Made available in DSpace on 2016-04-07T13:20:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 desio_oliveira_ioc_dout_2011.pdf: 1175865 bytes, checksum: f838717ed871f60759465b1b71ebee3c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A infecção pelo Trypanosoma cruzi promove alterações em órgãos linfóides. O timo apresenta-se atrofiado com depleção de células CD4+CD8+ (DP) na fase aguda. Em órgãos linfóides periféricos, os linfonodos subcutâneos (LSC) e o baço apresentam-se hipertrofiados com aumento de células T e B, enquanto os linfonodos mesentéricos (LM) apresentam-se atrofiados devido à morte dessas células. Nesse trabalho estudamos os efeitos da infecção pelo T. cruzi sobre células epiteliais tímicas (TEC) e timócitos, bem como o papel do timo no comportamento de órgãos linfóides periféricos. Em experimentos de infecção in vitro, avaliamos TEC, abordando a expressão de ligantes e receptores da matriz extracelular (ECM), e ainda, as possíveis conseqüências desse aumento de ECM sobre a interação de TEC/timócitos ou TEC/parasita. Nossos resultados demonstram que a infecção promove diminuição do número de TEC, alterações morfológicas e aumento de ECM em culturas infectadas. Observamos também que componentes da ECM são requeridos na interação entre TEC/parasita. Curiosamente, o menor crescimento de TEC em culturas infectadas está associada com a inibição do ciclo celular e não com apoptose No que se refere à interação TEC/timócitos, observamos que a adesão foi maior nas culturas infectadas, especialmente sobre TEC parasitadas. Esse aumento de adesão entre TEC/timócitos corrobora a hipótese descrita anteriormente pelo nosso grupo que a infecção favorece a migração de timócitos para periferia. Estendendo nossa análise ao compartimento linfóide do timo, investigamos a apoptose de timócitos na infecção. Observamos que a celularidade do timo diminui viii durante a infecção, juntamente com aumento de apoptose de timócitos CD4-CD8- (DN), DP, CD4 e CD8. Procurando entender a via envolvida na apoptose desses timócitos, demonstramos que a atividade de caspases total, caspase 8, caspase 9 e caspase 3 estão aumentadas na infecção. Observamos que ambas caspases iniciadoras caspase 8 (via extrínseca, Fas, TNF, TRAIL) e caspase 9 (via intrínseca, privação de fatores) parecem estar envolvidas na depleção desses timócitos Esse dado foi confirmado nos experimentos de bloqueio de morte com inibidores de caspases, onde observamos que o tratamento in vivo (injeção intratímica) e in vitro com zVAD (inibidor geral de caspases) em timócitos de animais infectados foi mais eficaz no bloqueio da morte do que os inibidores de caspase-8 (zIETD) ou caspase-9 (zLEHD). Além disso, animais infectados e tratados com zVAD apresentaram a celularidade do timo parcialmente recuperada, mais especificamente em timócitos DN e DP. Finalmente, procurando entender o papel do timo na resposta imune regional de órgãos linfóides periféricos na infecção, camundongos foram timectomizados antes da infecção para avaliação da celularidade dos LSC, LM e baço. Nossos dados demonstram que, mesmo com a ausência do timo, a hipertrofia dos LSC e a atrofia dos LM permaneciam inalterados, entretanto, encontramos significativo acúmulo de linfócitos T e B no baço de animais infectados. Em conjunto, nossos resultados demonstram que as alterações observadas no componente epitelial do microambiente tímico, assim como em timócitos de animais infectados favorecem a migração e morte destes timócitos e a atrofia desse tecido. Além disso, demonstramos que células do timo possuem papel imunoregulatório no baço durante a infecção / Trypanosoma cruzi infection promotes lymphoid organ alterations. The thymus is atroph ied with CD4 + CD8 + (DP) thymocyte depletion in the acute phase of infection. In p eripheral lymphoid organs, subcuta neous lymph nodes (LSC) and spleen present hypertrophy, with increase of T and B cells, whereas mesenteric lymph nodes (LM) are atrophied due to the death of these cells . In this work, we studied the effects of T. cruzi infec tion in thymic epithelial cells (TEC) and thymocytes , as well as the role of thymus in the behavior of peripheral lymphoid organs . In experiments of in vitro infection, we evaluated TEC, concerning the expression of extracellular matrix (ECM) ligands and receptor s , and also the possible conseq uences of ECM increase in TEC /thymocyte or TEC/parasit e intera ctions . Our data demonstrate that T. cruzi infection promotes a decrease of TEC number , morphological alterations and ECM increase in infected cultures . We observed that ECM components ar e required in the interaction between TEC and parasit es . Curiously, the decrease in TE C number in infected cultures is associated to cell cycle inhibition but not to apoptos is . Concerning TEC/thymocyte interactions, we observed that adhesion was greater in infected cultures, especially on parasitized TEC . This increase in TEC/thymocyte adhesion corroborates the hypothesis previously described by our group that the infection favors migration of thymocyte s to the periphery . Extending our analysis to th ymic ly mphoid compartment, we investigated thymocyte apoptosis following infection . We observed that thymus cellulari ty decreases during infection, together with the increase of apopt osis in CD4 - CD8 - (DN), DP, CD4 and CD8 thymocyte s. Searching to understand what death pathway is involved in thymocyte apoptosis, we demonstrated that the activity of total cas pases, caspase - 8, caspase - 9 and caspase-3 (ef f e c tor caspase ) are increased in infection . We observ ed that both initiator ca spase - 8 (extrinsic pathway, Fas, TNF , TRAIL) and caspase - 9 (intrinsic pathway, factor deprivation) seem to be involved in thymocyte deple tion. These data were confirmed in death blocking experiments with caspase inhibitors , in which w e showed that in vivo (intrat hy mic inje ction ) and in vitro treatment s with zVAD ( general caspase in hibitor ) were more effective in blocking thymocyte death than the in hibitors of caspase - 8 (zIETD) or caspase - 9 (zLEHD) separately . Moreover , infected animals treated with zVAD showed a partial recovery of thymus cellularity , more specifica lly in DN and DP thymocytes . Finally, searching to understand the role of the thymus in the regional immune response of peripheral lymphoid organs in infection , mice were t hy mectomiz e d prior to infection to evaluation of LSC, LM and spleen cellularity. Our data demonstrate d that, even in the absence of the thymus, LSC hypertrophy and LM atrophy were not altered ; however , we found a significant accumulation of T and B lymphocytes in the spleen of infected animals. Conjointl y , our results show that the alterations observed in the epithelial component of the thymus microenvironment, as well as in thymocyte s of infected animals favor the migration and death of thymocyte s and the atrophy of this tissue . Besides that , we demonstr at ed that thymic cells have an immunoregulatory role in the spleen during infection .

Made available in DSpace on 2016-04-15T12:59:57Z (GMT). No. of bitstreams: 2 marco_stimamiglio_ioc_dout_2009.pdf: 7045829 bytes, checksum: 6668ee161093cf29f56e28a841129af4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A colonização do timo por precursores hematopoéticos representa um evento crucial para o desenvolvimento deste próprio órgão, assim como garante a diferenciação e a formação do repertório de células T maduras. Entretanto, os mecanismos moleculares que dirigem este processo não são totalmente conhecidos. A entrada destes precursores depende da ativação de uma cascata de sinalizações intermoleculares, onde participam algumas moléculas, como as integrinas e as quimiocinas. Os receptores Eph, que compõem a maior família de receptores tirosina-quinase, representam importantes moléculas reguladoras do desenvolvimento de sistemas e órgãos, sendo encontrados também no tecido linfóide. Mais recentemente, essa família de receptores, juntamente com seus ligantes, efrinas, foi descrita como moléculas co-estimulatórias de sinais transmitidos em linfócitos T pelo receptor de antígeno, por quimiocinas e integrinas. Neste contexto, o objetivo central deste trabalho foi o de avaliar as possíveis funções dos receptores Eph, em particular EphB2, em modular a atividade migratória de precursores T durante os processos de colonização do timo e maturação intratímica de linfócitos Nossos resultados demonstram a expressão dos receptores EphB2 no timo de camundongos e a sua participação tanto nos processos iniciais da organogênese do timo, quanto na diferenciação intratímica de timócitos. Este receptor, assim como seus principais ligantes, também é expresso em células precursoras derivadas da medula óssea de camundongos e é capaz de modular a migração e a capacidade de entrada destes precursores em lóbulos tímicos alinfóides. Além disso, vimos que a falta deste receptor, ou de seu domínio catalítico tirosina-quinase, promove uma redução na deposição de proteínas da matriz extracelular e de quimiocinas no timo, assim como resulta em importante inibição da entrada dos precursores hematopoiéticos neste órgão. De igual maneira, o desequilíbrio dos sinais transmitidos pelo complexo EphB2/efrina-B impede o correto posicionamento intratímico destes precursores, possivelmente levando a um bloqueio na maturação dos timócitos. Finalmente, demonstramos que a ausência do receptor ou dos sinais EphB2 não modifica os níveis de expressão de outros receptores como integrinas e receptores de quimiocina nos precursores hematopoiéticos e timócitos, mas possivelmente modula sua atividade e, desta forma, a atividade migratória destas células frente a estímulos hapto e quimiotáticos. Em conjunto, nossos resultados apontam uma importante participação dos sinais desencadeados pelo complexo Eph/efrina e sua co-regulação com outros receptores que modulam o processo de migração dos precursores de células T, desde sua entrada no timo, até o seu correto desenvolvimento e migração dentro deste órgão / Thymus settling by hematopoietic progenitors represents a crucial event during thymus ontogeny and guarantees the proper differentiation of the T-cell repertoire. However, the molecular mechanisms that drive such process are not completely understood. Progenitor settling depends on the activation of intercellular signaling cascades, where some integrins and chemokines play a role. Eph receptors, th e major tyrosine-kinase receptor family, are important regulatory molecules for the development of several systems and organs, being also expressed in lymphoid tissues. More recently, this receptor family, conjointly with the corresponding ligands, the ephrins, has been reported as costimulatory molecules for the T- cell receptor, chemokine receptors and integrins on T lymphocytes. In this context, the aim of this work was to evaluate the possible functions of Eph receptors, in particular EphB2, as modulators of T-cell progenitor migration during thymus settling and intrathymic T-cell maturation. Our results demonstrate that EphB2 receptors are expressed in the mouse thymus and participate in its organogenesis and intrathymic T-cell development. This receptor and its main ligands are also expressed in mouse bone marrow-derived progenitor cells, being able to modulate migration and the ability of these cells to settling thymic lobes. Moreover, the lack of such receptor, or its tyrosine-kinase domain, results in a reduced deposition of extracellular matrix proteins and chemokines in the thymus, and leads to an important inhibition of thymus settling by hematopoietic progenitors. Furthermore, an imbalance of the signals transmitted by EphB2/ephrin-B complex prevents proper intrathymic positioning of progenitor cells, possibly causing a blockade in thymocyte maturation. Finally, we demonstrated that the lack of EphB2 receptor or signaling does not change the expression level of integrins and chemokine receptors on hematopoietic progenitors and thymocytes, but possibly modulates the activity of these receptors and the cell migration activity through hapto and chemotactic stimuli. Taken together, our results point to an important participation of Eph/ephrin complex signaling and its cross-regulation with other receptors that modulates T-cell migration process, from thymus settling until the pr oper thymocyte development within the organ.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los efectos de la exposición a bajos niveles de plomo sobre la función endocrina e inmune, no han sido objeto de suficientes estudios, siendo esta situación diferente en el caso de la intoxicación aguda, particularmente en otros sistemas corporales, tales como el nervioso, cardiovascular, reproductivo y gastrointestinal. La presente investigación estudió los efectos de la exposición subaguda a bajos niveles de plomo en el periodo prepuberal, sobre algunos parámetros conocidos que evalúan, en alguna medida, los mecanismos de adaptación inmunoendocrinos frente al stress, considerándose en este estudio, el número de linfocitos T CD4+ y CD8+, número y grado de degranulación de leucocitos eosinófilos y número de receptores para glucocorticoides presentes en timo y bazo de las ratas impúberes analizadas. Ratas Sprague Dowley hembras, mantenidas bajo condiciones de manejo con 12 h de luz y acceso libre a alimento y agua, fueron expuestas a acetato de plomo o suero fisiológico, vía inyecciones subcutáneas sucesivas, alternadas cada 72 h, a partir de los 7 días de edad hasta alcanzar los 19 días, momento en el cual cada animal tratado con plomo recibió una dosis total acumulada de 24.38 mg., distribuida en forma de dosis crecientes, proporcionales al peso de los animales. Después de 48 h de la última dosis de suero fisiológico o acetato de plomo, se aplicó una inyección endovenosa única de suero fisiológico o 18 mg de succinato de hidrocortisona por cada 100 g de peso corporal y 24 h después se anestesió a los animales con gas éter, extrayendo muestra completa de timo y bazo, seleccionando tejido para fijación en formalina al 10%, deshidratación e inclusión en parafina, para luego realizar cortes histológicos seriados, sometiéndolos a tinción con azul de anilina y eosina, para la determinación, bajo microcopía de epifluorescencia, del número y grado de degranulación de eosinófilos. Adicionalmente, se dispusieron cortes para desparafinación y posterior incubación con anticuerpos monoclonales marcados con ficoeritrina o fluoresceína, siendo destinados una primera serie de cortes a reaccionar con los anticuerpos anti-CD8, procediendo en una segunda serie, a la incubación de los cortes con anticuerpos anti-CD4. Paralelamente, se tomaron muestras de bazo y timo de ratas sometidas a inyecciones de plomo o suero fisiológico entre los días 7 y 19 de edad, aplicando intravenosamente suero fisiológico en ambos grupos el día 21, procediendo 24 hrs. después a la recolección de pequeñas muestras de tejido, incubándolas in vitro con dexametasona tritiada, congelando posteriormente los tejidos radiomarcados en propano/butano líquido enfriado en nitrógeno líquido, para luego someter las muestras a la técnica de radioautografía seca, destinada a cuantificar, bajo microscopía óptica, los receptores para glucocorticoides presentes en timo y bazo. Los resultados mostraron una disminución inducida por plomo del número de linfocitos T CD4+ y CD8+ en timo de ratas expuestas a plomo durante la vida prepuberal, encontrándose además un reducido número de linfocitos CD8+ en los grupos tratados con hidrocortisona. El número de receptores para glucocorticoides no demostró variación estadísticamente significativa atribuible al efecto del plomo en el presente estudio experimental. Los animales expuestos a plomo demostraron una disminución en el número de eosinófilos en timo, pero no en bazo. Además, presentaron una disminución inducida por hidrocortisona en el número de eosinófilos en bazo, pero no en timo. Se comprobó un efecto sinérgico entre el plomo y la hidrocortisona, demostrado por el disminuido número de eosinófilos esplénicos en los animales que recibieron plomo y luego fueron tratados con hidrocortisona. Los leucocitos eosinófilos esplénicos se degranulan con mayor intensidad en los animales expuestos a plomo, observándose una reversión de este fenómeno inducido por hidrocortisona, revelada por una menor degranulación en el grupo expuesto a plomo y tratado con hidrocortisona en relación a los animales expuestos a plomo y tratados posteriormente con suero fisiológico. El grado de degranulación de los eosinófilos tímicos, no demostró diferencias significativas producto de algún tratamiento. No obstante, los eosinófilos de timo fueron de menor volumen y de mayor luminosidad que los encontrados en todas las muestras de bazo. Luego del análisis de los resultados es posible afirmar que la exposición subaguda a plomo en ratas a edad prepuberal, modifica variablemente el número de linfocitos T en órganos linfoides, alterando paralelamente la eosinofilia tisular y el grado de degranulación de los leucocitos eosinófilos, sin cambios aparentes en el número de receptores para glucocorticoides analizados en bazo y timo. / Financiamiento FONDECYT 1.950.634

O timo é um órgão essencial para a maturação, diferenciação e seleção de linfócitos T, consequentemente fundamental para o desenvolvimento da imunidade do organismo. Além do papel na manutenção da integridade tecidual, os vasos sanguíneos tímicos desempenham função no processo de migração de células precursoras de linfócitos para o interior do órgão. Sua arquitetura típica é caracterizada por grandes vasos localizados na junção corticomedular e uma fina cadeia de ramificações e anastomoses no interior do córtex, porém são pouco conhecidas as bases moleculares que induzem a formação desta particular vascularização, bem como os exatos mecanismos que desencadeiam a involução do órgão, evento relacionado a alterações nos padrões vasculares. Entretanto, tem sido demonstrado que as interações entre o estroma, que inclui o endotélio vascular, e o compartimento hematopoiético tímico desempenham papéis cruciais na funcionalidade do órgão. Sendo o VEGF um fator angiogênico essencial na formação do leito vascular tecidual e na modulação de funções diretamente relacionadas à vascularização, objetivamos neste estudo avaliar a expressão gênica e protéica deste fator de crescimento durante estágios de desenvolvimento e involução do órgão. Foram utilizadas amostras de timo suíno em 3 diferentes estágios de desenvolvimento fetal (65, 85 e 111 dias) e 2 estágios de vida pós-natal, um compreendendo fase de maturação (5 meses) e outro de involução do órgão (2 anos), compreendendo um total de 25 animais, divididos em 5 grupos (n = 5). A análise da expressão relativa do mRNA do sistema VEGF-A, acessada por meio de PCR em tempo real, apresentou modificações tempo-dependentes significativas (P<0,05) em relação ao controle endógeno GAPDH. Também foram observadas diferenças significativas (P0,05) na quantificação vascular por meio de estereologia entre as idades. A imunolocalização da proteína do VEGF e de seus receptores Flt-1 e KDR foi identificada no timo de todos os grupos experimentais e variou entre os grupos pré e pós-natais, com expressão mais rara nestes últimos, o que sugere diferenças temporais na modulação do mRNA no órgão. Assim como as células endoteliais, as células epiteliais tímicas demonstraram modulação pelo sistema VEGF-A, indicando ação parácrina e/ou autócrina deste fator de crescimento no timo. Os valores das variáveis estereológicas Sv[m] e Vv[m] do timo fetal em período próximo ao nascimento mantiveram-se maiores do que no córtex e se correlacionaram positivamente com a expressão do mRNA do KDR e negativamente com a do Flt-1 até a idade adulta. Ao contrário da expressão protéica, a expressão gênica do sistema VEGF-A pode se correlacionar negativamente com aspectos quantitativos da vascularização do timo pós-natal, como observado para o mRNA do VEGF e seu receptor Flt-1 a partir dos 5 meses de idade, quando os valores das variáveis Vv[vasos,timo], Sv[vasos,timo] e Lv[vasos,timo] diminuíram significativamente (P0,05), o que sugere uma resposta de compensação ou manutenção de uma condição hipóxica instalada no órgão. / Crucial for maturation, differentiation and selection of T lymphocytes, the thymus is an essential organ to the development of immunity. In addition to its role in the maintenance of tissue integrity, thymus blood vessels play a role in migration of T-cell precursors into the organ, and show a typical architecture characterized by the presence of large blood vessels at the corticomedullary junction and fine network of branching vessels and anastomosing arcades extending into the cortex. The molecular basis of this typical vasculature and the exact mechanisms that trigger thymus involution are both not well understood. However, it has been shown that the interactions between thymus stroma, including vascular endothelium and the hematopoietic compartment play crucial roles for normal organ function. Thus, because VEGF is an essential angiogenic factor for induction of the vascular bed and modulation of functions directly related with vascularization, the aim of this study was to assess the temporal protein and mRNA expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR in the thymus during early stages of its development and involution. Samples of thymus from 3 different stages of fetal development (65, 85, and 111 days) and 2 stages of postnatal life of pigs, including one stage of maturation (5 months) and another of involution (2 years) comprising a total of 25 animals that were divided into 5 groups (n = 5). Relative mRNA expression of VEGF-A system, accessed by real-time PCR, showed temporal significant changes (P<0.05) compared to endogenous control GAPDH. Quantification of blood vessels by means of stereology also showed significant differences (P0.05) between ages. Positive immunostaining for VEGF and its receptors Flt-1 and KDR was identified in the thymus of all groups and it varied between the pre and postnatal groups with rare expression in the latter, suggesting temporal differences in the modulation of mRNA. Endothelial and epithelial cells showed modulation by the VEGF-A system, suggesting paracrine or alternatively autocrine activity of this growth factor. The values of the stereological parameters Sv[m] and Vv[m] of the thymus in fetal period around the birth remained higher than in the cortex and upregulated with mRNA expression of KDR and downregulated with mRNA expression of Flt-1 until adulthood. Unlike protein expression, gene expression gene expression of VEGF-A system can be downregulated with quantitative aspects of the postnatal thymus vascularization as observed for the mRNA of VEGF and its receptor Flt-1 from the age of 5 months, when the values of the stereological parameters Vv[vessels,thymus], Sv[vessels,thymus] and Lv[vessels,thymus] decreased significantly (P0.05), which suggests a compensatory or maintenance response to an hypoxic condition in the organ.

Submitted by WAGNER GARCEZ DE MELLO (wagnergarcez@foa.unesp.br) on 2016-05-19T11:31:47Z No. of bitstreams: 1 TESE - WAGNER GARCEZ DE MELLO.pdf: 3737001 bytes, checksum: e1ec14f336cc47469d8097ff9f7d4d47 (MD5) / Rejected by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br), reason: Troca solicitada pelo autor, por favor realize uma nova submissão com o arquivo correto on 2016-05-19T14:28:25Z (GMT) / Submitted by WAGNER GARCEZ DE MELLO (wagner_garcez@hotmail.com) on 2016-05-19T14:44:43Z No. of bitstreams: 1 TESE - WAGNER GARCEZ DE MELLO.pdf: 3729799 bytes, checksum: 31766ebe878f0096a9110e22b5aa8e50 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-05-19T18:05:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mello_wg_foa.pdf: 3729799 bytes, checksum: 31766ebe878f0096a9110e22b5aa8e50 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-19T18:05:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mello_wg_foa.pdf: 3729799 bytes, checksum: 31766ebe878f0096a9110e22b5aa8e50 (MD5) Previous issue date: 2016-03-21 / O presente trabalho avaliou os efeitos da timectomia neonatal sobre o dimorfismo sexual esquelético e qualidade óssea, bem como, determinou se as alterações causadas por este modelo podem influenciar as secreções de leptina em animais pré-púberes, púberes e adultos-jovens. Para isso, Ratos Wistar, neonatos foram divididos em grupo controle e grupo timectomizado, de ambos os sexos, totalizando quatro grupos experimentais (n = 06-08 por grupo). Os animais foram timectomizados no terceiro dia pós-natal. Os grupos foram eutanasiados aos 20, 40 e 120 dias pós-natais, que correspondem, respectivamente, às fases pré-púbere, púbere e adultos-jovens. Foram coletados sangue e ambos os fêmures. Os fêmures esquerdos foram usados para determinação do comprimento, realizado com auxílio de um paquímetro. Avaliação das propriedades biofísicas do fêmur foram determinadas por meio do teste de densitometria óssea, e o comportamento biomecânico avaliado por meio do o ensaio mecânico de compressão da cabeça do fêmur. Os fêmures direitos foram usados para avaliação histométrica da base do colo femoral. As amostras sanguíneas foram utilizadas para determinar as concentrações plasmáticas de leptina. Em conjunto os dados do presente trabalho demonstram que em animais controle, as diferenças sexualmente dimórficas em relação ao desenvolvimento corporal e esquelético, bem como na secreção de leptina, existem durante o período pré-púbere, mas são consolidadas após a puberdade. Demonstram ainda, que a timectomia neonatal causa alterações sexo- e tempo-dependentes no desenvolvimento corporal, propriedades estruturais e biomecânicas do tecido ósseo, além de modular a secreção plasmática de leptina, sugerindo uma comunicação bidirecional entre o Timo e esse hormônio. Estes resultados fornecem uma nova visão sobre a complexidade dinâmica da homeostase da massa óssea e sugerem que a presença do Timo durante o período perinatal é importante para o desenvolvimento esquelético normal. / This study evaluates the effects of neonatal thymectomy on skeletal sexual dimorphism and bone quality. In addition, we verified whether the changes caused by this model may influence the leptin secretion in prepubertal, puberty and adulthood. For this, Wistar, newborns were divided into control group and thymectomized group, of both sexes, totaling four experimental groups (n = 08 per group). The animals were thymectomized at the third postnatal day. The groups were euthanized at 20, 40 and 120 days’ postnatal life, which correspond respectively to the prepuberty, puberty and adulthood periods. Blood and both femurs were collected. The left femurs were used to determine the length, conducted with the aid of a caliper. The biophysical properties of the femur were evaluated using dual-energy x-ray absorptiometry, and the biomechanical properties assessed by the mechanical compression of the femoral head. In the right femurs, the base of the femoral neck was used to quantitative histometric analysis. The blood samples were used to determine plasma concentrations of leptin. Taken together, the data of the present study demonstrates that control animals, sexually dimorphic differences in relation to body and skeletal development as well as the secretion of leptin, there during the prepubertal period but are consolidated after puberty. Demonstrate further that the neonatal thymectomy causes changes sex- and time-dependent on body development, structural and biomechanical properties of bone tissue, as well as plasma leptin secretion, suggesting a cross-talk between Thymus and this hormone. These findings provide new insight into the dynamic complexity of bone homeostasis and suggest that the presence of Thymus during the perinatal period is important for normal skeletal development.

Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:16Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) ellen_contreiras_ioc_dout_2000.pdf: 498931 bytes, checksum: e1cd4415e0ee25940a50108c1801ed6f (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Neste trabalho, estudamos timos de eqüinos, incluindo aspectos morfológicos e o microambiente tímico em fetos, e em animais após o nascimento, assim como eqüinos com anemia infecciosa eqüina (AIE). Utilizamos 56 animais: 6 (2-10 meses de gestação), 42 (6 meses -18 anos de idade) e 8 (5-20 cavalos com AIE). Os timos foram analisados por técnicas histológicas, imuno histoquímica para detecção de proteínas de matriz extracelular tais como, fibronectina, laminina e colágeno tipo IV, e ainda por microscopia eletrônica. Nos animais após o nascimento, classificamos a involução tímica dependente da idade em cinco graus. Atrofias graus I e II, ocorriam predominantemente entre 6 a 18 meses de idade; atrofia III, de 18 meses até 4 anos de idade; atrofias IV e V, de 4-5 anos de idade até 18 anos. Esta atrofia não ocorre uniformemente, no mesmo timo, demonstrando variação local de um lóbulo para outro, sugerindo variabilidade de microambiente.Espaços perivasculares (PVS) foram observados contendo, linfócitos os quais formavam uma camada celular ou eram dispostos em cordões, sugerindo comunicação funcional com a camada periférica de células epiteliais do compartimento intraparenquimal A matriz extracelular no timo eqüino apresenta distribuições definidas na cápsula, septos e espaço perivascular (colágenos intersticiais, proteoglicanos, fibras elásticas e fibronectina); membrana basal lobular e vascular (laminina e colágeno tipo IV); intersticial ou intraparenquimal colágeno tipo III e fibronectina. Isto é semelhante ao que foi observado em timo de outras espécies de mamíferos. Hematopoese intratímica não linfóide é um acontecimento freqüente em cavalos. Eosinófilos se diferenciam dentro do timo uma vez que tem formas imaturas como mielócitos e metamielócitos. Eosinopoese foi observada em timos eqüinos, em todas as idades estando entretanto em menor número em animais idosos. A eosinófilos imaturos e maduros foram encontrados em várias regiões dos lóbulos tímicos (dispersos ou formando agregados), particularmente nos espaços perivasculares, nas regiões cortical e medular. É interessante destacar que grânulos de eosinófilos não apresentam o típico cristaloide como outras espécies de mamíferos. Avaliamos também fetos eqüinos. Aspectos morfológicos foram descritos, em relação ao aparecimento seqüencial de certos eventos fundamentais, assim como a definição córtico-medular, e maturação dos corpúsculos de Hassall Esses são similares àqueles descritos em humanos e outras espécies animais. Entretanto, os fetos eqüinos, apresentavam intensa eosinofilia intratímica e hematopoese de outras linhagens. Adicionalmente, vasos linfáticos bem definidos repletos de linfócitos foram vistos nos timos fetais. Nossos resultados demonstraram que comparando várias características morfológicas com timos de outros mamíferos, o timo fetal eqüino exibe aspectos particulares, sugerindo representar um interessante modelo adicional para estudos de hematopoese não linfóide intratímica em mamíferos, assim como a origem e destino de linfócitos encontrados dentro de vasos linfáticos tímicos. Finalmente, estudamos timos de cavalos com AIE. Observamos uma severa e acelerada atrofia tímica, com formação de grandes corpúsculos de Hassall cistificados, assim como um aumento da deposição dos componentes de matriz extracelular e da rede vascular quando comparados aos timos de animais normais. Concluindo, nosso estudo enfatizou ainda a importância de se analisar vários modelos animais, de forma a evitarmos o víés de percebermos o sistema imune baseando-se somente ou, em sua maioria, no modelo de camundongo / n this work, we studied morphological aspects and the equine thymic microenvironment in fetuses, and in the normal post -natal development, as well as in horses undergoing Equine Infectious Anemia (EIA). This study comprised 56 animals in different ages. These thymuses were analyzed by conventional histology, immunohistochemistry for de tection of extracellular matrix proteins. In post-natal animals, we classified the equine age -dependent thymic involution or atrophy in five grades. Atrophies of grades I and I I occurred predominantly from 6 to 18 months old; atrophy III, from 18 months to 4 years old; atrophies IV and V, from 4-5 to 18 years old. This atrophy does not occur uniformly, e ven in the same thymus, showing local variation from one lobule to another, thus suggesti ng microenvironmental variability. Perivascular spaces (PVS) were observed and lymphoc ytes formed a cell layer or were arranged in strands, suggesting a functional commun ication with the peripheral layer of epithelial cells from the intraparenchymal compartm ent. The extracellular matrix in the equine thymus prese nted four basic distribution profiles in capsular, septal and perivascular (interstitial collagens, proteoglycans, elastic fibers and fibronectin); lobular and vascular basement membran e (laminin and type IV collagen); interstitial or intraparenchymal type III colagen a nd fibronectin. In general, this is similar to what has been previously seen in the thymus of othe r mammalian species. Intrathymic non-lymphoid hematopoiesis is a frequen t event in horses. Eosinophils differentiate within the equine thymus since immatu re forms such as myelocytes and metamyelocytes are often detected. Eosinopoiesis we re observed in the equine thymus in all ages being however less numerous in the older anima ls. These immature and mature eosinophils were found in various regions of the th ymic lobules (scattered or forming clusters), particularly in the perivascular spaces, both in the regions cortical and medular. Interestingly, eosinophil granules do not exhibit t he typical crystalloid from other mammalian species. We also evaluated the equine fetal thymus. The morphological aspects described, plus the sequential appearance of certain fundament al events, such as cortical-medullar definition, the appearance and the maturation of Ha ssall’s corpuscles, are similar to those described in humans and other animals species . However, the equine fetal thymuses show intense intrathymic eosinophilia and hematopoiesis of other lineages. Additionally, clear-cut lymphatic vessels full of l ymphocytes were seen in these fetal thymuses. Our results show that despite sharing sev eral morphological features with the thymus from other mammals, the equine fetal thymus exhibits particular aspects, suggesting that it may represent an interesting mod el for further studies on mammalian intrathymic non-lymphoid hemopoiesis as well as the origin and fate of lymphocytes found within thymic lymphatic vessels. Finally we studied thymuses from horses undergoing equine infectious anemia. we observed a severe an accelerated thymic atrophy, wi th formation of large cystic hassall's corpuscles, as well as an augmentation in the depos ition of extracellular matrix components and the vascular network when compared with normal animals. In conclusion, our study also emphasizes the import ance of analyzing various animal models, in order to avoid a skew view of the immune system, based only or mainly on the mouse model.

Made available in DSpace on 2016-03-04T13:59:26Z (GMT). No. of bitstreams: 2 luciana_barros_ioc_dout_2014.pdf: 3326577 bytes, checksum: 370ee3d6142f8100a7adc37a80899e9a (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O timo é um órgão linfoide primário, sítio do desenvolvimento de células T, provendo fatores críticos e coordenados que induzem e suportam o comprometimento de linhagem, diferenciação e sobrevivência dessas células. A presença das células não-linfóides, principalmente as células epiteliais do timo (TEC) no parênquima tímico promove a migração e diferenciação coordenada dos linfócitos T. Os linfócitos T são o principal alvo do Virus linfotrópico T humano (HTLV-1), agente etiológico da leucemia/linfoma associado ao HTLV-1 (ATL) e de doença que compromete o sistema nervoso/muscular (HAM/TSP). É desconhecida a causa que leva a uma ou outra doença. A resposta imune antiviral mediada por células T é ineficiente nessas patologias. Mesmo que o vírus tenha tropismo pelos linfócitos T, ele é capaz de infectar outros tipos celulares por contato direto entre células ou por partículas virais livres. Linfócitos ativados recirculam pelos órgãos linfoides, incluindo o timo, onde as células epiteliais tímicas (TEC) interagem intimamente com as células recirculantes, promovendo uma possível via de transmição do HTLV-1. No nosso trabalho, observamos que as TECs possuem os receptores para a entrada do vírus (GLUT-1 e Neuropilina-1). Experimentos in vitro mostraram que as TECs podem ser infectadas pelo HTLV-1 por linhagens de linfócitos derivados de pacientes portadores de ATL e de HAM/TSP Essas infecções ocorreram tanto por contato direto entre as células, quanto por sobrenadante contendo partículas virais livres derivadas do sobrenadante dos linfócitos. O vírus pode ser observado após 24 horas e 10 dias de cultivo, quando a maioria das células estava infectada. Através de microscopia eletrônica de transmissão, foram observadas partículas virais brotando de estruturas semelhantes a corpos multivesculares nas TECs. A expressão gênica de citocinas e quimiocinas foram encontradas aumentadas nas TECs logo após contato com o sobrenadante contendo HTLV-1 derivado dos linfócitos. Somado a isso, a expressão gênica de inteferon tipo 1 e genes induzidos por interferon estavam diminuídos. A resposta migratória de linfócitos T CD4+ induzida por TEC HTLV-1+ estava aumentada em relação as TEC não-infectadas. As TEC infectadas são capazes de transmitir a infecção para linfócitos T por contato, alterando a expressão de receptores de quimiocinas e de adesão nos linfócitos T CD4+. Juntos, esses resultados sugerem que as TEC HTLV-1+ infectadas por linfócitos infectados ou por vírus livres, transmitem a infecção para outras TECs e para linfócitos T CD4+, disseminando a infecção / The thymus is a primary lymphoid organ, site of developing T cells, providing a coordinated set of critical factors to induce and support lineage commitment, di fferentiation and survival of these cells. The presence of non - lymphoid cells through the thymic parenchyma serves to provide coordinated migration and differentiation of T lymphocytes. T lymphocytes are the main target of Human T Lymphotropic Virus type 1 (HTLV - 1). This virus is the etiologic agent of HTLV - 1 associated lymphoma and leukemia (ATL) or a disease of muscular/nervous systems (HAM/TSP), but it is unknown what triggers to one or other disease. T - cell mediated immune response against viral protein s is not effective in both diseases. Although the virus has T lymphocyte tropism, it can infect other cells by cell contact and cell - free virus. Activated T lymphocytes circulates around lymphoid organs, including the thymus, where the thymic epithelial ce lls (TEC) strongly interact with recirculating cells, so infected lymphocytes could transmit the virus to TEC. Interestingly, in our work we observed that TEC expresses molecules related to the HTLV - 1 transmission (GLUT - 1, Neuropilin 1). In vitro experimen ts showed that TEC could be infected by cell lineages derived from ATL and HAM/TSP patients. These infections happened from cell contact and by cell - free virus derived from cell supernatants. The virus can be seen after 24h and after 10 days, when most cel ls in the culture were infected. By transmission electron microscopy, virus particles were observed budding from multivesicular bodies like structures in TEC. Cytokines and chemokines were incr eased at mRNA level soon after contact with HTLV - 1 containing supernatant derived from lymphocytes. In addition, type 1 interferon and interferon stimulated genes were decreased in HTLV - 1 infected TEC. Migration response from T CD4 + lymphocytes driven by H TLV - 1 + TEC were increased in relation to non - infected TEC. HTLV - 1 + TEC could transmit the infection to T CD4 + lymphocytes by cell contact, altering some chemokines and adhesion receptors in T CD4 + cells. Altogether, these results suggest that after TEC inf ection by HTLV - 1 via infected lymphocytes and cell - free virus, it is able to contaminate another TEC and transmit the virus to non - infected T lymphocytes, disseminating the infection.

Made available in DSpace on 2016-05-16T12:55:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 larissa_fontes_ioc_mest_2016.pdf: 4617034 bytes, checksum: eee0cf93cb18ec86d4b978b114c27212 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A Síndrome de Wiskott-Aldrich (WAS \2013 \201CWiskott-Aldrich Syndrome\201D) é uma imunodeficiência primária associada a infecções recorrentes e ao desenvolvimento de doenças autoimunes e linfomas. Essa imunodeficiência se desenvolve em consequência de mutações no gene que codifica a proteína WASP (\201CWAS Protein\201D), expressa em células hematopoiéticas, e com funções reguladoras sobre os rearranjos do citoesqueleto de actina e na ativação de linfócitos T. Nesse sentido, camundongos deficientes em Wasp (Wasp \201Cknockout\201D \2013 WKO) apresentam desregulação de processos centrais para a resposta imunológica, resultando em migração leucocitária aberrante, proliferação linfocitária deficiente, e disfunção de células T reguladoras (Treg). De forma interessante, foi demonstrado que as células Treg, definidas pelo fenótipo CD4+CD25+Foxp3+ e com função imunossupressora, já se encontram em menor número no timo desses animais. Esse dado sugere que a deficiência em Wasp resulta em defeito na geração intratímica de células Treg. Nesse contexto, é importante salientar que a migração do timócito através do microambiente tímico é crucial para a formação das células T e, particularmente, a matriz extracelular exerce uma função determinante para os eventos de adesão e de-adesão da célula migrante. Assim, podemos postular que a matriz extracelular medeia interações cruciais para as células Treg tímicas (tTreg), fornecendo e facilitando o acesso aos diferentes sinais celulares durante o processo de maturação dessas células Nesse projeto, decidimos estudar a participação de ligantes e receptores da matriz extracelular na maturação de células tTreg e o possível envolvimento dessas moléculas na deficiência numérica de células tTreg em camundongos WKO. Foi observada uma diminuição da rede de fibronectina na região medular do timo dos animais WKO em relação ao controle. Além disso, observamos uma redução de células tTreg expressando VLA-4 e VLA-5 nos animais WKO em relação ao controle. As análises de proliferação, ativação e morte demonstraram que as células Treg de animais WKO apresentam alterações em relação às células precursoras (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). De forma interessante, as análises de adesão em fibronectina demonstraram que as células Treg dos animais WKO apresentam menos filopódios que as células Treg do controle, e que essa diminuição é proeminente comparando-se às células T CD4 SP. Esses resultados sugerem que a fibronectina tenha importância na diferenciação das células tTreg / Abstract: The Wiskott-Aldrich syndrome (WAS) is a primary immunodeficiency associated with recurrent infection and development of autoimmune diseases and lymphomas. This immune deficiency develops as a result of mutations in the gene encoding the WASP protein ("WAS protein"), expressed in hematopoietic cells, and with regulatory functions on the actin cytoskeleton rearrangements and activation of T lymphocytes. Accordingly, mice deficient in Wasp (Wasp "knockout" - WKO) present disruption in central processes to the immune response, resulting in aberrant leukocyte migration, impaired lymphocyte proliferation and dysfunction of regulatory T cells (Treg). Interestingly, it was shown that Treg cells defined by the CD4+CD25+Foxp3+ phenotype and immunosuppressive function, already decreased in the thymus of the animals. This suggests that the Wasp deficiency results in defective intrathymic generation of Treg cells. In this context, it is important to note that the migration of the thymocyte through the thymic microenvironment is crucial for the formation of T cells and, particularly, the extracellular matrix has a decisive role in the events of adhesion and de-adhesion of migrant cell Thus, we postulated that the extracellular matrix mediates interactions crucial for thymic Treg cells (tTreg) by providing and facilitating access to different cellular signals during the maturation process of these cells. In this project, we decided to study the role of ligands and receptors of extracellular matrix in the maturation of tTreg cells and the possible involvement of these molecules in numerical deficiency tTreg WKO cells in mice. We observed a decrease in fibronectin network in the medulla of the thymus of WKO animals compared to the control. In addition, a decrease in cells expressing VLA-4 and VLA-5 in WKO animals compared to the control. The analysis of proliferation, activation, and death demonstrated that Treg cells animals in WKO showed changes from precursor cells (CD4+CD8-CD25+Foxp3-). Interestingly, adhesion on fibronectin showed that Treg cells from WKO animals present less filopodia compared to control Treg cells and that this is a marked decrease as compared to the CD4 SP cells. These results suggest an important role for fibronectin in the differentiation of Treg cells

Orientador: : Liana Maria Cardoso Verinaud / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T07:17:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Francelin_Carolina_M.pdf: 13380043 bytes, checksum: 2e65773bab75b0bdc836c19740bd7d3e (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O timo é um órgão linfóide primário, responsável pela diferenciação, maturação e desenvolvimento dos linfócitos T (ou timócitos, enquanto no timo). Este órgão apresenta complexa arquitetura tímica composta por elementos celulares e solúveis responsáveis pela migração dos precursores de linfócito T do espaço perivascular para a região cortical e subseqüente migração para a região medular. A trajetória do timócitos pelos microambientes tímicos permite que estas células recebam estímulos que os tornam linfócitos maduros, simples positivos TCD4+ ou TCD8+, prontos para migrar para os órgãos linfóides secundários. Durante a maturação, timócitos que são auto-reativos ou anérgicos são eliminados pelo processo de morte celular programada. Entretanto, a desregulação da apoptose nos linfócitos pode acarretar no desenvolvimento de doenças auto-imunes, tumores e imunodeficiências. Estudos em modelos murinos de atrofia tímica relatam que em diversas infecções parasitárias, virais, helmínticas, bacterianas e fúngicas e até mesmo em distúrbio metabólico como a diabetes experimental o timo é um órgão alvo. Nestes modelos, foi observado intenso acometimento tímico com involução do órgão acompanha por desarranjo da arquitetura tímica e depleção de todas as subpopulações de timócitos. Em estudos anteriores, observamos profundas alterações no timo durante a infecção experimental com Plasmodium berghei que incluíam severa atrofia no décimo quarto dia após inoculação do parasita, alterações histológicas, perda da delimitação cortico-medular, redução de todas sub-populações de timócitos e a presença intra-tímica do parasita. No presente trabalho avaliamos se a grande perda de timócitos observada no timo de animais infectados pelo Plasmodium berghei NK65 é devido a um aumento da ocorrência de apoptose, e/ou necrose, ou se é devida à saída prematura destas células para a periferia.A avaliação de morte celular na população de timócitos total revelou aumento no número de células Anexina-V+/PI- em animais infectados quando comparados aos controles.Ainda, a análise da apoptose em timos atróficos, no pico da parasitemia, revelou aumento de núcleos apoptóticos nas regiões cortical e medular tímica bem como aumento no número de linfócitos (CD4+, DP e DN) Anexina-V positivos. Alteração na expressão de genes pró-apoptóticos no timo de animais infectados quando comparado ao controle, sugerindo a participação de vias de ativação extrínsecas especificas da apoptose, também foram observadas. Embora 90% dos timócitos de animais infectados sejam Anexina-V positivos, as alterações na expressão dos elementos de matriz extracelular, relatadas anteriormente pelo nosso grupo, sugere também a exportação precoce destas células para a periferia do sistema imune. Nossos resultados apontam para um aumento de linfócitos imaturos (DP e DN) nos linfonodos mesentéricos de animais infectados, um indicativo de que parte dos timócitos imaturos sai do timo antes de completarem seu amadurecimento. Em conjunto, nossos dados mostram que as alterações estruturais e de componentes solúveis do timo durante a infecção com Plasmodium berghei NK65 podem favorecer tanto a deleção, por apoptose, de timócitos corticais como também a migração precoce de células imaturas para a periferia do sistema imune. O acometimento tímico na atrofia tímica induzida pelo Plasmodium berghei NK65 revela que durante uma infecção o timo sofre influências de diversos fatores que provocam profundas alterações nas subpopulações linfocitárias. Também, é possível que as alterações observadas em nosso modelo prejudique a resposta imune periférica contra o parasita contribuindo para o agravamento da doença e que a presença de timócitos prematuros nos linfonodos favoreça o desenvolvimento de doenças auto-imunes / Abstract: The thymus is the primary lymphoid organ responsible for the differentiation, maturation and development of T lymphocytes (or thymocytes, as in the thymus).This organ presents a complex architecture composed by soluble and cellular elements that support the migration of lymphocyte precursors from space perivascular to the cortical region, and then their migration toward the medullar area. The trajectory of thymocytes by thymic microenvironments allows these cells to receive stimuli that make them mature into CD4+ or CD8+ T cells, which leave the thymus to populate peripheral lymphoid organs. Studies using murine models of thymic atrophy have reported that thymus is a target organ in several parasitic, viral, helminthic, bacterial and fungal infections. In these models, one can observe intense thymic involution accompanying by disruption of thymic architecture and depletion of all thymocyte subpopulations. In a previous study, our laboratory has demonstrated profound changes in the thymus during experimental infection with Plasmodium berghei, the causative agent of Malaria. Such alterations comprised severe atrophy, histopathological changes with loss of cortical-medullary delimitation, and reduction of all thymocytes sub-populations. In addition, the presence of parasites inside the thymus was detected for the first time. In another study using the same experimental model, we have demonstrated that Plasmodium-infected animals present changes in the expression of extracellular matrix elements and chemokine protein families, which are important molecules for the dynamic thymocyte migration within the thymus. In this study we evaluate whether the acute thymic atrophy observed in Plasmodium berghei-infected animals is correlated with increased apoptotic levels of thymocytes, or with their premature emigration to the periphery. Our data showed profound histological alterations, which included a very large number of cells showing nuclear condensation and karyorrhectic changes surrounded by histiocytes suggesting increased levels of apoptosis. This was confirmed by immunohistochemistry and flow cytometry techniques. Also, increased expression of proapoptotic genes was observed in the thymus of infected animals when compared with controls, suggesting the involvement of the extrinsic, or receptor-iniciated, pathway of apoptosis. Although the rate of apoptosis in the thymus from infected animals is much higher than the controls, the hypothesis that a premature emigration of thymic cells to the peripheral lymphoid organs may also account for the severe atrophy observed during Plasmodium infection could not be ruled out. In fact, we have found a consistent fraction of immature cells, mainly double-negative and double-positive thymocytes, in mesenteric lymph nodes of infected animals. Although this result serves as an evidence of premature emigration of non-mature thymocytes, the precise mechanism by which this process occurs is not clear until now. No significant differences were found in the spleen. Taken together, our data show that thymic alterations observed during Plasmodium berghei infection can favour both the deletion of thymocyte subpopulation by apoptosis and the early emigration of immature cells to the periphery of the system immune. As a consequence, an altered peripheral immune response to the parasite can be expected. Our findings provide relevant information concerning the immune involvement in malaria infection. Moreover, the murine model described here could be useful for mechanist studies of acute thymic atrophy / Mestrado / Imunologia / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O timo é um órgão essencial para a maturação, diferenciação e seleção de linfócitos T, consequentemente fundamental para o desenvolvimento da imunidade do organismo. Além do papel na manutenção da integridade tecidual, os vasos sanguíneos tímicos desempenham função no processo de migração de células precursoras de linfócitos para o interior do órgão. Sua arquitetura típica é caracterizada por grandes vasos localizados na junção corticomedular e uma fina cadeia de ramificações e anastomoses no interior do córtex, porém são pouco conhecidas as bases moleculares que induzem a formação desta particular vascularização, bem como os exatos mecanismos que desencadeiam a involução do órgão, evento relacionado a alterações nos padrões vasculares. Entretanto, tem sido demonstrado que as interações entre o estroma, que inclui o endotélio vascular, e o compartimento hematopoiético tímico desempenham papéis cruciais na funcionalidade do órgão. Sendo o VEGF um fator angiogênico essencial na formação do leito vascular tecidual e na modulação de funções diretamente relacionadas à vascularização, objetivamos neste estudo avaliar a expressão gênica e protéica deste fator de crescimento durante estágios de desenvolvimento e involução do órgão. Foram utilizadas amostras de timo suíno em 3 diferentes estágios de desenvolvimento fetal (65, 85 e 111 dias) e 2 estágios de vida pós-natal, um compreendendo fase de maturação (5 meses) e outro de involução do órgão (2 anos), compreendendo um total de 25 animais, divididos em 5 grupos (n = 5). A análise da expressão relativa do mRNA do sistema VEGF-A, acessada por meio de PCR em tempo real, apresentou modificações tempo-dependentes significativas (P<0,05) em relação ao controle endógeno GAPDH. Também foram observadas diferenças significativas (P0,05) na quantificação vascular por meio de estereologia entre as idades. A imunolocalização da proteína do VEGF e de seus receptores Flt-1 e KDR foi identificada no timo de todos os grupos experimentais e variou entre os grupos pré e pós-natais, com expressão mais rara nestes últimos, o que sugere diferenças temporais na modulação do mRNA no órgão. Assim como as células endoteliais, as células epiteliais tímicas demonstraram modulação pelo sistema VEGF-A, indicando ação parácrina e/ou autócrina deste fator de crescimento no timo. Os valores das variáveis estereológicas Sv[m] e Vv[m] do timo fetal em período próximo ao nascimento mantiveram-se maiores do que no córtex e se correlacionaram positivamente com a expressão do mRNA do KDR e negativamente com a do Flt-1 até a idade adulta. Ao contrário da expressão protéica, a expressão gênica do sistema VEGF-A pode se correlacionar negativamente com aspectos quantitativos da vascularização do timo pós-natal, como observado para o mRNA do VEGF e seu receptor Flt-1 a partir dos 5 meses de idade, quando os valores das variáveis Vv[vasos,timo], Sv[vasos,timo] e Lv[vasos,timo] diminuíram significativamente (P0,05), o que sugere uma resposta de compensação ou manutenção de uma condição hipóxica instalada no órgão. / Crucial for maturation, differentiation and selection of T lymphocytes, the thymus is an essential organ to the development of immunity. In addition to its role in the maintenance of tissue integrity, thymus blood vessels play a role in migration of T-cell precursors into the organ, and show a typical architecture characterized by the presence of large blood vessels at the corticomedullary junction and fine network of branching vessels and anastomosing arcades extending into the cortex. The molecular basis of this typical vasculature and the exact mechanisms that trigger thymus involution are both not well understood. However, it has been shown that the interactions between thymus stroma, including vascular endothelium and the hematopoietic compartment play crucial roles for normal organ function. Thus, because VEGF is an essential angiogenic factor for induction of the vascular bed and modulation of functions directly related with vascularization, the aim of this study was to assess the temporal protein and mRNA expression of VEGF and its receptors Flt-1 and KDR in the thymus during early stages of its development and involution. Samples of thymus from 3 different stages of fetal development (65, 85, and 111 days) and 2 stages of postnatal life of pigs, including one stage of maturation (5 months) and another of involution (2 years) comprising a total of 25 animals that were divided into 5 groups (n = 5). Relative mRNA expression of VEGF-A system, accessed by real-time PCR, showed temporal significant changes (P<0.05) compared to endogenous control GAPDH. Quantification of blood vessels by means of stereology also showed significant differences (P0.05) between ages. Positive immunostaining for VEGF and its receptors Flt-1 and KDR was identified in the thymus of all groups and it varied between the pre and postnatal groups with rare expression in the latter, suggesting temporal differences in the modulation of mRNA. Endothelial and epithelial cells showed modulation by the VEGF-A system, suggesting paracrine or alternatively autocrine activity of this growth factor. The values of the stereological parameters Sv[m] and Vv[m] of the thymus in fetal period around the birth remained higher than in the cortex and upregulated with mRNA expression of KDR and downregulated with mRNA expression of Flt-1 until adulthood. Unlike protein expression, gene expression gene expression of VEGF-A system can be downregulated with quantitative aspects of the postnatal thymus vascularization as observed for the mRNA of VEGF and its receptor Flt-1 from the age of 5 months, when the values of the stereological parameters Vv[vessels,thymus], Sv[vessels,thymus] and Lv[vessels,thymus] decreased significantly (P0.05), which suggests a compensatory or maintenance response to an hypoxic condition in the organ.