Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-10T13:08:15Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 734479 bytes, checksum: dcd87645d1e8d78a8a5ad22880dd5630 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T13:08:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 734479 bytes, checksum: dcd87645d1e8d78a8a5ad22880dd5630 (MD5) Previous issue date: 2002-06-12 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Há muito tempo que as características relacionadas à coloração do fruto e sua qualidade nutricional têm sido consideradas desejáveis para manipulação em citros. Entretanto, a produção de novas cultivares dessas plantas tem sido limitada pelos vários obstáculos que impedem o seu melhoramento genético. A biotecnologia, por meio das técnicas de cultura de tecidos e transformação genética de plantas, surge como uma opção viável para contornar esse problema. Os objetivos do presente estudo foram isolar e caracterizar alguns genes envolvidos na rota biossintética de carotenóides de Citrus paradisi (Macf.) e desenvolver metodologias de regeneração in vitro e transformação genética para manipulação dessa rota biossintética em citros, visando alterar o conteúdo de provitamina A, a coloração do fruto e o porte das plantas. Utilizando-se a técnica de RT-PCR, as seqüências de cDNAs dos genes da sintase do fitoeno (AF152892), desaturase do fitoeno (AF364515), desaturase do ζ-caroteno (AF372617), ciclase-β do licopeno (AF152246) e ciclase-ε do licopeno (AF486650) foram isoladas de C. paradisi. Em geral, essas seqüências apresentaram elevada homologia aos genes correspondentes em tomate, com identidade de 72-83% em nível de aminoácidos. Dois ou mais transcritos diferentes foram identificados para três dos cinco genes caracterizados nesse estudo. Em cada caso, um ou mais transcritos foram considerados aberrantes, em que a produção de polipeptídeos não-funcionais foi predita. Estudos de expressão gênica revelaram que a maioria dos genes isolados é transcricionalmente regulada durante o desenvolvimento do fruto. No entanto, a diferenciação da coloração do fruto entre as cultivares de C. paradisi pode ser causada por mutações na seqüência aberta de leitura e não por regulação transcricional diferencial, sendo a desaturase do fitoeno e/ou ciclase-ε do licopeno os genes candidatos pelas diferenças observadas. Na avaliação da morfogênese in vitro de tecidos derivados de epicótilos de limão ‘Cravo’ (C. limonia Osb.), pomelo ‘Foster’ (C. paradisi Macf.) e laranja ‘Pêra’ [C. sinensis (L.) Osb.], verificou-se diferentes respostas às condições de cultivo in vitro em função da cultivar, da região do epicótilo utilizada como fonte de explantes, da composição do meio de cultura e das condições de incubação. Um sistema eficiente de transformação genética via Agrobacterium tumefaciens foi desenvolvido para C. paradisi, examinando-se os efeitos de seis fatores na eficiência de transformação. A pré- cultura dos explantes e a composição do meio de co-cultivo foram os fatores que mais influenciaram a eficiência de transformação. O protocolo otimizado foi empregado na produção de plantas transgênicas contendo os genes da sintase do fitoeno, desaturase do fitoeno ou ciclase-β do licopeno sob expressão constitutiva. / Fruit color and its nutritional value have been considered desirable for manipulation in citrus for a long time. However, citrus breeding has been limited due to several factors that hinder its genetic improvement. Plant biotechnology appears to be a viable option for the improvement of citrus species by means of the plant tissue culture and genetic transformation techniques. The objectives of this study were to isolate and characterize some genes involved in the carotenoid biosynthetic pathway of Citrus paradisi (Macf.) and to develop protocols of in vitro regeneration and genetic transformation for manipulation of this pathway in citrus, aiming to change the provitamin A content, fruit color, and plant height. By using the RT-PCR technique, the cDNA sequences of the genes phytoene synthase (AF152892), phytoene desaturase (AF364515), ζ-carotene desaturase (AF372617), lycopene β-cyclase (AF152246), and lycopene ε-cyclase (AF486650) were isolated from C. paradisi. In general, they were highly homologous to the corresponding tomato genes at the amino acid level, with identity ranging from 72-83%. Two or more different transcripts were identifyed for three of the five genes characterized in this study. In each case, one or more of the transcripts were aberrant, so that the production of a nonfunctional protein would be predicted. The expression analysis of the isolated carotenoid biosynthetic genes indicated complex expression patterns during fruit development. However, the fruit color differentiation between the grapefruit cultivars may be caused by frame-shift mutation and not by differential transcriptional regulation, with phytoene desaturase and/or lycopene ε-cyclase being the candidate genes for fruit color differences. The in vitro responses of epicotyl explants from ‘Cravo’ rangpur lime (Citrus limonia Osb.), ‘Foster’ grapefruit (C. paradisi Macf.), and ‘Pêra’ sweet-orange [C. sinensis (L.) Osb.] varyed according to cultivar, region of the epicotyl used as source of explant, culture medium composition, and incubation conditions. An improved protocol for Agrobacterium-mediated transformation of epicotyl explants from ‘Duncan’ grapefruit was developed by examining the effects of six different factors on the efficiency of transformation and combining the best treatments for each factor. The preculturing of the explants and the composition of the cocultivation medium were the factors that most influenced transformation efficiency. The optimized protocol was successfully employed in the production of transgenic grapefruit plants containing the carotenoid biosynthetic genes phytoene synthase, phytoene desaturase, or lycopene β-cyclase under constitutive expression. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-02T14:57:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287684 bytes, checksum: c5eb42af7676e85b16363c3edd753449 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-02T14:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 287684 bytes, checksum: c5eb42af7676e85b16363c3edd753449 (MD5) Previous issue date: 2004-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A transformação genética está se tornando, cada vez mais, uma ferramenta importante em programas de melhoramento genético de diversas espécies, sendo uma alternativa para a incorporação de gene(s) exógeno(s) no genoma da planta, modificando características de interesse. Para citros, essa ferramenta permite romper barreiras naturais dessa espécie, visto que o desenvolvimento de novas variedades pelo melhoramento convencional possui uma série de limitações impostas pela sua biologia reprodutiva. Entretanto, os protocolos de transformação genética requerem, primariamente, o estabelecimento de um eficiente sistema de morfogênese in vitro para que o sucesso do método de transformação seja alcançado. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o estabelecimento das melhores condições de cultivo in vitro para a organogênese e a posterior adequação de uma metodologia eficiente de transformação genética para a variedade de laranja-doce [Citrus sinensis (L.) Osb.] ‘Pêra’. Na avaliação das melhores condições da organogênese in vitro, segmentos de epicótilos foram introduzidos em meio de cultura MT contendo diferentes concentrações de BAP. A concentração de 1,0 mg L -1 de BAP utilizada na fase de indução de brotações assegurou as melhores freqüências de organogênese. Foram também estudados fatores que possam influenciar o processo de transformação genética de citros via Agrobacterium tumefaciens, utilizando epicótilos de laranja ‘Pêra’ como fonte de explante. Os fatores testados foram: tempo de inoculação com Agrobacterium, o período de co-cultivo e a presença de auxina no meio de pré-cultivo. O protocolo otimizado para a transformação genética de laranja ‘Pêra’ foi a imersão do explante em uma solução contendo Agrobacterium, por um tempo de 5 minutos, seguido de um período de co-cultivo de 2 dias em meio de cultura contendo 100 μM de acetoseringona e transferidos para o meio de seleção, constituído do meio MT e ainda de 75 mg L -1 de canamicina, 500 mg L -1 de Timetin ® e 1 mg L -1 de BAP. / Genetic transformation is a technique whose importance is increasing as an important tool for breeding programs of several species, being a reliable alternative for introducing characteristics of interest. For citrus, this tool helps to overcome natural reproductive barriers, the obtention of new cultivars by conventional breeding methods has several constraints, mainly linked to its reproductive biology. However, genetic transformation protocols demand, primarily, the establishment of efficient regeneration systems, in order to guarantee the success of transformation method. The objective of the present work was to establish promotive conditions for a reliable in vitro regeneration system from epicotyl explants, and further adequate an efficient and reproducinle transformation methodology for a sweet orange variety [Citrus sinensis L. (Osb.) ‘Pêra’]. For organogenesis, epicotyl explants were cultured onto a MT medium containing different BAP concentrations. For induction phase, 1.0 mg L -1 BAP enabled higher regeneration frequencies of adventitious shoots. Also, factors affecting Agrobacterium-mediated transformation efficiency were tested, as follows: incubation period with bacteria, co-culture period, and the presence of auxin in the pre-culture step. The following conditions generated and optimized protocol for ‘Pêra’ transformation: immersion for 5 minutes of the explants in a diluted Agrobacterium suspension; a 2-days co-culture period in a 100 μM acetoseryngone-supplemented medium; transfer for a selective regeneration MT-based medium, supplemented with 1.0 mg L -1 BAP, 75 mg L -1 kanamycin, and 500 mg L -1 Timentin ® .

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.

O objetivo do presente trabalho foi otimizar o sistema de transformação genética de embriões somáticos de soja [Glycine max (L.) Merr.] utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada. Os antibióticos, adicionados ao meio de cultura para supressão da bactéria após a transferência do transgene, foram o alvo do estudo. Inicialmente, comparou-se o efeito de diferentes tratamentos com antibióticos sobre o tecido embriogênico de soja e sua eficiência na supressão da linhagem LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens durante o processo de transformação. A carbenicilina (500 mg/l) apresentou efeitos diferentes sobre o tecido vegetal das duas cultivares testadas. Os tecidos embriogênicos da cv. IAS5 não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle, enquanto que a proliferação dos embriões somáticos da cv. Bragg foi três vezes maior com a adição deste antibiótico ao meio de cultura. Contudo, a presença da carbenicilina nas duas concentrações testadas (500 e 1000 mg/l) não foi eficiente para supressão de Agrobacterium. Por outro lado, nos tratamentos com cefotaxima sozinha (350 e 500 mg/l), ou cefotaxima (250 mg/l) + vancomicina (250 mg/l) esta bactéria foi completamente suprimida da superfície dos embriões somáticos após 49 dias de tratamento. No entanto, enquanto a presença de cefotaxima, em qualquer concentração, foi prejudicial à sobrevivência do tecido embriogênico, a combinação de cefotaxima + vancomicina não afetou significativamente os embriões somáticos de soja até os 63 dias de tratamento. Portanto, os resultados indicam que o tratamento com cefotaxima + vancomicina por um período de 49 - 63 dias é o mais adequado para a transformação genética de soja, por suprimir Agrobacterium e apresentar mínimos efeitos sobre o tecido embriogênico. Por fim, conjuntos de embriões somáticos de soja foram transformados e tratados com a combinação recomendada de antibióticos para avaliação da eficiência do método na obtenção de transformantes estáveis. Foram obtidos 48 e 232 clones higromicina-resistentes para Bragg e IAS5, respectivamente. Para cv. Bragg, 26 plantas foram obtidas de um único clone, enquanto 580 plantas foram regeneradas de 105 clones da cv. IAS5. As plantas transgênicas eram férteis e morfologicamente normais. A presença do transgene no genoma destas plantas foi confirmada por análises moleculares. Portanto, a adequação dos antibióticos permitiu o desenvolvimento de um método de transformação altamente eficiente para soja. Os resultados do presente trabalho constituem o primeiro registro (1) do efeito de antibióticos sobre tecidos de soja ou de leguminosas e (2) de obtenção de transformantes estáveis de soja utilizando a biolística e o sistema Agrobacterium de maneira integrada.

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A cultura do maracujazeiro é de grande importância econômica para o Brasil, porém problemas fitossanitários vêm limitando a sua produção. A doença do endurecimento dos frutos causada pelo Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV), é atualmente a principal doença que afeta a cultura do maracujazeiro, tendo ocorrência generalizada no Brasil, diminuindo a produtividade e a longevidade dos pomares. Devido à ineficiência dos métodos convencionais de controle desta doença, a biotecnologia mostra-se como uma ferramenta para auxiliar na obtenção de plantas resistentes ao patógeno com o uso de técnicas de transformação genética. Com o intuito de obter plantas resistentes ao CABMV, Pinto (2010) regenerou 48 plantasde P. alataem experimentos de transformação genética via Agrobacteriumtumefaciens, utilizando uma construção gênica do tipo hairpin, a qual contém um fragmento do gene da proteína capsidial do CABMV, baseando-se no conceito de resistência derivada do patógeno (PDR). Foram identificadas 22 plantas transgênicas por PCR utilizando primers específicos para amplificação do gene CP. A integração do transgene foi confirmada via Southern blot, com sonda para detecção do gene de seleção nptII. As plantas identificadas como transgênicas por PCR foram propagadas (4 plantas por linhagem), inoculadas mecanicamente com o CABMV (3x) e analisadas por teste de ELISA. As plantas infectadas foram descartadas e as remanescentes foram inoculadas por afídeos virulíferos. Após 30 dias as plantas inoculadas foram analisadas por RT-PCR e RT-qPCR para detecção do patógeno. Todas as linhagens transgênicas inoculadas indicaram a presença do vírus em pelo menos 3 dos 4 clones inoculados. Foram selecionadas 3 plantas nas quais o vírus não foi detectado após 3 inoculações mecânicas e uma via vetor, e 3 plantas que apresentaram baixa titulação viral. Estas plantas serão propagadas para plantio em campo e avaliação de resistência à infecção pelo CABMV em condições naturais de infecção / The passion fruit crop has an expressive economic importance in Brazil, however phytosanitary problems has been limiting its production. The passion fruit woodiness disease caused by Cowpea aphid-borne mosaic virus (CABMV) it\'s the currently main disease, decreasing productivity and the longevity of orchards and has a widespread occurrence in Brazil. Due to the inefficiency of the conventional methods for controlling this disease, genetic transformation techniques shown as an alternative way for obtaining pathogen resistant transgenic plants. In order to obtain transgenic plants resistant to the CABMV, Pinto (2010) regenerated 48 plants from genetic transformation experiments with P. alata using a hairpin genetic construct containing a CABMV coat protein gene fragment, based on the PDR (pathogen-derived resistance) concept, were 22 transgenic lineages were identified by PCR for the CP gene. The transgene integration was confirmed by Southern blot with a probe for the nptII gene. The transgenic plants were propagated in a total of 4 plants per lineage and then inoculated mechanically for 3 times with the CABMV. The viral replication was confirmed by ELISA. The infected plants were discarded after each inoculation and the remaining were inoculated by viruliferous aphids and analyzed by RT-PCR and RT-qPCR. All inoculated transgenic lines shown the presence of the virus in at least 3 of 4 clones. After the inoculations,3 plants showed no symptoms and 3 a very low viral titration. These plants will be propagated for field tests in natural conditions of infection by CABMV

O oxigênio atua como substrato ou cofator numa série de reações bioquímicas do metabolismo primário e secundário das plantas. Várias estratégias têm sido utilizadas no sentido de interferir neste metabolismo aeróbico, visando, entre outras possibilidades, reduzir a formação de espécies reativas de oxigênio (ROS). A fim de alterar a disponibilidade de oxigênio no interior da organela, foram produzidas plantas de fumo (Nicotiana tabacum) expressando a leghemoglobina de soja no interior das mitocôndrias. Para tanto, as plantas foram transformadas, via Agrobacterium tumefaciens, com uma construção quimérica, onde o gene da Lba de soja foi fusionado a uma seqüência de direcionamento mitocondrial. A expressão do gene quimérico foi assegurada pela presença do promotor constitutivo 35S, do vírus do mosaico da couve-flor. A proteína foi corretamente importada e processada no interior das mitocôndrias. Entretanto, não foi possível detectar alterações significativas na função mitocondrial. Numa segunda etapa do presente trabalho, plantas transgênicas de batata (Solanum tuberosum cv Bintje) expressando a leghemoglobina de soja no interior dos cloroplastos, foram caracterizadas do ponto de vista molecular e fenotípico. Observou-se que as plantas apresentaram um fenótipo semelhante àquelas deficientes na biossíntese de giberelina / not available

As proteases FtsHs, encontradas em eubactérias e eucariotos, pertencem à família das proteínas AAA (ATPases associadas a diferentes atividades celulares) e são classificadas no grupo das metaloproteases. A proteína FtsH foi primeiro identificada em Escherichia coli em mutantes ftsH (filamentation temperature sensitive) como uma protease que age facilitando a degradação de proteínas intermembrânicas e citosólicas. Ortólogas a FtsH já foram encontradas em leveduras, metazoários e plantas. Nestas últimas, a FtsH pode estar localizada nos plastídeos, como uma proteína integral da membrana dos tilacóides ou na membrana interna das mitocôndrias, como em leveduras. Estudos sobre as isoformas plastidiais são abundantes e indicam a participação dessas proteases na renovação da proteína D1, componente do fotossistema II, na resposta hipersensível e na biogênese das membranas do tilacóide. Os estudos sobre as isoformas mitocôndriais são escassos e resumem-se a informações sobre o direcionamento subcelular dessas proteases e evidências de seu envolvimento no acúmulo da subunidade 9 da ATP-sintase na membrana interna. Com o objetivo de caracterizar a função da FtsH-m1 em plantas, foi realizada a transformação genética de Nicotiana tabacum via Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo em que o cDNA da FtsHm1 de cana-de-açúcar encontra-se sob o controle de um promotor transcricional constitutivo. Esse plasmídeo apresenta o gene seletivo nptII, que confere resistência à canamicina. As plantas regeneradas in vitro, 17 no total, foram aclimatadas e transferidas para a casa de vegetação até a produção de sementes. As plantas regeneradas foram testadas quanto à presença do cDNA da FtsH-m1 de cana-de-açúcar por meio da técnica de PCR. A seleção de plantas da geração T1 que possuíam o transgene de interesse foi conduzida em ensaios in vitro e em casa de vegetação baseados na resistência dessas plantas à canamicina. A presença do transgene foi confirmada por meio da técnica de PCR. A análise da expressão heteróloga foi realizada via RT-PCR e revelou níveis elevados de RNA mensageiro nas plantas transformadas. Ao todo, foram obtidas dez plantas de fumo em que a presença do transgene de interesse foi confirmada. Não foram observadas alterações fenotípicas marcantes nas plantas das gerações T0 e T1 que pudessem ser relacionadas à expressão heteróloga da FtsH-m1 de cana-de-açúcar. Devem ser realizadas análises mais finas, que podem incluir ensaios para a investigação de possíveis alterações na função mitocondrial, no metabolismo respiratório ou na ultraestrutura das mitocôndrias em plantas a partir da geração T2. / FtsH proteases of eubacteria and eucaryotes belong to the AAA protein family (ATPases associated with different celular activities) and are included among the metaloproteases. The FtsH protein was first described in ftsh (filamentation temperature sensitive) mutant of Escherichia coli as a protease involved in the degradation of transmembrane and cytosolic proteins. FtsH-ortologous proteins have been described in yeast, metazoa and plants. In the latter, FtsHs are localized to plastids, as an integral membrane protein of thylakoid or, as in yeast, to the inner mitochondrial membrane. The various studies on the plastid isoforms point to their involvement in the turnover of D1 protein, a member of the photosystem II, in hypersensitive response, and in thylakoid membrane biogenesis. On the other hand, data on the mitochondrial isoforms are scarce and restricted to their subcellular localization, and involvement in the accumulation of ATP-synthase subunit 9 in the inner membrane. With the aim of disclosing the function of FtsH-m1 in plants, Nicotiana tabacum plants were transformed by Agrobacterium tumefaciens carrying a designed plasmid containing the sugar-cane FtsH-m1 cDNA under the control of a constitutive-transcription promoter. This plasmid also contained the selectable kanamycin-resistance gene nptII. The seventeen plants obtained in vitro were acclimatized and kept in a greenhouse until seeding. These plants were then tested by PCR for the presence of the sugar-cane FtsH-m1 cDNA. Selection of T1 plants for the presence of the transgene of interest was carried out both in vitro and in the greenhouse, based on kanamycin resistance. The transgene carrier status of the selected plants was confirmed by PCR. Higher levels of FtsH-m1 messenger RNA were detected by RT-PCR in transformed T1 plants. A total of ten tobacco plants carrying the sugar-cane FtsH-m1 cDNA were obtained. T0 and T1 plants did not show conspicuous phenotype alterations which could be related to the heterologous gene expression. Refined analyses are needed in plants from T2 generation on, including the evaluation of mitochondrial structural abnormalities and disfunction, as well as respiratory alterations.

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Os estudos sobre a conversão in vitro de meristemas apicais radiculares em gemas caulinares de plantas do gênero Catasetum vêm contribuindo para uma melhor compreensão dos processos de competência, indução e determinação celular no processo de desenvolvimento, necessitando, no momento, de aprofundamento em estudos moleculares. Para tanto, a utilização de plantas transgênicas representa uma ferramenta de trabalho importante. Além disso, os métodos de transformação genética acenam como uma alternativa eficaz para o melhoramento de plantas de interesse econômico com ciclos reprodutivos longos, como as orquídeas. Desta forma, o objetivo deste projeto foi estabelecer um protocolo para transformação genética de Catasetum pileatum, utilizando tecidos meristemáticos como explantes alvos. Para tanto, avaliou-se o potencial de alguns promotores na expressão de uidA em tecidos de C. pileatum, dentre os quais destacaram-se o 35S de CaMV, o promotor do gene Pthi1 e o de PTE027, sendo que os dois primeiros foram utilizados para os experimentos de transformação genética permanente. Como explantes alvos para a transformação, foram testadas tanto gemas laterais de caules estiolados (CEs) quanto ápices radiculares (ARs), além de segmentos radiculares subapicais (SRs). Para obtenção de estruturas com maior quantidade de células em divisão celular, foi estabelecido um protocolo de cultura de tecidos a partir de segmentos radiculares subapicais (SRs). Na região proximal destes segmentos, estabeleceu-se uma estrutura globular e intumescida na presença de 0,5mg.L-1 de BA. Cortes histológicos destas intumescências revelaram a presença de grande quantidade de células em intensa divisão celular, levando, em estágios mais avançados, à formação de gemas caulinares superficiais. Estas originavam plantas após um mês em meio propício para este fim. Estes explantes foram submetidos a várias concentrações de higromicina, sendo que as concentrações escolhidas para seleção de tecidos transformados foram de 25mg.L-1 para CEs e ARs e 10mg.L-1 para SRs. CEs e ARs foram bombardeados com micropartículas de tungstênio contendo DNA plasmidial adsorvido (P35S:uidA ou Pthi1:uidA) e transferidos para meio seletivo após uma, duas ou três semanas. No entanto, estes não foram capazes de sobreviver em meio seletivo após dois meses de seleção. SRs foram bombardeados com P35S:uidA ou Pthi1:uidA. Estes foram capazes de expressar uidA entre 48h até quatro semanas, sendo que após três meses de seleção, foi observada uma gema azul transformada com Pthi1. As melhores condições para a transformação foram as seguintes: bombardeamento dos SRs recém-isolados, manutenção por duas semanas em meio não seletivo e, por fim, transferência para meio com higromicina até o término de três meses. Não obstante a necessidade de refinamentos dos procedimentos utilizados e de análises moleculares adicionais, estes resultados constituem os primeiros a indicarem a possibilidade de obtenção de plantas transgênicas de Catasetum pileatum. / Research on in vitro conversion of root apical meristems into buds in Catasetum has contributed to a better understanding of competence, induction and cellular determination processes during plant development. Nowadays It demands advances in molecular studies. To achieve this, the use of transgenic plants is an important working tool. Furthermore, genetic transformation methods seem to be an efficient alternative for improvement of commercial plants with longlife cycles, such as orchids. Therefore, the aim of these studies was to establish a protocol for genetic transformation of Catasetum pileatum, using meristematic tissues as target explants. The potential of some gene promoters to induce the expression of uidA was evaluated in C. pileatum tissues. CaMV 35S, Pthi and the PTE027 showed the best results among all tested. The CaMV 35S and the Pthi1 were used in the permanent genetic transformation experiments. Lateral buds of shoot explants (CEs), root apices (ARs) and root segments (SRs) were tested as target explants for transformation. In order to obtain material containing higher quantity of proliferating cells, a tissue culture protocol was established using root segments (SRs). The formation of a globular structure on the proximal region of the explants was observed in the presence of 0.5mg.L-1 of BA. Histological sections of these structures showed the presence of a huge quantity of cells in intense cellular division. In advanced stages, it was observed superficial bud formation on the structures. These buds have the capacity to produce whole plants within one month, in appropriated culture medium. Explants were exposed to a range of hygromycin concentrations and thereupon concentrations of 25mg.L-1 and 10mg.L-1 were chosen for selecting CEs and ARs, and for selection of SRs, respectively. CEs and ARs were bombarded with tungsten microparticules containing adsorbed plasmidial DNA (P35S:uidA or Pthi1:uidA) and it was transferred to selective medium after one, two or three weeks. Nevertheless, these explants were not capable to survive in selective medium after two months. SRs were also bombarded with P35S:uidA or Pthi1:uidA. These explants expressed uidA between 48 hours and four weeks. After three months of selection, it was possible to see a blue stained bud transformed with Pthi1. The best conditions for genetic transformation of C. pileatum were followed: bombardment of newly isolated SRs, maintenance for two weeks in non-selective medium followed of transference to hygromicin medium up to three months. Although additional experiments will still be necessary to refine transformation methods and conduct molecular analysis, the results from the present study are the first reference about genetic transformation of Catasetum pileatum plants.