A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-02-07T17:06:02Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3400245 bytes, checksum: b57a0d743c1ea165d35b1ffebb7e5dbc (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-07T17:06:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3400245 bytes, checksum: b57a0d743c1ea165d35b1ffebb7e5dbc (MD5) Previous issue date: 2016-07-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A disponibilidade de gás oxigênio (O2) é uma das principais forças que moldam a evolução dos organismos vivos e é essencial para a sobrevivência das plantas. A deficiência parcial (hipóxia) ou total (anóxia) de gás oxigênio é componente importante do estresse de alagamento. Para o aprofundamento do conhecimento genético, a transcriptômica possibilita identificar genes envolvidos nos mecanismos de respostas, e a transformação desses genes em plantas permite avaliar seus efeitos. Com o objetivo de caracterizar genes responsivos à deficiência de oxigênio e identificar genes candidatos para tolerância ao alagamento, analisamos dados de RNA-seq de raízes das cultivares de soja Embrapa 45 (tolerante ao encharcamento do solo) e BR 4 (sensível ao encharcamento) sob hipóxia. Das diferenças entre as duas cultivares, Embrapa 45 apresentou menor número de genes up-, maior quantidade de genes down- regulados, e maior expressão dos genes que codificam phosphoglucomutase (Glyma05g34790), unknown protein related to N-terminal protein myristoylation (Glyma06g03430), protein suppressor of phyA-105 (Glyma06g37080) e fibrillin (Glyma10g32620). Dados de RNA-seq e qRT-PCR da hemoglobina não simbionte Glyma11g12980 indicaram divergência estrutural desse gene entre as cultivares. Em comum entre as duas cultivares, mudanças na abundância de transcritos envolvidos no metabolismo de aminoácidos e derivados sugerem perturbação destes em modificações do tRNA, acurácia/eficiência traducional e estresse do retículo endoplasmático (RE) sob hipóxia. Também observamos que grupos de genes (estáveis, up- e down-regulados) diferem quanto à frequência de elementos cis TATA box, ABREs (ABA-responsive elements) e CRT/DREs (C-repeat/dehydration-responsive elements), assim como em estrutura, composição e uso de códons sinônimos. Especulamos que cis elementos ABRE podem mediar expressão gênica independentemente de ABA em raízes de soja sob hipóxia. Por fim, a nosso conhecimento, somos os primeiros a demonstrar viabilidade de se transformar Setaria viridis (espécie modelo de monocotiledôneas C4) mediada por Agrobacterium por meio da técnica floral dip, que não demanda cultura de tecidos nem regeneração de plantas transgênicas. Assim como em arabidopsis, espécie modelo de dicotiledôneas C3, floral dip em S. viridis pode acelerar estudos genéticos e de genômica funcional (inclusive ao estresse de alagamento) de gramíneas importantes para alimentação humana e animal, fibras e biocombustíveis, tais como cana-de-açúcar, Miscanthus, capim- elefante, Brachiaria, sorgo e milho. / Oxygen gas (O2) availability is one of primary forces shaping the evolution of living organisms and essential for land plants survival. Partial (hypoxic) or total (anoxic) oxygen gas deficiency is important component of flooding stress. For deepening the genetic knowledge, transcriptomics identify genes involved in stress response mechanisms, and transformation of these genes in plants allows to evaluate its effects. In order to characterize genes responsive to oxygen deficiency and identify candidate flooding tolerance genes we analyzed root RNA-seq data from flood-tolerant Embrapa 45 and flood-sensitive BR 4 soybean cultivars under hypoxic stress. From differences between the two cultivars, Embrapa 45 showed less up- and more down-regulated genes, and stronger induction of phosphoglucomutase (Glyma05g34790), unknown protein related to protein N-terminal myristoylation (Glyma06g03430), protein suppressor of Phya- 105 (Glyma06g37080), and fibrillin (Glyma10g32620). RNA-seq and qRT-PCR data of non-symbiotic hemoglobin Glyma11g12980 indicated structural divergence of this gene between cultivars. In common between the two cultivars, transcriptional changes in amino acids and derivative metabolic process suggest its disturbance in tRNA modifications, translation accuracy/efficiency, and endoplasmic reticulum (ER) stress under hypoxia. In addition, genes groups (stable, up-, and down-regulated genes) differed in promoter TATA box, ABREs (ABA-responsive elements), and CRT/DREs (C-repeat/dehydration-responsive elements) frequency, as well as in structure, composition, and codon usage. We speculate that cis-acting ABREs can mediate gene expression independent of ABA in hypoxic soybean roots. Finally, to our knowledge, we first report Agrobacterium-mediated transformation method in Setaria viridis (C4 monocotyledonous model species) using floral dip, which does not require tissue culture nor transgenic plant regeneration. As in arabidopsis, C3 dicotyledonous model species, floral dip in S. viridis may accelerate genetic studies and functional genomics (including flooding stress) of important food–feed–fiber–fuel grass crops such as sugarcane, Miscanthus, elephant grass, Brachiaria, Sorghum and maize.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-20T18:33:23Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-20T18:33:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 20005358 bytes, checksum: 1121af69167ca6262a2059e1892c3134 (MD5) Previous issue date: 2003-12-12 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Em Magnaporthe grisea, agente causal da brusone, mutagênese insercional mediada por transformação tem constituído estratégia para a identificação de genes essenciais para a patogenicidade em arroz. A técnica REMI, integração mediada por enzima de restrição, merece destaque em virtude da eficiência de transformação e da predominância de integrações simples. Visando a implantação de programa de mutagênese insercional em M. grisea, os objetivos deste trabalho incluíram: (1) adequar as condições para a obtenção e regeneração de protoplastos do ascomiceto, (2) estabelecer sistema de transformação REMI em M. grisea, avaliando o potencial dos protoplastos e do vetor pAN7-1 e (3) selecionar e caracterizar mutantes com patogenicidade alterada em plantas de arroz. Produção eficiente de protoplastos foi alcançada com o uso simultâneo de 10 mg de Lysing Enzymes e 10 mg de Cellulase Onozuka R10 em 3 mL de MgSO 4 a 1,2 M / NaH 2 PO 4 a 0,01 M (pH = 5,8). Protoplastos de M. grisea I-22 liberados com 3 horas de hidrólise enzimática apresentaram maior capacidade de regeneração da parede celular. Quando expostos ao vetor pAN7-1, os protoplastos foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando pAN7-1- HindIII foi usado para transformar I-22 na presença de HindIII, a freqüência de transformantes foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da endonuclease de restrição. No geral, a melhor concentração de HindIII foi 5 unidades/reação de transformação. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes, principalmente gerados por REMI, foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi mais longo do que o do isolado selvagem. Além disso, atrasos consideráveis na germinação de conídios e na formação de apressórios foram detectados em T72. Os mutantes T93 e T251 apresentaram fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom. Análises Southern blots de quatro mutantes indicaram que em 50 % dos casos, T108 e T251, apenas uma cópia de pAN7-1 se integrou em um único sítio no genoma. No mutante T251 ocorreu evento REMI propriamente dito. Os mutantes T41 e T93 apresentaram padrões de integração mais complexos. / Transformation mediated-insertional mutagenesis of phytopathogenic fungi is an important tool to identify genes involved in pathogenicity. An improved version of this method is the restriction enzyme mediated integration, or REMI. We chose REMI to begin an insertional mutagenesis project in M. grisea. In this work, were reported the: (1) protoplasts production and regeneration of M. grisea, (2) transformation of protoplasts with pAN7-1 mediated by restriction enzyme and (3) identification and characterization of five transformants with pathogenicity defects in rice, at the phenotypic and molecular levels. The highest protoplasts production was obtained with Lysing Enzymes plus Cellulase Onozuka R-10 and the osmotic buffer MgSO 4 at 1.2 M / NaH 2 PO 4 at 0.01 M (pH = 5.8). The highest regeneration frequency was obtained with protoplasts produced after 3 hours of incubation. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1-HindIII was used to transform fungal protoplasts in the presence of the HindIII, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal HindIII concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. Out of 125 transformants screened for the ability to infect rice plants, five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than of wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. The T93 and T251 mutants had similar phenotypes, characterized by a brown-pigmented colony. Four mutants (T41, T93, T108 and T251) were examined by Southern blots. The T108 and T251 mutants contained one copy of the vector integrated at a single site in the genome. REMI event occurred in the T251 mutant. More complex integration events were observed in the T41 and T93 mutants. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-10T16:53:01Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6078357 bytes, checksum: 26dd06f3cc777f1681a5e8f5d8395eab (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-10T16:53:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 6078357 bytes, checksum: 26dd06f3cc777f1681a5e8f5d8395eab (MD5) Previous issue date: 2002-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Avaliaram-se a resistência de berinjela ‘Embú’ controle e transgênica, contendo a região codante do gene orizacistatina, às espécies Meloidogyne incognita, M. javanica e M. arenaria. Foi verificado que a berinjela transgênica foi altamente suscetível a M. incognita, M. arenaria e M. javanica, assim como a berinjela controle as espécies M. incognita e M. javanica com grande número de galhas e número de ovos. Portanto, a transgênese não afetou a resposta de berinjela ‘Embú’ aos nematóides avaliados. A resistência às espécies de pulgões (Myzus persicae e Macrosiphum euphorbiae) e lagartas (Mechanitis polymnia e Mechanitis lysimnia) também foi avaliada. Trabalhou-se com uma geração de M. persicae e de M. euphorbiae para elaboração de tabelas de vida. Foram detectados efeitos significativos das linhagens da planta quanto às características (Ro - taxa líquida de reprodução, rm - razão infinitesimal de aumento populacional e λ - razão finita de aumento populacional) estudadas, exceto para tempo de geração (T). O efeito da espécie de pulgão foi significativo para todas as características, enquanto que o efeito da interação entre linhagem da planta e espécie de pulgão não foi significativo para nenhuma das características. Conclui-se que o ciclo biológico de M. persicae e M. euphorbiae foi alterado, sendo que Ro, rm e λ foram menores nas plantas transgênicas. Para o teste de resistência à lagartas, foram avaliados a área foliar consumida, o número de indivíduos e sua mortalidade, nas fases de desenvolvimento (da lagarta até a fase adulta). Não foram observadas significâncias para as características (duração do período pupal, e mortalidade larval e pupal) avaliadas, à exceção da duração larval. Em relação à área foliar consumida pelas lagartas, observou-se que não houve diferença entre as linhagens da planta e na interação entre linhagem e espécie da lagarta, porém houve diferença em todos os parâmetros avaliados (área foliar total e diária consumida em centímetros quadrado e em porcentagem) quando analisada as espécies de lagarta. Assim, as plantas transgênicas utilizadas não apresentam atividade sobre a mortalidade e duração das fases larval e pupal de Mechanitis polymnia e M. lysimnia. Atividade genotóxica de extratos de berinjela transgênicos utilizados como alimento na dieta de larvas de Drosophila melanogaster, na forma de extratos de frutos in natura e aquecidos em banho-maria a 45oC foi avaliada pelo SMART (somatic mutation and recombination test). Em berinjela ‘Embú’, foram incorporados os genes das construções pRGG hpt, pOZC6 e pCLDO04541, chamados de HPT-1, OZC-2 e SW5-3, respectivamente. Foram realizados dois experimentos independentes nos quais foram testados os mesmos frutos de cada linhagem in natura. No experimento II foram acrescentados os mesmos frutos aquecidos e mais dois frutos: OZC-4 e SW5-5. Além desses, diluiu-se o triturado do fruto OZC-2 a uma concentração de 25%. Em cada experimento também foram incluídos um controle positivo (Ciclofosfamida) e um negativo (água). Em ambos experimentos, resultados positivos foram observados para o controle positivo e em algum dos tratamentos com berinjela transgênica in natura e aquecidos. Por comparação das progênies obtidas no SMART, observou que ocorreu recombinação em alta frequência. Frações de todos os frutos liofilizados das plantas transgênicas e controle, utilizados no SMART, foram mantidos a –80oC e foram, posteriormente, utilizados para detecção de Agrobacterium tumefaciens. Após a rehidratação dos tecidos, com água destilada e estéril, esses foram plaqueados, sob condições assépticas, e avaliado o crescimento de bactérias e sua natureza pelo teste ketolactose. Dos seis frutos utilizados (Berinjela controle, HPT-1; OZC-2, SW5-3, OZC-4, SW5-5) foram isoladas 10 colônias de bactérias, apenas dos fruto SW5-3 e SW5-5. Dessas, 5 colônias foram identificadas pelo teste Ketolactose como Agrobacterium tumefaciens. À luz dos resultados, conclui-se que apesar das evidências de que extrato de berinjela induziu a recombinação somática em D. melanogaster, a ausência de dados na literatura acerca da aplicação deste teste na caracterização de efeitos genótoxicos, advindos dos produtos dos transgenes, sugere que outros estudos devem ser conduzidos, para determinar o(s) agente(s) indutor(es) de recombinação, inclusive aqueles advindos de bactérias residentes nos tecidos de frutos transformados e de possíveis situações de estresses de natureza biótica ou abiótica. / Control and transgenic eggplants for the orizacystatin gene were evaluated as for resistance to nematode species Meloidogyne incognita, M. javanica, and M. arenaria. Transgenic eggplants were highly susceptible to M. incognita, M. arenaria, and M. javanica, as well as the control eggplants were to M. incognita and M. javanica, with high number of galls and eggs produced in the roots. Therefore, the transgenesis did not affect the response of ‘Embú’ eggplant to the nematodes evaluated. The resistance to species of aphids (Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae) and butterfly larvae (Mechanitis polymnia and Mechanitis lysimnia) was also evaluated. For elaboration of life tables, a generation of Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae was used. Significant effects of plant lines were detected for the parameters studied (Ro - net reproductive rate, rm - intrinsic rate of population increase e λ - finite rate of population increase), except for generation time (T). The effect of aphid species was significant for all parameters evaluated, whereas the effect of interaction between plant line and aphid species was not significant for the parameters analyzed. It can be concluded that the biological cycle of M. persicae and M. euphorbiae was alterated, since Ro, rm and λ were smaller in the transgenic plants. For the resistance test to butterfly larvae, consumed leaf area, individual number and mortality were evaluated during the different stages of its development (from larval to adult stage). Significant differences for the parameters evaluated (time period of pupal stage and larval and pupal mortality) were not observed, with exception of time period of larval stage. In relation to consumed leaf area by the larvae, it was observed no difference between the plant lines and no interaction between the plant lines and larvae species; however, differences in all parameters evaluated (total and daily leaf area consumed) were observed depending on larvae species. Thus, the transgenic plants analized did not have any influence on the mortality and time period of larval and pupal stages of Mechanitis polymnia and M. lysimnia. The genotoxic activity of fruit extracts (in natura and preheated at 45 o C) from transgenic eggplants, used as food in the diet of Drosophila melanogaster larvae, was evaluated by the somatic mutation and recombination test (SMART). The T-DNAs from the constructs pRGG hpt [containing the genes hygromycin phosphotransferase (hpt) and β -glucuronidase (uidA), pOZC6 [containing the genes orizacystatin (ozc), uidA, and neomycin phosphotransferase II (nptII), and pCLDO04541 [containing the genes npt and Sw5], were incorporated into eggplant cv. Embú, called of HPT-1, OZC-2 and SW5-3, respectively. Two independent experiments were performed, in which the same fruits from each line were tested in natura. In the experiment II, it was added the same preheated fruits and additional two fruits: OZC-4 and SW5-5. Besides, the triturated from the fruit OZC-2 was diluted to a concentration of 25%. It was also included, in each experiment, a positive (Cyclophosphamide) and a negative (water) control. In both experiments, positive results were observed for the positive control and also in some treatments with transgenic eggplant in natura and preheated. Comparing the progenies obtained in the SMART, it was verifyed the occurrence of recombination at high frequency. Fractions of all lyophilized fruits from transgenic and control plants, used in the SMART, were kept at –80oC, and then utilized for the detection of Agrobacterium tumefaciens. After re-hydration of the tissues, with sterile destilled water, they were plaqued, under asseptic conditions, and the bacterial growth and nature were evaluated by the ketolactose test. Among six fruits analized (control, HPT-1, OZC-2, SW5-3, OZC-4, and SW5-5), bacterial colonies (total of 10) were isolated only from SW5-3 and SW5-5 fruits. Five colonies were identifyed by the ketolactose test as Agrobacterium tumefaciens. Despite evidences that extracts from transgenic eggplant induced somatic recombination in D. melanogaster, it can be concluded that the absence of data in the literature, concerning the application of SMART in the characterization of genotoxic effects of transgenic products, suggests that other studies need to be accomplished, aiming to determine the inductive agent(s) of recombination, including those from bacteria resident in transformed fruit tissues and from possible situations of stress of biotic and abiotic nature. / Dissertação importada do Alexandria

Submitted by Nathália Faria da Silva (nathaliafsilva.ufv@gmail.com) on 2017-06-13T14:19:53Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-13T14:19:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 786589 bytes, checksum: eb63aec8e42b5ea4321e4a66b75765e1 (MD5) Previous issue date: 2003-08-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho abordou a transformação genética em C. perniciosa, fungo causador da vassoura-de-bruxa no cacaueiro, investigando os fatores que podem influenciar a eficiência de transformação neste organismo, bem como a forma de integração do vetor no genoma do fungo. A transformação dos protoplastos foi realizada pelo método químico do PEG/CaCl 2 e a seleção dos transformantes foi feita com base na resistência à higromicina B. A eficiência de transformação foi analisada em função do promotor utilizado para expressar o gene marcador (se proveniente de basidiomiceto ou de ascomiceto), da forma do vetor (circular ou linear) e da presença de inibidores de nuclease (ácido aurintricarboxílico, putrecina e espermidina) na mistura de transformação. A técnica REMI (restriction enzyme mediated integration) foi realizada utilizando a enzima de restrição BamHI. Também foi construído um vetor contendo o gene que confere resistência à higromicina B (hph) sob o comando do promotor do gene gpd de Agaricus bisporus, para experimentos futuros de mutagênese insercional. A utilização do promotor gpd de Agaricus bisporus resultou em uma eficiência de transformação cinco vezes superior àquela obtida quando o promoter gpd de Aspergillus nidulans foi utilizado. Além disso, os transformantes desenvolveram- se mais rapidamente, com redução do tempo necessário para visualização das colônias nas placas em comparação aos transformantes que continham o gene hph sob o controle do promotor gpd Aspergillus. Os inibidores de nucleases putrecina e ATA (ácido aurintricarboxílico) reduziram a eficiência de transformação nas condições utilizadas, enquanto que a presença de espermidina não exerceu influência quando comparado ao controle. A linearização do vetor não influenciou a eficiência de transformação e todos os transformantes resultantes desse tratamento que foram analisados por hibridização apresentaram um padrão complexo de integração, com duas ou mais cópias do plasmídeo inseridas em posições distintas no genoma. A mais elevada eficiência de transformação foi obtida com REMI, utilizando-se 10U da enzima de restrição BamHI e 10 μg do vetor na forma circular. Nesta condição, foram obtidos cerca de 64 transformantes/μg de plasmídeo, cerca de três vezes mais transformantes que o tratamento onde BamHI não esteve presente. Não foi verificada a influência da enzima de restrição promovendo a obtenção de transformantes com uma única cópia do vetor integrada. Os transformantes mostraram alto nível de resistência à higromicina (>500 μg/mL). Dos transformantes analisados quanto à estabilidade mitótica, 100% conservaram-se resistentes após a passagem por meio não seletivo durante 40 dias. / The present work has investigated the different conditions that may influence the transformation efficiency and the way transforming DNA integrates into the genome of the fungus Crinipellis perniciosa, the causal agent of the witches' broom disease of cacao. Protoplast transformation was done by the PEG/CaCl 2 method. Transformant colonies were selected for resistance to hygromycin B. The transformation efficiency was related to the type of promoter used to express the hph gene (either from an ascomycete or from a basidiomycete fungus), vector shape (linear or circular forms), and the presence of nuclease inhibitors (aurintricarboxylic acid, putrescine or spermidine) in the transformation mix. The REMI (restriction enzyme-mediated integration) technique was employed using BamHI. For future experiments of insertional mutagenesis, a plasmid containing the hph gene controlled by the gpd gene from Agaricus bisporus was constructed. The use of the gpd promoter from Agaricus bisporus resulted in a five-fold increase in transformation efficiency compared to that obtained with the gpd promoter from Aspergillus nidulans. In addition, these transformants showed faster growth than those containing gpd from Aspergillus. Putrescine and ATA (aurintricarboxylic acid) decreased the transformation efficiency, while spermidine did not have any influence in comparison to the control. Vector linearization was not effective and a complex pattern of plasmid integrations resulted from this procedure, with two or more copies integrated throughout the genome. The highest efficiency was obtained with REMI (10U of BamHI added prior to transformation with 10 μg of circular vector). An efficiency of 64 transformants/μg of plasmid was obtained in this treatment. Under the analyzed conditions, BamHI did not induce single copy integrations in Crinipellis perniciosa, although an approximate three-fold increase in the transformation efficiency was obtained. The transformants were highly resistant to hygromycin (> 500 μg/mL). All transformants analyzed were mitotically stable after successive transfers to nonselective media for 40 days.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-27T17:22:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 72319 bytes, checksum: 8ea16ab7752471ab01d10c647ee35e08 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-27T17:22:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 72319 bytes, checksum: 8ea16ab7752471ab01d10c647ee35e08 (MD5) Previous issue date: 2001-03-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Foram estudados alguns fatores que influenciam a organogênese, bem como a regeneração in vitro desta espécie, visando fornecer subsídios à transformação genética. Analisando-se o efeito de concentrações de BAP na indução de multibrotações em segmentos caulinares nodais de O. selloi cultivados in vitro, evidenciou-se que quanto maior a concentração de BAP, tanto menor foi o comprimento dos brotos, porém maior o número de brotos. Menores concentrações de BAP relacionam-se a maiores pesos de matéria seca dos brotos. Estudando-se o efeito de concentrações de sacarose e sais no cultivo in vitro de segmentos caulinares nodais de O. selloi constatou-se que a concentração de 100 % de sais do meio MS combinada com a concentração 2 % de sacarose foi a melhor na propagação in vitro de O. selloi, em razão de se ter obtido brotos mais longos e com raízes grandes, resultando em maior peso do material vegetal. Observando-se o efeito de concentrações de ANA e BAP e da posição dos explantes na indução de organogênese in vitro em segmentos caulinares internodais de O. selloi verificou-se que o primeiro, o segundo e o terceiro segmentos caulinares internodais apresentaram, em meio de cultivo -1 -1 complementado com 1,00 mg L de ANA e 0,25 mg L de BAP, freqüência de calogênese de 60,00%, 50,00% e 60,00%, respectivamente. O primeiro, o segundo e o terceiro segmento caulinar internodal apresentaram, respectivamente, freqüência de organogênese de 93,33%, 73,33% e 73,33%, média de órgãos produzidos de 2,80, 1,80 e 1,80 e eficiência de organogênese de 2,60, 1,32 e 1,32 em meio de cultivo suplementado com 0,10 mg L -1 de ANA e 1,00 mg L -1 de BAP. Verificando-se o efeito de concentrações de ANA na indução do enraizamento em brotos de O. selloi, obtidos a partir de segmentos caulinares internodais cultivados in vitro, evidenciou-se que tanto o número de raízes quanto o comprimento de raízes foram crescentes à medida que elevou-se a concentração de ANA de 0,0 a 1,0 mg L -1 . Avaliando-se o efeito de agentes gelificantes na indução de organogênese em segmentos caulinares internodais de O. selloi cultivados in vitro, averigou-se que o primeiro segmento caulinar internodal comportou-se melhor na indução de brotos comparado ao segundo segmento caulinar internodal e combinado ao Phytagel - “Sigma” foi superior ao associado com Agar - “Merck”. O uso de higromicina com timentin foi mais eficiente que o de canamicina com timentin para a seleção de regenerantes, pois para inibir a organogênese usou-se 10 mg L -1 de higromicina com 300 mg L -1 de timentin e 100 mg L -1 de canamicina com 300 mg L -1 timentin. A freqüência de regeneração de brotos em meio seletivo contendo higromicina e timentin foi de 0,5%, enquanto que a de canamicina e timentin foi de 1,0%. Conclui-se que não foi possível obter plantas transgênicas, pois a transformação genética não foi mostrada pelo teste Gus, nem confirmada por PCR. / Some factors that influence the organogenesis have been studied, as well as the regeneration in vitro of this species, with the aim of providing a basis for genetic transformation. By analysing the effect of BAP concentrations in the induction of multishooting in nodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has become clear that the higher the BAP concentration, the shorter the shoots were, though they were in a larger number. A lower concentration of BAP is related to a higher amount of dry matter in the shoots. By studying the effect of sucrose and salt concentrations in the cultivation in vitro of nodal stem segments of O. selloi, it has been observed that the concentration of 100% of salt in a MS medium combined to a concentration of 2% of sucrose was the best one for the in vitro propagation of O. selloi , since the shoots obtained were longer and deeper-rooted, resulting in a larger amount of vegetal matter. By observing the effect of NAA and BAP concentrations and the position of explants in the induction of the organogenesis in vitro of the internodal stem segments of O. selloi, it has been verified that the first, second and third internodal stem segments presented a calogenesis frequency of 60,00 %, 50,00% and 60,00% respectively in a medium of cultivation supplemented with 1,00 mg L -1 and 0,25 mg L -1 of NAA of BAP. The first, the second and the third internodal stem segments presented organogenesis frequency of 93,33%, 73,33% and 73,33%, respectively, an average of organs produced of 2,80, 1,80 and 1,80 and organogenesis efficacy of 2,60, 1,32 and 1,32 in a medium of cultivation supplemented with 0,10 mg L -1 of NAA and 1,00 mg L -1 of BAP. By analysing the effect of NAA concentrations in the induction of rooting in O. selloi shoots, obtained from internodal stem segments cultivated in vitro, it has become clear that both the number of roots and their length grew as the concentration of NAA was increased from 0,0 to 1,0 mg L -1 . By evaluating the effect of gelling agents in the induction of organogenesis in internodal stem segments of O. selloi cultivated in vitro, it has been verified that the first internodal stem segment reacted best in the induction of shoots as compared to the second internodal stem segment, and, combined to Phytagel - “Sigma”, it was better than that associated to Agar - “Merck”. The use of hygromycin combined with timetin was more effective than the use of kanamycin combined with timetin for the selection of the regenerants, since it was used 10 mg L -1 of hygromycin combined to 300 mg L -1 of timetin and 100 mg L -1 of kanamycin combined with 300 mg L -1 of timetin. The frequency of the regeneration of the shoots in a selective medium containing hygromycin and timetin was of 0,5%, whereas that of kanamycin and timetin was of 1,0%. The conclusion was that it is not possible to obtain transgenetic plants, since the genetic transformation has not been shown by the GUS test, neither confirmed by PCR.

RIBEIRO, Sandra Mara Serafim. Transformação genética de plantas de fumo (Nicotiana tabacum var. Xanthi) com a seqüência CV1887 de Chromobacterium violaceum. 2009. 90 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T12:29:18Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:19:46Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:19:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_smsribeiro.pdf: 1692746 bytes, checksum: 683e626eb9d261fd4a3e1f97ecdd84fe (MD5) Previous issue date: 2009 / The genetic transformation of plants represents today an important tool to investigate the function of genes of diverse origins like plants, fungi, virus, nematodes and bacteria. Those that come from bacteria are the most representative ones. Within this context, sequences coding to domains containing YD (tyrosine - asparatate) repetitions, that have similarities with nematicide proteins, were detected in the Chromobacterium violaceum strain ATCC 12472 genome. Among these sequences, the ORF CV1887 (4.155 bp) was selected for cloning and expression in the heterologous system, in the attempt to validate its activity determined in silico in the C. violaceum genome's annotation. The experimental strategy consisted in cloning the complete (4.155 bp) and the partial sequence (2.642 bp) of the ORF in the binary vector pBI121. The recombinant vectors w ere introduced in Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404 cells by electroporation. By utilizing agroinfection system, leaves segments of Nicotiana tabacum var. Xanthi were transformed and used as propagles for regeneration of the firsts transformants. Th e confirmation of the genetic transformation was achieved by PCR with the genomic DNA extracted from of the selected clones, followed of a PCR reaction. The visualization of bands in the agarose gel electrophoresis showed that from the 19 clones with the p artial sequence cv1887 that were selected, 84% showed bands with approximate size of 2.642 bp, and from the 13 clones with the complete sequence CV1887 that were selected, 78% showed bands with approximate size of 4.155 bp. For the expression analysis, the following were selected: three transformed clones with partial sequence CV1887, two transformed clones with complete sequence CV1887, three clones transformed with the reporter gene gus, which encodes for the enzyme b - glucoronidase, and two control clone s of non - transformed plants. The RNA from the selected clones was used in a RT - PCR reaction for cDNA synthesis and amplification of the corresponding sequences. The products of the amplification were analyzed in an agarose gel electrophoresis, showing the presence of bands with 2.642 bp for the three clones transformed with partial sequence CV1887 and 1.812 bp for the three clones transformed with gus and it is confirmed the presence of these sequences in the transformed cells. It was not confirmed the pres ence in transformed clones, the complete sequence CV1887. / A transformação genética de plantas atualmente representa uma importante ferramenta para investigação da função de genes de diversas origens como plantas, fungos, vírus, nematóides e bactérias, sendo os de origem bacteriana os mais representativos. Dentro desse contexto, seqüências codificando para domínios contendo repetições YD (tirosina- ácido aspártico), que possuem similaridades com proteínas nematicidas, foram previamente detectadas no genoma de Chromobacterium violaceum estirpe ATCC 12472. Dentre essas seqüências, a ORF CV1887 (4.155 pb) foi selecionada para clonagem e expressão no sistema heterólogo, objetivando validar a atividade determinada in silico na anotação do genoma de C. violaceum. A estratégia experimental consistiu em clonar as seqüências completa (4.155 pb) e parcial (2.642 pb) da ORF CV1887 no vetor binário pBI121. Os vetores recombinantes foram introduzidos em células de Agrobacterium tumefaciens estirpe LBA4404, por eletroporação. Empregando-se o sistema de agroinfecção, segmentos foliares de Nicotiana tabacum var. Xanthi foram transformados e usados como propágulos para regeneração dos transformantes primários. A confirmação da transformação genética foi feita por reação da polimerase em cadeia (PCR), sendo usado como molde, o DNA genômico extraído de clones selecionados em meio de cultura contendo canamicina. Pela visualização das bandas no gel de agarose, dos 19 clones selecionados de CV1887 parcial, 84% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb e dos 13 clones selecionados de CV1887 completo, 78% apresentaram bandas no tamanho aproximado de 4.155 pb. Para a análise da expressão, foram selecionados três clones transformados com a seqüência CV1887 parcial, dois clones transformados com a seqüência CV1887 completa, três clones transformados com o gene repórter gus, que codifica para a enzima β-glucoronidase, e dois clones de plantas controle não transformadas. O RNA extraído dos clones selecionados foi utilizado em uma reação de RT-PCR para a síntese do cDNA e amplificação das seqüências correspondentes. Os produtos da amplificação foram analisados por meio de eletroforese em gel de agarose, constatando-se a presença de bandas no tamanho aproximado de 2.642 pb para os três clones transformados com a seqüência CV1887 parcial e no tamanho de 1.812 pb para os três clones transformados com gus, confirmando-se a presença dessas seqüências nas células transformadas. Não foi confirmada a presença, nos clones transformados, da seqüência CV1887 completa.

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

A resistência a doenças em plantas transgênicas tem sido obtida por meio da expressão de genes isolados de bactérias, fungos micoparasitas e plantas. Neste trabalho, relatamos a utilização de um gene do fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae como modo de gerar resistência a doenças fúngicas em plantas. O gene chit1 codifica a quitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), pertencente a uma classe de glicosil-hidrolases capazes de converter quitina em oligômeros de N-acetil-glicosamina (NAcGlc). Quando presentes em tecidos vegetais, supõese que as quitinases ataquem especificamente a parede celular de fungos invasores, provocando danos às hifas e causando a morte por lise das células fúngicas. Deste modo, dois diferentes grupos de plantas transgênicas de Nicotiana tabacum foram produzidos: no primeiro deles, denominado chitplus, os indivíduos possuem o gene chit1 sob o controle do promotor CaMV 35S. O segundo grupo, demoninado chitless, consiste de plantas transformadas com um T-DNA não contendo o gene do fungo. Trinta e quatro plantas transgênicas resistentes à canamicina (17 de cada grupo) foram regeneradas a partir de discos de folhas infectados por Agrobacterium tumefaciens. A produção da quitinase em extratos protéicos de folhas foi analisada por zimogramas em SDS-PAGE contendo glicol-quitina e corados por calcoflúor branco, na forma de um screening dos transgênicos primários. As plantas transgênicas foram testadas, ainda, por meio de ensaios colorimétricos empregando oligômeros sintéticos de NAcGlc como substratos específicos, além de immunoblot e Western blot com soro anti-quitinase. A quantidade de enzima recombinante nas plantas chitplus variou desde nenhuma atividade detectável a elevados níveis de expressão da enzima. A hibridização de Southern blot demonstrou que o número de cópias do gene chit1 integradas no genoma vegetal foi estimado entre uma e quatro. A primeira geração de plantas transgênicas geradas por autofecundação de parentais portadores de duas cópias do transgene foi testada com relação à estabilidade da herança do transgene e em 43 de um total de 67 descendentes, originados de quatro cruzamentos independentes, o padrão de segregação não diferiu das proporções Mendelianas esperadas. Ensaios de resistência, desafiando as plantas transgênicas com o basidiomiceto Rhizoctonia solani foram realizados e uma evidente diminuição da área foliar contendo lesões fúngicas foi observada entre as linhagens transgênicas, embora variações na atividade quitinolítica tenham influenciado o nível de resistência. Nossos resultados sugerem uma relação direta entre a atividade específica de quitinase e ao aumento nos níveis de resistência às lesões causadas pela infecção por R. solani. / Plant resistance in transgenic plants has been obtained by expressing genes isolated from bacteria, mycoparasitic fungi and plants. Here we report the employment of a gene from the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae as a tool to generate resistance to fungal diseases in plants. The chit1 gene encodes the chitinase CHIT42 (EC 3.2.1.14), belonging to a class of glicosyl-hydrolases able to convert chitin into N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) oligomers. When present in plant tissues, chitinases are supposed to disrupt the invading fungal cell wall specifically, causing hyphae damage and leading to cell lysis. Hence two different groups of transgenic Nicotiana tabacum plants were produced. The first group was named chitplus, in which individuals harbour the chit1 gene under the control of the CaMV 35S promoter . The second group, named chitless, carried a T-DNA not containing the fungal gene. Thirty-four kanamicin resistant plants (17 of each group) were regenerated from leaf discs infected with Agrobacterium tumefaciens. Chitinase production in leaf protein extracts was analysed through zymograms in SDS-PAGE containing glycol-chitin and stained by calcofluor white, as a screening of primary transformants. Transgenic plants were also evaluated by colorimetric assays using synthetic GlcNAc oligomers as specific substrates besides immunoblot and Western blot probed with rabbit anti-chitinase sera. The amount of recombinant enzyme in chitplus plants ranged from no detectable chitinase activity to high levels of enzyme expression. Southern blot hybridisation revealed that chit1 copy number inserted into plant genomes varied from one to four. The first self pollinated generation of transgenic lines bearing two copies of the transgene was tested on inheritance stability and in 43 out of 67 descendants, derived from four independent crosses, the segregation pattern was discovered not to differ from the predicted Mendelian ratios. Resistance assays challenging transgenic plants with the basidiomycete Rhizoctonia solani were performed and a clear decrease in the foliar area containing fungal lesions was observed amongst transgenic lines, though variations in chitinase activity also reflected on the resistance level. Our results suggest a direct relationship between chitinase specific activity and the improvement in the resistance to lesions caused by infection.

Neste trabalho, foram realizados estudos envolvendo a relação tritrófica onde as plantas de cana-de-açúcar transgênica fazem parte do primeiro nível trófico, que alimenta o segundo nível, formado pelos insetos-alvo (neste caso, a broca da cana-de-açúcar Diatraea saccharalis), os quais possuem inimigos naturais (o parasitóide Trichospilus diatraeae), caracterizando o terceiro nível trófico, sendo analisada a longevidade, a fertilidade, a porcentagem de parasitismo e a atratividade da planta transgênica ao parasitóide. Outro teste envolveu o pulgão da cana-de-açúcar Melanaphis sacchari (segundo nível trófico), e o predador Chrysoperla externa (terceiro nível trófico) sendo que os parâmetros avaliados foram a longevidade, a fertilidade, o período de desenvolvimento e a viabilidade. As pesquisas foram desenvolvidas no Departamento de Entomologia da Cooperativa de Produtores de Cana, Açúcar e Álcool do Estado de São Paulo Ltda (COPERSUCAR), de Piracicaba-SP, que possui o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB) – nº 0006-96. Os resultados demonstraram que a longevidade da progênie de T. diatraeae foi maior quando comparada com a longevidade das fêmeas de T. diatraeae utilizadas para o parasitismo de pupas da broca da cana-de-açúcar. O número de descendentes de T. diatraeae foi semelhante quando comparado com as plantas transgênicas e a testemunha. Nos testes realizados em telado envolvendo a mesma praga e o parasitóide T. diatraeae não ocorreram diferenças significativas nos diferentes tratamentos. Experimentos com o predador C. externa demonstraram algumas diferenças significativas, na longevidade das larvas de 2º instar e na fase pupal, enquanto que na primeira geração a diferença significativa foi maior apenas na fase pupal. O número de ovos foi semelhante em todos os tratamentos, e a razão sexual de C. externa foi de uma fêmea para um macho. / not available