Abstract : The chymase-dependant pathway responsible for converting Big ET-1 to ET-1 was established in vitro. It has only been recently, in 2009, that our group demonstrated that the conversion of Big ET-1 to ET-1 (1-31) can occur in vivo in mice (Simard et al., 2009), knowing that ET-1 (1-31) is converted to ET-1 via NEP in vivo (Fecteau et al., 2005). In addition, our laboratory demonstrated in 2013 that mMCP-4, the murine analogue of human chymase, produces ET-1 (1-31) from the Big ET-1 precursor (Houde et al. 2013). Thus far, in the literature, there are no specific characterizations of recombinant chymases (human or murine). In fact, the group of Murakami published in 1995 a study characterizing the CMA1 (human chymase) in a chymostatin-dependent fashion, using Angiotensin I as a substrate (Murakami et al., 1995). However, chymostatin is a non-specific inhibitor of chymase. It has been shown that chymostatin can inhibit elastase, an enzyme that can convert Angiotensin I to Angiotensin II (Becari et al., 2005). Based on these observations, the proposed hypothesis in the present study suggests that recombinant as well as extracted CMA1 from LUVA (human mast cell line), in addition to soluble fractions of human aortas, convert Big ET-1 into ET-1 (1-31 ) in a TY-51469 (a chymase-specific inhibitor) sensitive manner. In a second component, we studied the enzyme kinetics of CMA1 with regard to the Big ET-1 and Ang I substrate. The affinity of CMA1 against Big ET-1 was greater compared to Ang I (KM Big ET- 1: 12.55 μM and Ang I: 37.53 μM). However, CMA1 was more effective in cleaving Ang I compared to Big ET-1 (Kcat / KM Big ET-1: 6.57 x 10-5 μM-1.s-1 and Ang I: 1.8 x 10-4 ΜM-1.s- 1). In a third component involving in vivo experiments, the pressor effects of Big ET-1, ET-1 and Ang I were tested in conscious mMCP-4 KO mice compared to wild-type mice. The increase in mean arterial pressure after administration of Big ET-1 was greater in wild-type mice compared to mMCP- 4 KO mice. This effect was not observed after administration of ET-1 and / or Ang I. / Résumé : La voie de conversion de Big ET-1 en ET-1, chymase dépendante a été établie in vitro. Ce n'est que récemment, en 2009 que notre groupe a démontré que la conversion de Big ET-1 en ET-1 (1-31) peut avoir lieu in vivo chez la souris (Simard et al., 2009), sachant que ET-1 (1-31) est convertie en ET-1 via NEP in vivo (Fecteau et al., 2005). En plus, en 2013, notre laboratoire a démontré que la mMCP- 4, l'analogue murin de la chymase humaine, produit l'ET-1 (1-31) à partir du précurseur Big ET-1 (Houde et al., 2013). Jusqu'a présent, dans la littérature, on ne trouve pas de caractérisations spécifiques de chymases (humaine ou murine) recombinantes. En fait, le groupe de Murakami, en 1995, a publié une étude caractérisant, d'une façon chymostatin dépendante, la CMA1 (chymase humaine) en utilisant l'Angiotensine I comme substrat (Murakami et al., 1995). Cependant, le chymostatin est un inhibiteur non-spécifique de la chymase. Il a été démontré que le chymostatin peut inhiber l'élastase, une enzyme pouvant convertir l'Angiotensine I en Angiotensine II (Becari et al., 2005). Basé sur ces observations, l'hypothèse formulée dans la présente étude est que la CMA1 recombinante ou extraite des cellules LUVA (lignée humaine de mastocytes) ou des fractions solubles des aortes humaines convertit la Big ET-1 en ET-1 (1-31) d'une façon TY-51469 (un inhibiteur spécifique de la chymase) sensible. Dans un deuxième volet, on a étudié la cinétique enzymatique de CMA1 en vers le substrat Big ET-1 et Ang I. L’affinité de CMA1 contre la Big ET-1 était plus grande comparé à l’Ang I (KM Big ET-1 : 12.55 μM et Ang I : 37.53 μM). Cependant CMA1 était plus efficace dans le clivage de l’Ang I comparé à la Big ET-1 (Kcat/KM Big ET-1 : 6.57 x 10-5 μM-1 .s-1 et Ang I : 1.8 x 10-4 μM-1 .s-1 ). Dans un troisième volet impliquant des expériences in vivo, l’effet presseur de la Big ET-1, l’ET-1 et l’Ang I a été testé chez des souris conscientes mMCP- 4 KO comparé à des souris de type sauvage. L’augmentation de la pression artérielle moyenne a été plus importante chez les souris de type sauvage après l’administration de Big ET-1 que chez les souris mMCP-4 KO. Cet effet n’a pas été observé après l’administration d’ET-1 et/ou d’Ang I ce qui explique le rôle de la chymase dans l’effet de la conversion de Big ET-1 en ET-1 (1-31).

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Depuis l'avènement des techniques d'ionisation douces comme le MALDI ou l'ESI, la spectrométrie de masse est devenue un outil incontournable pour l'étude des biomolécules, et en particulier, des protéines. Le mécanisme d'ionisation spécifique des sources MALDI introduit un phénomène de discrimination spectrale généralement considéré comme un frein. Le greffage d'un motif α-cyano 4-hydroxy cinnamique ou HCCA sur un peptide permet d'en tirer parti en créant une discrimination spectrale favorable au composé marqué. Deux applications du marquage HCCA ont été développées au cours de ce travail de thèse.Une des limitations des études phosphoprotéomiques réside dans la faible ionisation des peptides phosphorylés. De nombreuses méthodes de purification ont été proposées pour contourner ce problème. Nous avons étudié une approche alternative qui consiste à greffer spécifiquement un motif HCCA sur une position phosphorylée afin d'amplifier les signaux des peptides d'intérêt. Nous avons développé en parallèle une méthodologie pour l'étude de la liaison d'un ligand peptidique à son récepteur ne nécessitant pas de radioactivité. Le greffage covalent d'HCCA sur un ligand nous a permis de le détecter et de le quantifier dans une expérience de déplacement. Cette méthodologie a notamment permis de déterminer l'affinité d'un ligand de référence pour le récepteur V1A à la vasopressine. / Since the advent of soft ionization techniques such as MALDI or ESI, mass spectrometry has become an indispensable tool for the study of biomolecules, and particularly proteins. The specific ionization mechanism of MALDI leads to a spectral discrimination phenomenon generally regarded as a restriction. The α-cyano 4-hydroxy cinnamic acid (HCCA) pattern grafting on a peptide can take advantage by introducing a spectral discrimination in favor of the labeled compound. Two applications have been developed during this thesis, based on HCCA tagging.A limitation of phosphoproteomic studies is the low ionization of phosphorylated peptides. Many purification methods have been reported to circumvent this problem. We studied an alternative approach which consists in specifically grafting a HCCA moiety on a phosphorylated position in order to amplify the signal of interest peptide.At the same time, we have developed a methodology for the study of ligand peptidic binding to its receptor which does not require radioactivity. The covalent HCCA tagged ligand has allowed us to detect and quantify it, in a binding displacement assay. More particularly, this methodology allowed us to determine the affinity of a reference ligand for the V1A vasopressin receptor.

En recherche clinique ou environnementale, les biomarqueurs protéiques présentent un intérêt croissant. Bien que les immuno-dosages restent les méthodes de référence pour leur quantification, les récentes avancées en spectrométrie de masse (MS) font de cette technique une alternative crédible à l’ELISA. Ce travail apporte quelques éléments méthodologiques pour repousser certaines limitations de la MS. D’abord, deux dosages ont été proposés. Celui réalisé chez G. fossarum représente le premier exemple de dosage de la Vitellogénine chez un invertébré par LC-MS/MS. L’un des défis de la méthode présentée est de doser spécifiquement une protéine dans un organisme dont le génome est majoritairement inconnu. Le second dosage concerne les peptides contenant une méthionine. Nous avons développé un protocole d’oxydation des méthionines afin de s’affranchir du biais lié à leur oxydation partielle. Cette méthode a ensuite été appliquée à une protéine impliquée dans la maladie d’Alzheimer (l’Apolipoprotéine E4) dans une cohorte de 673 plasmas. Ce dosage est à ce jour l’une des plus grandes études réalisées par LC-MS/MS et montre toute la robustesse de cette approche. Enfin, l’influence de la phase mobile sur la sensibilité des dosages de peptides a été étudiée : d’abord en phase inverse, où le méthanol est une bonne alternative à l’acétonitrile ; ensuite en HILIC, où les difficultés liées à l’étude d’ions multichargés en milieu majoritairement organique ont été abordées. Les problèmes liés à la capacité de charge des colonnes ont également été soulevés. La chromatographie HILIC reste prometteuse pour la quantification de peptides puisqu’un facteur dix en sensibilité peut être apporté. / Both in clinical and environmental research, protein biomarkers are of growing interest. Although immunoassays are the gold standard for their quantification, recent advances in mass spectrometry (MS) make this technique a viable alternative to ELISA. This work provides some methodological elements to eliminate some limitations of the MS approach. First, two assays have been proposed. The first one achieved for G. fossarum represents the first example of quantification of vitellogenin in an invertebrate by LC-MS/MS. One of the challenges of the presented method is to specifically assay a protein in an organism whose genome is largely unknown. The second assay relates to methionine-containing peptides. A protocol was developped for total oxidation of methionines in order to overcome the bias due to their partial oxidation. This method was then applied to a protein involved in Alzheimer's disease (Apolipoprotein E4) in a cohort of 673 plasma samples. This assay is to date one of the largest study carried out by LC-MS/MS and shows all the robustness of this approach. Lastly, the influence of the mobile phase on the sensitivity of peptides assays was studied: first in reversed phase, where methanol is a good alternative to acetonitrile; then in HILIC, where the difficulties associated with the study of multicharged ions in a mainly organic content were discussed. Problems related to the carrying capacity of the columns were also raised.

Cette thèse confidentielle public/privé porte sur l’étude des sources biologiques de la palytoxine (PlTX) dont l’identification est nécessaire afin de développer un protocole industriel standardisé permettant d’obtenir des quantités importantes de toxine pour réaliser diverses études. Premièrement, l’activité anticancéreuse in vitro de la PlTX a été évaluée sur des lignées cellulaires cancéreuses humaines et murines. La cytotoxicité de la PlTX est 106 fois plus importante sur les lignées cancéreuses par rapport aux lignées non cancéreuses témoins. La PlTX utilisée a été purifiée à partir d’une espèce encore non décrite de Palythoa, qui a été caractérisée phylogénétiquement et morphologiquement et qui fournit les quantités de PlTX pures les plus élevées à ce jour (2,8 ± 0,45 mg/g de matière fraîche). La localisation de la PlTX dans les tissus de cette espèce a été décrite par des techniques innovantes d’imagerie par spectrométrie de masse MALDI. Deuxièmement, une étude phylogénétique et une quantification de la PlTX par HPLC chez 29 échantillons de Zoantharia a été réalisée. La spectrométrie de masse ESI a permis de donner la structure chimique du type de PlTX purifiée à partir de ces échantillons. La dernière partie présente une étude préliminaire sur la culture ex hospite des endosymbiotes unicellulaires de Palythoa spp. appartenant au genre Symbiodinium afin de tester leur implication dans la synthèse de PlTX. En conclusion, il ressort que la PlTX présente un effet anticancéreux très prometteur. Le moyen le plus efficace actuellement pour obtenir de la PlTX en quantité importante est de l’extraire à partir d’une espèce de Palythoa caractérisée grâce à ce travail. / The work presented in this manuscript is the outcome of a confidential public/private collaboration. It concerns the study of biological sources of PlTX. Their identification is required to develop an industrial-standard protocol in order to obtain sufficient quantity of toxin to perform several studies. In the first part, the in vitro anti-cancer activity of PlTX was evaluated upon several human and murine cancerous cell lines. The cytotoxic activity of PlTX was 106-times more powerful against cancerous lines compared to non-cancerous control lines. The PlTX used in this work was purified from an undescribed species of Palythoa which was characterized based on phylogenetic and morphological analyses. This species produces the highest PlTX levels ever recorded (2.8 ± 0.45 mg/g fresh matter). PlTX localization in tissues of this Palythoa species was also described by innovative MALDI mass spectrometry imaging techniques. The second part presents a phylogenetic study of 29 samples of Zoantharia and quantification of PlTX by HPLC. The ESI-mass spectrometry allowed to characterize the chemical structure of the type of PlTX purified from these samples. The last part of this thesis constitutes a preliminary study on the ex hospite culture of unicellular endosymbionts belonging to the genus Symbiodinium. Ensosymbiont cells were isolated from Palythoa species containing high PlTX concentrations in order to test their implication in PlTX synthesis. In conclusion, PLTX has a very promising anticancer activity, and the best way to obtain large quantities of PlTX is the extraction from a Palythoa species characterized in this work.

Les analyses de sûreté du stockage des déchets radioactifs HAVL nécessite une évaluation à long terme (≈ 10 000 ans) des risques, pour l’homme et l’environnement, associés à une contamination des sols par le sélénium. Une méthodologie a donc été développée pour déterminer les espèces séléniées (spéciation) présentes à l’état de traces dans les sols (μg kg-1 ; contexte radiologique) et estimer, leur capacité à être lessivées et leurs phases de rétention. Combinée à l’utilisation du traceur 77Se(IV), l’existence de processus lents impliqués dans la rétention et la transformation chimique de Se dans les sols a été mise en évidence, suggérant l’étude de Se natif pour estimer et modéliser sa mobilité à long terme. L’investigation de Se natif dans 29 sols aux caractéristiques contrastées a montré l’influence de la matière organique sur la nature des espèces susceptibles d’être lessivées (organique et colloïdale) et sur sa mobilité (stabilisation de Se dans la phase solide via les associations organo-minérales). / A radioactive isotope of selenium was shown to be among the most critical radionuclide forsafety assessment of high level and long lived nuclear waste repository in case of hypotheticalsoil contamination. A methodology was thus developed to determine Se species (speciation)present in soils at trace level (μg kg-1; radiological context) in assessing their leaching andretention phases (distribution). Combined to a 77Se(IV) tracer, kinetically limited processes were shown to be involved in Se retention and chemical transformations in soils, suggesting that native Se behavior is particularly relevant for its long term mobility assessment and modeling. The investigation of native Se speciation and distribution in 29 soils has finally highlighted that soil organic matter impact the nature of Se species susceptible to be leached (organic and colloidal compounds) and the Se mobility (Se stabilization in solid phase via organo-mineral associations).

Cette thèse a pour but de déterminer les espèces séléniées (spéciation) issues du métabolisme du poisson (truite) suite à l’enrichissement en sélénium, organique ou inorganique, des aliments piscicoles. Ces informations, complémentaires à celles utilisées en nutrition, sont nécessaires pour juger de la nécessité et de l’adéquation d’une supplémentation en sélénium des aliments végétaux afin de garantir les fonctions biologiques dépendantes de Se, ainsi que la qualité nutritionnelle des poissons. δa capacité équivalente d’un apport en sélénium inorganique ou organique à relever les niveaux de sélénoprotéines en cas de carence a ainsi été mise en évidence, ce qui diffère des conclusions habituellement obtenues sur la base de mesures du sélénium total. δ’utilisation de traceurs mono-spécifiques et mono-isotopiqueslors de la préparation d’échantillons (sang/plasma de truite) a montré l’existence de réactions co-précipitation et/ou d’interactions entre analytes séléniés et protéines démontrant l’attention particulière qui doit être portée à l’étape de préparation d’échantillon. / This PhD aims at the determination of selenium species (speciation) of fish metabolism after inorganic or organic selenium enrichment of aquaculture feeds. This information, complementary to the one obtained in the nutrition field, is necessary to assess the requirement and the suitability of the selenium supplementation of plant based feed in order toensure selenium dependent biological functions, as well as the nutritional quality of fish. The equivalent ability of inorganic and organic selenium to raise selenoproteins levels in case of deficiency was revealed, which differs with conclusion usually obtained based on total selenium measurements. The use of monospecific and monoisotopic tracers during sample preparation (trout plasma/blood) showed the existence of co-precipitation reactions and interactions between selenized analytes and proteins demonstrating thus that attention has to be paid to the sample preparation step.

Les stratégies de protéomique quantitative sans marquage sont très attractives dans le domaine de la recherche de biomarqueurs de pathologies. Cependant, elles requièrent une pleine maîtrise du schéma analytique et de sa répétabilité. Plus particulièrement, la préparation d’échantillons nécessite d’être suffisamment répétable pour ne pas impacter la qualité et la fiabilité des résultats. Les objectifs de cette thèse étaient de développer et d’optimiser des méthodes analytiques pour la protéomique quantitative, en particulier pour l’étape de préparation d’échantillons. Ainsi, un protocole innovant, simple, rapide et permettant l’analyse quantitative sans marquage d’un grand nombre d’échantillons avec une haute répétabilité a été développé et optimisé : le « Tube-Gel ». Par ailleurs, des préparations d’échantillons adaptées à différentes matrices biologiques pour la recherche de biomarqueurs ont été élaborées. Les méthodes mises au point et leur application ont permis de proposer des candidats biomarqueurs pour plusieurs pathologies : le glioblastome, les lymphomes B diffus à grandes cellules, et les complications survenant sur les greffons rénaux. / Label-free quantitative proteomics strategies are very attractive for diseases biomarkers researches. These approaches require the full control and the repeatability of the analytical workflow. In particular, the sample preparation has to be repeatable enough to ensure the quality and reliability of the results. Objectives of this work were to optimize and develop analytical methods for quantitative proteomics, with a special focus on the sample preparation step. Thus, an innovative, easy and fast protocol allowing the analysis of high sample numbers with high repeatability was developed and further optimized: the “Tube-Gel” protocol. Besides,sample preparations adapted to a variety of biological matrices were developed for the search of biomarkers. The developed methods and their application allowed the identification of potential biomarkers for a variety of diseases: glioblastoma, diffuse large B-cell lymphomas and renal transplants failures.