Doctor of Philosophy / Department of Anatomy and Physiology / Bruce D. Schultz / The first aim of this project is to define the cellular mechanisms that account for the low Na[superscript]+ concentration in human milk. MCF10A cells, which were derived from human mammary epithelium and grown on permeable supports, exhibit amiloride- and benzamil-sensitive short circuit current (I[subscript]sc), suggesting activity of the epithelial Na[superscript]+ channel, ENaC. When cultured in the presence of cholera toxin (Ctx), MCF10A cells exhibit greater amiloride sensitive I[subscript]sc at all time points tested, an effect that is not reduced with Ctx washout for 12 hours or by cytosolic pathways inhibitors. Ctx increases the abundance of both beta and gamma-ENaC in the apical membrane and increases its monoubiquitination but without changing total protein and mRNA levels. Additionally, Ctx increases the levels of both the phosphorylated and the nonphosphorylated forms of Nedd4-2, a ubiquitin-protein ligase that regulates ENaC degradation. The results reveal a novel mechanism in human mammary gland epithelia by which Ctx regulates ENaC-mediated Na[superscript]+ transport. The second project aim is to develop a protocol to isolate mammary gland epithelia for subsequent in vitro culture. Caprine (1[superscript]0CME) and bovine mammary epithelia (1[superscript]0BME) were isolated and cultured on permeable supports to study hormone- and neurotransmitter-sensitive ion transport. Both 1[superscript]0CME and 1[superscript]0BME cells were passed for multiple subcultures and all passages formed electrically tight barriers. 1[superscript]0CME were cultured in the presence of hydrocortisone and exhibited high electrical resistance and amiloride-sensitive I[subscript]sc, suggesting the presence of ENaC-mediated Na[superscript]+ transport. 1[superscript]0BME were grown in a complex media in the presence or absence of dexamethasone. In contrast to 1[superscript]0CME, 1[superscript]0BME exhibited no detectable amiloride-sensitive I[subscript]sc in either culture condition. However, 1[superscript]0BME monolayers responded to an adrenergic agonist, norepinephrine, and a cholinergic agonist, carbamylcholine, with rapid increases in I[subscript]sc. Thus, this protocol for isolation and primary cell culture can be used for future studies that focus on mammary epithelial cell regulation and functions. In conclusion, the results from these projects demonstrate that mammary epithelial cells form electrically tight monolayers and can exhibit neurotransmitter- and/or hormone-induced net ion transport. The mechanisms that regulate Na[superscript]+ transport across mammary gland may provide clues to prevent or treat mastitis.

A dengue é uma arbovirose que ameaça mais de metade da população mundial. No momento existem duas vacinas, administradas por vias parenterais, aprovada ou em estudos clínicos, que podem conferir proteção parcial em regiões endêmicas, mas que ainda não estão sendo administradas em larga escala. Por outro lado, a utilização de vias de administração alternativas, como a via transcutânea (TC), pode ter um impacto importante na eficácia vacinal. A entrega de formulações vacinais pela via TC tem como vantagem a administração segura e não invasiva de antígenos vacinais e a composição celular específica da pele, rica em células apresentadoras de antígenos, como as células de Langerhans; O presente estudo demonstra que a via TC pode induzir respostas sorológicas vírus-específicas de forma eficiente quando utilizada para a administração de vacinas contra DENV baseadas em partículas virais. Portanto, novos estudos devem ser feitos considerando a TC como uma via de administração alternativa às vias parenterais para a administração de vacinas contra a dengue. / Dengue is an arbovirosis that threatens more than half the world\'s population. Currently there are two vaccines, both administered via parenteral routes, approved or in clinical trials, which provide partial protection but are not being administered on a large scale. On the other hand, the use of alternative routes of administration, such as the transcutaneous (TC) route, can have a significant impact on vaccine efficacy. Delivery of vaccine formulations via the TC route has the advantage of a safe and non-invasive administration method of vaccine antigens through the skin, that has a cell composition rich in antigen-presenting cells, such as the Langerhans cells. The present study demonstrates that the TC route can efficiently induce virus-specific serological responses when used for administration of DENV vaccines based on viral particles. Further studies should explore different dengue vaccines using the TC route as an alternative to parenteral administration routes.

Relatos sobre a toxicidade da fruta carambola (Averrhoa carambola) em pacientes com disfunção renal, com alguns desses pacientes chegando ao óbito, foram atribuídos a uma toxina denominada caramboxina, um aminoácido não peptídico derivado da fenilalanina, recentemente isolada por pesquisadores da Universidade de São Paulo. Com isso, este estudo foi planejado com o objetivo principal de investigar estratégias de síntese que permitiriam a síntese total da toxina. A partir do desenvolvimento inicial de uma rota sintética que empregou um aril-triflato para uma reação de acoplamento cruzado de Heck e a olefina acrilaldeído, que não se mostrou efetiva, outras rotas sintéticas foram planejadas empregando uma olefina derivada do aminoácido serina ou fazendo uso de produtos sintetizados durante o estudo, através de reações que conduzissem à molécula alvo. Apesar dos resultados negativos obtidos, a variação de estratégias permitiu maior compreensão acerca da síntese, além de contribuir para o estudo de diferentes metodologias. Entretanto, uma rota que fez uso da reação de acoplamento cruzado de Negishi com composto organozinco oriundo da serina como etapa chave, foi capaz de levar à síntese total da caramboxina, permitindo inclusive obter o produto assimétrico, conforme observado em análises de quantificação de enantiômeros. Com bons rendimentos na obtenção dos blocos de construção e na etapa chave de acoplamento, a rota exigiu dez etapas, desde os materiais de partida até a desproteção total, apresentando 33% de rendimento global, com boa reprodutibilidade e escalabilidade. Assim, com a obtenção da caramboxina sintética poderão ser respondidas várias lacunas, tanto em nível molecular (mecanismo de ação), quanto sobre seu possível metabolismo e farmacocinética / Reports on the toxicity of star fruit (Averrhoa Carambola) in patients with renal dysfunction, with some of them coming to death, were attributed to a toxin named caramboxin, a non-peptidic amino acid derived from phenylalanine, recently isolated by researchers from the University of São Paulo. Thus, this study was designed with the main objective of investigate strategies that would allow the total synthesis of the toxin. Starting from the initial development of a synthetic route that used an aryl-triflate for a cross coupling reaction of Heck with the olefin acrylaldehyde, which did not show effectiveness, other routes were planned using an olefin derived of the serine amino acid or making use of synthetized products obtained through the study, employing reactions that would lead to the target molecule. Despite the negative results, the variation of strategies allowed greater comprehension of the synthesis contributing to the study of different methodologies. However, a route that used the cross-coupling reaction of Negishi with an organozinc compound derived of serine as key step, led to the total synthesis of caramboxin including the obtention of the asymmetric product, as observed in enantiomers quantification analysis. With good yields for the building blocks and the cross-coupling key step the route required ten steps, from the starting materials to the total deprotection, exhibiting 33% of overall yield with good reproducibility and scalability. Thus, with the obtainment of synthetic caramboxin, will be possible to answer different gaps, both at the molecular level (mechanism of action) as well as on its possible metabolism and pharmacokinetics

As toxinas termo-lábeis (LT) produzidas por linhagens de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) são adjuvantes com um importante foco em pesquisas acadêmicas e aplicadas, entretanto pouco é conhecido sobre a capacidade desses adjuvantes em induzir diferentes padrões de glicosilação em anticorpos IgG. Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi analisar a capacidade dos adjuvantes LT1 e seus derivados atóxicos (LT1-K63 e LT1-B) influenciarem na qualidade da resposta imunológica humoral, particularmente quanto aos perfis de glicosilação dos anticorpos IgG EIII-específicos. A administração das LTs proporcionaram a potencialização da resposta de anticorpos antígeno-específicos, modularam o perfil de subclasses de IgG, melhoraram a capacidade de neutralização viral e induziram diferentes perfis de glicosilação presentes na estrutura dos anticorpos induzidos. Os resultados obtidos demonstram a importância dos adjuvantes no perfil de glicosilação de anticorpos antígeno-específicos e sugerem a influência da glicosilação na funcionalidade desses anticorpos. / The heat-labile toxin (LT) produced by enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) are an important adjuvants to focus on academic and applied research, however little is known about the ability of these adjuvants to induce different patterns of glycosylation in IgG antibodies. Thus, the aim of this study was to analyze the ability of the adjuvants LT1 and its nontoxic derivative (LT1-K63 and LT1-B) influence on the quality of the humoral immune response, particularly regarding the glycosylation profiles of the EIII-specific IgG antibodies. The management of transmission lines provided potentiation response of antigen-specific antibodies modulate the profile of IgG subclasses, improved ability to induce virus neutralizing and different glycosylation profiles of in the antibodies purified IgG. The results demonstrate the importance of adjuvants in glycosylation of antigen-specific antibody profile and suggest the influence of glycosylation on the functionality of these antibodies.

Neste trabalho foram pesquisados os efeitos in vitro da metaloproteinase jararagina, em modelo de células de tumores de mama humana MCF7, T47D e murina (Tumor de Ehrlich), além de células normais, avaliando-se a viabilidade celular, morfologia, modificações nas fases do ciclo celular e tipo de morte celular; como os efeitos no modelo murino nas formas ascítica e sólido-ortotópica de Ehrlich. Os resultados obtidos mostraram que a jararagina diminui significativamente a viabilidade e adesão de maneira dose dependente, formação de agregados e estruturas tipo esferoides com formação túbulo-acinar. Os parâmetros antitumorais in vivo, não mostraram diminuição no volume tumoral ascítico, entretanto, no modelo ortotópico, a jararagina induz resposta inflamatória e remodelação da matriz extracelular e resulta em alterações na distribuição e organização do colágeno. Conclui-se que a jararagina induz citotoxicidade nas linhagens de células tumorais de mama e normais, e foi capaz de induzir infiltrado inflamatório durante o crescimento e disseminação das células tumorais. / The present study investigated the in vitro effects of metalloproteinase jararhagin in human breast tumor cells model MCF7 and T47D, murine tumor cells (Ehrlich\'s tumor), and normal cells, assessing cell viability, morphological alterations, changes in the cell cycle phases and death cell, as the effects on ascitic and solid orthotopic murin Ehrlich tumor. The results showed that jararhagin significantly decreases adhesion and cell viability in a dose dependent, with cells aggregates and spheroids with tubulo-acinar formation. The in vivo parameters showed no decrease in ascites tumor volume, however, the orthotopic model, jararhagin induces the inflammatory response and extracellular matrix remodeling with changes in the collagen distribution and organization. It is concluded that jararhagin induces cytotoxicity in breast tumor and normal cell lines, and was able to induce inflammatory infiltrate during the growth and dissemination of tumor cells.

Um total de 123 isolados de Pasteurella multocida provenientes de suínos foi avaliado através da PCR para pesquisa de genes codificadores de capsula, toxina dermonecrótica e outros fatores de virulência. As amostras foram caracterizadas como tipo capsular A (78,8 %) e tipo capsular D (21%). Nenhum dos isolados foi positivo para presença de toxina dermonecrótica. Os genes codificadores dos fatores de virulência pesquisados foram observados nas freqüências de 93,5 % para nanB, 92,7% para psl, 91,9% para oma87 e nanH, 87,8% para sodA,87% para hghA,83,7% para ompH, 82,9% para sodC, 79,7% para ptfA e exbBD tonB,73,2% para hgbB, 14,6% para pfhA e 4,9% para tbpA. Estes achados são compatíveis com o descrito na literatura internacional. / A total of 123 Pasteurella multocida strains from swine was evaluated through PCR to detect capsular, dermonecrotic toxin codifying genes and others virulence factors. The strains were identified as capsular type A (78.8 %) and capsular type D (21%). None of isolates were positive to dermonecrotic toxin gene. The virulence factors genes were detected in the following frequency: 93.5 % to nanB, 92.7% to psl, 91.9% to oma87 and nanH, 87.8% to sodA, 87% to hghA, 83.7% to ompH, 82.9% to sodC, 79.7% to ptfA and exbBD tonB, 73.2% to hgbB, 14.6% to pfhA and 4.9% to tbpA. These findings were in accordance with international literature.

Envenenamentos por animais peçonhentos são frequentes e quase 35% dos acidentes são ocasionados por escorpiões, especialmente por Tityus serrulatus. A peçonha do escorpião amarelo Tityus serrulatus tem despertado o interesse médico e científico por ser uma mistura complexa de mucopolissacarídeos, inibidores de proteases, histamina, neurotoxinas, entre outros componentes. As neurotoxinas são as principais responsáveis pelos sintomas do envenenamento, por possuírem alta afinidade e seletividade para canais iônicos sensíveis à voltagem. Além de induzirem a liberação de neurotransmissores, as neurotoxinas também são capazes de estimular a liberação de citocinas, principalmente nos casos de envenenamento de maior gravidade. Os objetivos deste trabalho focaram o isolamento e a caracterização de uma nova toxina, denominada Ts19 fragmento I (Ts19 frag I) presente nas frações VII e VIII obtidas por cromatografia da peçonha de Tityus serrulatus em CM-celulose-52. Entre os componentes preponderantes destas frações estão a Ts4, um peptídeo não tóxico que induz reações alérgicas, e a Ts3-KS, que interage com canais para sódio e foi capaz de induzir a liberação de IL-6. As frações VII e VIII foram aplicadas em coluna de fase reversa C18 (4,6 x 250 mm) e os picos 19, 22 (Ts19 frag I) e 23 foram recromatografados em coluna C18 (2,1 x 250 mm). O sequenciamento por degradação de Edman permitiu a determinação de 57 resíduos de aminoácidos da Ts19 frag I, incluindo 6 resíduos de cisteína. Esta proteína mostrou compartilhar um elevado grau de identidade sequencial com outras toxinas que atuam em canais para K+ depositadas em bancos de dados. Sua massa molar íntegra de 6.571,3165 Da foi determinada por espectrometria de massas. Os ensaios funcionais em células de linhagem de macrófagos peritoneais demonstraram que a Ts19 frag I (50 ?g/mL) estimulou a liberação de óxido nítrico, IL-6 e não foi citotóxica na dose utilizada. Um ensaio para verificar a atividade hemolítica da Ts19 frag I também foi realizado e nas concentrações de 25 ?g/mL e 50 ?g/mL esta não demonstrou atividade citolítica. Nas frações VII e VIII também foram encontradas a Ts2, como um contaminante do pico 22, e a Ts19 frag II, cujo precursor é a Ts19 frag I. A Ts19 frag II presente no pico 19 foi sequenciada e mostrou-se contaminada com a Ts19 frag I. / Poisonings by venomous animals are frequent and almost 35 % of the accidents are caused by scorpions, especially by Tityus serrulatus. The venom of the yellow scorpion Tityus serrulatus has aroused scientific and medical interest, since it is a complex mixture of mucopolysaccharides, protease inhibitors, histamine, neurotoxins and other components. The neurotoxins are the main responsible for the symptoms of poisoning by having high affinity and selectivity for voltage-sensitive ion channels. In addition to inducing neurotransmitter release, neurotoxins are also able to stimulate the release of cytokines, especially in cases of severe poisoning. The objectives of this study focused on the isolation and characterization of a novel toxin, named Ts19 fragment I (Ts19 frag I) present in fractions VII and VIII obtained by chromatography of Tityus serrulatus venom on CM-cellulose-52 column. Among the predominant components of these fractions are Ts4, a non-toxic peptide that induces allergic reactions, and Ts3-KS, which interact with sodium channels and was able to induce the release of IL-6. Fractions VII and VIII were applied to C18 reverse phase column (4.6 x 250 mm) and the peaks 19, 22 (Ts19 frag I) and 23 were rechromatographed on C18 (2.1 x 250 mm) column. Sequencing by Edman degradation allowed the determination of 57 amino acid residues of Ts19 frag I, including six cysteine residues. This protein showed to share a high degree of sequence identity with other toxins acting on K+ channels deposited in databases. Its full molar mass of 6.571,3165 Da was determined by mass spectrometry. The functional assays in cell line of peritoneal macrophages showed that Ts19 frag I (50 ?g/mL) stimulated the release of nitric oxide, IL-6 and was not cytotoxic in the dose used. A test to verify the hemolytic activity of Ts19 frag I was also performed and concentrations of 25 ?g/mL and 50 ?g/mL of toxin showed no cytolytic activity. In the fractions VII and VIII were also found Ts2, as a contaminant of the peak 22, and Ts19 frag II, whose precursor is the Ts19 frag I. The Ts19 frag II present in peak 19 was sequenced and showed to be contaminated with Ts19 frag I.

Introdução: A Distonia Cervical (DC) é o tipo mais comum de distonia focal primária e atualmente o tratamento padrão ouro consiste na aplicação periódica de toxina botulínica nos músculos afetados. Considerando que cada formulação de toxina botulínica é farmacologicamente distinta, nesta pesquisa foi realizada a comparação de dois tipos de toxina botulínica tipo A (TBA) disponíveis no Brasil: Dysport® (Abobotulinumtoxin A) e Prosigne® (Lanzhou botulinum toxin type A). Metodologia: Foi conduzido um estudo prospectivo, randomizado e duplo cego com dois braços em uso de substância ativa, Dysport® e Prosigne®. Foram recrutados 34 pacientes do ambulatório de toxina botulínica (ATXB) do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP) de maio de 2010 a junho de 2011, foram incluídos apenas pacientes com diagnóstico de distonia cervical idiopática. Cada indivíduo foi acompanhado por um período de 13 meses, sendo que nesse período foram submetidos a 5 aplicações de TBA com intervalo de 3 meses entre cada procedimento. Como instrumento para aferir a melhora dos movimentos involuntários, aplicamos a Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS), escala completa com subescalas de gravidade, incapacidade e dor, antes da primeira aplicação e um mês após, e antes da última aplicação e um mês após. Após cada aplicação os pacientes foram submetidos à entrevista estruturada para aplicação da escala de melhora global Clinician Interview-Based Impression of Change (CIBIC) e colher dados sobre tempo de duração do efeito benéfico da toxina e efeitos colaterais apresentados. Para análise estatística foram utilizados o teste t para amostras pareadas, o teste não-paramétrico de Mann-Whitnney, o teste não paramétrico de Friedman e o teste do qui quadrado. Resultados: Foram recrutados 14 indivíduos para o grupo Dysport® e 20 indivíduos para o grupo Prosigne®, a média de idade foi de 57,21 anos no primeiro grupo e 51,95 no segundo (p = 0,239). Após a primeira aplicação houve uma redução média nos valores da TWSTRS de 12,78 pontos no grupo sendo tratado com Dysport® e 9,98 pontos no grupo sendo tratado com Prosigne® (p = 0,38). Após a última aplicação a redução desses valores foi de 11,87 pontos no primeiro grupo e 11,35 no segundo (p = 0,86). Em relação à escala CIBIC a grande maioria dos pacientes referiu algum grau de melhora após as aplicações, sem diferença estatística entre os dois braços do estudo. Também não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao tempo de duração da melhora após aplicações. Disfagia foi o efeito colateral mais comum, ocorrendo em 27,27 % das aplicações, seguido por dor local e fraqueza muscular. Não houve diferença significativa entre os grupos em relação à incidência de efeitos colaterais. Conclusão: Nossos dados mostram que as toxinas botulínicas Dysport® e Prosigne® tem perfil de eficácia similar para o tratamento da distonia cervical idiopática. Além disso, ambas as toxinas são equivalentes em relação à segurança e tolerabilidade. / Introduction: Cervical dystonia (CD) is the most frequent type of primary focal dystonia and treatment with botulinum toxin is currently the gold standard. Considering that each botulinum toxin brand is pharmacologically distinct, in this paper we compared two botulinum toxins available in Brazil: Abobotulinumtoxin A (Dysport®) and Lanzhou botulinum toxin type A (Prosigne®). Methodology: We conducted a prospective, randomized, double blind trial with one group being treated with Dysport® and the other Prosigne®. We recruited 34 patientes from Ribeirao Preto Medical Schools (HCFMRP) botulinum toxin clinic (ATXB) from may 2010 to june 2011, only patients with idiopathic CD were included in the trial. Each individual was followed during a 13 month period, during which 5 TBA injection sessions were conducted with 3 month intervals between them. To assess objective improvement we used the Toronto Western Spasmodic Torticollis Rating Scale (TWSTRS), full scale and severity, disability and pain subscales, before and after the first and fifth treatment sessions. After each treatment session we assessed improvement with the Clinician Interview Based Impression of Change (CIBIC) scale and asked about side effects and duration of improvement. For statistical analysis we used the following tests: t test for paired samples, Mann-Whitneys non parametrical test, Friedmans non parametrical test and qui square test. Results: Fourteen patients were randomized to receive Dysport® and twenty to receive Prosigne®. Mean age in Dysport® group was 57.21 years and in Prosigne® group was 51.95 (p = 0.23). After first injection, mean TWSTRS values reduced 12.78 points in Dysport® group and 9.98 in Prosigne® group (p = 0.38). After last injection the reduction in TWSTRS values was 11.87 points for Dysport® and 11.35 points for Prosigne® (p = 0.86). CIBIC scores showed that the majority of patients reported some level of improvement after injections without statistical differences between groups. Dysphagia was the commonest adverse effect, occurring after 27.27 % of all injections, followed by local pain and muscle weakness. Once again there were no statistical difference between groups regarding adverse effects. Conclusion: Our data showed similar efficacy and safety profiles when comparing both toxins, Dysport® and Prosigne®.

INTRODUÇÃO: A presença de rugas na face devido à hipercinese muscular é comum nas regiões frontal, glabelar e peri-orbitárias. São descritos diversos métodos para o tratamento das rugas de expressão, como a dermoabrasão, a ablação a laser, o laser não ablativo, preenchimentos, cirurgia e aplicações de toxina botulínica. O tratamento das rugas da face com toxina botulínica tipo A é método consagrado, porém são pouco definidos os efeitos a longo prazo. Este estudo retrospectivo teve como objetivo avaliar as rugas das regiões frontal e glabelar da face em pacientes submetidas a aplicações seriadas da toxina botulínica tipo A com finalidade estética, analisando os intervalos entre as aplicações e as doses utilizadas. MÉTODOS: Foram analisadas 24 pacientes do sexo feminino, submetidas entre 5 a 7 aplicações da toxina botulínica tipo A, no período de julho de 1997 a junho de 2006. O tempo médio de acompanhamento foi de 42,2 (± 4,0) meses e o intervalo médio entre as aplicações de 8 (± 0,51) meses. A idade média observada de início da aplicação foi de 48,0 (± 3,0) anos, e da última aplicação foi de 51,6 (± 3,0) anos. Foram métodos de avaliação a análise da documentação fotográfica de antes da primeira e antes da última aplicação, sendo as rugas frontais e glabelares avaliadas segundo escala padronizada, e dados colhidos dos prontuários. RESULTADOS: A longo prazo, verificou-se: 1) amenização das rugas estáticas da região frontal em 62,5% das pacientes e em 37,5% tais rugas se mantiveram inalteradas; 2) amenização das rugas estáticas da região glabelar em 47,2% das pacientes, em 50% tais rugas se mantiveram inalteradas e em 2,8% verificou-se pouca acentuação; 3) amenização das rugas dinâmicas da região frontal em 84,7% das pacientes e em 15,3% tais rugas se mantiveram inalteradas; 4) amenização das rugas dinâmicas da região glabelar (corrugadores) em 63,9% das pacientes, em 26,4% tais rugas se mantiveram inalteradas e em 9,7% verificou-se pouca acentuação. 5) amenização das rugas dinâmicas da região glabelar (prócero) em 57% das pacientes, em 32% tais rugas se mantiveram inalteradas e em 11% verificou-se pouca acentuação. A média da dose total de toxina botulínica utilizada por sessão no presente estudo foi de 43,83 ± 1,25 U, e a dose total cumulativa foi de 272,08 ± 20,42 U. CONCLUSÕES: No longo prazo, existe maior porcentagem de pacientes com amenização ou aspecto inalterado das rugas estáticas e dinâmicas das regiões frontal e glabelar da face em relação a pacientes com acentuação das mesmas. Não houve variação estatisticamente significativa das médias dos intervalos entre as aplicações. A dose total de toxina botulínica aumentou de forma estatisticamente significativa até a terceira aplicação, mantendo-se sem variação significativa a partir de então. / INTRODUCTION: The presence of wrinkles on the face due to the over activity of muscles is rather common on the frontal, glabellar, and periocular regions. A number of methods for the treatment of face lines, such as skin abrasion, laser resurfacing, fillers, surgery and botulinum toxin A have been described. The treatment of facial rhytids with botulinum toxin A is widely used. However, its long term effects are not well defined. This retrospective study assesses the rhytids of both the frontal and glabellar regions of the face on patients submitted to multiple botulinum toxin A applications for aesthetic use, analyzing intervals between applications and dosages. METHODS: 24 female patients who had undergone 5 to 7 botulinum toxin A applications from July, 1997 to June, 2006 were studied. The mean time of follow up was 42.2 (± 4.0) months and the mean interval between applications was 8 (± 0.51) months. The mean age of the patients at the beginning of application was 48.0 (± 3.0) years old, and 51.6 (± 3.0) years old at the last application. The evaluation was carried through the analysis of photographic documentation from before the first and last applications, and both frontal and glabellar rhytids were evaluated according to standardized scale, as well as data collected from patients charts. RESULTS: the long term analysis demonstrated that: 1) improvement of the static rhytids of the frontal region in 62,5% of patients and such rhytids remained unaltered in 37.5% of the patients; 2) improvement of the static rhytids of the glabellar region in 47.2% of the patients, they remained unaltered in 50% of the patients and there was a slight worsening in 2.8% of the patients; 3) improvement of the dynamic rhytids of the frontal region in 84.7% of patients, and they remained unaltered in 15.3% of the patients; 4) improvement of the dynamic rhytids of the glabellar region (corrugator) in 63.9% of the patients, they remained unaltered in 26.4% of the patients and there was a slight worsening in 9.7% of the patients; 5) improvement of the dynamic rhytids of the glabellar region (procerus) in 57% of the patients, they remained unaltered in 32% and there was a slight worsening in 11% of the patients. The mean total dosage of botulinum toxin A used per session in this study was 43.83 ± 1.25 U, and the total cumulative dosage was 272.08 ± 20.42 U. CONCLUSIONS: In the long run, a higher percentage of patients showed improvement or unaltered aspect of their static and dynamic rhytids of the frontal and glabellar regions of the face, when compared to the patients that showed worsening. There was no variation of the mean intervals between the applications. The total dosage of botulinum toxin was significantly increased up to the third application, and kept stable in the following sessions.

O aumento da incidência de florações de cianobactérias potencialmente tóxicas nos mananciais de abastecimento, favorecidas pelo elevado aporte de nutrientes nos corpos d\'água, compromete a qualidade da água de consumo e põe em risco a saúde humana e animal, além de elevar os custos do tratamento de água. A pré-cloração, tem se mostrado uma ótima opção tanto na inativação de cianobactérias como na remoção de cianotoxinas dissolvidas. No entanto, sob certas condições, pode causar lise celular e promover a liberação das toxinas no meio. O objetivo deste trabalho foi avaliar em escala laboratorial, o efeito da pré-cloração, utilizando como agente oxidante o hipoclorito de sódio, sobre a integridade celular de uma linhagem tóxica de Microcystis aeruginosa (LTPNA 08), por citometria de fluxo, e sobre a subsequente liberação e degradação das microcistinas (LR e RR) por LC-MS/ MS. Diferentes dosagens de cloro (0,05, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4 e 8 mg.L-1), tempos de contato (0, 15, 30 e 60 minutos) e densidade celular (1x106 células.mL-1 para os ensaios de jarros e 3,5 x106 células.mL-1 para o ensaio de viabilidade celular) foram utilizadas neste estudo. Os resultados obtidos nos ensaios de jarros mostraram remoções de microcistinas acima de 70% após 60 minutos de exposição ao oxidante, com 100% de remoção em doses de 2,5 e 3 mg Cl2.L-1. Valores de CT (concentração x tempo) acima de 40,66 mg.min.L-1 foram necessários para degradar as microcistinas a concentrações abaixo de 1,0 µg.L-1, exigidos pela organização mundial de saúde (WHO) e pela legislação brasileira de potabilidade da água (Portaria MS nº 2914/2011). Não foi possível verificar a lise celular por microscopia óptica, no entanto, na análise por HPLC-DAD verificou-se degradação de mais de 70% da clorofila-a em todas as dosagens testadas, após 60 minutos de exposição, com a completa degradação nas concentrações de 2,5 e 3 mg.L-1 Cl2, indicando dano celular. Nos ensaios por citometria de fluxo, foi verificada a perda da integridade celular com o aumento da dosagem de cloro aplicada, observando-se a permeabilidade celular máxima, sem a desintegração da célula, na concentração de 2,5 mg.L-1 Cl2. Concentrações de 4 e 8 mg.L1 Cl2 promoveram a lise total das células, impossibilitando a permanência do marcador na célula. A perda dos pigmentos clorofila a e ficocianina ocorreram em concentrações de acima de 2,5 e acima de 1,5 mg.L-1 Cl2, respectivamente. O presente trabalho reforçou a eficiência da cloração na degradação das toxinas e os resultados obtidos podem ajudar as autoridades competentes a otimizar as práticas de cloração utilizadas no pré-tratamento da água. / The increased incidence of blooms of potentially toxic cyanobacteria in supply sources, favored by high input of nutrients in water bodies, compromises the quality of drinking water and affect human and animal health, besides increasing water treatment costs. The pre-chlorination, has proved a great choice both in the inactivation of cyanobacterial cells as in removing dissolved cyanotoxins. However, under certain conditions, can cause cell lysis and release toxins. The objective of this study was to evaluate in laboratory scale, the effect of pre-chlorination, using sodium hypochlorite, on cell integrity of toxic Microcystis aeruginosa (LTPNA 08) using flow cytometry, and the subsequent release and degradation of microcystins (LR and RR) by LC-MS / MS. Different chlorine doses (0.05, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 and 8 mg.L-1), contact times (0, 15, 30 and 60 minutes) and cell density (1x106 células.mL-1 for jar-test and 3.5 x106 células.mL-1 for cell viability assay) were used in this study. The results obtained in the jar- test showed degradations up to 70% after 60 minutes of exposure, with complete degradation at chlorine doses of 2,5 e 3 mg.L-1. Chlorine exposure (CT) values over 40,66 mg.min.L-1 were required for oxidation of microcystin LR and RR to concentrations below the World Health Organization (WHO) and Brazilian legislation for water potability (Portaria MS nº 2914/2011) guideline value of 1µg.L-1. No differences in cell number was observed by microscopy, however, analysis by HPLC-DAD found chlorophyll-a reductions of more than 70% in all dosages tested after 60 minutes exposure, with values below the limit of quantification for concentrations of 2.5 and 3 mg.L-1 Cl2, indicating cell damage. In assays using flow cytometry, loss of cell integrity was observed with increasing chlorine concentration. The maximum cell permeability without cell disintegration was observed at a concentration of 2.5 mg.L-1 Cl2. Concentrations of 4 and 8 mg.L-1 Cl2 lead to complete cell lysis, making impossible the permanence of SYTOX Green in the cell. The loss of pigment chlorophyll a and phycocyanin occurred in concentrations above 2.5 and 1.5 mg.L-1 Cl2, respectively. This study reinforced the efficiency of chlorination in the toxins degradation and the results can help the water authorities to optimize the chlorination practices used in the pretreatment of water.