La microsporidie Encephalitozoon cuniculi, parasite intracellulaire obligatoire, pathogène de l'homme, est responsable d'infections opportunistes chez des sujets immunodéprimés. Sa spore est protégée par une épaisse paroi protéo-chitineuse pour laquelle peu de données sur les constituants protéiques sont disponibles. Dans ces travaux, nous avons décrit le protéome exprimé dans les stades tardifs de développement d'E. cuniculi. Grâce à des extractions protéiques séquentielles et une double stratégie d'analyse protéomique, après électrophorèse et "Shotgun", 177 protéines différentes ont pû être identifiées, permettant d'obtenir une vision globale de la physiologie de la spore. L'exploitation de ces données et le développement d'un crible bioinformatique a permis l'identification de 4 protéines de paroi. Le premier modèle dynamique de morphogenèse de la paroi microsporidienne a été proposé grâce au suivi de la localisation de ces protéines durant le cycle de développement

Le dépôt d'énergie cinétique d'un projectile rapide dans une cible conduit à l'éjection de matière sous forme d'atomes ou d'agrégats ("pulvérisation"). La mesure des rendements, des distributions en énergie et en angle des particules pulvérisées contribuent à comprendre le processus microscopique de l'endommagement et de la création de défauts dans les matériaux. Un nouveau dispositif expérimental ultra vide (AODO) permet de mesurer les distributions en masse et les vecteurs vitesse de chaque ion secondaire émis par technique d'imagerie XY-TOF-SIMS ("Secondary Ion Mass Spectroscopy"). Ici, nous nous intéressons à la pulvérisation du fluorure de lithium (isolant cristallin "modèle" à gap très important ≈ 14 eV) irradié par des ions lourds rapides (≈ 10 MeV/u). En fonction du pouvoir d'arrêt Se, deux régimes de l'évolution des rendements de pulvérisation Y des ions secondaires sont observés. Pour les faibles Se (< 8 keV/nm), régime de faible perturbation, Y ~ Se^ 2. Pour les forts Se (> 8 keV/nm), régime de forte perturbation, une saturation (Y = constante) est observée. Les données expérimentales permettent aussi de tester des modèles théoriques proposés dans la littérature (le modèle de l'onde de choc, pointe thermique, explosion coulombienne...). Il apparaît qu'aucun de ces modèles ne peut interpréter correctement l'ensemble de ces résultats. Une distribution de type Maxwell- Boltzmann décrit bien les distributions en énergie des ions secondaires. Les processus générant la pulvérisation doivent donc être principalement d'origine thermique.

La spectrométrie de masse est une technique utilisée en protéomique pour identifier des protéines inconnues dans un échantillon. Le spectromètre mesure la masse de fragments de la protéine et fournit ainsi des spectres expérimentaux qui sont des représentations, sous forme de séries de pics, de la présence de ces différents fragments. En étudiant ces spectres, nous espérons pouvoir identifier la protéine d'origine en la retrouvant dans une banque. L'objectif de cette thèse est de proposer de nouvelles méthodes permettant d'étudier ces spectres. Cependant, ces méthodes doivent fonctionner sur des organismes non séquencés. Dans ce cas particulier, nous ne retrouverons pas exactement ces protéines dans la banque, mais uniquement des protéines qui y ressemblent. Nous proposons tout d'abord un nouvel algorithme dit de comparaison de spectres : PacketSpectralAlignment. Cet algorithme permet de comparer des spectres expérimentaux à des spectres créés à partir des données contenues dans la banque, et ce, même en présence de modifications. Cette comparaison permet l'association de chacun des spectres à un peptide de cette banque. Ensuite, nous détaillerons différents prétraitements et filtrages permettant d'améliorer l'exploitation de notre nouvel algorithme. Tous ces éléments sont intégrés dans une plate-forme intitulé SIFpackets. Enfin, nous validons les résultats de PacketSpectralAlignment ainsi que de SIFpackets sur différents jeux de données réelles.

Notre laboratoire, Laboratory of Biochemical Pharmacology (LOBP), dirigé par Dr R.F. Schinazi, est spécialisé dans la recherche sur les nucléosides analogues et plus particulièrement les inhibiteurs de la transcriptase inverse. Au sein de ce laboratoire, l'équipe de pharmacologie a pour rôle d'étudier le métabolisme des molécules en développement ainsi que des molécules déjà commercialisées dans des cellules humaines en culture. Les résultats obtenus guident les chimistes vers une synthèse de composés plus actif et moins toxiques. Pour les molécules les plus avancées, comme l'amdoxovir TM , les études réalisées au laboratoire relèvent du stade II d'essai clinique. Le rôle de l'équipe analytique est de réaliser toutes les mesures liées aux essais cliniques et cellulaires. Pour cela, nous avons choisi d'utiliser des instruments permettant des mesures spécifiques avec une sensibilité suffisante pour mesurer des quantités de l'ordre du ppb. Notre choix s'est donc porté sur la chromatographie haute performance en phase liquide couplée à un spectromètre de masse de type triple quadrupôle. Puisque seuls les métabolites phosphorylés des nucléosides analogues sont actifs dans les cellules, il fut nécessaire de développer une méthode pour analyser ces composés polaires. Cette méthode, présentée dans le premier chapitre, permet l'analyse simultanée de la plupart des métabolites de nucléosides analogues commercialisés, ceux de l'amdoxovir et des nucléotides naturels présents dans les cellules. Les limites de détections sont telles que de très faibles niveaux de triphosphates ont pu être quantifiés dans les macrophages. Ces résultats sont présentés à la fin du second chapitre. Dans le deuxième chapitre, nous avons voulu approfondir nos connaissances sur le métabolisme de l'amdoxovir dans les lymphocytes. Pour cela, nous avons testé l'amdoxovir en présence de nucléosides susceptible d'inhiber sa phosphorylation. Puis nous avons établit l'absence d'interaction directe entre l'amdoxovir et trois autres nucléosides analogues commercialisés. Finalement, des études plus poussées sur les nucléotides naturels donnent une indication pour expliquer les effets synergiques entre l'amdoxovir et la zidovudine. Dans le dernier chapitre, nous présentons le développement et la validation d'une méthodologie permettant de mesurer simultanément les niveaux d'amdoxovir, de son métabolite principal et de la zidovudine dans des échantillons de plasma humain. Cette méthode a été appliquée à une étude clinique dont les résultats sont brièvement décrits.

La barrière entre l'aspect bénéfique du sélénium (Se) et son aspect toxique est étroite. Afin de mieux contrôler les apports de cet élément dans l'alimentation, de nombreux travaux s'intéressent à la compréhension de son métabolisme. Cette thèse présente le développement et l'optimisation de méthodes d'analyse des espèces séléniées dissoutes et volatiles présentes dans l'urine de sujets non supplémentés. Le couplage entre la chromatographie liquide et la spectrométrie de masse atomique précédé d'un prétraitement de l'échantillon par extraction sur phase solide a permis non seulement de confirmer la présence de métabolites séléniés précédemment détectés dans l'urine de sujets supplémentés mais également, de mettre en évidence des composés inconnus. Un de ces composés a été identifié par spectrométrie de masse moléculaire. Les couplages entre la chromatographie gazeuse et les spectrométries de masse atomique et moléculaire, précédés d'une micro-extraction sur phase solide ont été utilisés pour l'analyse des formes volatiles de Se. Ces méthodes ont permis de confirmer la présence de composés séléniés et mixtes Se/S dans les urines de sujets non supplémentés et, de définir des conditions de stockage permettant de préserver la spéciation originelle dans l'échantillon.

Les acides aminés forment une des plus importantes classes de molécules naturelles. Ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques dont le plus important est sans doute l'élaboration des peptides et protéines. Ils sont pour la plupart dépourvus de groupements chromophores, aussi, la majorité des méthodes chromatographiques proposées pour leur détermination en mélanges implique une dérivation pré- ou post colonne permettant alors une détection spectrophotométrique.<br />Pour éviter l'étape de dérivation, la Chromatographie en Phase Liquide (CPL) est ici associée au Détecteur Evaporatif à Diffusion de la Lumière (DEDL) ou couplée à la Spectrométrie de Masse (SM). Ces deux modes de détection sont quasi universels mais requièrent la mise au point de phases mobiles volatiles.<br />Parmi les systèmes CPL testés pour l'analyse directe des acides aminés, le carbone graphitique poreux a été retenu et évalué comme phase stationnaire. Une phase mobile aqueuse saline, volatile, composée d'acétate d'ammonium, ajustée à pH=9,3, permet notamment la séparation d'acides aminés soufrés analogues de la taurine et la séparation partielle d'acides aminés protéiques. En revanche, la séparation totale des 20 acides aminés protéiques est obtenue avec une phase mobile contenant un acide carboxylique perfluoré (acide nonafluoropentanoique) comme agent d'appariement d'ions volatil, en gradient d'élution, à 10°C, en une quarantaine de minutes.<br />Les systèmes CPL mis au point avec le DEDL sont directement compatibles avec la SM. En utilisant la spécificité de détection de la SM et la SM tandem, l'analyse des acides aminés protéiques est possible en 20 minutes. Si le DEDL ne permet pas de descendre à des concentrations détectées inférieures au mg/l, la SM tandem autorise des limites de détection avoisinant quelques dizaines de µg/l seulement. La CPL-SM tandem a permis le dosage direct d'acides aminés soufrés dans des invertébrés marins.

L'acide désoxyribonucléique (ADN) est porteur de l'information génétique et les conséquences biologiques des lésions survenant sur cette molécule peuvent être importantes. Nous avons utilisé la chromatographie liquide haute performance couplée à la spectrométrie de masse en mode tandem (CLHP/SM-SM) pour mettre en évidence la formation de nouvelles lésions radio-induites de l'ADN. L'analyse par CLHP/SM-SM en mode « perte de neutre » utilise la perte de 116 unités de masse, spécifique de la fragmentation de la majorité des nucléosides. Ainsi, 4 nouvelles lésions radio-induites, dont la quantité formée est proportionnelle à la dose d'irradiation, ont été détectées dans l'ADN isolé. L'une d'elles, la dCyd341 est de plus formée dans l'ADN cellulaire. Il s'agit d'une modification de la 2'-désoxycytidine (dCyd) ayant un poids moléculaire de 341 uma. La synthèse chimique de ce nucléoside modifié nous a permis de le caractériser par résonance magnétique nucléaire (RMN) et de déterminer sa masse exacte. Un mécanisme de formation a été proposé, dans lequel l'évènement initiateur est l'arrachement de l'atome d'hydrogène en position 4 du 2-désoxyribose (dR) génèrant un intermédiaire aldéhydique capable de réagir sur une cytosine voisine. La dCyd341 peut être considérée comme un dommage complexe, sa formation impliquant une cassure de la chaîne d'ADN et un pontage entre un produit de modification du dR et une dCyd voisine. En plus de sa caractérisation, de premières études biologiques portant sur la réparation de la dCyd341 ont révélé que la lésion est excisée de l'ADN avec une certaine efficacité.

Les interactions non-covalentes (NCI pour Non-Covalent Interactions) stabilisant les complexes non-covalents biologiques (NCX pour Non-Covalent compleXes) régissent la majorité des processus cellulaires indispensables au développement et au bon fonctionnement de tout organisme vivant. Toutes les fonctions de l'ADN, tels que son conditionnement, sa réplication et la régulation de son expression, sont permises par la formation et la dissociation de NCI avec des protéines. La compréhension des bases de ces processus cellulaires de l'ADN au niveau moléculaire est un sujet d'actualité et d'une importance fondamentale. Des informations essentielles peuvent être obtenues par spectrométrie de masse (MS pour Mass Spectrometry) qui joue un rôle de plus en plus important dans ce domaine. Malgré la technologie avancée déjà mise en ¿uvre, le développement de nouveaux concepts d'ionisation et d'activation implémentent perpétuellement la MS. Les travaux de thèse exposés à travers ce manuscrit présente l'étude de la stabilité des NCI maintenant les NCX biologiques par la comparaison des voies de fragmentations observées en mode positif et en mode négatif mais aussi par l'application de certains concepts récents de la MS comme : (i) l'utilisation d'agents de " superchargement " et, (ii) le développement et l'utilisation d'une source V-EASI (pour Venturi Easy Ambiant Sonic-spray Ionization) permettant l'aspiration libre de la solution et la désorption/ionisation des analytes par la seule vélocité du gaz de nébulisation.

Certains médicaments en se métabolisant dans le corps forment des métabolites dits « réactifs » (MR) qui peuvent entraîner une toxicité en se liant de manière covalente à des protéines pour former des adduits. Notre étude se concentre sur l'analyse d'adduits formés à partir d'une protéine sanguine : la sérum albumine humaine. En particulier, les adduits formés au niveau du site actif de l'albumine situé sur la cystéine en position 34. L'objectif principal de ce travail était de mettre en place une méthode d'analyse en chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) permettant la détection et la caractérisation des adduits peptidiques issus de la sérum albumine modifiée. Le travail a consisté tout d'abord à valider par des réactions in vitro la formation d'adduit issus de médicaments connus pour former des MR avec un antioxydant naturel : le glutathion (GSH). En parallèle, en mimant le site actif de la sérum albumine humaine avec un peptide synthétique, le QQCPF, le profil de fragmentation en LC-MS/MS des adduits formés avec le QQCPF ont été comparé avec ceux obtenus par le GSH et ont permis de le valider comme agent de trappage. Pour de futures réactions in vivo, l'identification des adduits d'albumines en LC-MS implique une étape de digestion de l'albumine en peptides, le protocole de digestion de l'albumine en comparant plusieurs enzymes a été optimisé pour l'analyse en LC-MS des peptides digérés comportant la cystéine 34. Par ailleurs, une méthode de quantification de ce peptide modifié a été mise en place par l'introduction d'un étalon interne provenant d'une autre espèce d'albumine, l'albumine de rat. Le but ultime est que la sérum albumine soit utilisée comme biomarqueur sanguin de toxicité en utilisant cette méthodologie qui permettra avec un prélèvement sanguin d'identifier à partir de la sérum albumine humaine modifiée, la toxicité du médicament ingéré et ainsi améliorer la prévention de risque du médicament. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Sérum albumine, métabolite réactif, adduits, liaison covalente, spectrométrie de masse, fragmentation, séquençage, chromatographie liquide.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal