltransferase 2 (NAT2). This phenomenon has been shown in the rat. We have previously demonstrated the role of parathyroid hormone (PTH) in CYP450 down-regulation in rats with CRF. However, the study of mechanisms underlying the down-regulation of CYP450 by PTH should be confirmed with the use of knockout mice. The aim of this study was, therefore, to confirm these results in a murine model. Firstly, to validate this experimental model, CRF was produced in C57BL/6 mice using the 3/4 subtotal nephrectomy. Protein and mRNA levels of hepatic CYP450 and Nat2 were then analyzed. The results showed that CRF down-regulates these enzymes, as previously observed in the rat. Finally, PTH-null mice (PTH-/-) and their corresponding wild type (PTH+/+) were nephrectomized in order to analyze protein and mRNA expression of hepatic CYP450. If PTH is responsible for the decrease of CYP450 in the presence of CRF, then PTH-/- mice with CRF should not show any reduction in CYP450 expression compared to controls. The results concerning the PTH-/- mice could not be interpreted because PTH+/+ mice with CRF did not show any significant difference of CYP450 expression when compared to PTH+/+ controls. Thus, additional experiments must be conducted in order to determine the role of PTH in CYP450 down-regulation in CRF mice.

La néphropathie diabétique est une maladie rénale caractérisée par un syndrome néphrotique et de la glomérulosclérose. Celle-ci est reliée à l’angiopathie de capillaires suite au diabète. Il s’agit d’une importante cause d’insuffisance rénale en Amérique. Or, les anomalies tubulaires comme l’apoptose ou le détachement de tubules des glomérules sont reconnues comme étant de bons marqueurs de progression de cette maladie. Ainsi, il a été proposé au cours des travaux reliés à cette thèse d’étudier les différents mécanismes moléculaires reliés à l’apoptose des tubules proximaux, en particulier dans un thème de relation avec les dommages reliés aux espèces réactives oxygénées (ROS). Une des hypothèses développée au cours de précédents travaux faisait état que l’une des sources initiales qui entrainent le développement de dommages tubulaires soit régulée à travers la production de ROS dérivés des NADPH oxydases. Ainsi, une des premières séries d’expériences entreprises au cours de cette thèse a été effectuée sur un modèle animal de diabète de type 2, la souris db/db. Suite à la caractérisation des différentes pathologies rénales et leur réduction par la surexpression de l’enzyme antioxydante catalase dans les tubules proximaux, des expériences de micro-puces d’expression génétiques furent effectuées. À l’aide de cet outil et par des analyses bioinformatiques, il a été possible d’établir un profilage de gènes reliés à différentes voies de signalisation modulées par le diabète et la catalase. Ainsi, il a été possible d’effectuer de plus amples études sur des gènes reliés à l’apoptose surexprimé dans les tubules proximaux de souris diabétiques. Un des gènes pro-apoptotique mieux caractérisé durant cette thèse fut le gène Bmf, un membre de la famille des régulateurs de Bcl-2 impliqués dans l’apoptose via le relâchement de cytochrome c de la mitochondrie. Ainsi, il a été déterminé que ce gène est surexprimé dans les tubules proximaux de souris diabétiques, et que celui-ci était augmenté dans différents modèles in vitro de diabète. Cela a permis de conclure que Bmf joue sans doute un rôle important la régulation de l’apoptose et de l’atrophie des tubules proximaux. Une autre étude effectuée dans le cadre de cette thèse était reliée avec l’utilisation d’un modèle transgénique afin de mieux définir le rôle que jouent les dommages reliés au stress oxydatif dans la progression des pathologies rénales reliées à l’induction du système rénine-angiotensine. Les résultats obtenus ont permis de déterminer que la surexpression de l’enzyme antioxydante catalase a permis de réduire les différentes pathologies rénales observées dans les souris transgéniques, ce qui permet de conclure que les espèces réactives oxygénées jouen un rôle important dans le développement de l’hypertension et des dommages rénaux. / Diabetic nephropathy is a disease characterized by a nephrotic syndrome and glomerulosclerosis. It is related to capillaries angiopathy caused by diabetes. It is one of the main sources of end stage renal disease in America. Tubular anomalies such as apoptosis or tubular detachment from glomeruli are known to be efficient markers for the progression of this disease. Thus, it has been proposed during the work related to this thesis to study the different molecular mechanisms linked with proximal tubules apoptosis, particularly those related with reactive oxygen species (ROS). A previously stated hypothesis made by our laboratory stated that one of the initial sources of the development of tubular damages may be regulated by the production of ROS by NADPH oxidases. Thus, one of the first series of experiments carried during this thesis was done on an animal model of type 2 diabetes, the db/db mouse. Following the characterization of different renal pathologies and their reduction in the proximal tubules by the antioxidant enzyme catalase, experiment with genetics expression microarrays were carried. Using this tool and bioinformatics analysis, it was possible to profile different genes linked to pathways involved by diabetes and the catalase enzyme. Thus, it was possible to carry further studies on these genes linked to apoptosis and overexpressed in the proximal tubules of diabetic mice. One of the pro apoptotic genes characterized in this thesis was the Bmf gene, a member of the family of Bcl-2 regulator, involved in apoptosis related to the release of cytochrome c from the mitochondria. Thus, it was determined that this gene is overexpressed in the proximal tubules of diabetic mice, and that it was also upregulated by in vitro models of diabetes. This enabled our team to conclude that Bmf must play an important role in the regulation of apoptosis and atrophy of the proximal tubules. Another study carried during this thesis was linked with the use of a transgenic animal model to better define the role played by damages related to oxidative stress in the progression of renal pathologies related to renin-angiotensin system activation. The results obtained by this study stated that overexpression of the antioxidant enzyme catalase managed to reduce the different kidney pathologies observed in the transgenic model, which let us conclude that reactive oxygen species have an important role to play in the development of hypertension and kidney damages.

L‟infection par le VIH-1, chez les patients, affecte principalement le système immunitaire et conduit à une destruction graduelle des lymphocytes T CD4 et, par conséquent, entraîne un état d‟immunodéficience. Cette immunodéficience permet l'établissement d‟infections opportunistes qui sont responsables de manifestations cliniques associées au Sida. Ces patients peuvent aussi développer des lymphomes, lésions du système nerveux central et une atteinte rénale. L'ampleur et la sévérité des conditions associées observées chez les patients infectés par le VIH-1 ne peuvent être imputées seulement au processus infectieux et à la déplétion des cellules T CD4+. Ceci suggère que les produits des gènes de régulation pourraient avoir des effets cytopathogènes. Cependant, les études sur la physiopathogenèse induite par le VIH ou ses différents gènes ont été difficiles à mener en raison de l'absence d'animaux de laboratoire infectés par ce virus. Ceux-ci auraient pu aider à disséquer le rôle des différents composants du génome viral et les mécanismes pathogénétiques impliqués. Pour pallier cette contrainte, nous avons produit le premier modèle de souris transgéniques pour le gène vpu. Vpu code pour une phosphoprotéine membranaire avec plusieurs fonctions connues. Elle participe au relargage des virions à la surface cellulaire, induit la dégradation des CD4, induit la régulation négative des CMH-1, augmente la susceptibilité à la mort cellulaire des lymphocytes T infectés par le VIH et favorise la réplication virale en empêchant les mécanismes antiviraux cellulaires. Dans ce travail, nous avons caractérisé pathologiquement un modèle de souris transgéniques porteuses du gène vpu du VIH-1. Nos résultats démontrent que l‟expression de vpu chez les souris transgéniques induit le développement spontané d‟une hyperplasie lymphoïde pansystémique, une splénomégalie avec une hyperplasie lymphoïde folliculaire évoluant en lésions prémalignes et malignes qui présentent certaines similarités avec la maladie de Castleman et une iv glomérulonéphrite mesangioproliférative qui rappelle certaines altérations de néphropathie associée au VIH chez les patients infectés. L‟ensemble des altérations démontre que les souris Tg/vpu développent une activation chronique et non spécifique du système immunitaire. Dans cette activation immunitaire, une dérégulation de l‟IL-6 et une hyperplasie du réseau de cellules métallophiliques pourraient être impliquées. D‟autres résultats obtenus sur les évaluations du fonctionnement du système immunitaire de la rate et du thymus mettent en évidence une susceptibilité augmentée des lymphocytes des tissus lymphoïdes aux effets apoptotiques de la dexaméthasone et des lipopolysaccharides et un retard dans le repeuplement par les cellules d‟organes lymphoïdes ainsi qu‟une réaction inflammatoire (Schwartzman) exacerbée et des anomalies dans la réaction d‟hypersensibilité retardée expérimentale. Ce modèle transgénique reproduit plusieurs anomalies rencontrées chez les patients infectés par le VIH et ouvre de nouvelles hypothèses sur la pathogenèse de l‟infection par le VIH. / The HIV-1 infection results in a severe immunodepression due to an increasing depletion of the CD4+T lymphocytes and in a neurodegeneration that leads to a motor/cognitive complex dysfunction. In addition to these pathological alterations, patients with AIDS may also develop additional complications including neoplasms, nephropathy, hematological abnormalities and opportunistic infections. None of these complications can be accounted for solely by the loss of CD4+T lymphocytes and several investigators have started to suspect the regulatory and accessory genes of possibly playing a role in the AIDS physiopathogenesis. However, studies on the pathological effects contributed by these genes have been hampered by the lack of laboratory animals susceptible to HIV-1 infection. These could have helped to dissect out the role of the different components of the viral genome and their pathogenetic mechanisms. To overcome this obstacle, several investigators have developed transgenic mice carrying either HIV-1 individual genes or partially deleted genome. The vpu gene, which is unique to HIV-1, encodes a membrane phosphoprotein with several known functions as determined by in vitro studies. It participates in virions release at the cell surface, induces CD4 degradation, MHC-1 downregulation, increases apoptosis susceptibility of infected T cells and promotes viral replication by inhibiting cellular antiviral mechanisms. In order to investigate the contribution of vpu to the complex pathogenesis associated with HIV-1 infection, our laboratory developed a transgenic mouse model carrying vpu under the RSV LTR promoter. Here, we described our results of the clinical and pathological investigation of this unique animal model. Our results demonstrate that the expression of vpu in the transgenic mice induces a pansystemic lymphoid hyperplasia, splenomegaly with follicular lymphoid hyperplasia that progress to premalignant and malignant lesions, with striking characteristics of Castelman like-disease, and a mesangial vi hyperplasia variant of HIVAN frequently observed in adult and pediatric AIDS. All lesions observed in this mouse model suggest that the vpu carrying mice develop a nonspecific chronic activation of the immune system with hyperplasia of perivascular metallophillic cells and deregulation of the IL-6 expression within the hyperplastic follicles. Following treatment with dexamethazone and LPS, we observed an increased apoptosis susceptibility of the lymphocytes of the spleen and thymus with slow lymphocyte repopulation of these lymphoid organs. In addition, the transgenic mice developed an exacerbated reaction to the induced Schwartzman reaction and demonstrated a more delayed experimental DTH reaction. Thus, this transgenic model reproduces several abnormalities present in HIV patients. It represents a very interesting and valuable model for studies on the pathology contributed by the vpu gene in the absence of the cumulative effects of the other HIV-1 genes and might help define new possible functions and mechanisms of vpu in the HIV-1 pathogenesis.

La tumeur des cellules de la granulosa (GCT) représente 5% des cas de cancers ovariens chez la femme. Bien que considérées comme peu malignes, la mort survient dans 80% des cas suite à une recrudescence de la maladie. En dépit de ces statistiques sinistres, peu d’études ont été portées sur ce type de cancer. Le premier objectif de cette étude consistait à élucider les mécanismes moléculaires causant les GCT en démontrant l’implication de la voie de signalisation PI3K/AKT dans leur étiologie. Pour ce faire, nous avons employé la technologie Cre-Lox afin de cibler le gène Pten (antagoniste de cette voie) spécifiquement dans les cellules de la granulosa chez la souris. Ces souris (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) ont occasionnellement développé des GCT, soutenant notre hypothèse de l’importance de la voie PI3K/AKT dans leur étiologie. La voie WNT/CTNNB1 est une autre voie de signalisation qui a récemment été impliquée dans le développement des GCT. Dans le cadre de ce projet, nous avons également testé l’existence possible d’une synergie fonctionnelle entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la maladie. Pour ce faire, nous avons créé le modèle transgénique Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+, chez lequel les cellules de la granulosa présentant non seulement une désinhibition de la voie PI3K/AKT, mais aussi une suractivation de la voie WNT/CTNNB1. Tel que prédit, les souris Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ ont développé une forme de GCT beaucoup plus agressive que celle observée chez les femelles Ptenflox/flox;Amhr2cre/+. Spécifiquement, le développement des tumeurs se déclenchait plus tôt, leur croissance était beaucoup plus rapide, nous avons pu observer des métastases pulmonaires et la dissémination des cellules tumorales dans la cavité péritonéale, et la maladie était invariablement fatale avant l’âge de 8 semaines. Le modèle Ptenflox/flox;Ctnnb1flox (ex3)/+;Amhr2cre/+ a donc servi à démontrer l'existence d'une synergie entre les voies WNT/CTNNB1 et PI3K/AKT dans le développement de la GCT. De façon inattendue, les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ ont aussi présenté un phénotype de sous-fertilité qui n’était pas d’origine ovarienne. Il a récemment été démontré que la souche Amhr2cre dirige l’expression de Cre non seulement aux cellules de la granulosa, mais aussi au stroma utérin et au myomètre. Le second objectif de ce travail était donc de démontrer si et comment le phénotype d’infertilité chez les souris Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ pouvait découler d’un défaut utérin. Lors de l'implantation, les cellules du stroma utérin se différencient en cellules déciduelles pour former la décidua maternelle (DM), qui se régresse ensuite par apoptose afin de faciliter l’invasion des cellules trophoblastiques. De plus, la DM, en collaboration avec le tissu foetal, recrute des uNKs dont le rôle est de remodeler les artères spiralées pour augmenter l’apport sanguin maternel vers le foetus en développement. Nous avons pu démontrer que l'utérus des femelles gestantes Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ présentait une DM anormalement résistante à l'apoptose, moins de uNKs et des artères spiralées non-remodelées. Par conséquent, l’invasion des cellules du trophoblaste était restreinte, compromettant le développement et la survie de l'embryon. Nous avons donc établi pour la première fois l’importance de Pten lors de la décidualisation et de l’invasion du trophoblaste. / The granulosa cell tumor (GCT) represents up to 5% of all ovarian cancer cases in women. Although GCT is characterized as a low-grade malignancy, death occurs in approximately 80% of cases following to the disease’s recurrence. Despite these statistics, very few studies have been dedicated to increasing our understanding of the molecular mechanisms responsible for the development of GCT. The first objective of this work was to elucidate some of these molecular mechanisms by proving the involvement of the PI3K/AKT signaling pathway in the etiology of GCT. To this end, we used Cre-LoxP technology to conditionally target Pten (a PI3K/AKT signaling antagonist) in granulosa cells. These transgenic mice (Ptenflox/flox;Amhr2cre/+) occasionally developed GCT, supporting our hypothesis on the importance of the PI3K/AKT pathway in the etiology of this disease. The WNT/CTNNB1 signaling pathway has also recently been implicated in GCT development. We therefore postulated that a functional synergy may exist between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in development of GCT. To test this, we created a second transgenic model (Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+), in which the granulosa cells featured not only a disinhibition of the PI3K/AKT pathway but also a constitutive activation of the WNT/CTNNB1 pathway. As predicted, the Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ mice developed a form of GCT that was much more aggressive than the one observed in the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ model. Specifically, the tumors developed sooner, their growth was faster, pulmonary metastases and the seeding of tumor cells in the abdominal cavity were observed, and the disease was invariably fatal by 8 weeks of age. The Ptenflox/flox;Ctnnb1flox(ex3)/+;Amhr2cre/+ model therefore served to demonstrate a synergy between the WNT/CTNNB1 and PI3K/AKT pathways in GCT development. Unexpectedly, the majority of the Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females presented an infertility phenotype that was not caused by an ovarian defect. Recently, it has been shown that the Amhr2cre strain can direct the Cre activity not only to the granulosa cells but also to the uterine stroma and myometrium. The second objective of this work was therefore to determine if and how the infertility observed in Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ mice could be caused by a uterine defect. During implantation, uterine stromal cells differentiate into decidual cells and form the maternal decidua (MD), which subsequently regresses by apoptosis to facilitate trophoblast invasion. In collaboration with the fetal tissue, the MD also recruits uNKs, which are responsible for spiral artery remodeling that increases maternal blood flow to the developing fetus. We were able to demonstrate that the uteri of pregnant Ptenflox/flox;Amhr2cre/+ females had a MD that was resistant to apoptosis, less uNKs, and spiral arteries that were not properly remodeled. Consequently, the trophoblast cell invasion was restricted, thereby compromising the development and survival of the embryo. We have therefore established for the first time the importance of Pten during the decidualization of the uterine stroma and trophoblast invasion.

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Les ephrines et leurs récepteurs Eph constituent une famille multigénique de facteurs de guidage cellulaire et axonal. Ces facteurs jouent un rôle-clé dans l’établissement de cartes neurales topographiques, notamment au niveau des connexions thalamocorticales, réseau neuronal majeur du cerveau des mammifères.<p><p>Notre projet visait initialement à étudier l’implication des ephrines corticales dans la génèse des connexions thalamocorticales par une approche de gain de fonction. Pour ce faire, nous avons généré des souris transgéniques présentant une expression ectopique spécifique de l’ephrine-A5 dans le cortex en développement, en utilisant une technique de transgénèse d’addition par chromosome artificiel de bactéries (BAC). <p><p>De façon surprenante, l’analyse de ces souris nous a révélé que les ephrines, à côté de leurs rôles classiques de facteurs de guidage, influençaient la taille du cortex cérébral en régulant l’apoptose des progéniteurs neuronaux. En effet, nous avons pu montrer que l’expression ectopique du ligand ephrine-A5 par les progéniteurs corticaux exprimant son récepteur EphA7 résultait en une déplétion précoce en progéniteurs corticaux par apoptose, et une diminution subséquente de la taille du cortex. Cette vague apoptotique est observée en l’absence de toute altération détectable de la prolifération, la différenciation et la migration neurale dans le cortex.<p><p>Nous avons étayé notre étude in vivo par des expériences in vitro, qui ont montré que l’ephrine-A5 recombinante était capable d’induire rapidement la mort des progéniteurs neuronaux dissociés. Nous avons également montré que cette mort cellulaire impliquait l’activation de la caspase-3, confirmant ainsi l’effet direct des ephrines et de leurs récepteurs sur une ou plusieurs cascades apoptotiques. Par contre, la stimulation des neurones post-mitotiques corticaux par l’ephrine-A5 est accompagnée d’une activation de la caspase-3 sans mort cellulaire apparente. La signalisation ephrine/Eph induirait donc l’activation de la caspase-3 dans différents types cellulaires, sans que celle-ci ne soit systématiquement le reflet d’une mort cellulaire programmée. <p><p>Parallèlement, afin d’évaluer l’importance physiologique de cette voie pro-apoptotique dépendante des ephrines, nous avons étudié des souris présentant une perte de fonction du récepteur EphA7. L’analyse de ces mutants nous a permis de mettre en évidence une diminution de l’apoptose des progéniteurs corticaux, une augmentation de la taille du cortex, ainsi qu’une hypercroissance exencéphalique de tout le cerveau antérieur dans les cas les plus extrêmes. Ces observations indiquent donc que les ephrines sont nécessaires au contrôle de la mort cellulaire programmée des progéniteurs du cortex cérébral. Nous avons également observé le même phénotype exencéphalique dans des mutants déficients en ephrines-A2, -A3 et -A5, dont l’analyse préliminaire suggère également des défauts de processus apoptotiques. <p><p>Nos diverses expériences, combinant une approche par gain et perte de fonction, à la fois in vivo et in vitro, ont ainsi permis de proposer un nouveau rôle des ephrines en marge de leur implication dans la guidance axonale, à savoir un rôle dans le contrôle de la taille cérébrale par induction de l’apoptose des progéniteurs corticaux.<p>La mise en évidence de cette nouvelle voie de signalisation pro-apoptotique pourrait avoir des implications importantes dans d’autres aspects de la biologie du développement et des cellules souches, ainsi que dans l’oncogénèse. <p> / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

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Les membres de la famille des 5-phosphatases d’inositols polyphosphates et de phosphoinositides sont des enzymes caractérisées par la présence de deux domaines catalytiques conservés qui hydrolysent un phosphate en position 5 sur un noyau inositol. SKIP (Skeletal Muscle and Kidney enriched Inositol Phosphatase), également appelée Pps (Putative PI 5-phosphatase) est un des derniers membres de la famille des 5-phosphatases à avoir été découvert à ce jour. Cette enzyme hydrolyse majoritairement le phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P2) et le phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate (PtdIns(3,4,5)P3). Les phosphoinositides (PtdIns) représentent environ 10% des lipides membranaires et sont impliqués dans de nombreuses cascades de signalisation cellulaire conduisant, entre autres, à la prolifération, l’apoptose, la différenciation, la sécrétion, le trafic vésiculaire et la mobilité cellulaire.<p>Des études de surexpression de SKIP en cellules tendent à montrer que cette protéine pourrait jouer un rôle de régulateur négatif dans la formation du cytosquelette d’actine et/ou dans la voie de signalisation de l’insuline. <p><p>Afin d’étudier in vivo la fonction de la protéine SKIP chez la souris, nous avons décidé de générer des souris transgéniques surexprimant cette protéine de manière conditionnelle. Dans ce but, nous avons infecté des embryons murins par des lentivirus porteurs d’un transgène SKIP et avons obtenu, après réimplantation des embryons infectés dans des femelles pseudogestantes, deux lignées de souris transgéniques. Celles-ci ont ensuite été croisées avec des souris exprimant la recombinase Cre de manière ubiquitaire afin de pouvoir activer la transcription de SKIP dans l’ensemble des organes. Des expériences de Western blot, de dosage d’activité 5-phosphatase ainsi que des PCR en temps réel sont venus confirmer la présence de la protéine transgénique et de son activité catalytique.<p>L’ensemble des expériences qui ont été menées du point de vue phénotypique tend à montrer que dans notre modèle, la surexpression de SKIP ne provoque aucune anomalie évidente du point de vue anatomique, glycémique ou immunologique. Toutefois, des expériences concernant la physiologie rénale ont été réalisées sur base des résultats d’immunohistochimie et nous ont permis de détecter une anomalie dans les mécanismes de réabsorption d’eau ainsi que dans l’expression et la phosphorylation des canaux hydriques AQP2.<p> / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished