Fluorescence spectroscopy was examined as a potential technique for identifying aerosol particles like bacterial spores. This technique was used for laboratory measurements on some common biological agent simulants. We have measured the intrinsic steady-state fluorescence emission spectra as a function of the excitation wavelength for several bacterial spores (washed and unwashed) in dry and aqueous suspensions at room temperature using excitation wavelengths from 200 to 600 nm. These measurements were compared to those of common, naturally occurring biological components like fungal spores and pollen and non spore samples like ovalbumin. The spectra of samples were combined into fluorescence profiles or fluorescence fingerprints. Different substrates were used for collection and detection of spores. Each bacterium produces a unique in vitro fluorescence profile when measured in dried and aqueous suspension and exhibits a strong maximum in its fluorescence emission spectrum near 330-340 nm. The fluorescence profiles were reproducible. The complexity of microorganisms made the interpretation of their spectral signature a difficult task. Principal components analysis (PCA) and cluster analysis were done as a data reduction technique for detection and identification from different backgrounds. PCA illustrates that linear combination of detected fluorescence intensities, which are present in different ratios in each of samples studied, can be used to discriminate biological agent simulants from other biological samples. The hydration effects, washing effects and the role of tryptophan on spore fluorescence were also investigated. The emission spectra of the dried spores showed a maximum near 330 nm, suggesting a hydrophobic environment for its tryptophan residues. The aqueous solution of tryptophan showed fluorescence shifted to 360 nm and in ethanol solution the maximum was shifted to 340 nm, suggesting a rather more polar average location of the tryptophan. To find the limit of detection we measured the quantum efficiency (QE) of a few samples. We concluded that spectroscopy techniques coupled with effective interpretation models are applicable to biological simulants agents. Index Heading: Bacteria; Spores; Identification; Fluorescence; Fluorescence Quantum Efficiency; Principal Components Analysis; Cluster Analysis.

Fluorescence spectroscopy was examined as a potential technique for identifying aerosol particles like bacterial spores. This technique was used for laboratory measurements on some common biological agent simulants. We have measured the intrinsic steady-state fluorescence emission spectra as a function of the excitation wavelength for several bacterial spores (washed and unwashed) in dry and aqueous suspensions at room temperature using excitation wavelengths from 200 to 600 nm. These measurements were compared to those of common, naturally occurring biological components like fungal spores and pollen and non spore samples like ovalbumin. The spectra of samples were combined into fluorescence profiles or fluorescence fingerprints. Different substrates were used for collection and detection of spores. Each bacterium produces a unique in vitro fluorescence profile when measured in dried and aqueous suspension and exhibits a strong maximum in its fluorescence emission spectrum near 330-340 nm. The fluorescence profiles were reproducible. The complexity of microorganisms made the interpretation of their spectral signature a difficult task. Principal components analysis (PCA) and cluster analysis were done as a data reduction technique for detection and identification from different backgrounds. PCA illustrates that linear combination of detected fluorescence intensities, which are present in different ratios in each of samples studied, can be used to discriminate biological agent simulants from other biological samples. The hydration effects, washing effects and the role of tryptophan on spore fluorescence were also investigated. The emission spectra of the dried spores showed a maximum near 330 nm, suggesting a hydrophobic environment for its tryptophan residues. The aqueous solution of tryptophan showed fluorescence shifted to 360 nm and in ethanol solution the maximum was shifted to 340 nm, suggesting a rather more polar average location of the tryptophan. To find the limit of detection we measured the quantum efficiency (QE) of a few samples. We concluded that spectroscopy techniques coupled with effective interpretation models are applicable to biological simulants agents. Index Heading: Bacteria; Spores; Identification; Fluorescence; Fluorescence Quantum Efficiency; Principal Components Analysis; Cluster Analysis.

Les spores fongiques sont à l'origine d'infections nosocomiales affectant le pronostic vital de patients immunodéprimés, et peuvent se transmettre par l'air. C'est pourquoi nous nous sommes intéressé à la déposition et au réenvol de spores d'"Aspergillus", responsables de pathologies gravissimes comme l'aspergillose pulmonaire invasive. Nous avons lors de nos expérimentations utilisé deux méthodes d'aérosolisation : le nébuliseur Collison standard, nécessitant la mise en solution des spores, ainsi qu'un prototype permettant de souffler directement sur les cultures fongiques Ceci nous a permis de mesurer la vitesse de sédimentation des spores, et d'évaluer l'efficacité et la rémanence de traitements fongicides en utilisant un protocole original mettant en œuvre des conditions réalistes.Un dispositif expérimental a été mis au point afin de soumettre des spores déposées sur une surface à un flux d'air tangentiel, et de filmer leur réenvol ( http://tinyurl.com/bla9ynz ), et un critère prédictif théorique de détachement a été exhibé. Des simulations numériques de l'écoulement autour de sphères idéales ont complété cette étude en nous donnant accès à des paramètres critiques inaccessibles expérimentalement.Nous avons finalement appliqué les résultats de nos investigations à la problématique des infections nosocomiales aérotransmises, et découvert que les ventilateurs de refroidissement d'appareils électroniques sont un réservoir de pathogènes et une source de contamination croisée potentielle. Des expériences en milieu contrôlé associées à une campagne de prélèvements en milieu hospitalier ont mis à jour ce nouveau et important risque de contamination. / Fungal spores are a leading cause of lethal nosocomial infections affecting immunocompromised patients, and can be transmitted through the air. As such, we have studied the deposition and re-entrainment of "Aspergillus" fungal spores, which are responsible for invasive pulmonary aspergillosis, a severe disease with a high mortality rate among immunocompromised populations.In our studies two methods of fungal spore aerosolization are used; standard nebulization, and dry blowing using a homemade device. This enabled us to measure the spore settling velocity and to assess the efficiency of fungicide surface treatments using a newly developed test under realistic conditions. These tests have allowed us to quantify different surface treatment efficiencies and established their persistence.An experimental set-up has also been developed to expose spores deposited on a surface to a tangential flow, and to observe and record their removal ( http://tinyurl.com/bla9ynz ). These studies have lead to theoretical criteria for spore detachment. Furthermore, computational fluid dynamic simulations around ideal spherical particles exposed to a tangential flow were used to determine critical parameters needed to estimate particle detachment.Lastly, we have applied our findings to nosocomial infection concerns in the hospital environment and discovered that electronic fans are a pathogen reservoir and potential cross-contamination source. Systematic testing together with random sampling in hospital wards has revealed a new and important contamination risk.

Il existe de nombreuses technologies de décontamination, néanmoins les spores et les biofilms bactériens demeurent une préoccupation majeure dans de nombreux domaines, tels que le secteur hospitalier, alimentaire et de la biodéfense car elles sont résistantes. Une mousse novatrice contenant un biocide (l’hypochlorite de sodium ou le peroxyde d’hydrogène) et un agent stabilisant (le Xanthane) a été étudiée pour répondre à ce besoin. Cette mousse a la capacité d’être mise en oeuvre de différentes façons sur le terrain par : pulvérisation au sol ; talochage et pulvérisation sur les murs ; remplissage de pièces entières (murs et sols). Le travail de thèse est d’évaluer les modes d’action biocide de ces mousses sur les spores et les biofilms. Afin d’étudier le mode d’action de ces mousses des protocoles expérimentaux ont été mis au point sur les spores et les biofilms suivant leurs futures mises en oeuvre (horizontale, verticale et remplissage) et suivant différents facteurs environnementaux pouvant influencer leur efficacité de décontamination (températures, salissures, matériaux, …). L’ensemble de ce travail de thèse a permis de distinguer l’intérêt de la mousse au Xanthane contenant NaOCl 5% par rapport à celle H2O2 12% pour répondre aux besoins spécifiques de la décontamination des agents de la menace biologique. Cette mousse permet une décontamination rapide de 7 logs de spores en 30 minutes pour chacune des trois voies de mise en oeuvre à 20°C. De plus, elle permet la destruction de biofilms contenant 107 de bactéries/cm² en 1 heure maximum sur un support horizontal et par remplissage. Cette mousse NaOCl est suffisamment mature pour pouvoir réaliser un futur transfert industriel. / Several decontamination technologies exist, however bacterial spores and biofilms remain a concern in a lot of fields, like hospital, alimentary and military. A new foam containing a biocide (sodium hypochlorite or hydrogen peroxide) and a stabilizing agent (Xanthan) has been studied to answer this problematic. This foam can be used in different ways on the field following contaminations: grounds’ spraying, walls’ covering and spraying, full pieces’ filling (walls and ground). The goal of this thesis is to evaluate the biocide efficiency of these foams on spores and biofilms. We optimized experimental protocols in order to study mechanisms of foams’ action on spores and biofilms based on theirs future applications (horizontal, vertical and filling) and depending on different environmental factors which may impact foam decontamination efficiencies (materials, temperatures, soil, …). This thesis work enabled to highlight the Xanthan foam containing 5% NaOCl from the one including 12% H2O2 in military sector. This foam allows a rapid decontamination, about 7 logs of spores in 30 minutes, for each of the three ways of use at 20°C. Moreover, the destruction of biofilms containing 107 logs of bacteria/cm² was achieved in 1 hour on a horizontal support by filling. This NaOCl foam is ready to be used for industrials.

En réponse à un stress nutritif, les espèces du genre Bacillus sont susceptibles de former desspores métaboliquement dormantes résistantes à d’autres formes de stress. Ces spores peuventse retrouver à forte concentration dans beaucoup d’aliments secs, ce qui peut provoquer desintoxications alimentaires ou dégrader les aliments lorsqu’ils sont réhydratés. Comme leurdestruction est très difficile, la plupart des méthodes couramment utilisées pour décontaminerles aliments secs sont peu efficaces. L’objectif de ce travail est de comprendre l’influence del’hydratation de la spore sur l’inactivation des spores sèches de B. subtilis. Une étudefondamentale a été menée en soumettant les spores placées dans les capsules d’AnalyseEnthalpique Différentielle à différent traitements thermiques et en associant simultanémentles thermogrammes obtenus à la viabilité des spores traitées. Les résultats montrent lapersistance d’une teneur en eau relativement élevée dans le protoplaste des spores équilibréesà faible aw (0,13). De plus, une relation forte a été mise en évidence entre la teneur en eau duprotoplaste de la spore et sa sensibilité thermique. La spectroscopie IR à transformée deFourier a montré que cette sensibilité est fortement reliée à la dénaturation/agrégation desprotéines et à la libération de l’acide dipicolinique. Ces résultats ont finalement permis dedévelopper un procédé d’inactivation thermique sous pression (entre 2 et 7 bar) des sporessèches. Le maintien d’une pression d’azote dans le réacteur chauffé permet d’empêcherl’évaporation de l’eau du protoplaste des spores et donc de favoriser leur inactivation. A termeet après développement, ce procédé peut être un moyen original de décontaminationd’aliments secs. / In response to starvation, species from the genre Bacillus are able to form metabolicallydormant spores which are very resistant to multiple forms of stress. They are found in quitehigh concentrations in some dried foods which, upon rehydration, may lead to food deterioration or food-borne diseases. Moreover, their destruction is rather difficult and mostof the techniques commonly used to treat dry foods result in a very low spore inactivation.The aim of this work is to better understand the role spore hydration in the inactivation ofdried Bacillus subtilis spores. A fundamental study was conducted using DifferentialScanning Calorimetry pans as reactors to perform a heat treatment in dried spores andsimultaneously relate the thermograms to spore viability. Results show the persistence of arelatively high water concentration in the core of extremely dry spores. Besides, a strongrelation between this core water concentration and spore thermal sensitivity wasdemonstrated. This destruction was found to be highly related to proteindenaturation/aggregation and dipicolinic acid release through Fourier Transform InfraredSpectroscopy analysis. From this fundamental study, a procedure for the inactivation of driedspores using low pressures (2-7 bar) and high temperature was developed. The systemconsisted of a heated reactor in which gaseous nitrogen was compressed to prevent theevaporation of water from the spores and so favor spore inactivation (> 5 log10). This methodof inactivation could be an interesting new way to optimize the decontamination of driedfoods.

La spore bactérienne est une forme microbienne multicouche extrêmement résistante aux perturbations environnementales. Cette résistance est notamment liée à sa structure unique qui est particulièrement peu perméable et compacte. Ce travail de thèse a pour but d’identifier et de caractériser les structures sporales impliquées dans ces propriétés. Des méthodes d’investigations globales comme la RMN ou l’anisotropie de fluorescence ont permis de montrer que le cortex des spores de Bacillus subtilis est modifié par la température, pour des valeurs proches de celle de l’activation de la germination. Ceci aura pour conséquence de modifier l’accès à la membrane interne. Un outil d’étude à l’échelle de la spore, l’imagerie en temps de vie de fluorescence (FLIM) couplé à l’utilisation d’un rotor moléculaire, a également été mis au point. Cet outil a permis de mettre en évidence que la membrane interne de B. subtilis possède une très forte viscosité, environ deux fois plus importante que celle de la membrane d’une cellule végétative. Cette viscosité n’est modifiée par la température qu’au-delà de 65 °C, correspondant également à l’activation de la germination. Une perturbation connue pour modifier l’intégrité de la structure de la spore a également été étudiée : l’éthanol couplé à une température importante (65 ou 70°C). Ce traitement est responsable d’une perméabilisation et d’une inactivation des spores. L’éthanol conduit notamment à l’altération de la membrane interne, dont la viscosité et la perméabilité sont modifiées. Ces résultats apportent de nouvelles données pour la compréhension des mécanismes responsables de l’inactivation des spores. Ils permettent d’envisager des applications, pour lesquelles une maitrise des modifications structurales est nécessaire, comme la microencapsulation. / The bacterial spore is a multilayer microbial form which is extremely resistant to environmental perturbations. This resistance is especially due to its unique structure which is particularly compact and weakly permeable. This work aims to identify and characterize the spore structures involved in these properties. Overall investigation methods, such as NMR and fluorescence anisotropy, have shown that the cortex of Bacillus subtilis spores is modified by temperature for level similar to that of the activation of germination. This will result in changes to the access to the inner membrane. A tool at the spore’s scale, the fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) in conjunction with the use of a molecular rotor, has been set up. This tool allowed demonstrating that inner membrane of B. subtilis has a very high viscosity, about two times greater than that of the membrane of a vegetative cell. This viscosity is changed by temperature near 65 °C, which corresponds to activation of germination. A stress known to modify the structural integrity of the spore has also been studied: ethanol combined with significant temperature (65 ou 70 °C). This treatment is responsible for inactivation of spores in parallel with their permeabilization. Ethanol especially leads to alteration of the inner membrane for which the viscosity and permeability are changed. These results provide new understanding of mechanisms implicated in spores’ destruction. They allow considering some new applications, for which it is necessary to control structural changing, for example microencapsulation.

Les microfossiles non-polliniques, des restes de divers organismes préservés dans les sédiments lacustres ou tourbeux, sont de plus en plus couramment employés en paléoécologie. Parmi ces microrestes, les spores de champignons coprophiles sont privilégiées dans les reconstructions des activités humaines telles que les activités pastorales. L’aptitude de ces spores à refléter la présence ou l’abondance des troupeaux n’est pas encore complètement comprise. Des analogues modernes ont été collectés dans deux zones d’estive, dans les montagnes du Pays Basque et d’Ossau. Des analyses de gradients contraintes par des variables environnementales ont permis d’identifier des assemblages non-polliniques associés à diverses conditions environnementales en contexte humide et terrestre. Un cortège d’ascospores de groupes coprophiles liées aux activités pastorales a pu être isolé. Les référentiels ont également fourni des informations sur la portée spatiale de l’information non-pollinique.Les microfossiles non-polliniques ont été étudiés dans quatre séquences tourbeuses en complément d’autres sources d’informations paléoenvironnementales (pollen, signal incendie). Ils ont fourni les informations sur les dynamiques des quatre sites durant l’Holocène et les périodes historiques. Les résultats des référentiels sont appliqués à l’interprétation des dynamiques pastorales. Les résultats modernes et fossiles montrent que la charge pastorale n’est pas le seul paramètre qui influence les signaux coprophiles ; ces spores pourraient avoir un potentiel d’indicateurs paléoenvironnementaux et pastoraux plus étendu qu’attendu.Les ascospores de groupes coprophiles sont décrites et illustrées ainsi que d’autres microfossiles fongiques, algaux et indéterminés. / Non-pollen palynomorphs, microscopic remains produced by a variety of organisms and preserved in peat and lake sediments, are now more widely used in palaeoenvironmental studies. In particular, spores of coprophilous fungi are considered as an adapted tool to reconstruct past land-use such as pastoral activities. However, their ability to reflect the presence and/or the number of cattle is not fully understood yet. Modern analogs from summer pastures in the Basque Mountains and the Ossau valley have been collected. Numerical analysis of modern non pollen-palynomorphs and environmental variables helped to distinguish several pools of microremains associated to distinct environmental conditions in both terrestrial and wet ecosystems. A group of ascospores of dung-related fungi clearly related to grazing activities was isolated. The modern dataset also provided useful information on the spatial scale represented by non-pollen palynomorphs. Fossil non-pollen palynomorphs from four peat records, combined with other palaeoenvironmental data (pollen, fire frequencies), have been studied. They informed on the evolution of the local conditions of the wetlands during Holocene and historical times. The modern data set is used to aid interpretation of the dynamics of past land-use and pastoral activities. The results from both modern and fossil approaches show that other parameters than the grazing pressure can induce variability in the copropilous signals; the indicative value of dung-related ascospores might be broader than expected. The ascospores of dung-related taxa are described and illustrated, alongside with other fungal, algal and unidentified microremains.

Les spores d'Aspergillus niger résultant d'un processus de reproduction asexuée possèdent une glucose oxydase sous forme active. Ces spores ont été produites par fermentation en milieu solide en utilisant différents substrats tels que les graines de sarrasin, de riz, de maïs, les racines de manioc, les semences de jack fruit, le blé, la bagasse de manioc et la bagasse. La glucose oxydase est quantitativement transféré du mycélium aux spores au cours de développement fongique sur substrat solide. Les spores se comportent donc comme une source d'enzyme utilisable dans la conversion du glucose en acide gluconique après leur récolte. Il a été démontré que l'expression de leur activité biocatalytique nécessite une permeabilisation des conidies et la prévention de leur germination. Les conditions optimales de réaction impliquent l'utilisation de spores ayant subi un cycle congélation-décongélation (109 spores / ml) traités par du citral (3% v / v) pendant 5 h à 30 °C, la réaction se déroulant selon un mode fed-batch impliquant des ajouts successifs de glucose en poudre. La vitesse moyenne de réaction obtenue est de 5,3 g / l.h avec 178 g / L d'acide gluconique produit pour 164 g / L de glucose consommé après environ 36 h de réaction, ce qui correspond à un rendement molaire proche de 100%. Il a été constaté que les spores peuvent être réutilisées pendant 14 cycles de réaction sans perte d'activité décelable. De même, un stockage d'un an à -20 °C ne conduit à aucune perte d'activité. Ainsi, ce processus pourrait concurrencer efficacement les procédés classiques de production de gluconate, qui impliquent la mise en oeuvre de la forme mycélienne du champignon.

Spores of foodborne pathogens such as Clostridium botulinum, Clostridium perfringens and Bacillus cereus are widely distributed in nature. Presence of those spores in food products, particularly C. botulinum spores in vacuum packed, ready-to-eat low-acid products, is a great safety concern. The research here described is a first effort towards understanding the role of the spore coat proteins in the inactivation of bacterial spore using high pressure processing. This study proposes a coat protein solubilization methodology using non-ionic detergents minimizing protein damage and compatible with spectroscopy methods. The methodology developed here was compared with approaches proposed in the literature with respect to protein yield, protein fractions identified, amino acid composition and suitability with spectroscopy techniques for the further analysis of coat proteins. Bacillus subtilis ATCC 6633 spore coat proteins were solubilized (n=3) using octyl-β-D-glucopyranoside (OGP) at room temperature and urea/sodium dodecyl sulphate (UDS) at 37C and 70C. Analysis of variance (ANOVA) showed no significant (95% confidence) differences between the three repetitions of the three spore coat protein solubilization methods. Protein yield was significantly larger (95% confidence) when using UDS at 70C as compared to UDS at 37C. OGP gave the lowest protein yield but allowed circular dichroism (CD) analysis of the spore coat protein solution with minimum blank signal. SDS-PAGE revealed that the UDS-70C coat protein solutions consisted of five major and six minor proteins ranging 6 to 65 kD while the OGP solution appear to consist of four major and nine minor bands in the same mw range. Amino acid analysis of the protein extracted by the OGP method was conducted using reverse phase HPLC (RP-HPLC) and compared with published information. The OGP spore coat protein solution showed a higher proportion of aspartate, glutamate, alanine and tyrosine. Pressure, heat and time effects were studied on spore coat proteins obtained from untreated and pressure-treated B. subtilis ATCC 6633 spores. Pressure treatments of spores, and of extracted spore coat protein solutions, at 50 kpsi (345 mPa) and 85 kpsi (586 mPa) for 10 and 30 min at constant 85C along with appropriate heat- and pressure-only controls and untreated sample, were used to study the effect of pressure, heat and time on spore coat proteins. Both spore coat protein solubilization procedures showed a significant reduction in protein yield for pressure-only, heat-only and pressure/heat treated spores when compared with untreated spores. When OGP-solubilized proteins from untreated spores were pressure treated, SDS-PAGE profile showed an increasing overall band intensity with increasing pressure and time. In the case of protein solution obtained from pressure-treated spores the electrophoretic pattern showed the loss of higher molecular weight proteins. The significance of this study is that for the first time we have observed extensive changes on spore coat proteins caused by pressure, as well as heat treatments. Future studies will examine what is the probable physiological role of the proteins damaged by these physical treatments. An advantage of the protein solubilization here developed will allow the application of spectroscopy techniques to characterize changes in spore coat proteins. / Graduation date: 2003

Les organismes vivants puisent leurs ressources de l'environnement pour les allouer aux différentes fonctions biologiques assurant leur développement (croissance, survie, reproduction). La quantité de ressources disponibles dans un environnement étant limitante, les individus doivent faire des compromis lors de l'allocation de ces ressources à leurs différentes fonctions biologiques. Ces compromis contraignent le développement des individus et entraînent d'autres compromis entre leurs traits d'histoire de vie (âge et taille à maturité, nombre de descendants), conditionnant ainsi leurs capacités d'adaptation à l'environnement. Au cours de cette thèse, nous avons étudié par modélisation les stratégies d'allocation des ressources entre la croissance intra-hôte et la production de spores au cours d'une infection par un unique génotype pathogène et déterminé les stratégies optimales dans différentes conditions écologiques. Si le pathogène a un accès limité aux ressources de l'hôte, la stratégie optimale est toujours Bang-bang. Si au contraire l'accès aux ressources de l'hôte est illimité, la stratégie optimale est toujours Bang-mixte. Dans un deuxième volet de ces travaux, des éléments de validation empirique de ces modèles ont été recherchés au travers d'expérimentations menés sur un champignon pathogène nécrotrophe, Magnaporthe oryzae, présentant un accès limité aux ressources de l'hôte et sur un champignon biotrophe, Melampsora larici-populina dont l'accès aux ressources de l'hôte semble plutôt illimité. Les observations réalisées sont en adéquation avec les prédictions théoriques et confirment la pertinence des hypothèses et de la démarche de modélisation / Living organisms extract resources from their environment and invest them toward various biological functions (growth, survival, reproduction). Available resources in an environment are usually limited so that organisms have to trade-off the resources invested in different biological functions. These trade-offs in resource investment reverberate in trade-offs between life-history traits (age and size at maturity, number of offspring) and determine pathogen potential to adapt to their environment.During this work, we have studied resource allocation strategy during infection caused by spore-producing pathogen. We have determined optimal resource allocation strategies between intra-host multiplication and spore production in different ecological settings. The main result of this work is that the optimal strategy is defined by the existence of a latent period, a period of time during which all extracted resources are investing toward within-host multiplication and no spore is produced. After latency, when the pathogen has a limited access to host resources, consumed resources are invested toward spore production only (Bang-bang strategy). On the contrary, when the pathogen has an unlimited access to host resources, a fixed proportion of host resources are invested toward maintenance of within-host multiplication forms (Bang-mixte strategy). A second part of this work presents empirical test of these theoretical assumptions, through experimentations on Magnaporthe oryzae and on Melampsora larici-populina. Our observations on these pathogens seem to agree with our theoretical predictions and corroborate the relevance of our modelling assumptions and approach