Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les travaux présentés dans cette thèse portent sur les mécanismes centraux impliqués dans la planification de la direction et de l'amplitude d'atteintes manuelles vers des cibles visuelles. Les résultats de plusieurs études psychophysiques suggèrent que le système nerveux central utilise une règle générale d'organisation qui consiste à planifier la direction et l'amplitude d'atteintes manuelles par l'intermédiaire de deux canaux de traitement indépendants. Nous avons évalué cette hypothèse en testant l'effet de différentes conditions sensorimotrices sur la nature des erreurs de direction et d'amplitude d'atteintes manuelles. Un système d'analyse de mouvement (Optotrak) a permis revaluation des erreurs produites lors d'atteintes manuelles vers des cibles visuelles. Sept sujets ont exécuté des mouvements d'atteintes vers des cibles situées à 5 distances différentes le long de 5 directions différentes dans deux conditions expérimentales. Dans la tâche l, les sujets devaient orienter le regard vers une cible visuelle présentée sur un plan horizontal, puis fermer les yeux, et effectuer un pointage manuel en direction de cette cible. Dans la tâche 2, les pointages manuels étaient effectués vers les mêmes positions spatiales que dans la tâche l, mais, les cibles étaient présentées sur un plan vertical. Dans ces deux tâches, les erreurs variables de distance ont été plus grandes que les erreurs variable de direction. Cependant, dans la tâche 2, ces erreurs variables ont présenté une gradation différente en fonction de l'amplitude des mouvements. Cette influence différente de la nature des transformations sensorimotrices sur les erreurs variables de direction et d'amplitude d'atteintes manuelles supporte l'hypothèse que le SNC planifie ces deux paramètres par des canaux de traitement distincts. Une analyse subséquente a porté sur une prédiction de cette conclusion. Si les patrons dans la variabilité finale des pointages manuels reflètent les processus de planification motrice qui précèdent l'initiation des mouvements, ces derniers devraient présenter une étroite correspondance avec les patrons dans la variabilité initiale d'atteintes manuelles. L'analyse comparée des distributions des positions spatiales des sommets d'accélération et de vitesse ainsi que des points finaux d'atteintes manuelles a montré que les positions finales ne sont pas entièrement déterminées lors de l'initiation des mouvements suggérant que la planification et l'exécution ne sont pas des étapes sérielles strictes. Cependant, l'indépendance de la variabilité spatiale de direction et d'amplitude le long des trajectoires de mouvements a suggéré une planification indépendante de ces paramètres au cours du temps. Une approche neurophysiologique a été utilisée afin d'évaluer les fondements neuronaux des canaux de traitement indépendants par lesquels la direction et l'amplitude des mouvements d'atteintes sont planifiées. L'activité de 162 cellules du cortex prémoteur dorsal (PMd) a été enregistrée dans 2 hémisphères d'un singe rhésus alors qu'il effectuait des mouvements d'atteinte vers 24 cibles visuelles situées à 3 différentes distances le long de 8 directions différentes. Dans cette tâche expérimentale, un indice visuospatial présenté durant 500 ms indique la position vers laquelle une atteinte manuelle devait être dirigée après une période de délais (l 000-2500 ms). Ensuite, un deuxième indice (visuel, non-spatial) donne l'instruction au singe d'initier un mouvement en direction de la position mémorisée de la cible. Durant la présentation de la cible, l’activité des cellules individuelles de PMd est préférentiellement liée à la direction du mouvement à produire. Ensuite, au cours des événements successifs, elle montre une augmentation graduelle de la modulation en fonction de la distance de la cible. Les fréquentes interactions entre l'encodage de la direction et de l'amplitude dans la décharge de cellules individuelles de PMd suggère que les canaux de traitement pour la planification de la direction et de l'amplitude n'impliquent pas deux populations distinctes de cellules dans le cortex PMd. L'augmentation progressive de la convergence de l'expression de ces paramètres au cours du temps pourrait refléter une représentation intermédiaire interposée entre les canaux de traitement indépendants et un code approprié pour la spécification éventuelle des forces et de l'activité musculaire.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau / Multiple Sclerosis is an inflammatory demyelinating disease in which immune cells from the peripheral blood infiltrate the central nervous system (CNS) to cause a pathologic neuroinflammatory reaction. Blood borne leucocytes cross the restrictive cerebral endothelium, the blood brain barrier (BBB), to gain access to the CNS parenchyma and cause cellular damage leading to the characteristic demyelinating lesions. The BBB is the interface between the blood and the CNS and as such is a critical mediator of neuro-immune reactions and an important therapeutic target to modulate neuroinflammation. It is essential to have a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the BBB properties to elaborate new therapeutic strategies to modulate the BBB and thus the local neuroinflammation reaction. This Ph.D. thesis describes three distinct molecular mechanisms which regulate key BBB properties. The first section describes a novel role for the renin-angiotensin system (RAS) in the neuro-vascular unit (NVU) as a regulator of paracellular permeability. The second part of this thesis characterises the role of a novel adhesion molecule of the BBB, ALCAM. The third part of this work studies the interactions between neural stem cells (NSC) and the BBB and identifies MCP-1 as a critical factor involved in NSC recruitment to the CNS. In the first experimental section we provide evidence that angiotensinogen (AGT) produced and secreted by astrocytes, is cleaved into angiotensin II (AngII) and acts on type 1 angiotensin receptors (AT1) expressed by BBB endothelial cells (ECs). Activation of AT1 restricts the passage of molecular tracers across human BBB-derived ECs through threonine-phosphorylation of the tight junction protein occludin and its mobilization to lipid raft membrane microdomains. We also show that AGT knockout animals have disorganized occludin strands at the level of the BBB and a diffuse accumulation of the endogenous serum protein plasminogen in the CNS, as compared to wild type animals. Finally, we demonstrate a reduction in the number of AGT-immunopositive perivascular astrocytes in multiple sclerosis (MS) lesions, which correlates with a reduced expression of occludin similarly seen in the CNS of AGT knockout animals. Such a reduction in astrocyte-expressed AGT and AngII is dependent, in vitro, on the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ. Our study defines a novel physiological role for AngII in the CNS and suggests that inflammation-induced downregulation of AngII production by astrocytes is involved in BBB dysfunction in MS lesions. In the second experimental part we focus on adhesion molecules of the BBB. Using a lipid raft-based proteomic approach, we identified ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) as an adhesion molecule involved in leukocyte migration across the BBB. ALCAM expressed on BBB endothelium co-localized with CD6 expressed on leukocytes and with BBB endothelium transmigratory cups. ALCAM expression on BBB cells was up-regulated in active multiple sclerosis and experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) lesions. Moreover, ALCAM blockade restricted transmigration of CD4+ lymphocytes and monocytes across BBB endothelium in vitro and in vivo, and reduced the severity and time of onset of EAE. Our findings point to an important role for ALCAM in leukocyte recruitment into the brain and identify ALCAM as a potential therapeutic target to dampen neuroinflammation. The third experimental part of this thesis studies the interactions between NCS and BBB. NCS represent an attractive source for cell transplantation and neural tissue repair. After systemic injection, NCS are confronted with the specialized BBB endothelial cells before they can enter the brain parenchyma. We investigated the interactions of human fetal neural precursor cells with human brain endothelial cells in an in vitro model using primary cultures. We demonstrated that human fetal neural precursor cells efficiently and specifically migrate to sub-endothelial space of human BBB-endothelium, but not pulmonary artery endothelial cells. When migrated across BBB-endothelial cells, fetal neural precursor cells spontaneously differentiate to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Effective migration and subsequent differentiation was found to be dependant on the chemokine CCL2/MCP-1, but not CXCL8/IL-8. Our findings suggest that an intact blood-brain barrier is not an intrinsic obstacle to neural stem cell migration into the brain and that differentiation of neural precursor cells occur in a sub-endothelial niche, under the influence of the chemokine CCL2/MCP-1. These three experimental sections demonstrate the crucial roles that the BBB plays in regulating the CNS homeostasis. Under pathological conditions, such as during neuro-immune reactions, the BBB is altered and becomes an important local player. The three different molecular mechanisms described in this thesis, contribute to our understanding of the BBB and may allow for the development of novel therapeutic strategies to limit neuroinflammation.

Les cellules neurales expriment des molécules dites immunes qui peuvent exercer des rôles différents de ceux exercés dans le système immunitaire. Les molécules du CMH-I classiques présentent des peptides représentatifs du contenu protéique de chaque cellule aux sentinelles du système immunitaire. Cependant, il est documenté que ces molécules ont aussi des fonctions « non immunes ». En effet, les molécules du CMH-I classiques jouent un rôle dans l'établissement et la plasticité des synapses. Sur divers types cellulaires, elles peuvent aussi interagir avec des récepteurs membranaires en cis, moduler leur stabilité à la membrane et en conséquence leur activité. RAE-1 est un membre de la famille des molécules du CMH-I, décrite initialement dans le système nerveux central embryonnaire. Pour le système immunitaire, RAE-1 est un ligand du récepteur activateur NKG2D, exprimé par les cellules NK, NKT, les lymphocytes T γδ et CD8+. RAE-1 est peu ou pas exprimé dans la plupart des tissus adultes. Son expression est induite par le stress génotoxique, la transformation tumorale ou l'infection virale ce qui permet au système immunitaire d'éliminer les cellules « malades » grâce à l'activation des cellules cytotoxiques exprimant NKG2D. Je décris l'expression de RAE-1 par les cellules neurales progénitrices et le rôle non immun de cette molécule dans la prolifération cellulaire. L'expression de RAE-1 est fortement corrélée au niveau de prolifération cellulaire et est dépendante du facteur de croissance EGF. / Neural cells express immune molecules which roles differ from those in the immune system. Classical MHC-I molecules present peptides originated from the proteic content of each cell to patrolling immune cells. However, these molecules can also have nonimmune roles. Indeed, classical MHC-I molecules participate in the establishment of synapses and synaptic plasticity. They can also interact in cis with different membrane receptors on different cell types, and modulate the receptors' membrane stability and activity. RAE-1, a member of MHC-I family, was initially described in the embryonic central nervous system. In the immune system, RAE-1 is a ligand of the activating receptor NKG2D, expressed by NK cells and by NKT, γδT and some CD8+ T lymphocytes. RAE-1 is weakly or not expressed in most adult tissues. Its expression is induced by genotoxic stress, tumoral transformation or viral infection and triggers the elimination of transformed cells by the cytotoxic immune cells which express NKG2D. I describe here the expression of RAE-1 by neural progenitor cells and its role in cell proliferation. RAE-1 expression level is highly correlated with the rate of cell proliferation and depends on the presence of epidermal growth factor (EGF). Exposition to EGF induces the colocalization of RAE-1 and phosphorylated EGF-receptor (EGFR) inside lipid rafts and endocytosed vesicles, which supports a role of RAE-1 as a partner of EGFR. RAE-1 expression is also induced in the nervous tissue in different models of CNS pathologies. In these conditions, RAE-1 could be expressed by proliferating microglia under the control of M-CSF.

Contexte. Au cours du siècle, les expositions aux champs électromagnétiques se sont multipliées avec l'électricité et les moyens de télécommunications. En 2002, les champs électromagnétiques d'extrêmement basse fréquence (CEM-EBF) ont été classés comme possiblement cancérogène pour l'homme, suivis des radiofréquences en 2011. A ce jour, ce rôle cancérigène reste controversé. L'association entre les tumeurs cérébrales (TC) et l'exposition aux champs électromagnétiques a été étudiée dans une étude cas-témoins, CERENAT. Méthodes. Les sujets de plus de 16 ans, résidant dans quatre départements français, avec un diagnostic de TC posé en 2004-2006 ont été inclus, ainsi que 2 témoins appariés par cas. Le calendrier professionnel détaillé et l'utilisation du téléphone portable (TP) ont été recueillis dans un questionnaire standardisé lors d'un entretien en face-à-face afin d'estimer l'exposition aux CEM-EBF (par l'application d'une matrice emploi-exposition), et aux radiofréquences. Résultats. L'étude a inclus 596 cas et 1192 témoins. Aucune association n'a été observée entre l'exposition aux CEM-EBF et les gliomes ou les méningiomes. Pour les neurinomes, le risque augmentait avec l'exposition, non significativement, atteignant un rapport de cotes (RC)=2,7 [0,8-9,0] pour une exposition moyenne sur la vie ≥ 0,2μT. Par ailleurs, l'usage régulier du TP (O/N) n'était pas associé aux TC (RC=1,1 [0,8-1,4]). Cependant, une association significative était observée pour les gliomes chez les plus grands utilisateurs pour une durée cumulée des appels ≥ 896 heures (RC=2,3 [1,4-3,8]). Les risques étaient plus élevés pour les tumeurs temporales, l'utilisation professionnelle et l'utilisation urbaine du téléphone. Conclusion. Nos résultats vont dans le sens des études antérieures, montrant une association entre les tumeurs cérébrales et l'utilisation importante du TP; et l'absence d'association avec l'exposition aux CEM-EBF. Cependant, le lien entre CEM-EBF et neurinomes reste à explorer, de même que le suivi à plus long terme des effets du TP. / Context. During the century, exposure to electromagnetic fields have increased with electricity and telecommunications facilities. In 2002, extremely low frequency electromagnetic fields (ELF-EMF) have been classified as possibly carcinogenic to humans, followed by radiofrequencies in 2011. To date, this carcinogenic role remains controversial. We investigated the association between brain tumors and exposure to electromagnetic fields in a case-control study, CERENAT. Methods. Subjects over 16 years, living in four French areas, with a diagnosis of brain tumor in 2004-2006 were included, with 2 matched controls per case. The detailed occupational history and mobile telephone use were collected in a standardized questionnaire during a face- to-face interview to estimate exposure to ELF-EMF (using job-exposure matrix) and to radiofrequencies. Results. The study included 596 cases and 1192 controls. No association was observed between exposure to ELF-EMF and gliomas or meningiomas. For neuromas, the risk increased with exposure, not significantly, reaching an odds ratio (OR)=2.7 [0.8 - 9.0] for a life-long mean exposure ≥ 0.2 μT. Moreover, regular use of mobile phone (Y/ N) was not associated with brain tumor (OR=1.1 [0.8 - 1.4]). However, a significant association was observed for gliomas in the heaviest users when considering a life-long cumulative duration of calls ≥ 896 hours (OR=2.3 [1.4 - 3.8]). Risks were higher for temporal tumors, occupational or urban mobile phone use. Conclusion. Our results are consistent with previous studies showing an association between brain tumors and the extensive use of MP, and no association with exposure to ELF-EMF. However, the association between ELF-EMF and neuromas remains to be explored, as well as the follow of mobile phone effects in the long term.

La dystrophie myotonique de type 1 (DM1), ou maladie de Steinert, est une maladie qui touche plusieurs tissus, dont le système nerveux central (SNC). L’atteinte neurologique est variable et inclut des troubles de la fonction exécutive, des changements de comportement et une hypersomnolence dans la forme adulte, ainsi qu’une déficience intellectuelle marquée dans la forme congénitale. Dans leur ensemble, les symptômes neurologiques ont un fort impact sur le parcours académique, professionnel et les interactions sociales. Aujourd’hui aucune thérapie n’existe pour cette maladie. La DM1 est due à une expansion anormale d’un triplet CTG non-codant dans le gène DMPK. Les ARN messagers DMPK, porteurs de l’expansion, s’accumulent dans le noyau des cellules (sous forme de foci) et perturbent la localisation et la fonction de protéines de liaison à l’ARN, notamment des familles MBNL et CELF, ce qui entraîne des défauts d’épissage alternatif, d’expression, de polyadenylation et de localisation d’autres ARN cibles. Malgré le progrès récent dans la compréhension des mécanismes de la maladie, les aspects cellulaires et moléculaires de l’atteinte neurologique restent méconnus: nous ne connaissons ni la contribution de chaque type cellulaire du cerveau, ni les voies moléculaires spécifiquement dérégulées dans chaque type cellulaire. L’objectif de ma thèse a été de répondre à ces deux questions importantes en utilisant un modèle de souris transgéniques et des cellules primaires dérivées de celui-ci. Pour mon projet, j’ai utilisé les souris DMSXL générées par mon laboratoire. Ces souris reproduisent des caractéristiques importantes de la DM1, notamment l’accumulation des ARN toxiques et la dérégulation de l’épissage alternatif dans plusieurs tissus. L’impacte fonctionnel des transcrits DMPK toxiques dans le SNC des souris DMSXL se traduit par des problèmes comportementaux et cognitifs et par des défauts de la plasticité synaptique. Afin d’identifier les mécanismes moléculaires associés à ces anomalies, une étude protéomique globale a montré une dérégulation de protéines neuronales et astrocytaires dans le cerveau des souris DMSXL. De plus, l’étude de la distribution des foci d’ARN dans les cerveaux des souris et des patients a montré un contenu plus élevé dans les astrocytes par rapport aux neurones. Ensemble, ces résultats suggèrent une contribution à la fois neuronale et gliale dans la neuropathogenèse de la DM1. L’étude protéomique globale des cerveaux des souris DMSXL, a aussi montré des défauts de protéines synaptiques spécifiques des neurones, que nous avons par la suite validés dans le cerveau des patients. SYN1 est hyperphosphorylée d’une façon CELF-dépendante et RAB3A est surexprimé en réponse à l’inactivation de MBNL1. Les protéines MBNL et CELF régulent l’épissage alternatif d’un groupe de transcrits au cours du développement, et leur dérégulation dans la DM1 entraîne l’expression anormale d’isoformes d’épissage embryonnaires dans le tissu adulte. Dans ce contexte, j’ai étudié si les défauts des protéines RAB3A et SYN1 sont associés à une dérégulation d’épissage, et si les anomalies des protéines synaptiques identifiées dans la DM1 reproduisent des évènements embryonnaires de la régulation de RAB3A et SYN1. Mes résultats indiquent que les défauts de ces protéines dans les cerveaux adultes ne sont pas dus à une altération de l’épissage alternatif des transcrits et ne recréent pas des évènements embryonnaires. La neuropathogenèse de la DM1 va, donc, au delà de la dérégulation de l’épissage et d’autres voies moléculaires restent à explorer dans les cerveaux DM1. Afin d’identifier des sous-populations cellulaires susceptibles à l’accumulation des ARN toxiques, nous avons étudié la distribution des foci dans plusieurs régions cérébrales. (...) / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a severe disorder that affects many tissues, including the central nervous system (CNS). The degree of brain impairment ranges from executive dysfunction, attention deficits, low processing speed, behavioural changes and hypersomnia in the adult form, to pronounced intellectual disability in the congenital cases. The neurological manifestations have a tremendous impact on the academic, professional, social and emotional aspects of daily life. Today there is no cure for this devastating condition. DM1 is caused by the abnormal expansion of a CTG trinucleotide repeat in the 3’UTR of the DMPK gene. Expanded DMPK transcripts accumulate in RNA aggregates (or foci) in the nucleus of DM1 cells, disrupting the activity of important RNA-binding proteins, like the MBNL and CELF families, and leading to abnormalities in alternative splicing, gene expression, RNA polyadenylation, localisation and translation. In spite of recent progress, fundamental gaps in our understanding of the molecular and cellular mechanisms behind the neurological manifestations still exist: we do not know the contribution of each cell type of the CNS to brain dysfunction, or the molecular pathways specifically deregulated in response to the CTG expansion. The aim of my PhD project has been to gain insight into these two important questions using a relevant transgenic mouse model of DM1 and cell cultures derived thereof. In my studies I used the DMSXL mice, previously generated in my host laboratory. The DMSXL mice express expanded DMPK mRNA with more than 1,000 CTG repeats. They recreate relevant DM1 features, such as RNA foci and missplicing in multiple tissues. The functional impact of expanded DMPK transcripts in the CNS of DMSXL mice translates into behavioural and cognitive abnormalities and defective synaptic plasticity. To identify the molecular mechanisms behind these abnormalities, a global proteomics analysis revealed changes in both neuron-specific and glial-specific proteins in DMSXL brain. We also investigated RNA foci in DMSXL and human DM1 brains and found non-homogenous distribution between cell types, with a higher foci content in astrocytes relative to neurons. Together these results suggest that both neuronal and glial defects contribute to DM1 neuropathogenesis. The global proteomics analysis of DMSXL brains also identified abnormalities in neuronal synaptic proteins that we have validated in human brain samples. SYN1 is hyperphosphorilated in a CELF-dependent manner while RAB3A is upregulated in association with MBNL1 depletion. CELF and MBNL proteins regulate the alternative splicing of a subset of transcripts throughout development, and their deregulation in DM1 leads to abnormal expression of fetal splicing isoforms in adult DM1 brains. In this context, I have studied if RAB3A and SYN1 deregulations observed in adult brains are associated with splicing abnormalities or if they recreated embryonic expression and phosphorylation events. My results indicate that the synaptic proteins abnormalities observed in adult DMSXL brains are not caused by defective alternative splicing and do not recreate embryonic events. Thus, DM1 neuropathogenesis goes beyond missplicing and other molecular pathways must be explored in DM1 brains. To better understand the cellular sub-populations susceptible of accumulating toxic RNA foci we have studied foci distribution in different brain regions. We identified pronounced accumulation of toxic RNAs in Bergman astrocytes of DMSXL mice cerebellum and DM1 patients, associated with neuronal hyperactivity of Purkinje cells. A quantitative proteomics analysis revealed a significant downregulation of GLT1 – a glial glutamate transporter expressed by the Bergmann cell in the cerebellum. I have confirmed the GLT1 downregulation in other brain regions of mouse and human brain. (...)

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Les microcapteurs implantables sont des outils de choix pour l’étude du système nerveux central. Ils permettent d’analyser en temps réel la composition du milieu interstitiel du cerveau et les variations de concentration de neurotransmetteurs et de substrats métaboliques dans l’espace extracellulaire. La procédure d’immobilisation de l’enzyme sur l’électrode est une étape cruciale déterminant les performances du biocapteur. Nous avons développé une méthode d’immobilisation simple, non-toxique et peu chère en utilisant une molécule de poly(ethyleneglycol) diglycidyl éther (PEGDE) qui répond bien aux critères des applications cliniques. La méthode a été étudiée et optimisée sur trois enzyme: la Glucose oxydase, la D-amino acide oxydase et la Glutamate oxydase. Les capteurs développés se caractérisent par une forte sensibilité et un temps de réponse suffisamment court pour la détection des événements biologiques en temps réel. Les capteurs à base de PEGDE ont démontrés une bonne stabilité dans le temps et leur capacité de suivre en temps réel la variation de concentration de glucose dans le SNC du rat suite à l’injection d’insuline ou de glucose. Nous avons également adapté les méthodes d’immobilisation d’enzyme les plus utilisées dans le domaine des neurosciences: immobilisation par réticulation dans des vapeurs de Glutaraldéhyde ou par PEGDE, piégeage dans une matrice de sol-gel ou de polypyrrole dérivé, ou immobilisation dans une matrice d’hydrogel. Nous avons comparé les biocapteurs ainsi obtenus en termes de sensibilité, de stabilité in vivo, de temps de réponse et aussi de toxicité. Cette étude comparative nous a permis de conclure que le PEGDE représente un procédé d’immobilisation optimal car il ne demande pas de synthèse organique, contrairement à l’hydrogel, il n’est pas toxique contrairement au glutaraldehyde et il assure une immobilisation covalente plus stable que le piégeage dans des sol-gel ou polypyrrole. Cette étude comparative a mis également en évidence l’effet de la procédure de fixation de l’enzyme sur la spécificité du biocapteur. Nous avons montré que l’immobilisation par glutaraldehyde provoque une importante perte de sélectivité de l’enzyme. Quant au PEGDE, son immobilisation est assez douce pour préserver la spécificité naturelle de l’enzyme. Nous avons montré que la procédure d’immobilisation a un impact important sur la quantification des molécules dans les échantillons biologiques et in vivo. La validité des mesures sur nos capteurs a été contrôlée par HPLC ou électrophorèse capillaire. Nous avons également développé des sondes multisensibles en utilisant les techniques de microfabrication sur silicium. Le dispositif comporte une aiguille de 6mm en longueur, 100µm en largeur et 50 µm en épaisseur. Elle porte trois électrodes de taille 40x200µm. Ces dispositifs, optimisés pour réduire les effets d’interférence entre les électrodes, ont été pour le suivi simultané de glucose et lactate dans le SNC de rats anesthésiés. / Identification, monitoring and quantification of biomolecules in the CNS is a field of growing interest for identifying biomarkers of neurological diseases. In this thesis, silicon needle-shaped multi-molecules sensing microprobes were developed. Our microelectrode array design comprises a needle length of 6mm with 100x50 µm2 cross-section bearing three platinum electrodes with a size of 40x200 µm and 200µm spacing between them. We have used these microprobes for simultaneous glucose and lactate monitoring, using the third electrode for control of non-specific current variations. Local microdroplet protein deposition on the electrode surface was achieved using a pneumatic picopump injection system. Enzyme immobilization on the electrode surface is a key step in microelectrode biosensor fabrication. We have developed a simple, low cost, non-toxic enzyme immobilization method employing poly(ethyleneglycol) diglycidyl ether (PEGDE). Successful biosensor fabrication was demonstrated with glucose oxidase, D-amino acid oxidase, and glutamate oxidase. We found that these biosensors exhibited high sensitivity and short response time sufficient for observing biological events in vivo on a second-by-second timescale. PEGDE-based biosensors demonstrated an excellent long-term stability and reliably monitored changes in brain glucose levels induced by sequential administration of insulin and glucose solution. We then carried out a comparative study of five enzyme immobilization procedures commonly used in Neuroscience: covalent immobilization by cross-linking using glutaraldehyde, PEGDE, or a hydrogel matrix and enzyme entrapment in a sol-gel or polypyrrole-derived matrices. Enzymatic microelectrodes prepared using these different procedures were compared in terms of sensitivity, response time, linear range, apparent Michaelis-Menten constant, stability and selectivity. We conclude that PEGDE and sol-gel techniques are potentially promising procedures for in vivo laboratory studies. The comparative study also revealed that glutaraldehyde significantly decreased enzyme selectivity while PEGDE preserved it. The effects that immobilization can have on enzyme substrate specificity, produce dramatic consequences on glutamate detection in complex biological samples and in the CNS. Our biosensor’s results were systematically controlled by HPLC or capillary electrophoresis. The highly selective PEGDE-based biosensors allowed accurate measurements glutamate concentrations in the anesthetized and awaked rats at physiological conditions and under pharmacological and electrical stimulations. The microfabricated multielectrodes based on silicon needles coupled to the simple, non-toxic and mild immobilization method based on PEGDE, open new possibilities for specific neurotransmitter detection in the central nervous system and the study of cell-cell communication in vivo.

La Sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune inflammatoire démyélinisante du système nerveux central (SNC), lors de laquelle des cellules inflammatoires du sang périphérique infiltrent le SNC pour y causer des dommages cellulaires. Dans ces réactions neuroinflammatoires, les cellules immunitaires traversent le système vasculaire du SNC, la barrière hémo-encéphalique (BHE), pour avoir accès au SNC et s’y accumuler. La BHE est donc la première entité que rencontrent les cellules inflammatoires du sang lors de leur migration au cerveau. Ceci lui confère un potentiel thérapeutique important pour influencer l’infiltration de cellules du sang vers le cerveau, et ainsi limiter les réactions neuroinflammatoires. En effet, les interactions entre les cellules immunitaires et les parois vasculaires sont encore mal comprises, car elles sont nombreuses et complexes. Différents mécanismes pouvant influencer la perméabilité de la BHE aux cellules immunitaires ont été décrits, et représentent aujourd’hui des cibles potentielles pour le contrôle des réactions neuro-immunes. Cette thèse a pour objectif de décrire de nouveaux mécanismes moléculaires opérant au niveau de la BHE qui interviennent dans les réactions neuroinflammatoires et qui ont un potentiel thérapeutique pour influencer les interactions neuro-immunologiques. Ce travail de doctorat est séparé en trois sections. La première section décrit la caractérisation du rôle de l’angiotensine II dans la régulation de la perméabilité de la BHE. La seconde section identifie et caractérise la fonction d’une nouvelle molécule d’adhérence de la BHE, ALCAM, dans la transmigration de cellules inflammatoires du sang vers le SNC. La troisième section traite des propriétés sécrétoires de la BHE et du rôle de la chimiokine MCP-1 dans les interactions entre la BHE et les cellules souches. Dans un premier temps, nous démontrons l’importance de l’angiotensinogène (AGT) dans la régulation de la perméabilité de la BHE. L’AGT est sécrété par les astrocytes et métabolisé en angiotensine II pour pouvoir agir au niveau des CE de la BHE à travers le récepteur à l’angiotensine II, AT1 et AT2. Au niveau de la BHE, l’angiotensine II entraîne la phosphorylation et l’enrichissement de l’occludine au sein de radeaux lipidiques, un phénomène associé à l’augmentation de l’étanchéité de la BHE. De plus, dans les lésions de SEP, on retrouve une diminution de l’expression de l’AGT et de l’occludine. Ceci est relié à nos observations in vitro, qui démontrent que des cytokines pro-inflammatoires limitent la sécrétion de l’AGT. Cette étude élucide un nouveau mécanisme par lequel les astrocytes influencent et augmentent l’étanchéité de la BHE, et implique une dysfonction de ce mécanisme dans les lésions de la SEP où s’accumulent les cellules inflammatoires. Dans un deuxième temps, les techniques établies dans la première section ont été utilisées afin d’identifier les protéines de la BHE qui s’accumulent dans les radeaux lipidiques. En utilisant une technique de protéomique nous avons identifié ALCAM (Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule) comme une protéine membranaire exprimée par les CE de la BHE. ALCAM se comporte comme une molécule d’adhérence typique. En effet, ALCAM permet la liaison entre les cellules du sang et la paroi vasculaire, via des interactions homotypiques (ALCAM-ALCAM pour les monocytes) ou hétérotypiques (ALCAM-CD6 pour les lymphocytes). Les cytokines inflammatoires augmentent le niveau d’expression d’ALCAM par la BHE, ce qui permet un recrutement local de cellules inflammatoires. Enfin, l’inhibition des interactions ALCAM-ALCAM et ALCAM-CD6 limite la transmigration des cellules inflammatoires (monocytes et cellules T CD4+) à travers la BHE in vitro et in vivo dans un modèle murin de la SEP. Cette deuxième partie identifie ALCAM comme une cible potentielle pour influencer la transmigration de cellules inflammatoires vers le cerveau. Dans un troisième temps, nous avons pu démontrer l’importance des propriétés sécrétoires spécifiques à la BHE dans les interactions avec les cellules souches neurales (CSN). Les CSN représentent un potentiel thérapeutique unique pour les maladies du SNC dans lesquelles la régénération cellulaire est limitée, comme dans la SEP. Des facteurs qui limitent l’utilisation thérapeutique des CSN sont le mode d’administration et leur maturation en cellules neurales ou gliales. Bien que la route d’administration préférée pour les CSN soit la voie intrathécale, l’injection intraveineuse représente la voie d’administration la plus facile et la moins invasive. Dans ce contexte, il est important de comprendre les interactions possibles entre les cellules souches et la paroi vasculaire du SNC qui sera responsable de leur recrutement dans le parenchyme cérébral. En collaborant avec des chercheurs de la Belgique spécialisés en CSN, nos travaux nous ont permis de confirmer, in vitro, que les cellules souches neurales humaines migrent à travers les CE humaines de la BHE avant d’entamer leur différenciation en cellules du SNC. Suite à la migration à travers les cellules de la BHE les CSN se différencient spontanément en neurones, en astrocytes et en oligodendrocytes. Ces effets sont notés préférentiellement avec les cellules de la BHE par rapport aux CE non cérébrales. Ces propriétés spécifiques aux cellules de la BHE dépendent de la chimiokine MCP-1/CCL2 sécrétée par ces dernières. Ainsi, cette dernière partie suggère que la BHE n’est pas un obstacle à la migration de CSN vers le SNC. De plus, la chimiokine MCP-1 est identifiée comme un facteur sécrété par la BHE qui permet l’accumulation et la différentiation préférentielle de cellules souches neurales dans l’espace sous-endothélial. Ces trois études démontrent l’importance de la BHE dans la migration des cellules inflammatoires et des CSN vers le SNC et indiquent que de multiples mécanismes moléculaires contribuent au dérèglement de l’homéostasie du SNC dans les réactions neuro-immunes. En utilisant des modèles in vitro, in situ et in vivo, nous avons identifié trois nouveaux mécanismes qui permettent d’influencer les interactions entre les cellules du sang et la BHE. L’identification de ces mécanismes permet non seulement une meilleure compréhension de la pathophysiologie des réactions neuroinflammatoires du SNC et des maladies qui y sont associées, mais suggère également des cibles thérapeutiques potentielles pour influencer l’infiltration des cellules du sang vers le cerveau / Multiple Sclerosis is an inflammatory demyelinating disease in which immune cells from the peripheral blood infiltrate the central nervous system (CNS) to cause a pathologic neuroinflammatory reaction. Blood borne leucocytes cross the restrictive cerebral endothelium, the blood brain barrier (BBB), to gain access to the CNS parenchyma and cause cellular damage leading to the characteristic demyelinating lesions. The BBB is the interface between the blood and the CNS and as such is a critical mediator of neuro-immune reactions and an important therapeutic target to modulate neuroinflammation. It is essential to have a better understanding of the molecular mechanisms that regulate the BBB properties to elaborate new therapeutic strategies to modulate the BBB and thus the local neuroinflammation reaction. This Ph.D. thesis describes three distinct molecular mechanisms which regulate key BBB properties. The first section describes a novel role for the renin-angiotensin system (RAS) in the neuro-vascular unit (NVU) as a regulator of paracellular permeability. The second part of this thesis characterises the role of a novel adhesion molecule of the BBB, ALCAM. The third part of this work studies the interactions between neural stem cells (NSC) and the BBB and identifies MCP-1 as a critical factor involved in NSC recruitment to the CNS. In the first experimental section we provide evidence that angiotensinogen (AGT) produced and secreted by astrocytes, is cleaved into angiotensin II (AngII) and acts on type 1 angiotensin receptors (AT1) expressed by BBB endothelial cells (ECs). Activation of AT1 restricts the passage of molecular tracers across human BBB-derived ECs through threonine-phosphorylation of the tight junction protein occludin and its mobilization to lipid raft membrane microdomains. We also show that AGT knockout animals have disorganized occludin strands at the level of the BBB and a diffuse accumulation of the endogenous serum protein plasminogen in the CNS, as compared to wild type animals. Finally, we demonstrate a reduction in the number of AGT-immunopositive perivascular astrocytes in multiple sclerosis (MS) lesions, which correlates with a reduced expression of occludin similarly seen in the CNS of AGT knockout animals. Such a reduction in astrocyte-expressed AGT and AngII is dependent, in vitro, on the pro-inflammatory cytokines tumor necrosis factor-α and interferon-γ. Our study defines a novel physiological role for AngII in the CNS and suggests that inflammation-induced downregulation of AngII production by astrocytes is involved in BBB dysfunction in MS lesions. In the second experimental part we focus on adhesion molecules of the BBB. Using a lipid raft-based proteomic approach, we identified ALCAM (Activated leukocyte cell adhesion molecule) as an adhesion molecule involved in leukocyte migration across the BBB. ALCAM expressed on BBB endothelium co-localized with CD6 expressed on leukocytes and with BBB endothelium transmigratory cups. ALCAM expression on BBB cells was up-regulated in active multiple sclerosis and experimental auto-immune encephalomyelitis (EAE) lesions. Moreover, ALCAM blockade restricted transmigration of CD4+ lymphocytes and monocytes across BBB endothelium in vitro and in vivo, and reduced the severity and time of onset of EAE. Our findings point to an important role for ALCAM in leukocyte recruitment into the brain and identify ALCAM as a potential therapeutic target to dampen neuroinflammation. The third experimental part of this thesis studies the interactions between NCS and BBB. NCS represent an attractive source for cell transplantation and neural tissue repair. After systemic injection, NCS are confronted with the specialized BBB endothelial cells before they can enter the brain parenchyma. We investigated the interactions of human fetal neural precursor cells with human brain endothelial cells in an in vitro model using primary cultures. We demonstrated that human fetal neural precursor cells efficiently and specifically migrate to sub-endothelial space of human BBB-endothelium, but not pulmonary artery endothelial cells. When migrated across BBB-endothelial cells, fetal neural precursor cells spontaneously differentiate to neurons, astrocytes and oligodendrocytes. Effective migration and subsequent differentiation was found to be dependant on the chemokine CCL2/MCP-1, but not CXCL8/IL-8. Our findings suggest that an intact blood-brain barrier is not an intrinsic obstacle to neural stem cell migration into the brain and that differentiation of neural precursor cells occur in a sub-endothelial niche, under the influence of the chemokine CCL2/MCP-1. These three experimental sections demonstrate the crucial roles that the BBB plays in regulating the CNS homeostasis. Under pathological conditions, such as during neuro-immune reactions, the BBB is altered and becomes an important local player. The three different molecular mechanisms described in this thesis, contribute to our understanding of the BBB and may allow for the development of novel therapeutic strategies to limit neuroinflammation.

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