Certains médicaments en se métabolisant dans le corps forment des métabolites dits « réactifs » (MR) qui peuvent entraîner une toxicité en se liant de manière covalente à des protéines pour former des adduits. Notre étude se concentre sur l'analyse d'adduits formés à partir d'une protéine sanguine : la sérum albumine humaine. En particulier, les adduits formés au niveau du site actif de l'albumine situé sur la cystéine en position 34. L'objectif principal de ce travail était de mettre en place une méthode d'analyse en chromatographie liquide haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) permettant la détection et la caractérisation des adduits peptidiques issus de la sérum albumine modifiée. Le travail a consisté tout d'abord à valider par des réactions in vitro la formation d'adduit issus de médicaments connus pour former des MR avec un antioxydant naturel : le glutathion (GSH). En parallèle, en mimant le site actif de la sérum albumine humaine avec un peptide synthétique, le QQCPF, le profil de fragmentation en LC-MS/MS des adduits formés avec le QQCPF ont été comparé avec ceux obtenus par le GSH et ont permis de le valider comme agent de trappage. Pour de futures réactions in vivo, l'identification des adduits d'albumines en LC-MS implique une étape de digestion de l'albumine en peptides, le protocole de digestion de l'albumine en comparant plusieurs enzymes a été optimisé pour l'analyse en LC-MS des peptides digérés comportant la cystéine 34. Par ailleurs, une méthode de quantification de ce peptide modifié a été mise en place par l'introduction d'un étalon interne provenant d'une autre espèce d'albumine, l'albumine de rat. Le but ultime est que la sérum albumine soit utilisée comme biomarqueur sanguin de toxicité en utilisant cette méthodologie qui permettra avec un prélèvement sanguin d'identifier à partir de la sérum albumine humaine modifiée, la toxicité du médicament ingéré et ainsi améliorer la prévention de risque du médicament. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Sérum albumine, métabolite réactif, adduits, liaison covalente, spectrométrie de masse, fragmentation, séquençage, chromatographie liquide.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Un défi majeur de l’ère post-génomique est de définir l’ensemble des protéines encodées par le génome : le protéome. Un ARNm mature est en général associé à un seul cadre ouvert de lecture (ORF, open reading frame en anglais) de référence (RefORF) codant pour une protéine. Des ORFs alternatifs (AltORFs) sont cependant présents dans les régions non-traduites (UTRs), ou chevauchant le RefORF dans les cadres de lecture alternatifs +2 et +3. Les AltORFs offrnt le potentiel d’augmenter la diversité protéique, mais leur réelle contribution au protéome est peu caractérisée. Par des techniques de biologie moléculaire, de biochimie, et de biologie cellulaire, j'ai tout d’abord mis en évidence chez plusieurs mammifères supérieurs, l’expression endogène d'une protéine alternative appelée AltPrP à partir du gène PRNP. La découverte d'AltPrP devrait améliorer notre compréhension des rôles pathologiques et physiologiques de ce gène. Suite à la découverte d'AltPrP, et basé sur ce modèle d’AltORF chevauchant un RefORF, j'ai entrepris d’investiguer l’étendue de l’utilisation de ces AltORFs comme source de diversité protéique, chez l’humain en particulier. Par des méthodes computationnelles, j'ai participé à la création d'une base de données d'AltORFs prédits dans les ARNm humains (HA1tORF, pour Human Alternative ORFs). HA1tORF est consultable et interrogeable en ligne. Elle facilitera et accélérera la découverte et l’étude des AltORFs. J'ai ensuite mis au point une approche protéomique afin d'apporter des preuves expérimentales de l’utilisation à grande échelle des AltORFs. Une base de données d’AltORFs, mise à jour pour inclure ceux chevauchant en tout ou partie les UTRs, a été créée et utilisée pour déterminer par spectrométrie de masse la contribution des protéines alternatives au protéome humain. J'ai validé l’expression de 1259 protéines alternatives prédites à travers différents échantillons. J'ai aussi démontré que l’expression d'AltORFs impliquait d’importants biais dans les dessins expérimentaux (transfections ou criblage de banques d’ADNc par exemple). Enfin, un grand nombre de protéines alternatives semblent conservées à travers l’évolution, suggérant leur importance fonctionnelle. En conclusion, mes travaux de doctorat ont permis de mettre en évidence que les AltORFs conduisent à l’expression de nouvelles protéines jusqu’alors ignorées. Ces résultats redéfinissent notre vision du protéome, remettent en question notre compréhension de la structure et de la fonction des gènes eucaryotes, et ouvrent la voie vers l’étude fonctionnelle des protéines alternatives.

Ce travail de thèse a été focalisé sur le développement d'approches MS et IM-MS supramoléculaires pour la caractérisation fine des interactions protéine/ligand et pour l'analyse de mélanges protéiques complexes. La maîtrise des instruments de MS supramoléculaire ainsi que les optimisations instrumentales et méthodologiques réalisées ont permis d'étendre le potentiel des approches MS et IM-MS pour la caractérisation d'assemblages moléculaires particulièrement complexes. Nous avons ainsi pu suivre la cinétique de formation de complexes protéine/ligand ainsi que les changements conformationnels qui y sont associés, montrant l'intérêt du couplage IM-MS en recherche pharmaceutique. De plus, ce travail a porté sur l'étude de complexes de très hauts poids moléculaires et l'évaluation de l'IM-MS pour obtenir des informations structurales sur ces complexes. Nous avons ainsi permis de repousser certaines limites de la MS et de placer cette technique au cœur des études de biologie structurale.

L'objectif de mon travail a été de développer, réaliser et tester un spectromètre de masse neutre afin d'étudier les exosphères planétaires : NIMEIS (Neutral and Ion Mass and Energy Imaging Spectrometer). Les particules présentes dans les exosphères planétaires peuvent s'interpréter comme la signature des processus d'interaction entre l'environnement des objets planétaires et leur atmosphère et/ou surface. Un instrument de mesure, capable de déterminer la masse et l'énergie des particules de l'exosphère a été imaginé afin d'identifier et caractériser ces processus. Un modèle numérique d'un spectromètre de masse et d'énergie pour la mesure des neutres et ions exosphériques a été développé afin de répondre aux objectifs instrumentaux imposés par notre connaissance de ces processus. A partir du modèle numérique obtenu, un prototype a été réalisé et des tests ont été effectués. En parallèle, j'ai travaillé sur le développement d'une source d'ionisation, également nécessaire pour le fonctionnement optimal du spectromètre de masse neutre, basée sur l'utilisation de nanotubes de carbone comme émetteurs d'électrons. Nous travaillons en collaboration avec un laboratoire Sud Coréen qui produit les nanotubes de carbone. Mon travail a permis de définir, concevoir et modéliser différents types de dispositifs pour parfaire l'extraction des électrons. J'ai également travaillé sur la définition et l'optimisation du modèle numérique de l'optique de l'instrument PICAM (Planetary Ion CAMera). PICAM est un spectromètre de masse d'ions de la mission Bepi-Colombo ayant pour objectif d'étudier l'exosphère ionisée de Mercure. La particularité de cet instrument est de mesurer la masse, l'énergie et de produire une image instantanée d'un champ de vue hémisphérique. L'optimisation du modèle s'est faite à partir d'un modèle numérique en partant du design de l'instrument DION de la mission Phobos-Grunt (Vaisberg et al. 2010). L'objectif de cette optimisation a consisté en la recherche d'une augmentation du facteur géométrique, indispensable dans le cadre de l'exploration de Mercure.

"Que peut-on apprendre en collant des atomes sur des agrégats ?". Le travail présenté ici répond (partiellement) à cette question. Grâce à un dispositif expérimental original, nous pouvons contrôler les réactions de collage entre un atome et un agrégat libre, sélectionné en masse et thermalisé. Cela nous permet mesurer des sections efficaces absolues pour ces réactions de collage. Nous montrons que, dans le cas d'agrégats de sodium, la section efficace mesurée suit une loi différente de celle prévue par le modèle géométrique généralement utilisé : le modèle de sphères dures. Nous expliquons en partie cette différence dans le cadre d'un modèle de harponnage et nous discutons l'influence de cette loi d'échelle non-géométrique sur la description des processus de nucléation et dans le cadre des théories<br />microréversibles décrivant l'évaporation des agrégats.<br />La maîtrise de réactions de collage ouvre d'autre part la possibilité de réaliser des expériences de nanocalorimétrie et donc de caractériser des transitions de phase dans les agrégats. Nous montrons en effet qu'il est possible de déterminer la capacité calorifique d'un agrégat en comptant simplement le nombre d'atomes que l'on peut coller dessus.<br />La méthode de mesure qui en découle s'avère au moins aussi précise que les deux autres méthodes existantes. Dans le cas des agrégats de sodium, nous pouvons ainsi mesurer les températures et chaleurs latentes de fusion pour des agrégats aussi petits que Na30+. Les résultats obtenus sont discutés dans le cadre d'un modèle à deux niveaux pour la fusion.

Ce manuscrit expose le développement de méthodes bidimensionnelles en ligne pour l'analyse de composés chargés en couplage avec la spectrométrie de masse. Le contexte de l'étude et les principes théoriques de la chromatographie en phase liquide unidimensionnelle et bidimensionnelle sont tout d'abord présentés. Les conditions expérimentales telles que l'instrumentation, les colonnes, les composés étudiés sont détaillés. Des études unidimensionnelles ont été effectuées afin de connaître le comportement cinétique des petites molécules ionisables et des peptides selon la phase mobile et la température. L'orthogonalité de systèmes chromatographiques et les capacités de pics générées ont ensuite été étudiés afin de connaître les conditions expérimentales les plus intéressantes pour l'analyse des composés chargés. Les comparaisons de systèmes ont été effectuées avec de nouveaux descripteurs d'orthogonalité et de capacité de pic effective qui ont été établit. Les systèmes bidimensionnels LCxLC ont ensuite été mis en place. L'utilité d'un split pour réduire le volume injecté en seconde dimension est envisagée. Des limites en termes de volume injecté dans la seconde dimension ont été définies en RPLC et en HILIC. Des mélanges de peptides ont été séparés par RPLCxRPLC(-MS), RPLCxHILIC(-MS) et HILICxRPLC. Le couplage avec la spectrométrie de masse est optimisé. L'intérêt des séparations bidimensionnelles est mis en évidence par rapport à des séparations LC-MS classiques

Dans le cadre de la protection de l'environnement et du consommateur, CTC effectue des tests enchimie analytique sur de nombreux paramètres en matrices aqueuses, cuir et textile. Les nouvelles substancesmises sur le marché ainsi que les réglementations évoluant sans cesse, le développement de nouvellesméthodes d'analyses est donc nécessaire.Plusieurs méthodes analytiques ont ainsi été développées. Pour l'analyse des rejets d'effluents industriels desinstallations classées et pour l'analyse d'innocuité de produits utilisant le cuir ou le textile (chaussures,maroquinerie, prêt-à-porter...).Les chloroalcanes ont été dosés en chromatographie gazeuse (GC) associée à la spectrométrie de masse (MS)utilisant l'ionisation chimique, à la fois en matrices aqueuses (limite de quantification, LQ, à 0,6 μg/l) et sur lescuirs (LQ à 2 mg/kg).Une analyse des alkylphénols et alkylphénols ethoxylates a été développée pour les matrices aqueuses parGC/MS (LQ à 0,05 μg/l).Plusieurs familles de retardateurs de flammes ont ensuite été étudiées. Les polybromodiphénylethers peuventêtre dosés dans les eaux (LQ<0,05 µl) et le cuir (LQ <= µg/kg), par GC/MS en ionisationchimique.L'hexabromocyclododécane et des organophosphates, par chromatographie liquide et spectrométrie de masseen tandem pour des matrices textiles (LQ à 6 mg/kg). Des hydrocarbures aromatiques polycycliques dans le cuir ont ensuite été analysés par GC/MS-MS (LQ à 250 μg/kg).Enfin, une méthode multirésidus portant sur plusieurs familles de micropolluants organiques a été mise aupoint en GC/MS pour les rejets d'effluents (LQ <0,1 µg/l)

La spectrométrie de masse, en particulier le couplage HPLC/MRM3, est un outil bien adapté au diagnostic in vitro, particulièrement en microbiologie clinique. L'utilisation en routine de cette technologie est cependant tributaire de sa sensibilité et de sa spécificité. Ce travail de thèse a pour objectif d'étudier la possibilité d'éjecter et de détecter simultanément et de façon sélective des ions de ratio masse/charge donnés, ceux-ci étant confinés dans un piège ionique quadrupolaire. Cette approche permet de supprimer les étapes de balayage en masse et d'intégration mathématique du signal en mode MRM3 ce qui permet de gagner à la fois en sensibilité et en spécificité (en diminuant le temps de cycle et en diminuant le rapport signal sur bruit). Cet objectif a été poursuivi premièrement par une étude théorique approfondie des équations du mouvement des ions dans un piège radiofréquence ; deuxièmement par une étude numérique de la stabilité de ces équations et enfin troisièmement par une validation expérimentale de ces résultats théoriques. La présentation de ces trois approches fait l'objet du présent mémoire

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective des motoneurones et impliquant les effets neurotoxiques des astrocytes. Le but de ce travail est d’explorer les altérations du métabolisme dans les astrocytes induites par des conditions associées à la SLA. Nous avons dans un premier temps mis en place une méthodologie d’analyse spectrométrique (résonance magnétique nucléaire et spectrométries de masse) du métabolome cellulaire. Ensuite, nous avons invalidé les cellules NSC-34 comme modèle in vitro d’étude de l’excitotoxicité induite par le glutamate. Nous avons enfin étudié les altérations métaboliques dans les astrocytes primaires dans des conditions de la SLA et décrit plusieurs dysfonctionnements métaboliques dans ces cellules induits par l’expression de la mutation SOD1G93A, par la présence des motoneurones sauvages et par l’exposition au glutamate. Ce travail met en évidence les relations métaboliques entre la SLA et le métabolisme énergétique cérébral. Nos résultats contribuent à la compréhension des altérations métaboliques des astrocytes dans la SLA et pourraient aider à appréhender de nouvelles cibles thérapeutiques associées aux altérations métaboliques dans la SLA, afin de protéger les motoneurones des perturbations induites par le glutamate. / The selective degeneration of motoneuron that characterizes amyotrophic lateral sclerosis (ALS), implicates non-cell-autonomous effects of astrocytes. The aim of this work is to explore the metabolic status of astrocytes exposed to ALS-associated conditions, using metabolomics approach. We first, developed a methodology for the analysis of cellular metabolome using different analytical technologies, and then we evaluated the relevance of differentiated NSC-34 as an in vitro model for glutamate excitotoxicity studies. Finally, we evaluated metabolic alterations in astrocytes in ALS-associated conditions and we described several metabolic dysfunctions in these cells induced by the expression of a SOD1G93A mutation, the presence of wildtype motoneurons and glutamate exposition. These studies highlight major impacts of ALS on the brain energetic metabolism. This work provides novel insight for understanding the metabolic dysfunction of astrocytes in ALS conditions and opens perspective of therapeutics targets though focus on these metabolic ways, in order to protect motoneurons from glutamate injury.